Summary
Bu protokol, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaraların nasıl üretileceğin ve yaraların morfometrik analiziçin nasıl izlendiğini, hasat edilip hazırlanacağını açıklar. Morfometrik kusurları tanımlamak, tam olarak ölçmek ve tespit etmek için seri histolojik bölümlerin nasıl kullanılacağına iliş bir açıklama dahildir.
Abstract
Murine eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin ardışık olarak örtüşen evrelerinin her birini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır: inflamasyon, proliferasyon ve remodeling. Mürin yaraları, iyileşme sürecinin bu farklı evrelerinin ölçülebilir olduğu histolojik olarak iyi tanımlanmış ve kolayca tanınabilir bir yara yatağına sahiptir. Alan içinde histolojik analizler için yaranın keyfi olarak tanımlanmış bir "orta" kullanmak yaygındır. Ancak, yaralar üç boyutlu bir varlıktır ve genellikle histolojik olarak simetrik değildir, küçük bir etki boyutuile morfometrik kusurları tespit etmek için iyi tanımlanmış ve sağlam bir nicel yöntem ihtiyacını destekler. Bu protokolde, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaralar oluşturma prosedürünün yanı sıra belirli seri bölümlerde bir görüntü işleme programı kullanılarak morfometrik parametrelerin nasıl ölçülmeye cerenebilir ayrıntılı bir talimatı açıklanmıştır. Yara uzunluğu, epidermal uzunluk, epidermal alan ve yara alanının iki boyutlu ölçümleri, yarayı kaplayan üç boyutlu epidermal alanı, genel yara alanı, epidermal hacim ve yara hacmini tahmin etmek için kesitler arasındaki bilinen uzaklıkla birlikte kullanılır. Bu ayrıntılı histolojik analiz konvansiyonel analizlere göre daha fazla zaman ve kaynak tüketen olmasına rağmen, titizliği doğal olarak karmaşık bir yara iyileşme sürecinde yeni fenotipleri tespit etme olasılığını artırır.
Introduction
Kutanöz yara iyileşmesi sırayla örtüşen aşamaları ile karmaşık bir biyolojik süreçtir. Hasarlı epitelin bariyer işlevini geri getirmek için zamansal ve mekansal olarak düzenlenmiş hücresel ve moleküler süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. İlk aşamada, inflamasyon, nötrofiller ve makrofajlar yaraya göç, lokal ve sistemik savunma seferber1. İnflamatuar evrenin takibi ve üst üste bindirilen proliferasyon aşamasıdır. Fibroblastlar hızla çoğalmaya ve granülasyon dokusuna göç etmeye başlar. Önden uzak keratinositler, öndeki kenardaki farklılaştırılmış keratinositler yarayı yeniden epitelize etmek için göç ederken yaraya doğru çoğalır2. Son olarak, remodeling ve olgunlaşma aşaması başlar, granülasyon dokusunda fibroblastlar sentez ve mevduat kollajen başlar sırasında. Yeni matrisin yeniden biçimlendirilmesi ve düzenlenmesi yaralanmadan sonra 1 yıla kadar sürebilir3. Birden fazla hücre tipi arasında çapraz konuşma içeren örtüşen olayların karmaşıklığı nedeniyle, ve araştırma yıl rağmen, hücresel ve moleküler mekanizmaların altta yatan yara iyileşmesi nin altında yatan kötü anlaşılmış kalır.
Fare modeli kullanım kolaylığı nedeniyle yara iyileşme mekanizmaları araştırmak için baskın memeli modelidir, nispeten düşük maliyetli ve genetik manipulability1,4,5. Murine modelinde farklı tiplerde yara tanımlanmış olsa da, en sık görülen eksizyonel yaradır (ya bilateral punch ya da direkt punch biyopsisi), ardından kesi yara modelleri4. Eksizyonel yara modeli, doğal olarak iyileşme sürecinden geçmiş olan kontrol dokusunu ürettiği için kesi modeline göre belirgin bir avantaja sahiptir. Cerrahi protokol kapsamında eksizlenen punch biyopsi dokusu, yaralı doku ile aynı şekilde işlenebilir ve istenilen kriter için homeostatik koşulların oluşturulmasında kullanılabilir. Eksizlü kontrol dokusu da bir cilt ön tedavi etkilerini değerlendirmek veya yaralanma sırasında başarılı gen değişikliği teyit yararlı olabilir4.
İyileştirme parametreleri planimetri veya histoloji de dahil olmak üzere birçok farklı teknikle değerlendirilebilir. Ancak, planimetri sadece yaranın görünür özelliklerini değerlendirebilir, ve bir yara varlığı nedeniyle, genellikle histoloji tarafından görselleştirilmiş şifa ölçümleri ile ilişkili değildir, bu nedenle histoloji analiz "altın standart" yapma4. Histolojik analiz altın standart olmasına rağmen, en sık yara nın keyfi bir alt kümesi üzerinde yapılır6,7. Örneğin, yarayı gömmeden ve kesmeden önce yarayı "yarıya" kesmek, malzeme ve veri analizi için harcanan zamanı ve kaynakları azaltmak için şu anda yaygın bir uygulamadır. Bu protokolde tanımlanan morfometrik analiz yöntemi, yara dokusunun tamamını kapsayacak, yaranın morfolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtacak ve küçük bir etki boyutunda yara iyileştirici kusurlarıtespit etme olasılığını artırmak için geliştirilmiştir. Bu protokolde, en sık çalışılan murine yarasını, bilateral tam kalınlıktaki eksizyonel yarayı oluşturmak için cerrahi bir yöntemin yanı sıra histolojik analiz için detaylı ve titiz bir yöntem insa edilen bu tür alanlarda nadiren kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler federal düzenlemelere uygun olarak tamamlanmıştır ve Iowa Üniversitesi'nin politika ve prosedürleri Iowa IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanlar ve hayvancılık
- Saç folikülü evresi telogen olduğunda 8-10 yaş arasında istenilen fare hattının yetişkin fareler kullanın.
- Ameliyat günü, temiz kafesler halinde fareler ayrı ve ayrı ayrı ev yara bozulmasını en aza indirmek için.
2. Cerrahi
NOT: Steril cerrahi koşulların sürdürülmesi gereksizdir. Hayvanlar arasında kısırlığı korumaya özen gösterilmesi gerekirken, yumruğun kendisi temiz ama steril olmayan bir yüzeyde yapılır. Hayvan başına ameliyat süresi 10 ile 15 dk arasındadır.
- Anestezi
- Isofluran buharlaştırıcı % 4-5 akış hızı ve oksijen akış ölçer dakikada 1 litre olarak ayarlanmış ayarlanmış bir indüksiyon odasında 1-2 dakika hayvan anestezi. Alternatif anestezi seçenekleri için tartışma konusuna bakın.
- İşleme başlamadan önce uygun anesteziyi onaylayın. Anestezi derinliği sağlam bir parmak çimdik tarafından teyit edilebilir.
- Fareyi indüksiyon kabından bir burun konisine aktarın ve izofluran akış hızını %1,5'e, oksijen akış ölçeri ise 0,5 L/dk'ya düşürün.
- Prosedür 5 dakikayı aştığı için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
- Termal ped kullanarak normal vücut ısısını koruyun.
- Yara alanının hazırlanması
- Omuz hizasında farenin arka kürk kaldırmak için bir kaudal rostral hareket bir elektrikli jilet makas kullanın. İkiden fazla yara yapıyorsa, gerektiğinde arkadaki tüyleri aşağı doğru çıkarın.
- Kesilen alanı yakından tıraş etmek için farenin arkasından 20° olarak tutulan rostral kaudal harekette bir jilet kullanarak kalan tüyleri çıkarın(Şekil 1A).
- Bir povidone-iyot bezi ile tıraş alanı temizleyin.
- İyot bezinden potansiyel kutanöz tahrişi azaltmak için cildi steril %70 izopropil alkol hazırlık pedi ile silin.
- Yaralama
- Sırt orta hattı boyunca kürek kemikleri arasındaki deriyi çimdiklayın ve sandviçli deriyi vücuttan çekin(Şekil 1B).
- Fareyi, temiz kağıt tabanlı havlu veya eşdeğeri ile kaplı düz bir yüzeyüzerinde deri kıvrımı ile yan tarafta konumlandırın. Altta yatan yüzeyi hasardan korumak için havlunun altında bir diş balmumu yaprağı kullanın(Şekil 1C).
- Mümkün olduğunca vücuda yakın istenilen boyutta biyopsi yumruk yerleştirin ve cildin dinlenmek için izin. Cildi esnetmeyin, yoksa yara boyutu belirlenen yumruk boyutundan daha büyük olacaktır(Şekil 1D).
- Aşağı bastırarak derini yumrukla, her iki taraftaki derinin tüm katmanlarının delinmesini sağlamak için sallanan bir hareket kullanılabilir(Şekil 1E). Her hayvan için yeni bir biyopsi yumruğu kullanın.
- Yaralardan yumruk biyopsileri çıkarın(Şekil 1F). Hala eki siteleri varsa çevredeki deriden yumruk serbest etmek için steril makas ve cımbız kullanın. Yara iyileşmesi analizleri için downstream planlarına göre yumrubiyopsi kontrol dokusunu gerektiği gibi işleyin (öneriler için tartışma ya da bkz.
- İlk yara alanını ölçmek ve analizden aykırıları ortadan kaldırmak için yara bölgelerine eşit mesafeden veya çerçevede cetvelle makroskopik fotoğraflar çekin.
- Onaylı bir hayvan protokolüne uygun olarak en az 24 saat analjezi uygulayın. Örneğin: Buprenorfin SR-LAB, tek doz subkutan olarak enjekte 0.5-2 mg/kg ağrı kesici 48 saat için (alternatif öneriler ve hususlar için Tartışma bakınız).
- Dik duruşu nu koruyana ve kafesin etrafında normal bir şekilde yürüyene kadar fareyi anesteziden çıkarken izleyin.
3. Yara sonrası izleme
- Araştırmacı tarafından belirlenen ve kurumsal protokollere uygun olarak deneysel uç noktalar için fareleri günlük olarak izleyin. Örnekler şunlardır: enfeksiyon, görünür kilo kaybı, ya da kambur duruş.
- İlk ameliyattan sonra olduğu gibi günlük makroskopik fotoğrafları kontrollü bir şekilde çekin.
4. Hasat yaraları
- Fareleri istenilen zamanda, onaylanmış bir hayvan protokolüne uygun olarak yaradan sonra ötenazi.
- Önceki fotoğraf edinimi ile tutarlı kontrollü bir şekilde yara sitelerinin makroskopik fotoğraflarını çekmek(Şekil 2A,C).
- Neşter kullanarak yara bölgelerinin etrafında geniş bir dikdörtgen kesin(Şekil 2D,E).
- Dikdörtgen doku parçasını makas ve cımbız kullanarak serbest bırakıp altta yatan dokudan deri koparın(Şekil 2F). Petri kabına yerleştirin (Şekil 2G).
- Yaraları hasat edin. Dikdörtgen şeklinde yaranın her tarafını çevreleyen 2 mm'lik yaralanmamış dokuyı kesin(Şekil 2H,I). Yarayı hasat etmek için alternatif seçenekler için Tartışma'ya bakın.
- Sonraki çalışmalar için gerekli yaraları işle. Parafin katıştırma ve histolojik analiz için fare başına en az bir yara ayırın.
5. Yara fiksasyonu ve gömme
- Yarayı düzeltin
- Yeni hazırlanmış %4 paraformaldehit çözeltisi içinde yara dokusunu oda sıcaklığında 3 saat 8'e düzeltin ve bir gecede 4 °C'ye aktarın. Elektron mikroskobu (EM) sınıfı paraformaldehit ve çözelti filtrasyonu gerekli değildir.
- 1x PBS 30 dakika boyunca iki kez yaraları yıkayın.
- PBS'yi %70 ETOH ile değiştirin ve katıştırmadan 4 °C'de saklayın. Antijen kaybını önlemek için 24-48 saat içinde veya histolojik özellikleri nin değerlendirilmesi durumunda 1-2 hafta içinde dokuları işleme.
- İşleme ve yara gömmek
- Her yarayı bir katıştırma kasetine aktarın. İşlem mürekkepleri kaldıracağı için kasetleri kaleme etiketleyin.
- Dokuyu el ile veya otomatik bir işlemci kullanarak, dokuyu artan etanol yüzdeleriyle susuz bırakarak, ksilen ile temizleyerek ve sonra parafin balmumu ile dokuya sızarak işleme koyun(Tablo 1).
- Yarayı gömme kalıbının yatay yüzeyinden 90° ("ayakta") yerleştirin(Şekil 3A,B).
6. Gün 0 yara alanı analizi
- NIH-Image J veya NIH-Fiji özgür yazılım (https://imagej.net/Fiji/Downloads) indirin.
- 0. gün yaralarının fotoğrafını içeren bir dosya açın.
- Analyze | altında "Alan" kutusunu işaretleyin Ölçümleri Ayarlayın.
- Analyze altında "Set Scale" seçeneğini belirleyin. Makroskopik ölçümler çalışmanın bir parçasıysa piksellere, bilinen ilgili mesafeye ve mesafenin birimine (= uzunluk birimi) girin veya yalnızca göreli ölçümler gerekiyorsa bu adımı atlayın.
- Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
- Yaranın çevresini ana hatlar.
- Analiz altında Ölçü'ye tıklayın.
- Yara başına hayvan başına ölçümleri takip etmek için bir elektronik tablo oluşturun.
- Elektronik tablodaki yara alanının ölçümlerini kopyalayın.
- Belirli bir deney için ortalama alanı ve tüm yaraların standart sapması hesaplayın.
- Histolojik analizden ortalamanın iki standart sapmadışında herhangi bir yara hariç.
7. Seri kesitleme
- Bir gecede parafin gömülü yara bloklarını 4 °C'de soğutun.
- Parafin bloğunu mikrotomun blok tutucuya yerleştirin ve yönlendirin, böylece bıçak blok boyunca düz bir şekilde kesecektir. Bloğu, dokunun 90° de "durması" ve epidermisin ve dermisin eş zamanlı olarak kesilmesine olanak sağlayacak şekilde yönlendirin(Şekil 3C,D).
- Her biri 7 μm 20-30 parafin bölümlerinden 2-4 şerit yapın.
- Kuru boya fırçası ve bir diseksiyon alay iğnesi kullanarak her bir kurdeleyi siyah plastik levha gibi sağlam ama manipüle edilebilir bir yüzeye aktarın.
- Her şeridin üst kısmını bir jiletle ayırın ve mikroskop slaytına yerleştirin.
- Hangilerinin saç folikülü yokluğunda tespit edilebilen yaralı doku, bağ dokusu nun veya epidermisin görünümündeki değişiklikler ve/veya bir yara parçasının varlığı ile tespit edilebilen yaralı doku içeren bir brightfield mikroskobu altında lekelenmemiş bölümleri gözlemleyin(Şekil 4A,B).
- Yara başlamadan önce 20 bölüme kadar yaraalmadan kesitler atın.
- Lekesiz kesitlerde yara tespit edilemeyene kadar 7.3 ve 7.4 basamakları tekrarlayarak yaranın içinden kesin.
8. Parafin bölümlerinin montajı
- İlk kurdeleden başlayarak her 5 bölümden biri ayrı parafin bölümleri(Şekil 3E).
- Mikroskop slaytlarını hem slayt numarasıyla hem de tüm bölüm numaralarını etiketle.
- Isliç boya fırçası ile 5 bölümden oluşan grubu alın ve onları düzleştirmek için ılık su banyosunun (40-45 °C) su yüzeyinde yüzdürün.
- Etiketli mikroskop kaydıraklarından birini(Şekil 3F)kullanarak su banyosundan 5 bölümden oluşan grubu seçin ve 37 °C'de 24 saate kadar bir kaydırak ısıtıcısı üzerine yerleştirin.
- Slaytları bir slayt kutusunda dik olarak saklayın.
9. Histolojik boyama
- Her 8mikroskop slaytı (her40'ına eşdeğer) hematoksilin ve eozin ile boyama rafına ve lekeye aktarın.
10. Mikroskobik görüntüleme
- 4x nesnel ve dijital satın alma özellikleriyle donatılmış parlak bir alan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin. Görüntünün alındığı ölçeği kaydedin.
- Her lekeli slayt üst bölümünün tüm yara görüntü ve her iki tarafta bazı yaralanmamış doku içerdiğinden emin olun. Yara tek bir resmin çerçevesinden daha büyükse, çakışan birden çok resim çekin.
- Morfometrik çözümleme için bölüm numarasını içeren dosyayı kaydedin. Aynı yaranın üst üste binen resimleri için a, b, c, vb. bölüm numarasını kullanın.
11. Morfometrik analiz
NOT: Yara birden fazla resmi kapsadığında, elektronik tabloya kaydetmek için yara bölümü başına metrik başına bir değer elde etmek için tek tek resimlerden alınan ölçümleri özetleyin.
- Resim J'de, lekeli bir yara resminin dijital dosyalarını açın. Analiz için dikişli resimler kullanmayın. Kapalı bırakmak ve resimden resme ölçümleri almak için yer işaretleri bularak yakınlaştırılmış çakışan resimlerüzerinde ölçümler gerçekleştirin.
- Ölçek ve ölçüm tercihlerini ayarlayın.
- Analyze altında "Set Scale" seçeneğini belirleyin. Piksellere mesafeyi, bilinen ilgili mesafeyi ve mesafenin birimini (= uzunluk birimi) girin. Ölçek pencerede görünmeli ve görüntünün elde edildiği ölçeğe karşılık gelir.
- Ölçeği her açık görüntü için aynı tutmak için "Global" kutusunu işaretleyin.
- Resim J her kapatıldığında ve yeniden açıldığında 11.2.1 ile 11.2.2 adımlarını yineleyin.
- Analyze | altında "Alan" kutusunu işaretleyin Ölçümleri Ayarlayın.
- Yara uzunluğunu ölçün
- Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
- Yaranın bir tarafındaki yaralanmamış dokunun son saç folikülünden başlayarak yaranın diğer tarafındaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülüne ölçüm yapılır(Şekil 4A,B).
- Bu iki simgesel yapıya ulaşmak için dermo-epidermal kavşak boyunca iz. Epidermis yaranın tamamını kaplamıyorsa, yaranın bir tarafındaki dermo-epidermal kavşağı takip edin ve göç eden dilin bittiği yerde granülasyon dokusunun üstün yönünü veya göçmen dile ulaşana kadar granülasyon dokusu ile kabuk arasındaki kavşak ve son olarak diğer taraftaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülünü takip edin(Şekil 4E,F).
- Analiz altında, Ölçü'yetıklayın. Ölçümün uzunluğu, ölçekte ayarlanan birimlerde görünür.
- Ölçümleri izlemek için bir elektronik tablo oluşturun (Ek Tablo 1).
- Yara uzunluğunu elektronik tabloya kopyalayın.
- Epidermal uzunluğu ölçün
- Eğer epidermis yaranın tamamını kapsıyorsa, epidermal uzunluk yara uzunluğuyla aynıdır.
- "Yara uzunluğu" ölçüsünü Excel elektronik tablosundaki "epidermal uzunluk" sütununa kopyalayın ve 11.5 adıma atlayın.
- Epidermis yaranın tamamını kaplamazsa, "Freehand seçimleri" seçeneğini seçin ve granülasyon dokusunun üstün yönünü veya granülasyon dokusu ile ilk saç folikülüne giden kabuk arasındaki kavşağı izleyen her epidermal öncü kenar arasındaki mesafeyi ölçün(Şekil 4C,D).
- Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
- Bu ölçümü yara uzunluğundan çıkarın ve Excel elektronik tablosundaki "epidermal uzunluk" altındaki sayıyı kaydedin.
- Eğer epidermis yaranın tamamını kapsıyorsa, epidermal uzunluk yara uzunluğuyla aynıdır.
- Yara alanını ölçün
- Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
- Yaranın bir tarafındaki yaralanmamış dokunun son saç folikülünden başlayarak yaranın diğer tarafındaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülüne kadar ölçüt(Şekil 4A,B,E,F).
- Yara tamamen epidermis ile kaplı değilse epidermisin üstün yönü boyunca iz (kabuk içermez) veya granülasyon dokusunun üstün yönü.
- Karşı saç folikülüne ulaşıldıktan ve yağ dokusu veya kas ulaşılıncaya kadar, saç folikülü boyunca granülasyon dokusuna dikey olarak iz sürmeye devam edin. Granülasyon dokusunun alt sınırını yaranın karşı tarafına doğru takip edin ve alanı kapatmak için saç folikülü boyunca başlangıç noktasına katılın(Şekil 4E,F).
- Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
- Yara alanını "ölçülen yara alanı" altında elektronik tabloya kopyalayın.
- Epidermal alanı ölçün
- Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
- Yara tamamen epitelize ise:
- Karşı saç folikülüne ulaşılıncaya kadar epidermisin üstün yönü boyunca iz ve epidermis ve dermis arasındaki dermo-epidermal kavşağı takip eden başlangıç noktasına "geri dönerek" alanı tamamlamak(Şekil 4D).
- Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
- Epidermal alanı "ölçülen epidermal alan" altında Excel elektronik tablosuna kopyalayın ve adım 11.7'ye atlayın.
- Yara tam olarak epitelize edilmezse:
- Epidermisin üstün yönü boyunca önden gelene kadar iz ve dermo-epidermal kavşaktaki başlangıç noktasına geri dönün (Şekil 4C).
- Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
- Yaranın karşı tarafında 11.6.3.1 ve 11.6.3.2 adımını tekrarlayın.
- Analiz altında Ölçü'ye tıklayın.
- 11.6.3.2 ve 11.6.3.4 adımlarında elde edilen iki sayıyı özetleyin ve sonucu elektronik tabloda "ölçülen epidermal alan" altında girin.
- Her40 bölüm (her8 slayt) üzerinde 11,3 ila 11,6 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm yaranın epidermal bölgesini hesaplayın.
- Elektronik tabloda "epidermal alan hesaplanmış" yanında "epidermal uzunluk" yanında yeni bir sütun oluşturun.
- "Epidermal uzunluk" sayısını, sonuncusu (7 μm kalınlığında bölüm x 40 kesit) hariç her bir bölüm için 280 ile çarpın.
- "Epidermal uzunluk" sayısını son bölüm için 7 ile çarpın (bölümün kalınlığı).
- Tüm yaranın epidermal alanını elde etmek için her bir bölüm için hesaplanan "epidermal alanın" değerini özetleyin.
- Tüm yaranın yara alanını hesapla.
- Yara uzunluğu ölçümlerini kullanarak 11.8.1 ile 11.8.4 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm yaranın epidermal hacmini hesaplayın.
- "Epidermal alan ölçülen" ölçümleri kullanarak 11.8.1 ile 11.8.4 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm yaranın yara hacmini hesapla.
- "Yara alanı ölçülen" ölçümleri kullanarak 11.8.1 ile 11.8.4 adımlarını tekrarlayın.
- Yaradaki epidermal hacim yüzdesini hesaplayın.
- Toplam epidermal hacmi toplam yara hacmine bölün ve yüzdeyi elde etmek için 100 ile çarpın (her bölüm için bu oranı yapmayın).
- Yara alanı arasındaki epidermal alanın yüzdesini hesaplayın.
- Toplam epidermal alanı toplam yara alanına bölün ve yüzdeyi elde etmek için 100 ile çarpın. Eğer bir yara tamamen epitelize edilmişse, bu sayı 100 olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 5, birden fazla cerrah tarafından farklı fare suşlarında üretilen ve farklı bireyler tarafından analiz edilen yabani tip yaralar üzerinde morfometrik analiz ler yaparak elde edilen ölçülen ve hesaplanan değerlerdeki aralığı gösterir. Farklı suşlardan gelen yabani fareler hem çalışmalarımızda hem de literatürde açıklandığı gibi istatistiksel farklılıklar gösterebilir9,10. Bu temsili sonuçlara dayanarak, bir çalışmada, sadece bir türden farelerin kullanılmasını öneriyoruz. Her ne kadar aynı bireyin belirli bir çalışma daki tüm yaraları yapmasını önersek de, 0. Son olarak, bu protokolde açıklanan morfometrik analiz kapsamlı olabileceğinden, birden çok kişi aynı deneyin parçalarını analiz edebilir, ancak iki örnek üzerinde yaptıkları analizin sonuçları birbirinin %5'i içindeyse. Ancak, önyargı önlemek için kör bir şekilde yaraları analiz tek bir bireyin olması tercih edilir.
Şekil 6, buçalışmada açıklanan protokolü izleyerek elde edilen yara ölçümlerini yaranın "orta" ve çevresindeki 40 bölümden elde edilen ölçümlerle karşılaştıran bir meta-analiz gösterir. Şekil 6A'daepidermal alan ve yara alanı, yara kesitlerinde epidermal ve yara uzunluklarının ölçülmesi sonucu yara alanı arasındaki epidermal alanın yüzdesinin hesaplanmasından (bazen "kapanma yüzdesi" veya "epitelizasyon yüzdesi" olarak da adlandırılır) hesaplanmıştır. Benzer şekilde, Şekil 6B'de,yaradaki epidermisin yüzdesi, yara hacmine (ölçülen yara bölgesinden hesaplanan) epidermal hacim oranı olarak elde edilmiştir (ölçülen yara bölgesinden hesaplanır). Her iki parametre için de, tüm yaranın analizi gruplar arasında güçlü istatistiksel farklılıklar gösterdi (Tek yönlü Anova'dan sonra P < 0.001'e kadar). Ancak, tek yönlü Anova'dan sonra 0.01'e kadar olan önem, aradaki sadece 40 bölüm analiz edildiğinde azaltıldı . Bu sonuçlar, yaranın sadece bir alt kümesi analiz edildiğinde anlam düzeyinde bir azalma olduğunu göstermektedir. Bu veriler, küçük bir etki boyutuna sahip kusurların büyük olasılıkla sadece yaranın tamamıüzerinde morfometrik analiz yaparken tespit edilmeyeceğini ve daha hafif yara iyileşmesi fenotiplerinin "yaranın ortası" analizinden kaçacağını göstermektedir.
In vivo yara iyileşmesini analiz etmek için yaygın bir uygulama yara nın bir yerde seçilen histolojik kesitlerinde yaranın alanının ölçülmesidir12. Bunu göz önünde bulundurarak, tüm yaraların seri bölümlerinden ölçülen yara alanının ortalaması orta alt küme bölümlerinden elde edilenile karşılaştırıldı. Sonuçlar, deney grupları ile analiz yöntemi arasında anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir(Şekil 6C). Ancak, mevcut protokol yara hacmini hesaplamak için tüm yara üzerinde ölçülen alanı (Şekil 6C'degösterilmiştir) kullanır. Şekil 6D'degösterildiği gibi, hesaplanan yara hacmi (sadece yaranın tamamının analizi ile hesaplanabilir) deney grupları arasında anlamlı olarak farklıdır. Özetle, bu temsili sonuçlar, daha geleneksel bir yara iyileşme analizi kullanılarak gözden kaçırılmış olabilecek fenotipleri saptamak için bu protokolde tanımlanan yara iyileşme parametrelerinin derinlemesine histolojik analizinin önemini göstermektedir.
Şekil 1: Bilateral eksizyonel yara işlemi. (A) Cerrahi bölgeden saç kırpma ve tıraş tan sonra farenin temsili fotoğrafı. (B) Sırt orta hattı boyunca kürek kemikleri arasında sıkışmış deri. (C) Fare, yassı bir şekilde, deri kıvrımı ile yan yana yerleştirilmiştir. (D) Biyopsi yumruğu yerleşiminin gösterimi. (E) Delikli deri. (F) Gün 0'da iki çift yaralı olan fare ve beyaz oklarda belirtildiği gibi eksizlenmiş yumrubiyopsi kontrol dokuları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yara hasat prosedürü. (A-C) 4 gün(A),7 gün(B)ve 11 gün(C)sonrası 6 mm eksizyonel yaraların makroskopik fotoğrafları . (D-E) Neşter bir bıçakla, yaraları ve çevredeki yaralanmamış dokuyu içeren geniş bir dikdörtgen şeklinde kutanöz bir kesi yapıldı. (F) Deri altta yatan dokudan forceps ve makas ile salındı. (G) Hasat edilen çift taraflı yaraların temsili. (H) Noktalı beyaz çizgi bir yumruk biyopsisi kullanımından sonra hasat edilecek dokunun sınırını temsil eder (bu yöntem hasat edilen doku standart miktarda sağlar). (I) Noktalı beyaz çizgi histoloji için kesilmiş olacak doku sınırını temsil eder (dikdörtgen şekil daha kolay gömme sağlar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Süre (dakika) | Sıcaklık (Santigrat) | Basınç (kPa) |
| %80 ETOH | 30 | Rt | Yok |
| %95 ETOH | 30 | Rt | Yok |
| %100 ETOH | 30 | Rt | Yok |
| Ksilen | 30 | Rt | Yok |
| Ksilen | 30 | Rt | Yok |
| Parafin | 30 | 60 | 20 |
| Parafin | 30 | 60 | 20 |
Tablo 1: Parafin katıştırma için örnek işleme prosedürü. RT = oda sıcaklığı. N/A = geçerli değildir.
Şekil 3: Yara gömme ve kesit. (A) Parafin işlenmiş yara bir katışma kalıbında düz yatıyor. (B) Yara, katıştırma için kalıbın yatay yüzeyinden 90° (ayakta) olarak tutulmuştu. (C) Parafin gömülü yara düzgün kesit için odaklı (D) Mikrotome monte parafin blok beyaz parantez tarafından belirtildiği gibi 5 bölümlük artışlarla kesilmiş yaklaşık 20bölümlükşeritler halinde kesildi . (F) Sıcak su banyosunda (40-45 °C) düz olarak döşenmiş seri kesitler mikroskop kayması üzerine monte edilmiştir. Karikatür(A-C)yara (turuncu) deride temsil (mavi) epidermisin uygun yönünü ile (e) ve dermis (d) her adım için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yaraların histolojik özellikleri ve morfometrik parametrelerin illüstrasyonu. (A, B) Histolojik özellikleri bir gün 4 (A) ve bir gün 7 (B) 6 mm yara. (C-F) Kantitatif morfometrik analizi gerçekleştirmek için kullanılan farklı ölçümlerin gösterimi: epidermisin uzunluğu(C, D, noktalı siyah çizgi), epidermisin ölçülen alanı (C, D, sarı gölgeli alan), yaranın uzunluğu(E, F, noktalı sarı çizgi) ve tüm yaranın ölçülen alanı(E, F, gri gölgeli alan). HF = saç folikülü; ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Temsili 6 mm yabani tip yaraların morfometrik özellikleri 4. Dağınık araziler, farklı cerrahlar tarafından farklı fare suşlarında üretilen ve farklı kişiler tarafından analiz edilen 6 mm'lik yabani tip yaraların morfometrik analizlerinden elde edilen verileri temsil eder. (A) yara hacmi, (B) epidermal hacim, (C) yaradaki epidermisin yüzdesi, (D) yara alanı (hesaplanmış), (E) epidermal alan (hesaplanmış) ve (F)yara alanı arasındaki epidermal alanın yüzdesi morfometrik değerlerdeki değişim aralığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Tüm yaradan elde edilen parametreleri yaranın ortası ile karşılaştıran meta-analiz, daha yüksek öneme sahip yeni defektleri tanımlar. Yara iyileşmesi morfometrisi, salin (kontrol), büyüme faktörü beta 3 (Tgfb3), Tgfb3'ü nötralize antikor (Tgfb3 + NAB) ile dönüştüren ve tek başına antikoru nötralize eden 7.gün yaralarda (NAB) uygulandı. Seri kesitli yaralar ("bütün") veya yaranın ortasından 40 bölüm ("orta") ölçümler yapıldı ve yara alanı(A),yaradaki epidermisin yüzdesi(B),yara hacmi(D)üzerinde epidermal alanın yüzdesini hesaplamak için kullanıldı. (C) yaranın tam veya ortası üzerinde ölçülen yara alanının ortalamasını temsil eder. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, ns = önemli değil, Tek yönlü Anova). Bu rakam Le ve ark.11'denalınan veriler kullanılarak değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Morfometrik ölçümleri kaydetmek için bir elektronik tablo örneği. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İki taraflı eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin birçok farklı yönünü incelemek için kullanılabilecek son derece özelleştirilebilir bir işlemdir. Bir yara iyileştirme projesi başlamadan önce, araştırmacılar belirli bir etki boyutu nda bir kusur tespit etmek için gerekli yaraların sayısını belirlemek için bir güç analizi yapmak gerekir. Literatürde tek tek farelerin veya yaraların biyolojik kopya olarak kullanılıp kullanılmadığı konusunda tutarsızlıklar mevcut, ancak yeni yapılan bir çalışma, tek bir hayvanda bulunan iki yara arasında anlamlı bir ilişki olmadığını göstermiştir4. Bu, tek bir hayvanDan gelen yaraların birbirinden bağımsız olduğunu ve biyolojik kopyalar olarak kabul edilebildiği, bir kusuru tespit etmek için gereken fare sayısını azalttığını göstermektedir. Bu, yüksek sayıda yaranın öneme ulaşması için gerekli olan küçük etki boyutları göz önüne alındığında önemlidir4. Buna ek olarak, güç hesaplama sonuçları her hayvan üzerinde kaç yara yapılır etkileyebilir, hayvan başına 2 ve 4 yara en yaygın olan.
Cerrahi protokolün kendisi de son derece esnektir. Kısa işlem uzunluğu ve hızlı iyileşme (fare başına 10-15 dk) nedeniyle izofluran buharlaştırıcı ile anestezi önerirken, buharlaştırıcıya erişimi olmayan araştırmacılar ketamin/ksilazin veya pentobarbital dahil olmak üzere enjekte edilebilir anestezi kullanabilirler. Yara iyileşmesinin inflamatuar evreleri ile ilgili olarak uygun bir analjezik seçimi özellikle önemlidir. Flunixin meglumine veya Meloxicam gibi steroid olmayan anti-inflamatuar ilaçların (NSAIDS) kullanımı inflamasyonu azaltabilir gibi dikkatli kullanılmalıdır. Bu nedenle, inflamasyonun araştırıldığı çalışmalarda opioidler tercih edilmektedir. 48 saate kadar analjezi sağlayan ve tekrarlanan ek dozlara olan ihtiyacı ortadan kaldıran analjezikleri (örn. Buprenorfin Sürekli Salınımı) öneririz. Tüm cerrahi prosedürler federal kurallara uygun olarak yürütülmelidir ve onaylanmış bir hayvan protokolü ile desteklenmelidir.
Yara iyileşmesi, her biri farklı hücre tiplerini içeren farklı biyolojik süreçler le karakterize edilen çeşitli evreleri kapsayan bir süreçtir3. İnflamatuar faz 0 ve 5 arasında, polimorfonükleer nötrofillerin erken göç ile oluşur (PMN) ve makrofajlar yaralanma sitesine13. Proliferatif faz 3 ile 14 gün arasında gerçekleşir ve yaranın büyüklüğüne göre değişen bir zaman dilimi ni dikkate alarak yeniden epitelizasyon14. Bu protokolde 6 mm biyopsi yapıldı ve yaraların çoğu 7 gün tekrar epitelize edildi. Ancak, daha küçük yumruklar kullanılırsa bu zaman diliminin kısaltılması gerekir (bunlar 1 mm kadar küçüktür). Daha önceki zaman noktaları ile birlikte, bu küçük yaralar histolojik analizmiktarını azaltmak için tercih edilebilir15. Son olarak, remodeling ve olgunlaşma aşamaları 7 gün sonra ve yaralanma16aşağıdaki bir yıl kadar oluşur. Bu daha sonraki zaman noktaları yaranın olgunlaşmasını araştırmak veya deneysel hayvanlarda yara iyileşme gecikmelerini araştırmak için gerekli olabilir. Bu nedenle, araştırmacı kendi özel hipotez5dayalı yara iyileşmesi belirli aşamaları araştırmak için gerekli kritik zaman noktaları belirlemek gerekir .
Yara iyileşmesinin analizi genellikle histolojik analizlerle sınırlı değildir. Lekesiz parafin bölümleri immünoresans veya Masson'un kollajen birikimi için trikromu gibi ek analizler için kullanılabilir. Kontrol dokusunun (punch biyopsileri) işlenmesi ve dokunun hasat basamaklarının tümü histolojik analizlere ek olarak yara iyileşmesinin nasıl değerlendirileceğine bağlıdır. Cerrahi protokol kapsamında eksizyonel yaraoluşturmak için punch biyopsileri çıkarılır. Bu yumruklar protein (batı veya sitokin profilleme için), DNA veya RNA ekstraksiyonu gibi downstream uygulamaları için yaralanmamış kontrol dokusu olarak hizmet verebilir ve buna göre işlenmelidir. Özellikle deride yaralanmadan önce tedavi edildiği durumlarda histolojik analiz için en az bir yumruğun kaydedilmesi önerilir (örneğin, Cre-Lox rekombinasyon17indüksiyonu için tamoksifen uygulaması). Yumruğun incelenmesi tedavinin kutanöz morfoloji üzerindeki etkisini belirleyebilir veya sadece kullanılan fare modelinin temel kutanöz morfolojisinin değerlendirilmesini sağlayabilir. Histolojide kullanılmayan yaralar, yaranın boyutunu kapsayan bir yumruk biyopsisi ile hasat edilebilir. Bu işlem, yara boyutune bakılmaksızın aynı miktarda dokunun hasat dahil olmak üzere birkaç avantajı vardır (büyük yaralar daha az çevreleyen sağlıklı doku var). Son olarak, %4'lük paraformaldehitin fiksatif ve parafin olarak kullanılmasını dokuların korunması ve gömülmesinde kullanılan malzeme olarak tanımlıyoruz. Diğer fiksatifler bazı uygulamalar için gerekli olabilir ve (örneğin, Carnoy veya Bouin's fiksatifler) değiştirilebilir. En iyi immünofloresan boyama için, donma ve Optimal Kesme Sıcaklığı bileşik içinde yara gömme ve dondurulmuş kesit takip tercih edilen yöntem kalır.
Yaralı doku kesiti birçok zorluklar, özellikle gün 4 yaralar kabuk varlığı nedeniyle ortaya çıkabilir. Yüksek kaliteli bölümler oluşturmak için, mikrotomun tüm parçalarının sıkıca sabitlendiğini, blok tutucunun ilk konumuna geri çekilip, bıçak tutucunun 0 ile 10° arasında ayarlendiğini ve bıçağın sıkıca bağlanıp aşırı sıkılaştırılmadığını doğrulamaları önerilir. Parafin bloğu soğutulmuş olmasına rağmen, doku hala parçalanabilir. Parçalama devam ederse, bir buz parçası hala monte ederken 5 dakika boyunca blok üzerine yerleştirilebilir. Kesit başladıktan sonra, parafin kesitlerinin kaybını önlemek için mikrotomdan blokenin çıkarılmasını önlememiz önerilir. Kayıp parafin bölümlerinin hem numaralarını hem de seri bölümlerindeki sıralamalarını kaydetmek zorunludur. Bu morfometrik analizi etkileyecek ve dikkate alınması gereken. Kesit başlandıktan sonra, lekesiz kesitlerde yaralı dokunun belirlenmesi zor olabilir, özellikle histoloji aşina değilse. Şüpheye düştüğünüzde, konservatif olması ve doku içeren tüm bölümleri tutmak önerilir. Histolojik leke yapıldıktan sonra doku organizasyonu daha belirgin ve yara daha belirgin olacaktır. Bazen, saç folikülleri açıkça görülebilir veya yara kenarından uzak olabilir. Bu durumda, yaralı dokunun diğer temel özellikleri epidermal kalınlıkta ani bir artış ve bağ dokusunun organizasyonunda ani değişiklikler de dahil olmak üzere yaranın sınırlarını belirlemek için kullanılabilir(Şekil 4A-B).
Dijital görüntüleme morfometrik analizde kritik bir adımdır. Morfometrik analiz, tekrarlanan ölçümleri önlemek için her görüntüde bir dönüm noktası kullanılarak tek tek görüntüler üzerinde yapılmalıdır. Ancak, dijital yazılım kullanarak tüm çerçeveleri bir araya getirmek ve tek bir görüntü üzerinde analiz yapmak mümkündür. Bu ilk başta daha kolay gibi görünse de, büyük bir görüntünün manipülasyonu analiz işlemini yavaşlatabilir. Bölümün seçimi de analiz için önemlidir. Her8 slaytın üst bölümünü dijital olarak edinmenizi önersek de, bölümün kalitesine öncelik verilmeli ve slayttaki 5 bölümün en iyisi görüntülenmelidir. Küçük kıvrımlı kesitler, kıvrımın alanı/uzunluğu tahmin edilerek analiz edilebilir. Söz konusu bölümün sayısı hem dijital dosyaya hem de Excel elektronik tablosuna kaydedilmelidir, ancak önceki ve bir sonraki çözümlenen bölüm arasındaki mesafe buna göre ayarlanabilir.
Kutanöz yaralar yılda 25 milyar doların üzerinde maliyeti olan tedavi ile tahmini 6.5 milyon kişi etkiler18 ve diyabet ve obezite de dahil olmak üzere diğer birçok sağlık endişeleri ikincil olmanın yanı sıra cerrahi prosedürlerin doğal bir bileşenidir. Fare, genellikle insan bozukluğuna göre ince bir fenotip sergilemesine rağmen, genomunu manipüle etme kolaylığı nedeniyle insan hastalıklarını incelemek için uygun bir model olarak kullanılmıştır. Bu protokolde açıklanan bilateral eksizyonel yara modeli ve sonraki morfometrik analizler, doğal olarak karmaşık bir yara iyileşme sürecinde küçük kusurları tespit etmedeki zorluğu giderme becerisi nedeniyle önemlidir19. Daha fazla hassasiyeti ve değişkenliği azaldığı için, bu protokol aynı deneysel hassasiyeti elde etmek için daha az hayvan kullanma fırsatı sağlar. Protokol son derece özelleştirilebilir ve doku onarımı tüm aşamalarında çalışmak için kullanılabilir. Doku biyonotipik karakterizasyonu ile birlikte ayrıntılı histolojik morfometrik analiz doku onarımı modüle kritik faktörlerin anlaşılması için gerekli bilgi artırmak için büyük bir potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Dunnwald Laboratuarı'nın yıllar boyunca bu protokolün optimizasyonuna katkıda bulunan tüm üyelerine ve yara analizi için seri kesit kullanımını teşvik etmedeki ısrarı yaratılmasını mümkün kılan Gina Schatteman'a minnettarız. Bu çalışma NIH/NIAMS'tan Martine Dunnwald'a (AR067739) yapılan fonla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
