Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Murine Excisional Wound Healing Modell og histologisk morfometrisk såranalyse

Published: August 21, 2020 doi: 10.3791/61616
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man genererer bilaterale, fulltykkelsessår hos mus og hvordan man senere overvåker, høster og forbereder sårene for morfometrisk analyse. Inkludert er en grundig beskrivelse av hvordan du bruker serielle histologiske seksjoner til å definere, nøyaktig kvantifisere og oppdage morfometriske defekter.

Abstract

Murine excisional wound modellen har blitt brukt mye for å studere hver av de sekvensielt overlappende faser av sårheling: betennelse, spredning og ombygging. Murine sår har en histologisk veldefinert og lett gjenkjennelig sårseng over hvilke disse forskjellige fasene av helbredelsesprosessen er målbare. Innenfor feltet er det vanlig å bruke en vilkårlig definert "midten" av såret for histologiske analyser. Imidlertid er sår en tredimensjonal enhet og ofte ikke histologisk symmetrisk, som støtter behovet for en veldefinert og robust kvantifiseringsmetode for å oppdage morfometriske defekter med liten effektstørrelse. I denne protokollen beskriver vi prosedyren for å lage bilaterale, fulltykkelse eksisjonelle sår hos mus, samt en detaljert instruksjon om hvordan man måler morfometriske parametere ved hjelp av et bildebehandlingsprogram på utvalgte serielle seksjoner. De todimensjonsmålingene av sårlengde, epidermal lengde, epidermal område og sårområde brukes i kombinasjon med den kjente avstanden mellom seksjoner for å ekstrapolere det tredimensjonale epidermale området som dekker såret, det generelle sårområdet, epidermalvolum og sårvolum. Selv om denne detaljerte histologiske analysen er mer tids- og ressurskrevende enn konvensjonelle analyser, øker strengheten sannsynligheten for å oppdage nye fenotyper i en iboende kompleks sårhelingsprosess.

Introduction

Kutan sårheling er en kompleks biologisk prosess med sekvensielt overlappende faser. Det krever koordinering av cellulære og molekylære prosesser som er timelig og romlig regulert for å gjenopprette barrierefunksjonen til det skadede epitelet. I den første fasen migrerer betennelse, nøytrofiler og makrofager inn i såret, mobiliserer lokalt og systemisk forsvar1. Etter og overlappende den inflammatoriske fasen er spredningsstadiet. Fibroblaster begynner raskt å spre seg og migrere inn i granuleringsvevet. Keratinocytes bort fra forkant retningsbestemt spre seg mot såret som differensierte keratinocytter i forkant migrere for å re-epitelialisere såret2. Til slutt begynner ombyggings- og modningsfasen, hvor fibroblaster i granuleringsvevet begynner å syntetisere og deponere kollagen. Ombygging og organisering av den nye matrisen kan vare opptil 1 år etter skade3. På grunn av kompleksiteten av overlappende hendelser som involverer kryss-snakk mellom flere celletyper, og til tross for år med forskning, forblir mange av de cellulære og molekylære mekanismene underliggende sårheling dårlig forstått.

Musemodellen er den dominerende pattedyrmodellen for å undersøke mekanismer for sårheling på grunn av deres brukervennlighet, relativt lave kostnader og genetiskmanipulabilitet 1,4,5. Selv om ulike typer sår har blitt beskrevet i murine-modellen, er det vanligste et eksisjonelt sår (enten bilateral punch eller direkte punch biopsi), etterfulgt av snittsårmodeller4. Den eksisjonelle sårmodellen har en klar fordel over snittmodellen som det iboende genererer kontrollvev som ikke har gjennomgått helbredelsesprosessen. Punch biopsivevet som er utskåret som en del av den kirurgiske protokollen, kan behandles på samme måte som det sårede vevet og brukes til å etablere de homeostatiske forholdene for et ønsket kriterium. Utskåret kontrollvev kan også være nyttig hvis man vurderer effekten av en hudforbehandling eller bekrefter vellykket genendring på skadestedet4.

Healing parametere kan vurderes ved mange forskjellige teknikker, inkludert planimetry eller histologi. Imidlertid kan planimetry bare evaluere synlige egenskaper av såret, og på grunn av tilstedeværelsen av en scab, ofte ikke korrelerer med målinger av helbredelse som visualiseres ved histologi, og dermed gjør histologi til "gullstandarden" av analyse4. Til tross for at histologisk analyse er gullstandarden, utføres den oftest på en vilkårlig undergruppe av såret6,7. For eksempel er det for tiden vanlig å kutte såret i "halvparten" før innebygging og snitting av såret for å redusere tid og ressurser brukt på snitting av materialer og dataanalyse. Metoden for morfometrisk analyse beskrevet i denne protokollen ble utviklet for å omfatte hele sårvevet, for å nøyaktig reflektere sårmorfologiske egenskaper, og for å øke sannsynligheten for å oppdage sårhelende defekter med en liten effektstørrelse. I denne protokollen beskriver vi en kirurgisk metode for å generere det mest studerte murine såret, det bilaterale fulltykkelsessåret, samt en detaljert og streng metode for histologisk analyse som sjelden brukes i feltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble fullført i samsvar med og overholdelse av føderale forskrifter og University of Iowa politikk og prosedyrer har blitt godkjent av University of Iowa IACUC.

1. Dyr og husdyrhold

  1. Bruk voksne mus av ønsket muselinje ved 8-10 ukers alder når hårsekken scenen er i telogen.
  2. På operasjonsdagen skiller du mus i rene bur og individuelt hus for å minimere sårforstyrrelser.

2. Kirurgi

MERK: Det er unødvendig å opprettholde sterile kirurgiske forhold. Mens forsiktighet bør tas for å opprettholde sterilitet mellom dyr, punch biopsi selv er gjort på en ren, men nonsterile overflate. Operasjonen varighet per dyr er mellom 10 og 15 min.

  1. Bedøvelse
    1. Bedøve dyret i 1-2 min i et induksjonskammer med isofluranfordamperen satt til en 4-5% strømningshastighet og oksygenstrømmåleren satt til 1 liter per minutt. Se Diskusjon for alternative anestesialternativer.
    2. Bekreft riktig bedøvelse før du begynner prosedyren. Dybden av anestesi kan bekreftes av en fast tåklem.
    3. Overfør musen fra induksjonsbeholderen til en nesekjegle og reduser isofluranstrømningshastigheten til 1,5% og oksygenstrømmåleren til 0,5 l / min.
    4. Påfør oftalmisk salve på begge øynene som prosedyren overstiger 5 min.
    5. Opprettholde normal kroppstemperatur ved hjelp av en termisk pute.
  2. Utarbeidelse av sårstedet
    1. Bruk en elektrisk barberhøvelklipper i en caudal rostral bevegelse for å fjerne pelsen på baksiden av musen på skuldernivå. Fjern håret lavere på baksiden etter behov hvis du utfører mer enn to sår.
    2. Fjern det gjenværende håret ved hjelp av et barberblad i en rostral caudal bevegelse holdt på 20° fra baksiden av musen for å nøye barbere det beskredede området (Figur 1A).
    3. Rengjør det barberte området med en povidone-jodvattpinne.
    4. Tørk av huden med en steril 70 % isopropylalkoholforberedelsespute for å redusere potensiell kutan irritasjon fra jodpinnen.
  3. Såret
    1. Klyp huden mellom skulderbladene langs den dorsale midtlinjen og trekk den sandwichede hudfolden bort fra kroppen (figur 1B).
    2. Plasser musen på siden med hudfolden på en flat overflate drapert med et rent papirbasert håndkle eller tilsvarende. Bruk et tanneark under håndkleet for å beskytte den underliggende overflaten mot skade (figur 1C).
    3. Plasser biopsipunsjen av ønsket størrelse så nær kroppen som mulig og la huden slappe av. Ikke strekk huden, ellers vil sårstørrelsen være større enn den angitte stansestørrelsen (figur 1D).
    4. Punch huden ved å trykke ned, kan en gyngebevegelse brukes til å sikre at alle lag av huden på begge sider har blitt penetrert (figur 1E). Bruk en ny biopsi punch for hvert dyr.
    5. Fjern punch biopsier fra sårene (Figur 1F). Hvis det fortsatt er festesteder, bruk steril saks og pinsett for å frigjøre slaget fra den omkringliggende huden. Behandle punch biopsi kontrollvev etter behov basert på nedstrøms planer for sårheling analyser (se Diskusjon for forslag).
    6. Ta makroskopiske fotografier fra lik avstand til sårstedene eller med en linjal i rammen for å måle det første sårområdet og eliminere outliers fra analyse.
    7. Administrer analgesi i minst 24 timer i henhold til en godkjent dyreprotokoll. For eksempel: Buprenorfin SR-LAB, injisert som en enkeltdose subkutant ved 0,5-2 mg/kg for 48 timer smertelindring (se Diskusjon for alternative forslag og hensyn).
    8. Overvåk musen når den kommer ut av anestesi til den opprettholder en oppreist holdning og går normalt rundt buret.

3. Overvåking av etter sår

  1. Overvåk mus daglig for eksperimentelle endepunkter som bestemmes av utprøver og i samsvar med institusjonelle protokoller. Eksempler inkluderer: infeksjon, synlig vekttap, eller en hunched holdning.
  2. Ta daglige makroskopiske fotografier på en kontrollert måte som ble gjort etter den første operasjonen.

4. Høsting sår

  1. Euthanize mus på ønsket tidspunkt etter såret i samsvar med en godkjent dyreprotokoll.
  2. Ta makroskopiske fotografier av sårstedene på en kontrollert måte i samsvar med tidligere fotografioppkjøp (Figur 2A, C).
  3. Skjær et bredt rektangel rundt sårstedene ved hjelp av en skalpell (figur 2D, E).
  4. Frigjør det rektangulære vevet ved hjelp av saks og pinsett for å skrelle tilbake og kutte huden bort fra det underliggende vevet (figur 2F). Plasser i en petriskål (figur 2G).
  5. Høst sårene. Trim ned til 2 mm uavbrud vev rundt alle sider av såret i en rektangulær form (figur 2H,I). Se Diskusjon om alternative alternativer for å høste såret.
  6. Behandle sårene etter behov for senere studier. Reserver minst ett sår per mus for parafininnbygging og histologisk analyse.

5. Sårfiksering og innebygging

  1. Fest såret
    1. Fest sårvevet i en nylaget 4% paraformaldehydløsning8 i 3 timer ved romtemperatur og overfør deretter til 4 °C over natten. Elektronmikroskopi (EM) paraformaldehyd og oppløsningfiltrering er ikke nødvendig.
    2. Vask sårene to ganger i 30 min i 1x PBS.
    3. Erstatt PBS med 70% ETOH og oppbevares ved 4 °C til innebygging. Behandle vev innen 24-48 timer for å unngå antigentap eller innen 1-2 uker hvis bare evaluering av histologiske egenskaper.
  2. Behandle og bygge inn såret
    1. Overfør hvert sår til en innbyggingskassett. Etikettinnbygging kassetter i blyant som prosessen vil fjerne blekk.
    2. Behandle vevet enten manuelt eller ved hjelp av en automatisert prosessor ved å dehydrere vevet med økende etanolprosenter, rydding med xylen, og infiltrere vevet med parafinvoks (tabell 1).
    3. Bygg inn såret 90° ("stående") fra den horisontale overflaten av innebyggingsformen (figur 3A,B).

6. Analyse av sårområde 0

  1. Last ned NIH-Image J eller NIH-Fiji gratis programvare (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Åpne en fil med et bilde av dag 0 sår.
  3. Merk av i boksen for"Område"under Analyser | Angi målinger.
  4. Velg "Angi skala" under Analyser. Angi avstanden i piksler, den kjente tilsvarende avstanden og enheten for avstanden (= lengdeenhet) hvis makroskopiske målinger er en del av studien eller hopper over dette trinnet hvis det bare er behov for relative målinger.
  5. Velg "Frihåndsvalg" på Fiji-verktøylinjen.
  6. Skissere sårets omkrets.
  7. Klikk Mål under Analyser.
  8. Opprett et regneark for å holde oversikt over målingene per dyr per sår.
  9. Kopier målingen av sårområdet i regnearket.
  10. Beregn gjennomsnittsområdet og standardavviket for alle sår for et gitt eksperiment.
  11. Ekskluder eventuelle sår utenfor to standardavvik av gjennomsnittet fra histologisk analyse.

7. Seriell snitting

  1. Chill parafin-innebygde sårblokker ved 4 ° C over natten.
  2. Sett parafinblokken på mikrotomens blokkholder og orienter slik at bladet skjærer rett over blokken. Orienter blokken slik at vevet "står" ved 90 ° slik at samtidig snitting av epidermis og dermis (figur 3C, D).
  3. Lag 2-4 bånd på 20-30 parafinseksjoner på 7 μm hver.
  4. Bruk en tørr pensel og en disseksjon erting nål for å overføre hvert bånd til en fast, men manipulerelig overflate som en fast svart plastark.
  5. Koble den øverste delen av hvert bånd med et barberblad og plasser på et mikroskop lysbilde.
  6. Vær oppmerksom på de uopphetede seksjonene under et brightfield-mikroskop for å finne ut hvilke som inneholder sårede vev, som kan identifiseres ved fravær av hårsekken, endringer i utseendet på bindevevet eller epidermis, og / eller tilstedeværelsen av en scab (figur 4A, B).
  7. Kast utundte seksjoner opp til 20 seksjoner før begynnelsen av såret.
  8. Seksjon gjennom såret ved å gjenta trinn 7.3 og 7.4 til det ikke oppdages sår i uoppdagede seksjoner.

8. Montering av parafinseksjoner

  1. Separate parafinseksjoner hver 5 seksjon med et barberblad, som starter med det første båndet (figur 3E).
  2. Etikettmikroskop glir med både lysbildenummeret og alle inndelingsnumrene.
  3. Ta tak i gruppen på 5 seksjoner med en våt pensel og flyte dem på overflaten av vannet i et varmt vannbad (40-45 °C) for å flate dem ut.
  4. Plukk gruppen på 5 seksjoner ut av vannbadet ved hjelp av en av de merkede mikroskopskliene (figur 3F) og plasser på et glidevarmersett ved 37 °C i opptil 24 timer.
  5. Lagre lysbildene stående i en lysbildeboks.

9. Histologisk farging

  1. Overfør hvert8. mikroskop (tilsvarende hver40. parafinseksjon) til et fargestativ og flekk med hematoksylin og eosin.

10. Mikroskopisk bildebehandling

  1. Skaff deg bilder ved hjelp av et lyst feltmikroskop utstyrt med et 4x mål og digitale oppkjøpsfunksjoner. Ta opp skalaen som bildet er tatt på.
  2. Bilde hele såret av den øverste delen av hver farget lysbilde og sørg for å inkludere noen uavbrud vev på hver side. Ta flere overlappende bilder hvis såret er større enn rammen på et enkelt bilde.
  3. Lagre filen, inkludert inndelingsnummeret for morfometrisk analyse. Bruk seksjonsnummeret etterfulgt av a, b, c, etc. for overlappende bilder av samme sår.

11. Morfometrisk analyse

MERK: Når såret strekker seg over flere bilder, summerer du målingene som er tatt fra de enkelte bildene, for å oppnå én verdi per metrisk per sårdel som skal registreres i regnearket.

  1. Åpne en digital fil av et farget sårbilde i Bilde J. Ikke bruk sydde bilder til analyse. Utfør målinger på zoomede overlappende bilder ved å finne landemerker for å forlate og plukke opp målinger fra bilde til bilde.
  2. Angi skala- og måleinnstillinger.
    1. Velg "Angi skala" under Analyser. Angi avstanden i piksler, den kjente tilsvarende avstanden og enheten for avstanden (= lengdeenhet). Skalaen skal vises i vinduet og skal tilsvare skalaen bildet ble anskaffet på.
    2. Merk av i boksen"Global"for å holde skalaen den samme for hvert åpne bilde.
    3. Gjenta trinn 11.2.1 til 11.2.2 hver gang Bilde J lukkes og åpnes på nytt.
    4. Merk av i boksen for"Område"under Analyser | Angi målinger.
  3. Mål sårlengden
    1. Velg "Frihåndsvalg" på Fiji-verktøylinjen.
    2. Mål fra den siste hårsekken i det uskadede vevet på den ene siden av såret til den første hårsekken i det uskadede vevet på den andre siden av såret (figur 4A, B).
    3. Spor langs dermo-epidermal krysset for å nå disse to landemerkene. Hvis epidermis ikke dekker hele såret, følg dermo-epidermal krysset på den ene siden av såret og hvor den migrerende tungen ender fortsette å følge det overlegne aspektet av granulering vev eller krysset mellom granulering vev og scab til du når migrerende tungen og deretter til slutt den første hårsekken av uskadet vev på den andre siden (Figur 4E, F).
    4. Klikk Målunder Analyser. Lengden på målingen vises i de samme enhetene som angitt i skalaen.
    5. Opprett et regneark for å holde oversikt over målingene (Tilleggstabell 1).
    6. Kopier sårlengden inn i regnearket.
  4. Mål epidermal lengde
    1. Hvis epidermis dekker hele såret, er epidermal lengde den samme som sårlengden.
      1. Kopier "sårlengde"-målingen til kolonnen "epidermal lengde" i Excel-regnearket og hopp til trinn 11.5.
    2. Hvis epidermis ikke dekker hele såret, velger du "Frihåndsvalg" og måler avstanden mellom hver epidermal forkant etter det overlegne aspektet av granuleringsvevet eller krysset mellom granuleringsvevet og scab til den første hårsekken (figur 4C, D).
      1. Klikk Målunder Analyser.
      2. Trekk denne målingen fra sårlengden og registrer nummeret under "epidermal lengde" i Excel-regnearket.
  5. Mål sårområdet
    1. Velg "Frihåndsvalg" på Fiji-verktøylinjen.
    2. Mål fra den siste hårsekken i det uskadede vevet på den ene siden av såret til den første hårsekken i det uskadede vevet på den andre siden av såret (figur 4A, B, E, F).
    3. Spor langs det overlegne aspektet av epidermis (inkluderer ikke scab) eller det overlegne aspektet av granuleringsvevet hvis såret ikke er fullt dekket av epidermis.
    4. Fortsett å spore vertikalt langs hårsekken inn i granuleringsvevet når det motsatte hårsekken er nådd og til fettvev eller muskel er nådd. Følg den underlegne grensen til granuleringsvevet til motsatt side av såret og bli med i utgangspunktet langs hårsekken for å lukke området (figur 4E,F).
    5. Klikk Målunder Analyser.
    6. Kopier sårområdet inn i regnearket under "sårområdet målt".
  6. Mål epidermalområdet
    1. Velg "Frihåndsvalg" på Fiji-verktøylinjen.
    2. Hvis såret er fullstendig epitelialisert:
      1. Spor langs det overlegne aspektet av epidermis til det motsatte hårsekken er nådd og fullføre området ved å "gå tilbake" til utgangspunktet etter dermo-epidermal krysset mellom epidermis og dermis (Figur 4D).
      2. Klikk Målunder Analyser.
      3. Kopier epidermalområdet til Excel-regnearket under "epidermal-området målt" og hopp til trinn 11.7.
    3. Hvis såret ikke er fullstendig epitelialisert:
      1. Spor langs det overlegne aspektet av epidermis til forkant og gå tilbake til utgangspunktet etter dermo-epidermal krysset (figur 4C).
      2. Klikk Målunder Analyser.
      3. Gjenta trinn 11.6.3.1 og 11.6.3.2 på motsatt side av såret.
      4. Klikk Mål under Analyser.
      5. Sum de to tallene innhentet i trinn 11.6.3.2 og 11.6.3.4 og skriv inn resultatet under "epidermal område målt" i regnearket.
  7. Gjenta trinn 11,3 til 11,6 på hver40.
  8. Beregn epidermalområdet av hele såret.
    1. Opprett en ny kolonne i regnearket "epidermal område beregnet" ved siden av "epidermal lengde."
    2. Multipliser tallet for "epidermal lengde" med 280 for hver seksjon unntatt den siste (7 μm tykk seksjon x 40 seksjoner).
    3. Multipliser tallet for "epidermal lengde" med 7 for den siste delen (tykkelsen av seksjonen).
    4. Sum verdien av "epidermal området beregnet" for hver seksjon for å oppnå epidermal området av hele såret.
  9. Beregn sårområdet av hele såret.
    1. Gjenta trinn 11.8.1 til 11.8.4 ved hjelp av målingene sårlengde.
  10. Beregn epidermalvolumet av hele såret.
    1. Gjenta trinn 11.8.1 til 11.8.4 ved hjelp av målingene "epidermal målt".
  11. Beregn sårvolumet av hele såret.
    1. Gjenta trinn 11.8.1 til 11.8.4 ved hjelp av målingene "sårområde målt".
  12. Beregn prosentandelen av epidermal volum i såret.
    1. Del det totale epidermale volumet med det totale sårvolumet og multipliser med 100 for å oppnå prosentandelen (ikke gjør dette forholdet for hver seksjon).
  13. Beregn prosentandelen av epidermal område blant sårområdet.
    1. Del det totale epidermale området med det totale sårområdet og multipliser med 100 for å oppnå prosentandelen. Hvis et sår er fullstendig epitelialisert, bør dette nummeret være 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 viser området i målte og beregnede verdier oppnådd ved å utføre morfometrisk analyse på villtype sår generert i forskjellige musestammer av flere kirurger og analysert av forskjellige individer. Villtype mus fra forskjellige stammer kan vise statistiske forskjeller som beskrevet både i våre studier og ilitteraturen 9,10. Basert på disse representative resultatene anbefaler vi at i løpet av en studie brukes mus fra bare en stamme. Selv om vi anbefaler at den samme personen utfører alle sårene i en bestemt studie, kan flere personer fungere som kirurger så lenge sårområdet på dag 0 ikke er statistisk forskjellig mellom individets arbeid. Til slutt, fordi den morfometriske analysen som er beskrevet i denne protokollen, kan være omfattende, kan flere personer analysere deler av samme eksperiment, men bare hvis resultatene av deres analyse av to prøver er innenfor 5% av hverandre. Det er imidlertid å foretrekke å ha en enkelt person som analyserer sårene på en blindet måte for å unngå bias.

Figur 6 viser en metaanalyse som sammenligner sårmålinger oppnådd ved å følge protokollen som er beskrevet i dennestudien 11 med målinger hentet fra "midten" av såret og 40 omkringliggende seksjoner. I figur 6Able epidermalområdet og sårområdet beregnet ut fra måling av epidermal og sårlengder på sårseksjoner etterfulgt av beregningen av prosentandelen av epidermalområdet blant sårområdet (noen ganger referert til som "prosentandel av nedleggelse" eller "prosentandel av epitelisering"). Tilsvarende, i figur 6B,ble prosentandelen av epidermis i såret oppnådd som forholdet mellom epidermalvolumet (beregnet fra det målte epidermale området) over sårvolumet (beregnet fra det målte sårområdet). For begge parametrene viste analysen av hele såret sterke statistiske forskjeller mellom grupper (opp til P < 0,001 etter enveis Anova). Betydningen ble imidlertid redusert (opp til P < 0,01 etter enveis Anova) da bare 40 seksjoner i midten av ville bli analysert. Disse resultatene viser en reduksjon i nivået av betydning når bare en undergruppe av såret analyseres. Disse dataene tyder på at defekter med liten effektstørrelse sannsynligvis bare vil bli oppdaget når du utfører morfometrisk analyse på hele såret, og at mer mild sårheling fenotyper vil bli savnet fra en "midten av såret" type analyse.

Vanlig praksis for å analysere in vivo sårheling innebærer å måle sårets område på histologiske seksjoner valgt et sted i såret12. Med det i tankene ble gjennomsnittet av det målte sårområdet fra de serielle delene av hele sårene sammenlignet med den som ble hentet fra de midterste delsettseksjonene. Resultatene viste ingen signifikant forskjell mellom eksperimentelle grupper og mellom analysemetode (figur 6C). Gjeldende protokoll bruker imidlertid det målte området (vist i figur 6C) over hele såret for å beregne sårvolumet. Som vist i figur 6Der det beregnede sårvolumet (som bare kan beregnes ved hjelp av analysen av hele såret) signifikant forskjellig mellom de eksperimentelle gruppene. I sum viser disse representative resultatene viktigheten av grundig histologisk analyse av sårhelingsparametere som er beskrevet i denne protokollen for å oppdage fenotyper som ellers ville ha blitt savnet ved hjelp av en mer tradisjonell sårhelingsanalyse.

Figure 1
Figur 1: Bilateral eksisjonell sårprosedyre. (A) Representativt bilde av en mus etter klipping og barbering av hår fra operasjonsområdet. (B)Huden klemt mellom skulderbladene langs den dorsale midtlinjen. (C) Musen plassert på siden med hudfolden lagt flatt. (D)Representasjon av biopsi punch plassering. (E) Punched skinfold. (F)Musen med to bilaterale sår på dag 0 og den utskåret punch biopsi kontroll vev som angitt av de hvite pilene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sårhøstingsprosedyre. (A-C) Makroskopiske fotografier av 6 mm eksisjonelle sår etter 4 dager (A), 7 dager (B) og 11 dager (C). -Det er ikke noe å si på. Med et skalpellblad ble det laget et kutant snitt i form av et bredt rektangel som inkluderer sårene og omkringliggende uavbrutt vev. (F)Huden ble frigjort fra underliggende vev med tang og saks. (G)Representasjon av høstede bilaterale sår. (H)Den stiplede hvite linjen representerer grensen til vevet som ville bli høstet etter bruk av en punch biopsi (denne metoden gjør det mulig for standardisert mengde vev høstet). (I)Den stiplede hvite linjen representerer grensen til vevet som ville bli trimmet for histologi (rektangulær form gir enklere innebygging). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Løsning Tid (minutter) Temperatur (Celsius) Trykk (kPa)
80% ETOH 30 Rt N/a
95% ETOH 30 Rt N/a
100% ETOH 30 Rt N/a
Xylen 30 Rt N/a
Xylen 30 Rt N/a
Parafin 30 60 20
Parafin 30 60 20

Tabell 1: Prosedyre for prøvebehandling for parafininnbygging. RT = romtemperatur. I/T = ikke aktuelt.

Figure 3
Figur 3: Innbygging og snitting av sår. (A)Parafinbehandlet sår liggende flatt i en innebygging mold. (B) Såret ble holdt på 90° ("stående") fra den horisontale overflaten av formen for innebygging. (C) Parafin-innebygd sår riktig orientert for snitting (D) Parafin blokk montert på mikrotomen ble delt i bånd på ca 20 seksjoner (E) Parafin bånd kuttet i 5-seksjon trinn som angitt av de hvite parentes. (F)Serielle seksjoner lagt flatt i et varmt vannbad (40-45 °C) ble montert på et mikroskopsklie. Tegneserien i (A-C) representerer såret (oransje) i huden (blå) med riktig orientering av epidermis (e) og dermis (d) for hvert trinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Histologiske egenskaper ved sår og illustrasjon av morfometriske parametere. (A, B) Histologiske trekk ved en dag 4 (A) og en dag 7 (B) 6 mm sår. (C-F) Representasjon av de forskjellige målingene som brukes til å utføre den kvantitative morfometriske analysen: lengden på epidermis (C, D, prikket svart linje), målt område av epidermis (C, D, gul skyggelagt område), lengden på såret (E, F, stiplet gul linje) og målt område av hele såret (E, F, grå skyggelagt område). HF = hårsekken; skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Morfometriske egenskaper av representative 6 mm villtype sår på dag 4, dag 7 og dag 11 etter såret. Spredte plott representerer data hentet fra morfometriske analyser av 6 mm villtype sår generert i forskjellige musestammer av flere kirurger og analysert av forskjellige individer. (A) sårvolum, (B) epidermal volum, (C) prosentandel av epidermis i såret, (D) sårområde (beregnet), (E) epidermal område (beregnet), og (F) prosentandel av epidermal område blant sårområdet viser variasjonsområdet i morfometriske verdier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Metaanalyse som sammenligner parametere hentet fra hele såret med midten av såret identifiserer nye defekter med høyere betydning. Sårheling morphometry ble utført på dag 7 sår injisert med saltvann (kontroll), transformere vekstfaktor beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 med nøytraliserende antistoff (Tgfb3 + NAB) og nøytraliserende antistoff alene (NAB). Målinger ble utført på serieliserte seksjonerte sår ("hele") eller på 40 seksjoner fra midten av såret ("midten") og brukes til å beregne prosentandelen av epidermal område over sårområdet (A), prosentandelen epidermis i såret (B), og sårvolumet (D). (C) representerer gjennomsnittet av sårområdet målt på hele eller midten av såret. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = ikke signifikant, enveis Anova). Dette tallet er endret ved hjelp av data fra Le et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: Et eksempel på et regneark for registrering av morfometriske målinger. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den bilaterale eksisjonelle sårmodellen er en svært tilpassbar prosedyre som kan brukes til å studere mange forskjellige aspekter ved sårheling. Før du begynner et sårhelingsprosjekt, bør etterforskerne utføre en kraftanalyse for å bestemme antall sår som trengs for å oppdage en defekt av en bestemt effektstørrelse. Det finnes uoverensstemmelser i litteraturen om hvorvidt individuelle mus eller sår skal brukes som biologiske repliker, men en fersk studie viste at det ikke er noen signifikant sammenheng mellom to sår på et enkelt dyr4. Dette tyder på at sår fra et enkelt dyr er uavhengige av hverandre og kan betraktes som biologiske repliker, noe som reduserer antall mus som kreves for å oppdage en defekt. Dette er relevant når man vurderer små effektstørrelser som et høyt antall sår er nødvendig for å nå betydning4. I tillegg kan resultatene av kraftberegningen påvirke hvor mange sår som utføres på hvert dyr, med 2 og 4 sår per dyr som er mest vanlig.

Den kirurgiske protokollen i seg selv er også svært fleksibel. Mens vi anbefaler bedøvelse av isofluran vaporizer på grunn av den korte prosedyren lengde og rask gjenoppretting (10-15 min per mus), etterforskere uten tilgang til en fordamper kan bruke injiserbare anestesi inkludert ketamin / xylazine eller pentobarbital. Valg av et passende smertestillende er spesielt kritisk, da det gjelder de inflammatoriske fasene av sårheling. Bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDS) som Flunixin meglumin eller Meloksikam bør brukes med forsiktighet da de kan redusere betennelse. Opioider foretrekkes derfor i studier der betennelse undersøkes. Vi anbefaler analgeics (f.eks Buprenorphine Sustained-Release) som gir opptil 48 timer analgesi og eliminerer behovet for gjentatte, ekstra doser. Alle kirurgiske prosedyrer bør utføres i samsvar med føderale retningslinjer og støttes av en godkjent dyreprotokoll.

Sårheling er en prosess som omfatter flere faser, som hver er preget av forskjellige biologiske prosesser som involverer forskjellige celletyper3. Den inflammatoriske fasen oppstår mellom dag 0 og 5, med tidlig migrering av polymorfoonukleære nøytrofiler (PMN) og makrofager til skadestedet13. Den proliferative fasen oppstår mellom 3 og 14 dager med re-epitelisering tar en varierende mengde tid basert på størrelsen på såret14. I denne protokollen brukte vi en 6 mm biopsi punch og de fleste sår ble re-epitelialisert av 7 dager. Denne tidsrammen må imidlertid forkortes hvis mindre slag ble brukt (de er tilgjengelige så små som 1 mm). I kombinasjon med tidligere tidspunkter kan disse mindre sårene være å foretrekke å redusere mengden histologiske analyser15. Til slutt oppstår ombyggings- og modningsfasene etter 7 dager og opptil et år etter skaden16. Disse senere tidspunktene kan være nødvendig for å undersøke modningen av såret eller for å undersøke sårhelingsforsinkelser hos eksperimentelle dyr. Derfor må undersøkeren bestemme de kritiske tidspunktene som kreves for å undersøke bestemte faser av sårheling basert på deres spesielle hypotese5.

Analysen av sårheling er ofte ikke begrenset til histologiske analyser. Unstained parafin seksjoner kan brukes til ytterligere analyser som immunofluorescence eller Massons trichrome for kollagen deponering. Behandlingen av kontrollvev (punch biopsier) og høsting trinnene i vevet vil alle avhenge av hvordan, i tillegg til histologiske analyser, sårheling vurderes. Som en del av den kirurgiske protokollen fjernes punch biopsier for å generere eksisjonssåret. Disse slagene kan tjene som viklet kontrollvev for nedstrøms applikasjoner som protein (for vestlig eller cytokin profilering), DNA eller RNA ekstraksjon og bør behandles tilsvarende. Det anbefales at minst ett slag lagres for histologisk analyse, spesielt i tilfeller der huden behandles før såret (for eksempel påføring av tamoxifen for induksjon av Cre-Lox rekombinasjon17). Undersøkelse av punch kan bestemme effekten av behandlingen på kutan morfologi eller bare tillate vurdering av baseline kutan morfologi av den bestemte musemodellen som brukes. Sår som ikke brukes til histologi kan høstes med en punch biopsi som omfatter størrelsen på såret. Denne prosedyren har noen fordeler, inkludert høsting av samme mengde vev uavhengig av sårstørrelsen (større sår har mindre omkringliggende sunt vev). Til slutt beskriver vi bruk av 4% paraformaldehyd som fikseringsmiddel og parafin som materiale for å bevare og bygge inn vev, henholdsvis. Andre fikseringsmidler kan være nødvendig for visse applikasjoner og kan erstattes (for eksempel Carnoys eller Bouins fikseringsmidler). For best mulig immunofluorescerende farging, frysing og innebygging av såret i Optimal Cutting Temperature sammensatt etterfulgt av frossen snitting er fortsatt den metoden for valg.

Seksjonering av sårede vev kan by på mange utfordringer, spesielt dag 4 sår på grunn av tilstedeværelsen av scab. For å generere seksjoner av høy kvalitet anbefales det å kontrollere at alle deler av mikrotomen er tett festet, blokkholderen trekkes tilbake til startposisjonen, bladholderen er satt mellom 0 og 10° og bladet er tett festet, men ikke strammet. Selv om parafinblokken er kjølt, kan vevet fortsatt makulere. Hvis makuleringen fortsetter, kan et stykke is plasseres på blokken i 5 minutter mens den fortsatt er montert. Når snittingen har begynt, anbefales det sterkt å unngå å fjerne blokken fra mikrotomen for å forhindre tap av parafinseksjoner. Det er viktig å registrere eventuelle tapte parafin seksjoner, både deres tall og deres rangering i seriell snitting. Dette vil påvirke den morfometriske analysen og må vurderes. Etter initiering av snitting kan identifisering av sårede vev på uopphetede seksjoner være vanskelig, spesielt hvis det ikke er kjent med histologi. Når du er i tvil, anbefales det å være konservativ og holde alle seksjonene som inneholder vev. Når den histologiske flekken er utført, vil vevsorganisasjonen være tydeligere og såret mer tydelig. Noen ganger kan hårsekkene ikke være tydelig synlige eller kan være langt fra sårkanten. Hvis dette er tilfelle, kan andre viktige egenskaper ved det sårede vevet brukes til å etablere grensene for såret, inkludert en brå økning etterfulgt av umiddelbar reduksjon i epidermal tykkelse og skarpe endringer i organiseringen av bindevevet (figur 4A-B).

Digital bildebehandling er et kritisk skritt i den morfometriske analysen. Den morfometriske analysen bør utføres på individuelle bilder ved hjelp av et landemerke på hvert bilde for å unngå gjentatte målinger. Det er imidlertid mulig å sy alle rammene sammen ved hjelp av digital programvare og utføre analysen på ett enkelt bilde. Selv om dette virker lettere i begynnelsen, kan manipulering av et stort bilde bremse analyseprosessen ned. Valget av seksjonen er også avgjørende for analyse. Selv om vi anbefaler å kjøpe den øverste delen av hvert8. lysbilde digitalt, bør kvaliteten på seksjonen prioriteres, og det beste av de 5 delene på lysbildet skal avbildes. Seksjoner med små folder kan fortsatt analyseres ved å estimere området / lengden på folden. Antallet av den bestemte delen skal registreres både i den digitale filen og i Excel-regnearket, slik at avstanden mellom forrige og neste analyserte inndeling kan justeres tilsvarende.

Kutane sår påvirker anslagsvis 6,5 millioner mennesker med behandling som koster over $ 25 milliarder årlig18 og er en iboende komponent i kirurgiske prosedyrer i tillegg til å være sekundært til mange andre helsemessige bekymringer, inkludert diabetes og fedme. Musen har blitt brukt som en praktisk modell for å studere menneskelige sykdommer på grunn av den enkle i å manipulere genomet, til tross for ofte viser en subtil fenotype i forhold til den menneskelige lidelsen. Den bilaterale eksisjonelle sårmodellen og påfølgende morfometriske analysen beskrevet i denne protokollen er betydelig på grunn av dens evne til å løse vanskeligheten med å oppdage mindre defekter i en iboende kompleks sårhelingsprosess19. På grunn av sin større følsomhet og redusert variasjon, gir denne protokollen muligheter til å bruke færre dyr for å oppnå samme eksperimentelle følsomhet. Protokollen er svært passelig og kan brukes til å studere alle stadier av vev reparasjon. Detaljert histologisk morfometrisk analyse i kombinasjon med fenotypisk karakterisering av vevet har stort potensial til å øke kunnskapen som trengs for å fremme forståelsen av kritiske faktorer som modulerer vevreparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til alle medlemmene av Dunnwald Lab som har bidratt til optimalisering av denne protokollen gjennom årene, og til Gina Schatteman hvis utholdenhet i å fremme bruk av seriell seksjonering for såranalyse gjorde etableringen mulig. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra NIH/NIAMS til Martine Dunnwald (AR067739).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep NOVAPLUS V9100 70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads Cellpath 22-222-012
Black plastic sheet Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips 22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds 22 x 22 x 12
Embedding rings Simport Scientific Inc. M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad Conair Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine Aplicare 82-255
Processing cassette Simport Scientific Inc. M490-2
Razor blades ASR .009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors sterile for surgery
Skin biopsy punches Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides Fisher Scientific 22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip sterile for surgery
tweezers, tapered tip sterile for surgery
WypAll X60 Kimberly-Clark 34865

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Tags

Denne måneden i JoVE sårheling eksisjonelt sår histologi morphometry hud mus kirurgi vev reparasjon
Murine Excisional Wound Healing Modell og histologisk morfometrisk såranalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine… More

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61616, doi:10.3791/61616 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter