Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man genererer bilaterale, fuld tykkelse excisional sår i mus, og hvordan man efterfølgende overvåge, høste, og forberede sår til morfometrisk analyse. Inkluderet er en dybdegående beskrivelse af, hvordan man bruger seriel histologiske sektioner til at definere, præcist kvantificere og detektere morfometriske defekter.
Abstract
Den murine excisional sår model er blevet brugt i udstrakt grad til at studere hver af de sekventielt overlappende faser af sårheling: betændelse, spredning og remodeling. Murine sår har en histologisk veldefineret og let genkendelig sårseng, over hvilken disse forskellige faser af helingsprocessen er målbare. Inden for feltet er det almindeligt at bruge en vilkårligt defineret "midten" af såret til histologiske analyser. Men sår er en tredimensionel enhed og ofte ikke histologisk symmetrisk, der understøtter behovet for en veldefineret og robust metode til kvantificering til at opdage morfometriske defekter med en lille effekt størrelse. I denne protokol beskriver vi proceduren for oprettelse af bilaterale, fuld-tykkelse excisional sår i mus samt en detaljeret instruktion om, hvordan man måler morfometriske parametre ved hjælp af et billedbehandlingsprogram på udvalgte serielle sektioner. De todimensionale målinger af sårlængde, epidermal længde, epidermalt område og sårområde anvendes i kombination med den kendte afstand mellem sektioner for at ekstrapolere det tredimensionale epidermale område, der dækker såret, det samlede sårområde, epidermal volumen og sårvolumen. Selv om denne detaljerede histologiske analyse er mere tid og ressourcekrævende end konventionelle analyser, dens stringens øger sandsynligheden for at opdage nye fænotyper i en i sagens natur kompleks sårheling proces.
Introduction
Kutan sårheling er en kompleks biologisk proces med sekventielt overlappende faser. Det kræver koordinering af cellulære og molekylære processer, der er tidsmæssigt og rumligt reguleret for at genoprette barrierefunktionen af det beskadigede epitel. I den første fase, betændelse, neutrofiler og makrofager migrere ind i såret, mobilisere lokale og systemiske forsvar1. Efter og overlappende den inflammatoriske fase er spredning fase. Fibroblaster begynder hurtigt prolifererende og migrerer ind i granulationsvævet. Keratinocytter væk fra forkant retningsbestemt formere sig mod såret som differentierede keratinocytter i den forreste kant migrere til re-epithelialize såret2. Endelig begynder remodeling og modningsfasen, hvor fibroblaster i granulationsvævet begynder at syntetisere og deponere kollagen. Ombygningen og tilrettelæggelsen af den nye matrix kan vare op til 1 år efter skade3. På grund af kompleksiteten af overlappende begivenheder, der involverer krydstale mellem flere celletyper, og på trods af mange års forskning, er mange af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for sårheling, stadig dårligt forstået.
Musemodellen er den fremherskende pattedyrmodel til undersøgelse af mekanismer til sårheling på grund af deres brugervenlighed, relativt lave omkostninger og genetisk manipulbilitet1,4,5. Selv om forskellige typer af sår er blevet beskrevet i murine model, den mest almindelige er en excisional sår (enten bilaterale punch eller direkte punch biopsi), efterfulgt af incisional sår modeller4. Den excisional sår model har en klar fordel i forhold til den incisionelle model, da det i sagens natur genererer kontrolvæv, der ikke har gennemgået helingsprocessen. Punch biopsi væv, der er fjernet som en del af den kirurgiske protokol kan behandles på samme måde som de sårede væv og bruges til at etablere de hjemlige betingelser for et ønsket kriterium. Punkterede kontrolvæv kan også være nyttigt , hvis man vurderer virkningerne af en hudforbehandling eller bekræfter en vellykket genændring påskadestidstids gang 4.
Helbredende parametre kan vurderes ved mange forskellige teknikker, herunder planimetri eller histologi. Men planimetri kan kun vurdere synlige egenskaber af såret, og på grund af tilstedeværelsen af en skurv, ofte ikke korrelerer med målinger af healing, der visualiseres ved histologi, hvilket gør histologi den "guld standard" af analyse4. På trods af histologisk analyse er guldstandarden, er det oftest udføres på en vilkårlig delmængde af såret6,7. For eksempel, skære såret i "halv" før indlejring og sektionsskæring såret er i øjeblikket almindelig praksis for at reducere den tid og ressourcer brugt på at dele materialer og dataanalyse. Den metode til morfometrisk analyse, der er beskrevet i denne protokol, er udviklet til at omfatte hele sårvævet, for præcist at afspejle sårets morfologiske egenskaber og for at øge sandsynligheden for at opdage sårhelingsdefekter med en lille effektstørrelse. I denne protokol beskriver vi en kirurgisk metode til at generere det mest almindeligt undersøgte murine sår, det bilaterale excisionalsår med fuld tykkelse samt en detaljeret og stringent metode til histologisk analyse, som sjældent anvendes i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev afsluttet i overensstemmelse og overholdelse af føderale regler og University of Iowa politik og procedurer er blevet godkendt af University of Iowa IACUC.
1. Dyr og husdyrhold
- Brug voksne mus af den ønskede muselinje ved 8-10 uger, når hårsækken fase er i telogen.
- På dagen for operationen, adskille mus i rene bure og individuelt hus for at minimere sår forstyrrelser.
2. Kirurgi
BEMÆRK: Det er unødvendigt at opretholde sterile kirurgiske tilstande. Mens man bør passe på at opretholde sterilitet mellem dyr, punch biopsi selv sker på en ren, men nonsterile overflade. Operationen varighed per dyr er mellem 10 og 15 min.
- Bedøvelse
- Bedøve dyret i 1-2 min i en induktion kammer med isoflurane vaporizer sat til en 4-5% strømningshastighed og ilt flow meter sat til 1 liter i minuttet. Se Diskussion for alternative anæstesi muligheder.
- Bekræft korrekt bedøvelse, før du begynder proceduren. Dybden af anæstesi kan bekræftes af en fast tå knivspids.
- Overfør musen fra induktionsbeholderen til en næsekeve og reducer isofluranstrømningshastigheden til 1,5% og iltstrømsmåleren til 0,5 L/min.
- Påfør oftalmologiske salve til begge øjne, da proceduren overstiger 5 min.
- Bevar normal kropstemperatur ved hjælp af en termisk pude.
- Forberedelse af sårstedet
- Brug en elektrisk barbermaskine clipper i en caudal rostral bevægelse for at fjerne pelsen på bagsiden af musen på skulderniveau. Fjern hår lavere på bagsiden efter behov, hvis der udfører mere end to sår.
- Fjern det resterende hår ved hjælp af et barberblad i en rostral halebevægelse, der holdes ved 20° fra bagsiden af musen for nøje at barbere det klippede område (Figur 1A).
- Rengør det barberede område med en povidone-jodpodning.
- Tør huden af med en steril 70% isopropylalkohol prep pad for at reducere potentiel kutan irritation fra jodpoden.
- Såret
- Klem huden mellem skulderbladene langs den dorsale midterlinje og træk den klemte hudfold væk fra kroppen (Figur 1B).
- Placer musen på siden med skinfolden på en flad overflade draperet med et rent papirbaseret håndklæde eller tilsvarende. Brug et ark tandvoks under håndklædet til at beskytte den underliggende overflade mod skader (Figur 1C).
- Placer biopsi punch af ønskede størrelse så tæt på kroppen som muligt og lad huden til at slappe af. Stræk ikke huden, eller sårstørrelsen vil være større end den angivne slagstørrelse (Figur 1D).
- Punch huden ved at trykke ned, kan en vuggende bevægelse bruges til at sikre, at alle lag af huden på begge sider er blevet trængt(Figur 1E). Brug en ny biopsi punch for hvert dyr.
- Fjern punch biopsier fra sårene (Figur 1F). Hvis der stadig er steder af vedhæftet fil bruge sterile saks og pincet til at frigøre punch fra den omgivende hud. Betak punch biopsi kontrol væv som krævet baseret på downstream planer for sårheling analyser (se Diskussion for forslag).
- Tag makroskopiske fotografier fra en lige stor afstand til sårsteder eller med en lineal i rammen for at måle det oprindelige sårområde og fjerne afvigende værdier fra analysen.
- Analgesi administreres i mindst 24 timer i overensstemmelse med en godkendt dyreprotokol. For eksempel: Buprenorphin SR-LAB, injiceres som en enkelt dosis subkutant ved 0,5-2 mg/kg for 48 timers smertelindring (se Diskussion for alternative forslag og overvejelser).
- Overvåg musen, da det kommer ud af anæstesi, indtil den opretholder en opretstående kropsholdning og går normalt rundt i buret.
3. Overvågning efter sår
- Monitorer mus dagligt for eksperimentelle endepunkter som bestemt af investigator og i overensstemmelse og overholdelse af institutionelle protokoller. Som eksempler kan nævnes: infektion, synligt vægttab, eller en pukkel kropsholdning.
- Tag daglige makroskopiske fotografier på en kontrolleret måde, som det blev gjort efter den første operation.
4. Høst sår
- Aflive mus på det ønskede tidspunkt efter såret i overensstemmelse med en godkendt dyreprotokol.
- Tag makroskopiske fotografier af sårsteder på en kontrolleret måde i overensstemmelse med tidligere fotografi erhvervelse (Figur 2A, C).
- Skær et bredt rektangel omkring sårsteder ved hjælp af en skalpel(Figur 2D,E).
- Frigør det rektangulære stykke væv ved hjælp af en saks og pincet til at skrælle tilbage og skære huden væk fra det underliggende væv(figur 2F). Placer i en petriskål(Figur 2G).
- Høst sårene. Trim ned til 2 mm affærdiget væv omkring alle sider af såret i rektangulær form (Figur 2H,I). Se Diskussion for alternative muligheder for at høste såret.
- Beting sårene som krævet til efterfølgende undersøgelser. Reserver mindst ét sår pr. mus til indlejring af paraffin og histologisk analyse.
5. Sårfiksering og indlejring
- Fastgør såret
- Sårvævet fastgøres i en frisklavet 4% paraformaldehydopløsning8 i 3 timer ved stuetemperatur og overfør derefter til 4 °C natten over. Elektronmikroskopi (EM) klasseparaformaldehyd og opløsningsfiltrering er ikke påkrævet.
- Vask sårene to gange i 30 min i 1x PBS.
- PBS erstat med 70% ETOH, og opbevar ved 4 °C, indtil indlejringen. Proces væv inden for 24-48 h for at undgå antigen tab eller inden for 1-2 uger, hvis kun evaluere histologiske egenskaber.
- Bearbejde og integrere såret
- Overfør hvert sår til en indlejring kassette. Label indlejring kassetter med blyant som processen vil fjerne blæk.
- Bearbejde vævet enten manuelt eller ved hjælp af en automatiseret processor ved at dehydrere vævet med stigende ethanolprocenter, rydde med xylen og derefter infiltrere vævet med paraffin (tabel 1).
- Sæv 90° ("stående") fastbeskændes fra den vandrette overflade af indlejringsformen (Figur 3A,B).
6. Dag 0 sår område analyse
- Download NIH-Image J eller NIH-Fiji gratis software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Åbn en fil med et fotografi af dag 0 sår.
- Markér afkrydsningsfeltet for "Område" under | Angiv målinger.
- Vælg "Angiv skalering" under Analysér. Angiv afstanden i pixel, den kendte tilsvarende afstand og afstandens enhed (= længdeenhed), hvis makroskopiske målinger er en del af undersøgelsen eller springe dette trin over, hvis der kun kræves relative målinger.
- Vælg "Frihåndsvalg" på værktøjslinjen i Fiji.
- Skitsere omkredsen af såret.
- Klik på Målér under Analysér.
- Opret et regneark for at holde styr på målingerne pr. dyr pr. sår.
- Kopier målingen af sårområdet i regnearket.
- Beregne middelområdet og standardafvigelsen for alle sår for et givet eksperiment.
- Udeluk eventuelle sår uden for to standardafvigelser af middelt navn fra histologisk analyse.
7. Seriel sektion
- Paraffinindreduceret sårblokkene afkøles ved 4 °C natten over.
- Sæt paraffinblokken på mikrotomens blokholder og orienterer, så klingen skærer lige over blokken. Vend blokken således, at vævet "står" ved 90° så samtidig trækning af epidermis og dermis (Figur 3C, D).
- Lav 2-4 bånd af 20-30 paraffin sektioner af 7 μm hver.
- Brug en tør pensel og en dissektion drilleri nål til at overføre hvert bånd til en fast endnu manipulerelig overflade såsom en fast sort plastfolie.
- Afbryd den øverste del af hvert bånd med et barberblad og placer på et mikroskop dias.
- Overhold de uindgroede sektioner under et brightfield mikroskop for at afgøre, hvilke der indeholder såret væv, som kan identificeres ved fravær af hårsækken, ændringer i udseendet af bindevævet eller epidermis, og / eller tilstedeværelsen af en skurv (Figur 4A, B).
- Udsmid udulerede sektioner op til 20 sektioner før sårets begyndelse.
- Afsnittet gennem såret ved at gentage trin 7.3 og 7.4, indtil der ikke opdages sår i ubesyede sektioner.
8. Montering af paraffinsektioner
- Adskå paraffinsektioner hver 5 sektioner med et barberblad, begyndende med det første bånd (Figur 3E).
- Etiketmikroskop slides med både diasnummeret og alle sektionsnumrene.
- Grib gruppen af 5 sektioner med en våd pensel og flyde dem på overfladen af vandet i et varmt vandbad (40-45 °C) for at flade dem ud.
- Gruppen af 5 sektioner ud af vandbadet plukkes ved hjælp af et af de mærkede mikroskoprutsjebaner (Figur 3F), og den på et objektvarmer, der er indstillet til 37 °C i op til 24 timer.
- Gem slides direkte i en slideboks.
9. Histologisk farvning
- Overfør hver 8th mikroskop dias (svarende til hver 40th paraffin sektion) til en farvning rack og plet med hematoxylin og eosin.
10. Mikroskopisk billeddannelse
- Ind erhverve billeder ved hjælp af en lys felt mikroskop udstyret med en 4x objektiv og digital erhvervelse kapaciteter. Optag den skala, som billedet tages med.
- Billede hele såret af den øverste del af hver plettet dias og sørg for at medtage nogle afviklet væv på begge sider. Tag flere overlappende billeder, hvis såret er større end rammen for et enkelt billede.
- Gem filen, herunder sektionsnummeret til morfometrisk analyse. Brug sektionsnummeret efterfulgt af a, b, c osv.
11. Morfometrisk analyse
BEMÆRK: Når såret strækker sig over flere billeder, skal du opsummere målingerne fra de enkelte billeder for at opnå én værdi pr. metrisk pr. sårsektion, der skal registreres i regnearket.
- Åbn en digital fil med et farvet sårbillede i Billede J. Brug ikke syede billeder til analyse. Udfør målinger på zoomede overlappende billeder ved at finde landemærker til at udelade og afhente målinger fra billede til billede.
- Angiv skalerings- og måleindstillingerne.
- Vælg "Angiv skalering" under Analysér. Angiv afstanden i pixel, den kendte tilsvarende afstand og afstandens enhed (= længdeenhed). Skalaen skal vises i vinduet og skal svare til den skala, billedet blev anskaffet på.
- Markér afkrydsningsfeltet "Global" for at holde skalaen den samme for hvert åbent billede.
- Gentag trin 11.2.1 til 11.2.2, hver gang Billede J lukkes og åbnes igen.
- Markér afkrydsningsfeltet for "Område" under | Angiv målinger.
- Mål sårlængden
- Vælg "Frihåndsvalg" på værktøjslinjen i Fiji.
- Mål fra den sidste hårsækken i det uskadte væv på den ene side af såret til den første hårsækken i det uskadte væv på den anden side af såret (Figur 4A,B).
- Spor langs dermo-epidermal krydset for at nå disse to vartegn. Hvis epidermis ikke dækker hele såret, følg dermo-epidermal krydset på den ene side af såret, og hvor den migrerende tungen ender fortsætte efter den overlegne aspekt af granulation væv eller krydset mellem granulation væv og skorpen, indtil du når den migrerende tungen og derefter endelig den første hårsækken af det uskadte væv på den anden side (Figur 4E,F).
- Klik på Målérunder Analysér. Længden af målingen vises i de samme enheder som angivet i skalaen.
- Opret et regneark for at holde styr på målingerne (supplerende tabel 1).
- Kopier sårlængden ind i regnearket.
- Mål den epidermale længde
- Hvis epidermis dækker hele såret, den epidermale længde er den samme som såret længde.
- Kopier målingen "sårlængde" i kolonnen "epidermal længde" i Excel-regnearket, og spring til trin 11.5.
- Hvis epidermis ikke dækker hele såret, skal du vælge " Frihåndsvalg " og måle afstanden mellem hver epidermal forkant eftergranulationsvævetsoverlegne aspekt eller krydset mellem granuleringsvævet og skurven til den første hårsækken (Figur 4C,D).
- Klik på Målérunder Analysér.
- Træk denne måling fra sårlængden, og bortset fra tallet under "epidermal længde" i Excel-regnearket.
- Hvis epidermis dækker hele såret, den epidermale længde er den samme som såret længde.
- Mål sårområdet
- Vælg "Frihåndsvalg" på værktøjslinjen i Fiji.
- Mål fra den sidste hårsækken i det uskadte væv på den ene side af såret til den første hårsækken i det uskadte væv på den anden side af såret (Figur 4A,B,E,F).
- Spor langs den overlegne aspekt af epidermis (omfatter ikke skurv) eller den overlegne aspekt af granulationsvæv, hvis såret ikke er fuldt dækket af epidermis.
- Fortsæt med at spore lodret langs hårsækken i granulering væv, når den modsatte hårsækken er nået, og indtil fedtvæv eller muskel er nået. Følg den ringere kant af granuleringsvævet på den modsatte side af såret og dig til startpunktet langs hårsækken for at lukke området (Figur 4E,F).
- Klik på Målérunder Analysér.
- Kopier sårområdet ind i regnearket under "sårområde målt.".
- Mål det epidermale område
- Vælg "Frihåndsvalg" på værktøjslinjen i Fiji.
- Hvis såret er fuldt epiteliseret:
- Spor langs den overlegne aspekt af epidermis, indtil den modsatte hårsækken er nået, og fuldføre området ved at "vende tilbage" til udgangspunktet efter dermo-epidermal krydset mellem epidermis og dermis (Figur 4D).
- Klik på Målérunder Analysér.
- Kopiér epidermalområdet til Excel-regnearket under "epidermalt område målt", og spring til trin 11.7.
- Hvis såret ikke er fuldt epiteliseret:
- Spor langs det overlegne aspekt af epidermis indtil forkant og vende tilbage til udgangspunktet efter dermo-epidermal krydset (Figur 4C).
- Klik på Målérunder Analysér.
- Trin 11.6.3.1 og 11.6.3.2 gentages på den modsatte side af såret.
- Klik på Målpunkt under Analysér.
- De to tal, der er opnået i trin 11.6.3.2 og 11.6.3.4, sammensmeltes, og ind i resultatet under "epidermalt område målt" i regnearket.
- Gentag trin 11.3 til 11.6 på hver40.
- Beregn det epidermale område af hele såret.
- Opret en ny kolonne i regnearket "epidermalt område beregnet" ud for "epidermal længde."
- Multiplicer tallet for "epidermal længde" med 280 for hver sektion undtagen den sidste (7 μm tyk sektion x 40 sektioner).
- Multiplicer tallet for "epidermal længde" med 7 for den sidste sektion (tykkelsen af sektionen).
- Summen af værdien af det "epidermale område beregnet" for hver sektion for at opnå det epidermale område af hele såret.
- Beregn sårområdet for hele såret.
- Trin 11.8.1 til 11.8.4 gentages ved hjælp af sårlængdemålingerne.
- Beregn det epidermale volumen af hele såret.
- Trin 11.8.1 til 11.8.4 gentages ved hjælp af målingerne "epidermalt område målt".
- Beregn sårvolumen af hele såret.
- Trin 11.8.1 til 11.8.4 gentages ved hjælp af målingerne "sårområde målt".
- Beregne procentdelen af epidermal volumen i såret.
- Divider det samlede epidermale volumen med det samlede sårvolumen og gang med 100 for at opnå procentdelen (gør ikke dette forhold for hver sektion).
- Beregne procentdelen af epidermal område blandt sårområdet.
- Divider det samlede epidermale areal med det samlede sårareal og gang med 100 for at opnå procentdelen. Hvis et sår er fuldt epiteliseret, bør dette tal være 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 viser det interval i målte og beregnede værdier, der opnås ved at udføre morfometrisk analyse af vilde sår, der genereres i forskellige musestammer af flere kirurger og analyseret af forskellige individer. Vilde mus fra forskellige stammer kan vise statistiske forskelle som beskrevet både i vores undersøgelser og i litteraturen9,10. Baseret på disse repræsentative resultater anbefaler vi, at der i en undersøgelse kun anvendes mus fra én stamme. Selv om vi anbefaler, at den samme person udføre alle de sår i en bestemt undersøgelse, flere personer kunne fungere som kirurger, så længe området af sårene på dag 0 er ikke statistisk forskellige mellem den enkeltes arbejde. Endelig, fordi den morfometriske analyse, der er beskrevet i denne protokol kan være omfattende, flere personer kunne analysere dele af det samme eksperiment, men kun hvis resultaterne af deres analyse af to prøver er inden for 5% af hinanden. Men det er at foretrække at have en enkelt person analysere sårene i en blindet måde for at undgå bias.
Figur 6 viser en metaanalyse, der sammenligner sårmålinger opnået ved at følge den protokol, der er beskrevet i dette studie11, med målinger fra sårets "midte" og 40 omgivende sektioner. I figur 6Ablev det epidermale område og sårarealet beregnet ud fra målingen af epidermale længder og sårlængder på sårsektioner efterfulgt af beregningen af procentdelen af det epidermale område mellem sårarealet (undertiden benævnt "afslutningsprocent" eller "epitelprocent"). Tilsvarende blev procentdelen af epidermis i såret i figur 6Bopnået som forholdet mellem det epidermale volumen (beregnet ud fra det målte epidermale område) over sårvolumenet (beregnet ud fra det målte sårområde). For begge parametre viste analysen af hele såret stærke statistiske forskelle mellem grupper (op til P < 0,001 efter One-way Anova). Men betydningen blev reduceret (op til P < 0,01 efter One-way Anova), når kun 40 sektioner i midten af ville blev analyseret. Disse resultater viser et fald i graden af betydning, når kun en delmængde af såret analyseres. Disse data tyder på, at defekter med en lille effekt størrelse sandsynligvis kun vil blive opdaget, når de udfører morfometrisk analyse på hele såret, og at mere mild sårheling fænotyper vil blive savnet fra en "midt i såret" type analyse.
Almindelig praksis for analyse af in vivo sårheling indebærer måling af området af såret på histologiske sektioner valgt et sted i såret12. Med det i tankerne blev gennemsnittet af det målte sårområde fra de serielle dele af hele sår sammenlignet med det, der blev opnået fra de midterste delmængdesektioner. Resultaterne viste ingen signifikant forskel mellem forsøgsgrupper og mellem analysemetoden (figur 6C). Den aktuelle protokol anvender imidlertid det målte område (vist i figur 6C) over hele såret til at beregne sårvolumenet. Som vist i figur 6Der den beregnede sårvolumen (som kun kan beregnes ved hjælp af analysen af hele såret) væsentligt forskellig fra forsøgsgrupperne. Sammenfattende viser disse repræsentative resultater betydningen af en dybtgående histologisk analyse af sårhelingsparametre, der er beskrevet i denne protokol, for at detektere fænotyper, der ellers ville være blevet overset ved hjælp af en mere traditionel sårhelingsanalyse.
Figur 1: Bilateral excisional sårprocedure. A) Repræsentativt fotografi af en mus efter klipning og barbering hår fra det kirurgiske område. (B) Huden klemt mellem skulderbladene langs den dorsale midterlinje. (C) Musen placeret på sin side med skinfold lagt fladt. d) Repræsentation af biopsipunchplaceringen. (E) Stanset skinfold. (F)Musen med to bilaterale sår på dag 0 og den punkterede punch biopsi kontrol væv som angivet af de hvide pile. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sårhøstelsesprocedure. (A-C) Makroskopiske fotografier af 6 mm eksskæresår efter 4 dage (A), 7 dage (B) og 11 dage (C). (D-E) Med en skalpel klinge, en kutan snit blev foretaget i form af et bredt rektangel, der omfatter sår og omgivende afviklet væv. (F)Huden blev frigivet fra underliggende væv med skrænt og saks. g) Repræsentation af høstede bilaterale sår. (H)Den stiplede hvide linje repræsenterer grænsen for det væv, der ville blive høstet efter brug af en punch biopsi (denne metode giver mulighed for standardiseret mængde af væv høstet). (I) Den stiplede hvide linje repræsenterer kanten af det væv, der ville blive trimmet til histologi (rektangulær form giver mulighed for lettere indlejring). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Tid (minutter) | Temperatur (Celsius) | Tryk (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | Nielsen |
| 95% ETOH | 30 | Rt | Nielsen |
| 100% ETOH | 30 | Rt | Nielsen |
| Xylen | 30 | Rt | Nielsen |
| Xylen | 30 | Rt | Nielsen |
| Paraffin | 30 | 60 | 20 |
| Paraffin | 30 | 60 | 20 |
Tabel 1: Prøvebehandlingsprocedure for indlejring af paraffin. RT = stuetemperatur. I/A = ikke relevant.
Figur 3: Indlejring og trækning af sår. (A) Paraffin-forarbejdede sår liggende fladt i en indlejring skimmel. (B) Såret blev holdt på 90 ° ("stående") fra den vandrette overflade af formen til indlejring. c) Paraffin-indlejret sår korrekt orienteret til skæring (D) Paraffin blok monteret på mikrotome blev opdelt i bånd på omkring 20 sektioner(E) Paraffin bånd skåret i 5-sektion intervaller som angivet af de hvide beslag. (F) Serielle sektioner, der er lagt fladt i et varmt vandbad (40-45 °C), er monteret på et mikroskop. Tegnefilmen i (A-C) repræsenterer såret (orange) i huden (blå) med den korrekte orientering af epidermis (e) og dermis (d) for hvert trin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Histologiske egenskaber ved sår og illustration af morfometriske parametre. (A, B) Histologiske træk ved en dag 4 (A) og en dag 7 (B) 6 mm sår. (C-F) Repræsentation af de forskellige målinger, der anvendes til at udføre den kvantitative morfometriske analyse: længden af overhuden (C, D, stiplet sort linje), målt område af epidermis (C, D, gult skyggeareal), længden af såret (E, F, stiplet gul linje) og målt område af hele såret (E, F, gråt skyggeområde). HF = hårsækken; skalalinje = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Morfometriske egenskaber for repræsentative 6 mm vilde sår på dag 4, dag 7 og dag 11 efter såret. Spredte observationsområder repræsenterer data fra morfometriske analyser af 6 mm vilde sår genereret i forskellige musestammer af flere kirurger og analyseret af forskellige individer. a) sårvolumen,B) epidermal volumen, (C) procentdel af overhuden i såret, (D) sårareal (beregnet),(E) epidermalt område (beregnet), og(F)procentdel af epidermalt område blandt sårarealet viser variationen i morfometriske værdier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Metaanalyse sammenligne parametre opnået fra hele såret med midten af såret identificerer nye defekter med større betydning. Sårheling morfometry blev udført på dag 7 sår injiceres med saltvand (kontrol), omdanne vækstfaktor beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 med neutraliserende antistof (Tgfb3 + NAB) og neutraliserende antistof alene (NAB). Målingerne blev udført på serielle sektionssår ("hele") eller på 40 sektioner fra midten af såret ("midten") og blev anvendt til at beregne procentdelen af epidermalt område over sårareal (A), procentdelen af epidermis i såret (B) og sårvolumen (D). c) repræsenterer gennemsnittet af sårarealet målt på hele eller midten af såret. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = ikke signifikant, One-way Anova). Dette tal er blevet ændret ved hjælp af data fra Le et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1: Et eksempel på et regneark til registrering af morfometriske målinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den bilaterale excisional sår model er en meget tilpasselig procedure, som kan bruges til at studere mange forskellige aspekter af sårheling. Før du begynder en sårheling projekt, bør efterforskere udføre en magt analyse for at bestemme antallet af sår er nødvendige for at opdage en defekt af en bestemt effekt størrelse. Der er uoverensstemmelser i litteraturen om, hvorvidt enkelte mus eller sår skal anvendes som biologiske replikater, men en nylig undersøgelse viste, at der ikke er nogen signifikant sammenhæng mellem to sår på et enkelt dyr4. Dette tyder på, at sår fra et enkelt dyr er uafhængige af hinanden og kan betragtes som biologiske replikater, hvilket reducerer antallet af mus, der kræves for at opdage en defekt. Dette er relevant , når man overvejer små effektstørrelser , for hvilke der kræves et stort antal sår for at opnå betydning4. Desuden kan resultaterne af effektberegningen påvirke, hvor mange sår der udføres på hvert dyr, med 2 og 4 sår pr dyr er mest almindelige.
Selve den kirurgiske protokol er også meget fleksibel. Mens vi anbefaler bedøvelse af isoflurane vaporizer på grund af den korte procedure længde og hurtig genopretning (10-15 min per mus), efterforskere uden adgang til en vaporizer kan bruge injicerbar anæstesi, herunder ketamin / xylazin eller pentobarbital. Udvælgelse af en passende smertestillende er særlig kritisk, da det vedrører de inflammatoriske faser af sårheling. Brugen af nonsteroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) såsom Flunixin meglumin eller Meloxicam bør anvendes med forsigtighed, da de kan nedsætte inflammation. Opioider foretrækkes derfor i undersøgelser, hvor inflammation undersøges. Vi anbefaler analgetika (f.eks. Alle kirurgiske procedurer bør udføres i overensstemmelse med føderale retningslinjer og understøttes af en godkendt dyreprotokol.
Sårheling er en proces, der omfatter flere faser, som hver især er karakteriseret ved forskellige biologiske processer, der involverer forskellige celletyper3. Den inflammatoriske fase opstår mellem dag 0 og 5, med den tidlige migration af polymorfeclear neutrofiler (PMN) og makrofager til stedet for skade13. Den proliferative fase opstår mellem 3 og 14 dage med re-epitelisering tager en varierende mængde tid baseret på størrelsen af såret14. I denne protokol, vi brugte en 6 mm biopsi punch og de fleste sår blev re-epithelialized af 7 dage. Men denne tidsramme skulle forkortes, hvis mindre slag blev brugt (de er tilgængelige så små som 1 mm). I kombination med tidligere tidspunkter kan disse mindre sår være at foretrække at reducere mængden af histologiske analyser15. Endelig opstår remodelations- og modningsfaserne efter 7 dage og op til et år efter skaden16. Disse senere tidspunktspunkter kan være nødvendige for at undersøge modningen af såret eller for at undersøge sårhelingsforsinkelser hos forsøgsdyr. Derfor vil investigator nødt til at bestemme de kritiske tidspunkter, der kræves for at undersøge bestemte faser af sårheling baseret på deres særlige hypotese5.
Analysen af sårheling er ofte ikke begrænset til histologiske analyser. Uindgroede paraffinsektioner kan bruges til yderligere analyser såsom immunfluorescens eller Massons trichrome til kollagenaflejring. Behandlingen af kontrolvæv (punchbiopsier) og vævets høsttrin vil alle afhænge af, hvordan sårheling ud over histologiske analyser vurderes. Som en del af den kirurgiske protokol fjernes punch biopsier for at generere det excisionale sår. Disse slag kan tjene som unwounded kontrol væv til downstream applikationer såsom protein (for vestlige eller cytokin profilering), DNA eller RNA ekstraktion og bør behandles i overensstemmelse hermed. Det anbefales, at der gemmes mindst én punch til histologisk analyse, især i tilfælde, hvor huden behandles før brænding(f.eks.anvendelse af tamoxifen til induktion af Cre-Lox-rekombination 17 ). Undersøgelse af punch kan bestemme effekten af behandlingen på kutan morfologi eller blot tillade vurdering af baseline kutan morfologi af den særlige musemodel, der anvendes. Sår, der ikke anvendes til histologi kan høstes med en punch biopsi, der omfatter størrelsen af såret. Denne procedure har et par fordele, herunder høst den samme mængde væv uanset sårstørrelse (større sår har mindre omgivende sundt væv). Endelig beskriver vi brugen af 4% paraformaldehyd som fiksativ og paraffin som materiale til henholdsvis konservering og indlejring af væv. Andre fiksativer kan være nødvendige for visse anvendelser og kan erstattes (f.eks. For bedste immunfluorescerende farvning, frysning og indlejring af såret i optimal skæretemperatur sammensatte efterfulgt af frosne skæring forbliver den foretrukne metode.
Sektionsafsnit af såret væv kan udgøre mange udfordringer, især dag 4 sår på grund af tilstedeværelsen af skorpen. For at generere sektioner af høj kvalitet anbefales det at kontrollere, at alle dele af mikrotomen er tæt fastgjort, blokholderen trækkes tilbage til startpositionen, klingeholderen indstilles mellem 0 og 10°, og klingen er stramt fastgjort, men ikke overspændt. Selv om paraffinblokken er kølet, kan vævet stadig makulere. Hvis makuleringen fortsætter, kan et stykke is placeres på blokken i 5 minutter, mens den stadig er monteret. Når nittet er begyndt, anbefales det stærkt at undgå at fjerne blokken fra mikrotomen for at forhindre tab af paraffinsektioner. Det er bydende nødvendigt at registrere eventuelle tabte paraffin sektioner, både deres numre og deres placering i den serielle sektion. Dette vil påvirke den morfometriske analyse og skal overvejes. Efter påbegyndelse af trækning kan det være vanskeligt at identificere såret væv på uhæmmede sektioner, især hvis det ikke er bekendt med histologien. Når du er i tvivl, anbefales det at være konservativ og holde alle de sektioner, der indeholder væv. Når den histologiske plet er udført, væv organisation vil være mere indlysende og såret mere tydeligt. Lejlighedsvis, hårsækkene kan ikke være klart synlige eller kan være langt fra såret kant. Hvis dette er tilfældet, kan andre centrale egenskaber ved det sårede væv bruges til at fastlægge grænserne for såret, herunder en brat stigning efterfulgt af øjeblikkelig reduktion i epidermal tykkelse og skarpe ændringer i tilrettelæggelsen af bindevæv (Figur 4A-B).
Digital billedbehandling er et kritisk skridt i den morfometriske analyse. Den morfometriske analyse bør udføres på individuelle billeder ved hjælp af et vartegn på hvert billede for at undgå gentagne målinger. Det er dog muligt at sy alle rammerne sammen ved hjælp af digital software og udføre analysen på et enkelt billede. Selv om dette synes lettere i første omgang, manipulation af et stort billede kan bremse analyseprocessen ned. Valget af sektion er også afgørende for analysen. Selvom vi anbefaler at erhverve den øverste del af hver8. Sektioner med små folder kan stadig analyseres ved at anslå området / længden af folden. Antallet af den pågældende sektion skal registreres både i den digitale fil og i Excel-regnearket, således at afstanden mellem den forrige og den næste analyserede sektion kan justeres i overensstemmelse hermed.
Kutane sår påvirker en anslået 6,5 millioner mennesker med behandling koster over 25 milliarder dollarsom året 18 og er en iboende komponent af kirurgiske procedurer ud over at være sekundære til mange andre sundhedsmæssige bekymringer, herunder diabetes og fedme. Musen er blevet brugt som en bekvem model til at studere menneskelige sygdomme på grund af den lethed i at manipulere sit genom, på trods af ofte udviser en subtil fænotype i forhold til den menneskelige lidelse. Den bilaterale excisional sårmodel og efterfølgende morfometriske analyse, der er beskrevet i denne protokol , er betydelig på grund af dens evne til at håndtere vanskelighederne ved at opdage mindre defekter i en i sagens natur kompleks sårhelingsproces19. På grund af sin større følsomhed og reducerede variation giver denne protokol mulighed for at bruge færre dyr til at opnå den samme eksperimentelle følsomhed. Protokollen er meget tilpasselig og kan bruges til at studere alle faser af væv reparation. Detaljeret histologisk morfometrisk analyse i kombination med fænoypisk karakterisering af vævet har et stort potentiale for at øge den viden, der er nødvendig for at fremme forståelsen af kritiske faktorer modulerende væv reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for alle de medlemmer af Dunnwald Lab, der har bidraget til optimering af denne protokol i årenes løb, og at Gina Schatteman hvis vedholdenhed i at fremme brugen af seriel sektionsopdelt til såranalyse gjort det muligt at skabe den. Dette arbejde blev støttet af støtte fra NIH/NIAMS til Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
