Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Murine Excisional Wound Healing Model en Histological Morphometric Wound Analysis

Published: August 21, 2020 doi: 10.3791/61616
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

Summary

Dit protocol beschrijft hoe bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen kunnen worden gegenereerd en hoe u de wonden vervolgens controleren, oogsten en voorbereiden op morfometrische analyse. Inbegrepen is een diepgaande beschrijving van het gebruik van seriële histologische secties om morfometrische defecten te definiëren, nauwkeurig te kwantificeren en op te sporen.

Abstract

Het murine excisional wondmodel is op grote schaal gebruikt om elk van de sequentiële overlappende fasen van wondgenezing te bestuderen: ontsteking, proliferatie en remodellering. Murine wonden hebben een histologisch goed gedefinieerde en gemakkelijk herkenbare wondbed waarover deze verschillende fasen van het genezingsproces meetbaar zijn. Binnen het veld is het gebruikelijk om een willekeurig gedefinieerd "midden" van de wond te gebruiken voor histologische analyses. Wonden zijn echter een driedimensionale entiteit en vaak niet histologisch symmetrisch, wat de noodzaak van een goed gedefinieerde en robuuste kwantificeringsmethode ondersteunt om morfometrische defecten met een kleine effectgrootte te detecteren. In dit protocol beschrijven we de procedure voor het maken van bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen, evenals een gedetailleerde instructie over het meten van morfometrische parameters met behulp van een beeldverwerkingsprogramma op geselecteerde seriële secties. De metingen met twee dimensies van wondlengte, opperhuidlengte, opperhuidgebied en wondgebied worden gebruikt in combinatie met de bekende afstand tussen secties om het epidermale gebied met drie dimensies dat de wond, het totale wondgebied, het oppervolume en het wondvolume bedekt, te extrapoleren. Hoewel deze gedetailleerde histologische analyse meer tijd en middelen verbruikt dan conventionele analyses, verhoogt de strengheid de kans op het detecteren van nieuwe fenotypes in een inherent complex wondgenezingsproces.

Introduction

Cutane wondgenezing is een complex biologisch proces met sequentieel overlappende fasen. Het vereist de coördinatie van cellulaire en moleculaire processen die tijdelijk en ruimtelijk worden gereguleerd om de barrièrefunctie van het beschadigde epitheel te herstellen. In de eerste fase migreren ontstekingen, neutrofielen en macrofagen naar de wond en mobiliseren lokale en systemische afweer1. Het volgen en overlappen van de ontstekingsfase is de proliferatiefase. Fibroblasten beginnen zich snel te vermenigvuldigen en migreren naar het granulatieweefsel. Keratinocyten uit de buurt van de voorste rand directioneel vermenigvuldigen naar de wond als gedifferentieerde keratinocyten in de voorste rand migreren naar re-epithialize de wond2. Ten slotte begint de remodellerings- en rijpingsfase, waarbij fibroblasten in het granulatieweefsel collageen beginnen te synthetiseren en deponeren. De verbouwing en organisatie van de nieuwe matrix kan tot 1 jaar duren na letsel3. Vanwege de complexiteit van overlappende gebeurtenissen waarbij cross-talk tussen meerdere celtypen, en ondanks jaren van onderzoek, veel van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan wondgenezing blijven slecht begrepen.

Het muismodel is het overheersende zoogdiermodel voor het onderzoeken van mechanismen van wondgenezing vanwege hun gebruiksgemak, relatief lage kosten en genetische manipulabiliteit1,4,5. Hoewel verschillende soorten wonden zijn beschreven in het murine model, de meest voorkomende is een excisional wond (ofwel bilaterale punch of directe punch biopsie), gevolgd door incisional wound modellen4. De excisional wond model heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van de incisie model als het inherent genereert controleweefsel dat niet heeft ondergaan het genezingsproces. De punch biopsie weefsel dat wordt verwijderd als onderdeel van het chirurgische protocol kan worden verwerkt op dezelfde manier als het gewonde weefsel en gebruikt om de homeostatische omstandigheden vast te stellen voor een gewenst criterium. Uitgesneden controleweefsel kan ook nuttig zijn bij het beoordelen van de effecten van een voorbehandeling van de huid of het bevestigen van een succesvolle genwijziging op het moment van letsel4.

Helende parameters kunnen worden beoordeeld door veel verschillende technieken, waaronder planimetrie of histologie. Planimetrie kan echter alleen de zichtbare kenmerken van de wond evalueren, en vanwege de aanwezigheid van een korst, correleert vaak niet met metingen van genezing die worden gevisualiseerd door histologie, waardoor histologie de "gouden standaard" van analyse4wordt. Ondanks histologische analyse is de gouden standaard, het wordt meestal uitgevoerd op een willekeurige subset van de wond6,7. Bijvoorbeeld, het snijden van de wond in "helft" voorafgaand aan het inbedden en doorsnijden van de wond is momenteel gebruikelijk om de tijd en middelen die worden besteed aan het doorsnijden van materialen en gegevensanalyse te verminderen. De in dit protocol beschreven methode van morfometrische analyse werd ontwikkeld om het volledige wondweefsel te omvatten, om de morfologische kenmerken van de wond nauwkeurig weer te geven en de kans op het detecteren van wondgenezingsdefecten met een kleine effectgrootte te vergroten. In dit protocol beschrijven we een chirurgische methode voor het genereren van de meest bestudeerde murinewond, de bilaterale excisionale wond met volledige dikte, evenals een gedetailleerde en rigoureuze methode voor histologische analyse die zelden in het veld wordt gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming met de federale regelgeving en de Universiteit van Iowa beleid en procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Iowa IACUC.

1. Dieren en veeteelt

  1. Gebruik volwassen muizen van de gewenste muislijn op 8-10 weken oud wanneer het haarzakje stadium is in telogen.
  2. Op de dag van de operatie, scheiden muizen in schone kooien en individueel huis om wondverstoring te minimaliseren.

2. Chirurgie

OPMERKING: Het is niet nodig om steriele chirurgische aandoeningen te handhaven. Hoewel er moet worden gezorgd voor steriliteit tussen dieren, wordt de ponsbiopsie zelf gedaan op een schoon, maar niet-steriel oppervlak. De operatieduur per dier ligt tussen de 10 en 15 min.

  1. Verdoving
    1. Verdoes het dier gedurende 1-2 min in een inductiekamer met de isoflurane vaporizer ingesteld op een 4-5% stroomsnelheid en de zuurstofstroom meter ingesteld op 1 liter per minuut. Zie Discussie voor alternatieve anesthesieopties.
    2. Bevestig de juiste verdovendering voordat u met de procedure begint. De diepte van anesthesie kan worden bevestigd door een stevige teensnuifje.
    3. Breng de muis van de inductiecontainer naar een neuskegel en verlaag de isoflurane stroomsnelheid tot 1,5% en de zuurstofstroommeter tot 0,5 L/min.
    4. Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen als de procedure meer dan 5 min.
    5. Houd de normale lichaamstemperatuur aan met behulp van een thermisch pad.
  2. Voorbereiding van het wondterrein
    1. Gebruik een elektrische scheermesknipper in een caudal rostral beweging om de vacht op de achterkant van de muis op schouderniveau te verwijderen. Verwijder haar lager op de rug als dat nodig is als het uitvoeren van meer dan twee wonden.
    2. Verwijder het resterende haar met behulp van een scheermesje in een rostrale caudal beweging die op 20° van de achterkant van de muis wordt gehouden om het afgeknipte gebied nauw te scheren (figuur 1A).
    3. Maak het geschoren gebied schoon met een povidone-jodiumuitstrijkje.
    4. Veeg de huid af met een steriele 70% isopropylalcohol prep pad om mogelijke cutane irritatie van het jodium wattenstaafje te verminderen.
  3. Verwonden
    1. Knijp de huid tussen de schouderbladen langs de rug middellijn en trek de ingeklemde huidplooi weg van het lichaam(figuur 1B).
    2. Plaats de muis op zijn kant met de huidplooi op een vlakke ondergrond gedrapeerd met een schone papieren handdoek of gelijkwaardig. Gebruik een vel tandwas onder de handdoek om het onderliggende oppervlak te beschermen tegen schade(figuur 1C).
    3. Plaats de biopsie punch van de gewenste grootte zo dicht mogelijk bij het lichaam mogelijk en laat de huid om te ontspannen. Rek de huid niet uit, of de wondgrootte zal groter zijn dan de aangewezen punch grootte(figuur 1D).
    4. Punch de huid door te drukken naar beneden, een schommelende beweging kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat alle lagen van de huid aan beide zijden zijn doorgedrongen (Figuur 1E). Gebruik een nieuwe biopsie punch voor elk dier.
    5. Verwijder de ponsbiopten uit de wonden(figuur 1F). Als er nog plaatsen van gehechtheid gebruik steriele schaar en pincet om de punch te bevrijden van de omliggende huid. Verwerk het punch biopsie controle weefsel zoals vereist op basis van downstream plannen voor wondgenezing analyses (zie Discussie voor suggesties).
    6. Maak macroscopische foto's van een gelijke afstand tot de wondplaatsen of met een liniaal in het frame om het oorspronkelijke wondgebied te meten en uitschieters uit te halen uit de analyse te elimineren.
    7. Beheer analgesie voor een minimum van 24 uur volgens een goedgekeurd dierprotocol. Bijvoorbeeld: Buprenorfine SR-LAB, geïnjecteerd als een enkele dosis onderhuids op 0,5-2 mg/kg voor 48 uur pijnbestrijding (zie Discussie voor alternatieve suggesties en overwegingen).
    8. Controleer de muis als het komt uit anesthesie totdat het onderhoudt een rechte houding en loopt normaal rond de kooi.

3. Na wondbewaking

  1. Controleer muizen dagelijks op experimentele eindpunten zoals bepaald door de onderzoeker en in overeenstemming met en naleving van institutionele protocollen. Voorbeelden hiervan zijn: infectie, zichtbaar gewichtsverlies of een gebogen houding.
  2. Neem dagelijkse macroscopische foto's op een gecontroleerde manier zoals werd gedaan na de eerste operatie.

4. Rooiwonden

  1. Euthanaseer muizen op het gewenste tijdstip na het verwonden volgens een goedgekeurd dierenprotocol.
  2. Neem macroscopische foto's van de wondplaatsen op een gecontroleerde manier in overeenstemming met eerdere foto-acquisitie (Figuur 2A,C).
  3. Snijd een brede rechthoek rond de wondplaatsen met behulp van een scalpel(figuur 2D,E).
  4. Bevrijd het rechthoekige stuk weefsel met een schaar en pincet om de huid af te pellen en de huid weg te snijden van het onderliggende weefsel(figuur 2F). Plaats in een petrischaaltje(figuur 2G).
  5. Oogst de wonden. Trim tot 2 mm ongewonden weefsel aan alle zijden van de wond in een rechthoekige vorm(figuur 2H,I). Zie Discussie voor alternatieve opties om de wond te oogsten.
  6. Verwerk de wonden zoals nodig voor latere studies. Reserveer ten minste één wond per muis voor paraffine inbedding en histologische analyse.

5. Wondfixatie en inbedding

  1. Repareer de wond
    1. Bevestig het wondweefsel in een vers bereide 4% paraformaldehydeoplossing8 voor 3 uur bij kamertemperatuur en breng 's nachts over naar 4 °C. Elektronenmicroscopie (EM) van paraformaldehyde en oplossingsfiltratie is niet nodig.
    2. Was de wonden twee keer gedurende 30 minuten in 1x PBS.
    3. Vervang PBS door 70% ETOH en bewaar op 4 °C tot inbedding. Verwerk weefsels binnen 24-48 uur om antigeenverlies te voorkomen of binnen 1-2 weken, als alleen de histologische kenmerken worden geëvalueerd.
  2. Proces en insluiten van de wond
    1. Breng elke wond over naar een inbeddingscassette. Label insluiten cassettes in potlood als het proces zal inkten te verwijderen.
    2. Verwerk het weefsel handmatig of gebruik een geautomatiseerde processor door het weefsel te dehydrateren met stijgende ethanolpercentages, op te ruimen met xyleen en vervolgens het weefsel te infiltreren met paraffinewas(tabel 1).
    3. Sluit de wond 90° ("staand") in van het horizontale oppervlak van de inbeddingsvorm (figuur 3A,B).

6. Analyse van dag 0 wondgebied

  1. Download NIH-Image J of NIH-Fiji vrije software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Open een bestand met een foto van dag 0 wonden.
  3. Schakel het selectievakje in voor 'Gebied' onder | analyseren Metingen instellen.
  4. Selecteer 'Schaal instellen'onder Analyseren. Voer de afstand in pixels, de bekende overeenkomstige afstand en de eenheid van de afstand (= lengteeenheid) in als macroscopische metingen deel uitmaken van de studie of sla deze stap over als er alleen relatieve metingen nodig zijn.
  5. Selecteer 'Uit de vrije hand selecties'op de werkbalk van Fiji.
  6. Schets de omtrek van de wond.
  7. Klik op Meten onder Analyseren.
  8. Maak een spreadsheet om de metingen per dier per wond bij te houden.
  9. Kopieer de meting van het wondgebied in de spreadsheet.
  10. Bereken het gemiddelde gebied en de standaarddeviatie van alle wonden voor een bepaald experiment.
  11. Sluit eventuele wonden buiten twee standaardafwijkingen van het gemiddelde uit zijntologische analyse.

7. Seriële afdeling

  1. Chill de paraffine-ingebedde wondblokken bij 4 °C 's nachts.
  2. Plaats het paraffineblok op de blokhouder van het microtome en oriënteer het mes, zodat het mes dwars door het blok snijdt. Oriënteer het blok zodanig dat het weefsel "staat" op 90° waardoor de gelijktijdige doorsectie van de opperhuid en dermis (figuur 3C, D).
  3. Maak 2-4 linten van 20-30 paraffinesecties van 7 μm per stuk.
  4. Gebruik een droge verfborstel en een ontledingsnaald om elk lint over te brengen naar een stevig maar toch manipulateerbaar oppervlak, zoals een stevig zwart plastic vel.
  5. Maak het bovenste gedeelte van elk lint los met een scheermesje en plaats op een microscoopplaat.
  6. Observeer de onbevlekte secties onder een helderveldmicroscoop om te bepalen welke gewond weefsel bevatten, dat kan worden geïdentificeerd door afwezigheid van haarzakje, veranderingen in het uiterlijk van het bindweefsel of de opperhuid, en/of de aanwezigheid van een korst (figuur 4A,B).
  7. Gooi afgewikkelde secties tot 20 secties voor het begin van de wond.
  8. Doorsneed de wond door de stappen 7.3 en 7.4 te herhalen totdat er geen wond in niet-bevlekte delen wordt gedetecteerd.

8. Montage van paraffinesecties

  1. Aparte paraffinesecties om de 5 secties met een scheermesje, te beginnen met het eerste lint(figuur 3E).
  2. Label microscoop dia's met zowel de dia nummer en alle sectie nummers.
  3. Pak de groep van 5 secties met een natte verfborstel en drijf ze op het oppervlak van het water van een warm waterbad (40-45 °C) om ze plat te maken.
  4. Haal de groep van 5 secties uit het waterbad met behulp van een van de gelabelde microscoopdia's(figuur 3F)en plaats op een diawarmer op 37 °C voor maximaal 24 uur.
  5. Bewaar de dia's rechtop in een diavak.

9. Histologische kleuring

  1. Breng elke8e microscoopplaat (gelijk aan elke 40e paraffinesectie) over op een kleurrek en vlek met hematoxylin en eosine.

10. Microscopische beeldvorming

  1. Verwerf afbeeldingen met behulp van een heldere veldmicroscoop uitgerust met een 4x objectieve en digitale acquisitiemogelijkheden. Nota van de schaal waarop de afbeelding wordt genomen.
  2. Beeld de gehele wond van het bovenste gedeelte van elke gekleurde dia en zorg ervoor dat sommige afgewikkeld weefsel aan weerszijden. Maak meerdere overlappende foto's als de wond groter is dan het frame van een enkele afbeelding.
  3. Sla het bestand op, inclusief het sectienummer voor morfometrische analyse. Gebruik het sectienummer gevolgd door a, b, c, etc. voor overlappende foto's van dezelfde wond.

11. Morfmetrische analyse

OPMERKING: Wanneer de wond meerdere foto's omspant, somt u de metingen op die zijn genomen van de afzonderlijke foto's om één waarde per metrische sectie per wondsectie te verkrijgen om in de spreadsheet op te nemen.

  1. Open in afbeelding J een digitaal bestand van een gekleurde wondfoto. Gebruik geen gestikte foto's voor analyse. Verricht metingen op ingezoomde overlappende afbeeldingen door oriëntatiepunten te vinden om weg te laten en metingen van beeld naar afbeelding op te pikken.
  2. Stel de schaal- en meetvoorkeuren in.
    1. Selecteer 'Schaal instellen'onder Analyseren. Voer de afstand in pixels, de bekende overeenkomstige afstand en de eenheid van de afstand (= lengte-eenheid). De schaal moet in het venster worden weergegeven en moet overeenkomen met de schaal waarop de afbeelding is verkregen.
    2. Schakel het selectievakje 'Globaal' in om de schaal voor elke geopende afbeelding gelijk te houden.
    3. Herhaal de stappen 11.2.1 tot 11.2.2 telkens wanneer Afbeelding J wordt gesloten en heropend.
    4. Schakel het selectievakje in voor 'Gebied' onder | analyseren Metingen instellen.
  3. Meet de wondlengte
    1. Selecteer 'Uit de vrije hand selecties'op de werkbalk van Fiji.
    2. Meet vanaf de laatste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de ene kant van de wond tot de eerste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de andere kant van de wond(figuur 4A,B).
    3. Traceer langs de dermo-epidermale kruising om deze twee bezienswaardigheden te bereiken. Als de opperhuid niet de gehele wond bedekt, volg dan de dermo-epidermale verbinding aan de ene kant van de wond en waar de migrerende tong eindigt na het superieure aspect van het granulatieweefsel of de kruising tussen het granulatieweefsel en de korst totdat u de migrerende tong bereikt en vervolgens uiteindelijk de eerste haarfollikel van het niet-gewonde weefsel aan de andere kant(figuur 4E,F).
    4. Klik onder Analyserenop Meten. De lengte van de meting wordt weergegeven in dezelfde eenheden als in de schaal.
    5. Maak een spreadsheet om de metingen bij te houden(aanvullende tabel 1).
    6. Kopieer de wondlengte in de spreadsheet.
  4. Meet de epidermale lengte
    1. Als de opperhuid de gehele wond bedekt, is de opperhuidlengte gelijk aan de wondlengte.
      1. Kopieer de meting "wondlengte" in de kolom 'epidermale lengte' in de Excel-spreadsheet en ga naar stap 11.5.
    2. Als de opperhuid niet de gehele wond bedekt, selecteert u de "Freehand selecties" en meet de afstand tussen elke epidermale voorrand volgens het superieure aspect van het granulatieweefsel of de kruising tussen het granulatieweefsel en de korst tot de eerste haarzakje (figuur 4C, D).
      1. Klik onder Analyserenop Meten.
      2. Trek deze meting af van de wondlengte en leg het getal op onder 'opperlengte' in de Excel-spreadsheet.
  5. Meet het wondgebied
    1. Selecteer 'Uit de vrije hand selecties'op de werkbalk van Fiji.
    2. Meet vanaf de laatste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de ene kant van de wond tot de eerste haarzakje van het niet-gewonde weefsel aan de andere kant van de wond(figuur 4A,B,E,F).
    3. Traceer langs het superieure aspect van de opperhuid (neem de korst niet op) of het superieure aspect van het granulatieweefsel als de wond niet volledig door de opperhuid wordt bedekt.
    4. Blijf verticaal te traceren langs de haarzakje in de granulatie weefsel zodra de tegenovergestelde haarzakje is bereikt en totdat vetweefsel of spier is bereikt. Volg de inferieure rand van het granulatieweefsel aan de andere kant van de wond en sluit het startpunt langs de haarzakje om het gebied te sluiten(figuur 4E,F).
    5. Klik onder Analyserenop Meten.
    6. Kopieer het wondgebied in de spreadsheet onder 'wondgebied gemeten'.
  6. Meet het epidermale gebied
    1. Selecteer 'Uit de vrije hand selecties'op de werkbalk van Fiji.
    2. Als de wond volledig epitheel is:
      1. Traceer langs het superieure aspect van de opperhuid totdat de tegenovergestelde haarzakje is bereikt en maak het gebied compleet door "terug te keren" naar het startpunt na de dermo-epidermale kruising tussen de opperhuid en dermis (figuur 4D).
      2. Klik onder Analyserenop Meten.
      3. Kopieer het oppergebied naar de Excel-spreadsheet onder 'epidermaal gebied gemeten' en ga naar stap 11.7.
    3. Als de wond niet volledig epitheel is:
      1. Traceer langs het superieure aspect van de opperhuid tot de voorrand en keer terug naar het startpunt na de dermo-epidermale kruising (figuur 4C).
      2. Klik onder Analyserenop Meten.
      3. Herhaal stap 11.6.3.1 en 11.6.3.2 aan de andere kant van de wond.
      4. Klik onder Analyseren op Meten.
      5. Som de twee getallen op die zijn verkregen in de stappen 11.6.3.2 en 11.6.3.4 en voer het resultaat in onder 'epidermal gebied gemeten' in de spreadsheet.
  7. Herhaal stap 11.3 tot 11.6 op elke 40e sectie (elke8e dia).
  8. Bereken het epidermale gebied van de hele wond.
    1. Maak een nieuwe kolom in de spreadsheet 'oppergebied berekend' naast 'epidermale lengte'.
    2. Vermenigvuldig het getal voor "epidermale lengte" met 280 voor elke sectie, behalve de laatste (7 μm dikke sectie x 40 secties).
    3. Vermenigvuldig het getal voor "epidermale lengte" met 7 voor de laatste sectie (dikte van de sectie).
    4. Som de waarde van het "opperhuidgebied berekend" voor elke sectie om het epidermale gebied van de gehele wond te verkrijgen.
  9. Bereken het wondgebied van de hele wond.
    1. Herhaal de stappen 11.8.1 tot en met 11.8.4 met behulp van de metingen van de wondlengte.
  10. Bereken het opperlichaamvolume van de hele wond.
    1. Herhaal de stappen 11.8.1 tot en met 11.8.4 met behulp van de metingen van het "epidermale gebied".
  11. Bereken het wondvolume van de hele wond.
    1. Herhaal de stappen 11.8.1 tot en met 11.8.4 met behulp van de metingen van het "wondgebied".
  12. Bereken het percentage van het opperhuidvolume in de wond.
    1. Verdeel het totale opperhuidvolume door het totale wondvolume en vermenigvuldig met 100 om het percentage te verkrijgen (doe deze verhouding niet voor elke sectie).
  13. Bereken het percentage van de opperhuid gebied tussen het wondgebied.
    1. Verdeel het totale epidermale gebied door het totale wondgebied en vermenigvuldig met 100 om het percentage te verkrijgen. Als een wond volledig epitheel is, moet dit aantal 100 zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 5 toont het bereik in gemeten en berekende waarden verkregen door het uitvoeren van morfometrische analyse op wilde wonden gegenereerd in verschillende muizenstammen door meerdere chirurgen en geanalyseerd door verschillende individuen. Wild-type muizen van verschillende stammen kunnen statistische verschillen vertonen zoals beschreven in zowel onze studies als in de literatuur9,10. Op basis van deze representatieve resultaten raden we aan om binnen één studie muizen van slechts één stam te gebruiken. Hoewel we adviseren dat dezelfde persoon alle wonden binnen een bepaalde studie uitvoert, kunnen meerdere personen als chirurgen optreden zolang het gebied van de wonden op dag 0 niet statistisch verschilt tussen het werk van het individu. Ten slotte, omdat de morfometrische analyse beschreven in dit protocol uitgebreid kan zijn, kunnen meerdere individuen delen van hetzelfde experiment analyseren, maar alleen als de resultaten van hun analyse van twee monsters binnen 5% van elkaar liggen. Het is echter beter om een enkel individu te hebben dat de wonden op een geblindeerde manier analyseert om vooringenomenheid te voorkomen.

Figuur 6 toont een meta-analyse waarin wondmetingen worden vergeleken die zijn verkregen volgens het in deze studie beschreven protocol11 met metingen die zijn verkregen uit het "midden" van de wond en 40 omliggende secties. In figuur 6Awerden het epidermale gebied en het wondgebied berekend op basis van de meting van de epidermale en wondlengtes op wondsecties, gevolgd door de berekening van het percentage van het epidermale gebied tussen het wondgebied (ook wel "percentage van de sluiting" of "percentage epithelialisatie" genoemd). Evenzo werd in figuur 6Bhet percentage van de opperhuid in de wond verkregen als de verhouding tussen het opperhuidvolume (berekend op basis van het gemeten epidermale gebied) over het wondvolume (berekend op basis van het gemeten wondgebied). Voor beide parameters vertoonde de analyse van de hele wond sterke statistische verschillen tussen groepen (tot P < 0,001 na One-way Anova). De betekenis werd echter verminderd (tot P < 0,01 na One-way Anova) toen slechts 40 secties in het midden van de zou worden geanalyseerd. Deze resultaten tonen een afname van het niveau van betekenis wanneer slechts een deelverzameling van de wond wordt geanalyseerd. Deze gegevens suggereren dat defecten met een kleine effectgrootte waarschijnlijk alleen zullen worden gedetecteerd bij het uitvoeren van morfometrische analyse op de gehele wond, en dat meer milde wondgenezing fenotypes zullen worden gemist vanuit een "midden van de wond" type analyse.

Gangbare praktijk voor het analyseren van in vivo wondgenezing omvat het meten van het gebied van de wond op histologische secties die ergens in de wond zijn gekozen12. Met dat in gedachten werd het gemiddelde van het gemeten wondgebied van de seriële delen van hele wonden vergeleken met het gemiddelde deelverzamelingsdeel. De resultaten toonden geen significant verschil tussen experimentele groepen en tussen analysemethode (figuur 6C). Het huidige protocol gebruikt echter het gemeten gebied (weergegeven in figuur 6C)over de gehele wond om het wondvolume te berekenen. Zoals blijkt uit figuur 6D,verschilt het berekende wondvolume (dat alleen kan worden berekend aan de hand van de analyse van de gehele wond) aanzienlijk tussen de experimentele groepen. Kortom, deze representatieve resultaten tonen het belang aan van diepgaande histologische analyse van wondgenezingsparameters beschreven in dit protocol om fenotypes te detecteren die anders zouden zijn gemist met behulp van een meer traditionele wondgenezingsanalyse.

Figure 1
Figuur 1: Bilaterale excisional wondprocedure. (A) Representatieve foto van een muis na het knippen en scheren van haar uit het chirurgische gebied. (B) De huid geknepen tussen de schouderbladen langs de dorsale middellijn. (C) De muis op zijn kant geplaatst met de huidplooi plat gelegd. (D) Vertegenwoordiging van de biopsie punch plaatsing. (E) Geponste huidplooi. (F) De muis met twee bilaterale wonden op dag 0 en de uitgesneden punch biopsie controle weefsels zoals aangegeven door de witte pijlen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Wondoogstprocedure. (A-C) Macroscopische foto's van 6 mm excisional wonden na 4 dagen (A), 7 dagen (B) en 11 dagen (C). (D-E) Met een scalpelmes werd een cutane incisie gemaakt in de vorm van een brede rechthoek die de wonden en het omringende ongewonde weefsel omvat. (F) De huid kwam met tangen en scharen vrij uit onderliggend weefsel. g) Vertegenwoordiging van geoogste bilaterale wonden. (H) De gestippelde witte lijn vertegenwoordigt de rand van het weefsel dat zou worden geoogst na het gebruik van een punch biopsie (deze methode maakt het mogelijk voor gestandaardiseerde hoeveelheid weefsel geoogst). (I) De gestippelde witte lijn vertegenwoordigt de rand van het weefsel dat zou worden bijgesneden voor histologie (rechthoekige vorm zorgt voor een gemakkelijker inbedden). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Oplossing Tijd (minuten) Temperatuur (Celsius) Druk (kPa)
80% ETOH 30 Rt N/a
95% ETOH 30 Rt N/a
100% ETOH 30 Rt N/a
Xyleen 30 Rt N/a
Xyleen 30 Rt N/a
Paraffine 30 60 20
Paraffine 30 60 20

Tabel 1: Monsterverwerkingsprocedure voor paraffinebedding. RT = kamertemperatuur. N/A = niet van toepassing.

Figure 3
Figuur 3: Wondbedding en sectie. (A) Paraffine-verwerkte wond liggen plat in een inbedding schimmel. (B) De wond werd gehouden op 90° ("staande") van het horizontale oppervlak van de mal voor inbedding. (C) Paraffine-ingebedde wond goed georiënteerd voor sectioning (D) Paraffine blok gemonteerd op het microtome werd gesneist in linten van ongeveer 20 secties (E) Paraffine linten gesneden in 5-sectie stappen zoals aangegeven door de witte beugels. (F) Seriële secties plat gelegd in een warm water bad (40-45 °C) werden gemonteerd op een microscoop glijbaan. De cartoon in (A-C) vertegenwoordigt de wond (oranje) in de huid (blauw) met de juiste oriëntatie van de opperhuid (e) en de dermis (d) voor elke stap. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Histologische kenmerken van wonden en illustratie van morfometrische parameters. (A, B) Histologische kenmerken van een dag 4 (A) en een dag 7 (B) 6 mm wond. (C-F) Weergave van de verschillende metingen die worden gebruikt om de kwantitatieve morfometrische analyse uit te voeren: lengte van de opperhuid (C, D, gestippelde zwarte lijn), gemeten gebied van de opperhuid (C, D, geel gearceerd gebied), lengte van de wond (E, F, gestippelde gele lijn) en gemeten gebied van de gehele wond (E, F, grijs gearceerd gebied). HF = haarzakje; schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Morfometrische kenmerken van representatieve wonden van het 6 mm wilde type op dag 4, dag 7 en dag 11 na het verwonden. Verspreide percelen vertegenwoordigen gegevens verkregen uit morfometrische analyses van 6 mm wild-type wonden gegenereerd in verschillende muizenstammen door meerdere chirurgen en geanalyseerd door verschillende individuen. (A) wondvolume,b) epidermaal volume, (C) percentage opperhuid in de wond, (D)wondgebied (berekend), (E) epidermale gebied (berekend) en (F) percentage van het opperhuidgebied tussen het wondgebied vertonen het variatiebereik in morfometrische waarden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Meta-analyse waarbij parameters worden vergeleken die zijn verkregen uit hele wond met het midden van de wond, identificeert nieuwe defecten met een hogere betekenis. Wondgenezing morfometrie werd uitgevoerd op dag 7 wonden geïnjecteerd met zout (controle), transformerende groeifactor beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 met neutraliserend antilichaam (Tgfb3 + NAB) en neutraliserend antilichaam alleen (NAB). Er werden metingen verricht op serieel geseinsale wonden ("geheel") of op 40 delen van het midden van de wond ("midden") en gebruikt om het percentage opperhuidgebied over wondgebied(A),het percentage opperhuid in de wond(B)en het wondvolume (D) te berekenen. (C) vertegenwoordigt het gemiddelde van het wondgebied gemeten over het geheel of midden van de wond. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = niet significant, One-way Anova). Dit cijfer is gewijzigd met behulp van gegevens van Le et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende tabel 1: een voorbeeld van een spreadsheet voor het opnemen van morfometrische metingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het bilaterale excisional wondmodel is een zeer aanpasbare procedure die kan worden gebruikt om veel verschillende aspecten van wondgenezing te bestuderen. Voordat ze met een wondhelend project beginnen, moeten onderzoekers een energieanalyse uitvoeren om het aantal wonden te bepalen dat nodig is om een defect van een bepaalde effectgrootte op te sporen. Inconsistenties bestaan in de literatuur over de vraag of individuele muizen of wonden moeten worden gebruikt als biologische replica's, echter, een recente studie toonde aan dat er geen significante correlatie tussen twee wonden op een enkel dier4. Dit suggereert dat wonden van een enkel dier onafhankelijk van elkaar zijn en kunnen worden beschouwd als biologische replica's, waardoor het aantal muizen dat nodig is om een defect op te sporen, wordt verminderd. Dit is relevant bij het overwegen van kleine effectgroottes waarvoor een groot aantal wonden nodig is omsignificantie 4te bereiken. Bovendien kunnen de resultaten van de vermogensberekening van invloed zijn op het aantal wonden dat op elk dier wordt uitgevoerd, waarbij 2 en 4 wonden per dier het meest voorkomen.

Het chirurgische protocol zelf is ook zeer flexibel. Hoewel we anesthesie door isoflurane vaporizer aanbevelen vanwege de korte procedurelengte en snel herstel (10-15 min per muis), kunnen onderzoekers zonder toegang tot een vaporizer injecteerbare anesthesie gebruiken, waaronder ketamine/xylazine of pentobarbital. Selectie van een geschikte pijnstiller is bijzonder cruciaal, omdat het betrekking heeft op de ontstekingsfasen van wondgenezing. Het gebruik van niet-steroïdale ontstekingsremmende geneesmiddelen (NSAIDS) zoals Flunixin meglumine of Meloxicam moet met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt omdat ze ontstekingen kunnen verminderen. Opioïden hebben daarom de voorkeur in studies waar ontsteking wordt onderzocht. Wij raden pijnstillers aan (bijvoorbeeld Buprenorfine Sustained-Release) die tot 48 uur analgesie bieden en de noodzaak van herhaalde, extra doses elimineren. Alle chirurgische ingrepen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de federale richtlijnen en ondersteund door een goedgekeurd dierprotocol.

Wondgenezing is een proces dat verschillende fasen omvat, die elk worden gekenmerkt door verschillende biologische processen waarbij verschillende celtypen3betrokken zijn. De ontstekingsfase treedt op tussen dag 0 en 5, met de vroege migratie van polymorfe neutrofielen (PMN) en macrofagen naar de plaats van letsel13. De proliferative fase vindt plaats tussen 3 en 14 dagen met re-epithelialisatie die een verschillende hoeveelheid tijd in beslag neemt op basis van de grootte van de wond14. In dit protocol gebruikten we een 6 mm biopsie punch en de meeste wonden werden opnieuw geepilelialiseerd door 7 dagen. Echter, dit tijdsbestek zou moeten worden ingekort als kleinere stoten werden gebruikt (ze zijn verkrijgbaar zo klein als 1 mm). In combinatie met eerdere tijdstippen kunnen deze kleinere wonden de voorkeur hebben om de hoeveelheid histologische analyses te verminderen15. Ten slotte vinden de renovatie- en rijpingsfasen plaats na 7 dagen en tot een jaar na de blessure16. Deze latere tijdstippen kunnen nodig zijn om de rijping van de wond te onderzoeken of om verwondingen van wondgenezing bij proefdieren te onderzoeken. Daarom moet de onderzoeker de kritieke tijdspunten bepalen die nodig zijn om bepaalde fasen van wondgenezing te onderzoeken op basis van hun specifieke hypothese5.

De analyse van wondgenezing is vaak niet beperkt tot histologische analyses. Niet-gekleurde paraffinesecties kunnen worden gebruikt voor aanvullende analyses zoals immunofluorescentie of het trichrome van Masson voor collageenafzetting. De verwerking van controleweefsel (ponsbiopten) en de oogststappen van het weefsel zullen allemaal afhangen van hoe, naast histologische analyses, wondgenezing wordt beoordeeld. Als onderdeel van het chirurgische protocol worden ponsbiopten verwijderd om de excisionele wond te genereren. Deze stoten kunnen dienen als afgewikkeld controleweefsel voor downstream toepassingen zoals eiwit (voor westerse of cytokine profilering), DNA of RNA extractie en moet dienovereenkomstig worden verwerkt. Aanbevolen wordt ten minste één stoot te besparen voor histologische analyse, vooral in gevallen waarin de huid wordt behandeld voorafgaand aan het verwonden (bijvoorbeeld de toepassing van tamoxifen voor inductie van Cre-Lox recombinatie17). Onderzoek van de punch kan het effect van de behandeling op cutane morfologie bepalen of gewoon de beoordeling van de baseline cutane morfologie van het specifieke muismodel dat wordt gebruikt toestaan. Wonden die niet worden gebruikt voor histologie kunnen worden geoogst met een punch biopsie die de grootte van de wond omvat. Deze procedure heeft een paar voordelen, waaronder het oogsten van dezelfde hoeveelheid weefsel, ongeacht de wondgrootte (grotere wonden hebben minder omliggende gezonde weefsel). Ten slotte beschrijven we het gebruik van 4% paraformaldehyde als het fixatieve en paraffine als het materiaal voor respectievelijk het behoud en het inbedden van weefsels. Andere fixatiemiddelen kunnen nodig zijn voor bepaalde toepassingen en kunnen worden vervangen (bijvoorbeeld Carnoy's of Bouin's fixatieven). Voor de beste immunofluorescente kleuring, bevriezing en inbedding van de wond in Optimale snijtemperatuur verbinding gevolgd door bevroren sectie blijft de methode van keuze.

Het doorsnee van gewond weefsel kan veel uitdagingen opleveren, met name dag 4 wonden vanwege de aanwezigheid van de korst. Om secties van hoge kwaliteit te genereren, wordt aanbevolen om te controleren of alle delen van het microtome goed zijn bevestigd, de blokhouder in zijn oorspronkelijke positie wordt ingetrokken, de bladhouder tussen 0 en 10° wordt ingesteld en het blad stevig is vastgemaakt, maar niet overdicht. Hoewel het paraffineblok gekoeld is, kan het weefsel nog steeds versnipperen. Als het versnipperen doorgaat, kan een stuk ijs gedurende 5 minuten op het blok worden geplaatst terwijl het nog steeds gemonteerd is. Zodra de sectie is begonnen, is het sterk aanbevolen om te voorkomen dat het verwijderen van het blok uit de microtome om het verlies van paraffine secties te voorkomen. Het is absoluut noodzakelijk om verloren paraffinesecties, zowel hun aantallen als hun rangorde in de seriële sectie te registreren. Dit zal van invloed zijn op de morfometrische analyse en moet worden overwogen. Na het initiëren van secties kan de identificatie van gewond weefsel op niet-bevlekte secties moeilijk zijn, vooral als het niet bekend is met histologie. Bij twijfel wordt aanbevolen om conservatief te zijn en alle secties die weefsel bevatten te houden. Zodra de histologische vlek is uitgevoerd, zal de weefselorganisatie duidelijker zijn en de wond duidelijker. Af en toe, haarzakjes kunnen niet duidelijk zichtbaar zijn of kan ver van de wond rand. Als dit het geval is, kunnen andere belangrijke kenmerken van het gewonde weefsel worden gebruikt om de grenzen van de wond vast te stellen, waaronder een abrupte toename, gevolgd door een onmiddellijke afname van de opperdikte en scherpe veranderingen in de organisatie van het bindweefsel(figuur 4A-B).

Digitale beeldvorming is een cruciale stap in de morfometrische analyse. De morfometrische analyse moet worden uitgevoerd op afzonderlijke afbeeldingen met behulp van een oriëntatiepunt op elke afbeelding om herhaalde metingen te voorkomen. Het is echter mogelijk om alle frames samen te naaien met behulp van digitale software en de analyse uit te voeren op een enkel beeld. Hoewel dit in eerste instantie gemakkelijker lijkt, kan manipulatie van een groot beeld het analyseproces vertragen. De keuze van de sectie is ook van cruciaal belang voor de analyse. Hoewel we adviseren om digitaal het bovenste gedeelte van elke8e dia te verwerven, moet de kwaliteit van de sectie worden geprioriteerd en moet het beste van de 5 secties op die dia worden afgebeeld. Secties met kleine plooien kunnen nog worden geanalyseerd door het gebied/de lengte van de vouw te schatten. Het nummer van die specifieke sectie moet zowel in het digitale bestand als in de Excel-spreadsheet worden geregistreerd, zodat de afstand tussen de vorige en de volgende geanalyseerde sectie dienovereenkomstig kan worden aangepast.

Cutane wonden beïnvloeden naar schatting 6,5 miljoen mensen met een behandeling kost meer dan $ 25 miljard per jaar18 en zijn een inherent onderdeel van chirurgische ingrepen in aanvulling op het feit dat secundair aan vele andere gezondheidsproblemen, met inbegrip van diabetes en obesitas. De muis is gebruikt als een handig model om menselijke ziekten te bestuderen vanwege het gemak bij het manipuleren van zijn genoom, ondanks het vaak vertonen van een subtiel fenotype in vergelijking met de menselijke aandoening. Het bilaterale excisional wondmodel en de daaropvolgende morfometrische analyse beschreven in dit protocol is significant vanwege zijn vermogen om de moeilijkheid aan te pakken bij het opsporen van kleine defecten in een inherent complex wondgenezingsproces19. Vanwege de grotere gevoeligheid en verminderde variabiliteit biedt dit protocol mogelijkheden om minder dieren te gebruiken om dezelfde experimentele gevoeligheid te verkrijgen. Het protocol is zeer aanpasbaar en kan worden gebruikt om alle stadia van weefselherstel te bestuderen. Gedetailleerde histologische morfometrische analyse in combinatie met fenotypische karakterisering van het weefsel hebben een groot potentieel om de kennis die nodig is om het begrip van kritische factoren moduleren weefsel herstel verder te verhogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We zijn alle leden van het Dunnwald Lab dankbaar die in de loop der jaren hebben bijgedragen aan de optimalisatie van dit protocol, en aan Gina Schatteman wiens volharding in het bevorderen van het gebruik van seriële secties voor wondanalyse de oprichting ervan mogelijk heeft gemaakt. Dit werk werd ondersteund door financiering van NIH/NIAMS aan Martine Dunnwald (AR067739).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep NOVAPLUS V9100 70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads Cellpath 22-222-012
Black plastic sheet Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips 22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds 22 x 22 x 12
Embedding rings Simport Scientific Inc. M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad Conair Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine Aplicare 82-255
Processing cassette Simport Scientific Inc. M490-2
Razor blades ASR .009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors sterile for surgery
Skin biopsy punches Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides Fisher Scientific 22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip sterile for surgery
tweezers, tapered tip sterile for surgery
WypAll X60 Kimberly-Clark 34865

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Tags

Deze maand in JoVE wondgenezing excisional wond histologie morfoom huid muis chirurgie weefsel reparatie
Murine Excisional Wound Healing Model en Histological Morphometric Wound Analysis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine… More

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61616, doi:10.3791/61616 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter