该协议提出了一种利用吸收电压敏感染料和光二极管阵列在非转基因无脊椎动物物种中单细胞分辨率成像神经元种群活动的方法。这种方法能够快速工作流程,其中成像和分析可以在一天的过程中进行。
转基因无脊椎动物制剂的发展,其中可用光记录和操纵可分辨神经元的活性,是研究行为神经基础的革命性进展。然而,这一发展的一个缺点是,它倾向于将调查人员集中在极少数的”设计者”生物(例如 ,C.elegans 和 D罗索菲拉)身上,这可能对许多物种进行比较研究产生负面影响,而这种研究对于确定网络功能的一般原则是必要的。本文阐述了非转基因胃足类大脑中具有电压敏感染料的光学记录如何能够快速(即在单个实验过程中)揭示其神经网络功能组织单细胞分辨率的特点。我们详细概述了我们的实验室在多个胃足类动物的CNS行为相关运动程序中获取数十到+150个神经元的行动潜在痕迹的解剖、染色和记录方法,其中包括一个神经科学的新方法——神经科 伯吉亚斯蒂芬妮亚。成像使用吸电电压敏感染料和 464 元素光二极管阵列进行,该阵列以 1,600 帧/秒的速度进行采样,速度足以捕获记录的神经元生成的所有动作电位。每次准备时可获得多分钟录音,很少或根本没有信号漂白或光毒。通过描述的方法收集的原始光学数据随后可以通过各种图示方法进行分析。我们的光学记录方法可以很容易地用于探测各种非转基因物种的网络活动,因此非常适合对大脑如何产生行为进行比较研究。
无脊椎动物(如嗜血杆菌和C.elegans)转基因系的发展提供了强大的系统,在这种系统中,行为的神经基础可以进行光学审讯和操纵。然而,这些特殊的准备可能会降低对非转基因物种神经回路研究的热情,特别是在将新物种引入神经科学研究方面。只关注一两个模型系统不利于对网络功能一般原理的探索,因为比较研究是发现网络功能1、2、3、4的基本途径。我们在这里的目的是展示一种大规模成像方法,以便快速了解胃足神经网络的功能结构,以促进神经网络功能的比较研究。
胃足类软体动物,如阿普利西亚,莱姆奈亚,特里托尼亚,普鲁罗布兰查亚等,长期以来一直被用来研究神经网络功能的原则,在很大程度上是因为它们的行为是由位于黑帮表面的大型,往往单独识别的神经元调解,使他们很容易获得记录技术5。 在20世纪70年代,可以集成到等离子膜中的电压敏感染料(VSD)很快实现了对多个神经元6产生的运动潜力的首次无电极记录。在这里,我们展示了我们使用VSD来检查网络活动在几种胃足类,包括一个新的神经科学,伯格亚斯蒂芬妮。成像设备是一个商业上可用的464元素光二极管阵列(PDA),以1,600帧/秒(图1)取样,当与快速吸收VD一起使用时,揭示了所有记录的神经元7的动作潜力。所有二极管记录的信号在采集后立即显示,并叠加在PDA采集软件中的结节图像上,从而有可能在同一制备8、9中用尖锐的电极来研究感兴趣的神经元。
在原始的 PDA 数据中,许多二极管冗余地记录较大的神经元,许多二极管还包含来自多个神经元的混合信号。一个转折点是开发一种自动尖峰排序方法,使用独立的组件分析,以快速处理每个原始的464通道PDA数据集成一组新的痕迹,其中每个记录的神经元出现在一个单独的跟踪,只包含其行动潜力10,11。
在本文中,我们概述了从胃足神经系统获得具有光二极管阵列和快速吸收性VD的大规模行动潜在记录所涉及的基本步骤。 此外,我们还说明了分析方法,可用于聚类和映射光学记录的神经元,关于其功能合奏,并用于特征的人口水平特征,往往不明显,通过简单的检查发射痕迹12,13。
实施大规模 VSD 成像方法的最重要细节之一是最大限度地减少振动,从而在二极管上产生对比边缘的运动,从而产生大量人工信号。由于吸收性VD在具有运动潜力的光强度上产生很小的百分比变化,振动伪体如果不被阻止,就会遮盖感兴趣的神经元信号。我们采用了几种方法来最大限度地减少振动。首先,我们的成像室位于一楼,将准备与建筑空气处理设备和许多其他来源相关的振动隔离开来。其次,使用了基于弹簧的隔离表,其他 PDA 用户已确认该表比较常见的空气表16提供更好的振动阻尼效果。第三,使用浸水目标,消除表面波纹引起的图像波动。第四,正在成像的制备被轻轻压在室盖唇底部和从上面压下来的覆盖唇碎片之间,硅胶塞或石油果冻保持到位,进一步稳定了制备。这也使结石或结石的凸面被成像,导致目标焦点平面上的神经元增加记录的神经元数量。
为了最大限度地提高因动作潜力导致的 VSD 光吸收程度的微小变化的信号与噪声比,必须通过准备到 PDA 实现近饱和光,同时最大限度地减少染料的光模糊。为此,我们通常以 3-4 V 的静息光强度工作,通过 PDA 控制面板在 1x 位置的增益开关(PDA 的 464 放大器在 10 V 光下饱和)进行测量。在数据采集过程中,增益系数更改为 100 倍。获得足够的光线,达到3-4 V的PDA测量可以通过几种方式完成。首先,使用超亮的 LED 光源,该光源提供适合使用中吸光染料的吸收特性的波长。因此,使用了 735 纳米 LED 共生灯,该灯与 RH155 和 RH482 的最佳吸收波长重叠。其次,如有必要,使用翻转式下台冷凝器,将光线从 LED 光源集中到较小的区域。第三,调整冷凝器高度,实现 Köhler 照明,确保高亮度、均匀度和最大图像质量。第四,确保光通路中没有热滤光片,从而减小 LED 灯的 735 纳米波长。第五,如果需要更多的光,从光学通路中取出扩散器。第六,使用高 NA 目标,提供高空间分辨率,并允许足够的光水平在低光强度下达到 PDA。这使我们能够最大限度地减少光出血,以便我们能够使用所有文件中相同的光强度,每次准备获得几个 10-20 分钟持续时间的采集文件,并且不会显著丧失信号振幅或需要重新染色。关键是,如果实验者希望跟踪这些较长文件中的神经元,则确保焦距平面不会发生变化,并且准备不会移动。最后,将足够的光线输送到PDA的另一种方法是使用更薄、因此不那么不透明的幼年动物。
我们时不时地发现,光学信号的信号与噪声比变质和/或电机程序节奏不理想(例如,慢速或异常)。当这种情况开始持续发生时,我们将 VSD 的新解决方案混合在一起。VSD 的 Aliquot 通常在 -20 °C 的冰柜中存活约 6 个月。相关方面,值得注意的是,对于 Berghia来说,迄今为止,吸收VSD RH482取得了最好的效果。由于RH482比RH155更嗜脂,它可能会更好地染色 Bergghia相对较小的神经元,或更有效地留在神经元膜中,在用于这个热带物种的较高记录盐水温度。
基于 PDA 的神经活动成像的一个限制与 100 倍预增步骤之前硬件中电压信号的交流耦合有关:尽管这是消除该技术所需的高静息光水平产生的大直流偏移的必要功能,但 PDA 固有的交流耦合排除了膜电位缓慢变化的测量, 例如那些与突触输入相关的输入。如果需要记录缓慢或稳定状态的潜在变化,则可以使用直流耦合 CMOS 相机成像系统来捕获子保持活动。伯恩和他的同事最近用RH155来描述神经元在阿普利西亚17、18的布卡勒结石中的活动。我们使用这两个系统,发现CMOS相机,由于其探测器密度高得多(128×128),产生50倍更大的数据文件为相同的成像时间7。PDA 的较小文件有助于更快地处理和分析。这也使扩展的单一试验录音(图4)和学习研究,其中来自多个试验的数据串联成一个大文件之前尖峰排序,允许网络组织跟踪学习发展19。
在其他基于摄像头的调查中,Kristan 和他的同事使用荧光 VSD 来检查水痘的细分结体中的网络功能。在一项有影响力的研究中,这导致了一个神经元的识别参与动物决定游泳或爬行20。在另一项研究中,Kristan等人研究了水痘的游泳和爬行行为是由多功能电路与专用电路21驱动的程度。最近,Wagenaar和他的同事使用双面显微镜进行电压成像,允许他们从几乎所有神经元中记录水痘段结节22。与许多基于相机的成像方法相比,我们基于 PDA 的成像方法的一个优点是 ICA 快速和公正地进行尖峰排序,这是一种盲源分离形式,不涉及对结果处理的神经元边界的决策。
关于VSD的选择,吸收染料RH155和RH482的一个优点是与它们相关的很少到没有光毒性23,24,使记录时间比荧光VD的典型更长的时间。此外,我们使用的快速吸收VD非常适合记录胃足量制剂中过冲的体细胞作用潜力,其振幅通常为80mV。如图3G所示,我们的光学方法可以记录动作电位下射(我们的记录均无跟踪平均):这表明我们使用的 VSD 应该能够识别其他模型系统中的动作电位,这些电位在一定程度上减弱,因此在到达索马时不会过冲。然而,我们的光学方法可能并不理想,因为已知在索马中记录时会表现出高度衰减的动作潜力的物种。
目前对神经网络的很多研究都集中在少数名牌转基因物种上。然而,神经科学受益于对各种不同植物物种的研究。研究许多不同的物种提供了关于电路如何演变25,26的见解,并阐明网络功能的原则,可能是常见的植物1,2,3,4,27。到目前为止,我们已经将我们的成像方法应用于一些胃足类动物,包括阿普利西亚卡利波尼卡8,11,12,13,14,28,特里托尼亚二恶英8,9,11,14,19,28,特里托尼亚节日28, 普鲁罗布兰查亚卡利科尼卡(未公布的数据),最近贝尔吉亚斯蒂芬妮(图5)。这种方法的吸引力在于,它可以很容易地应用于许多物种,而不需要转基因动物。我们希望承认,我们使用VSD成像与快速吸收染料和PDA的脚步,开拓性的工作,完成了这在半完整,行为纳瓦纳克斯29和阿普利西亚30准备。我们强调我们的方法的快速性,部分是回答担心许多研究人员可能越来越不愿意开始网络研究的新物种,因为担心多年的研究将有必要的特点的基本网络组织之前,能够探索科学问题,广泛感兴趣的神经科学31。因此,我们在这里的目标是展示一种技术,大大加快了这个过程 – 以至于可以从单一的准备中获得对网络组织的显著当日洞察。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家1257923和NIH 1U01NS10837的支持。作者希望感谢王让在实验室的帮助。
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |