Summary
Detta protokoll presenterar en metod för avbildning neuronal befolkning verksamhet med encellig upplösning i icke-transgena ryggradslösa arter med hjälp av absorbans spänning känsliga färgämnen och en fotodiod array. Detta tillvägagångssätt möjliggör ett snabbt arbetsflöde, där avbildning och analys kan bedrivas under en enda dag.
Abstract
Utvecklingen av transgena ryggradslösa preparat där aktiviteten hos specifika uppsättningar av nervceller kan registreras och manipuleras med ljus representerar ett revolutionerande framsteg för studier av den neurala grunden för beteende. En nackdel med denna utveckling är dock dess tendens att fokusera utredare på ett mycket litet antal "designer" organismer (t.ex. C. elegans och Drosophila), vilket potentiellt negativt påverkar strävan efter jämförande studier över många arter, vilket behövs för att identifiera allmänna principer för nätverksfunktion. Den nuvarande artikeln illustrerar hur optisk inspelning med spänningskänsliga färgämnen i hjärnan hos icke-transgena snäckor kan användas för att snabbt (dvs. inom tiden för enstaka experiment) avslöja funktioner i funktionell organisation av deras neurala nätverk med encellsupplösning. Vi beskriver i detalj dissekerings-, färgnings- och inspelningsmetoderna som används av vårt laboratorium för att få åtgärdspotentialspår från dussintals till ~ 150 neuroner under beteenderelevanta motorprogram i CNS av flera snäckor, inklusive en ny till neurovetenskap - nudibranch Berghia stephanieae. Avbildning utförs med absorbansspänningskänsliga färgämnen och en 464-element fotodiodmatris som provtar vid 1 600 bilder / sekund, tillräckligt snabbt för att fånga alla åtgärdspotentialer som genereras av de registrerade nervcellerna. Flera flera minuters inspelningar kan erhållas per beredning med liten eller ingen signalblekning eller fototoxicitet. De obehandlade optiska data som samlas in genom de beskrivna metoderna kan därefter analyseras med hjälp av en mängd olika illustrerade metoder. Vår optiska inspelningsmetod kan lätt användas för att undersöka nätverksaktivitet i en mängd icke-transgena arter, vilket gör den väl lämpad för jämförande studier av hur hjärnor genererar beteende.
Introduction
Utvecklingen av transgena linjer av ryggradslösa djur som Drosophila och C. elegans har gett kraftfulla system där de neurala grunderna för beteende kan förhöras optiskt och manipuleras. Dessa speciella preparat kan dock ha nackdelen att minska entusiasmen för neurala kretsstudier av icke-transgena arter, särskilt när det gäller införandet av nya arter i neurovetenskaplig forskning. Att fokusera uteslutande på ett eller två modellsystem är skadligt för sökandet efter allmänna principer för nätverksfunktion, eftersom jämförande studier representerar en viktig väg genom vilken sådana principerupptäcks 1,2,3,4. Vårt mål här är att demonstrera en storskalig bildbehandlingsmetod för att få snabb inblick i den funktionella strukturen hos gastropod neurala nätverk, i ett försök att underlätta jämförande studier av neural nätverksfunktion.
Snäckor och andra har länge använts för att undersöka principer för neural nätverksfunktion, till stor del på grund av att deras beteenden förmedlas av stora, ofta individuellt identifierbara nervceller som ligger på gangliernas yta, vilket gör dem lättillgängliga för inspelningstekniker5. På 1970-talet utvecklades spänningskänsliga färgämnen (VSD) som kan integreras i plasmamembranet som snart möjliggjorde de första elektrodfria inspelningarna av de åtgärdspotentialer som genererades av flera nervceller6. Här demonstrerar vi vår användning av VSDs för att undersöka nätverksaktivitet i flera arter av snäckor, inklusive en ny till neurovetenskap, Berghia stephanieae. Bildbehandlingsenheten är en kommersiellt tillgänglig 464-elements fotodiodmatris (PDA) som provar vid 1 600 bilder/sekund (figur 1), som, när den används med vsd-enheter med snabb absorbans, avslöjar åtgärdspotentialerna hos alla registrerade nervceller7. Signalerna som registreras av alla dioder visas omedelbart efter förvärvet och läggs ovanpå en bild av ganglion i PDA-förvärvsprogramvaran, vilket gör det möjligt att undersöka nervceller av intresse med skarpa elektroder i sammaförberedelse 8,9.
I de råa PDA-data registrerar många dioder redundant de större nervcellerna, och många innehåller också blandade signaler från flera nervceller. En vändpunkt var utvecklingen av en automatiserad spiksorteringsmetod med oberoende komponentanalys för att snabbt bearbeta varje rå 464-kanalig PDA-datauppsättning till en ny uppsättning spår, där varje inspelad neuron visas i ett separat spår som bara innehåller dess åtgärdspotentialer10,11.
I den här artikeln beskriver vi de väsentliga stegen som är involverade i att få storskaliga action potentiella inspelningar från snäckorv nervsystemet med en fotodiod array och snabb absorbans VSDs. Vi illustrerar dessutom analytiska metoder som kan användas för att gruppera och kartlägga de optiskt inspelade nervcellerna med avseende på deras funktionella ensembler och för att karakterisera funktioner på befolkningsnivå som ofta inte är uppenbara genom enkel inspektion av avfyrningsspåren12,13.
Protocol
Arbetsflödet nedan sammanfattas i figur 2.
1. Minimera vibrationer
- Om möjligt, se till att riggen är på bottenvåningen och använd ett fjäderbaserat isoleringsbord, vilket dämpar ett bredare spektrum av vibrationsfrekvenser än luftbord.
- Om du använder ett fjäderbaserat bord, se till att det flyter (det måste justeras varje gång man lägger till eller tar något från bordet).
- Minska vibrationsbaserat brus i bildrummet så mycket som möjligt, även i den utsträckning som luftflödet stängs av vid avbildning vid behov. Minimera eventuella vibrationer som härrör från vätsketurbulens i perfusionssystem.
OBS: Den neurala preparatet får inte röra sig under förvärvet. Rörelser av något slag ger förskjutningar av kontrastkanter över dioderna, vilket leder till artefaktiska signaler. Om förfarandet innebär en stimulans under förvärvet får det inte inducera förberedelserörelse.
2. Kör ett pinhole-test för att möjliggöra korrekt anpassning av ganglionfoton med handdatorns data
- Placera en bit aluminiumfolie med 3 små hål i den på en mikroskopbild. Ta en bild av de tre hålen med digitalkameran monterad på sin parfokala fotoport.
- Använd bildframställningsprogramvaran som mednsluter handdatorn, skaffa en kort fil (t.ex. 5 s). Halvvägs genom förvärvet trycker du på bordet för att inducera vibrationsartefakter som kommer att vara mycket synliga runt kanterna på pinholes, så att bilden av pinholes kan justeras exakt med de optiska data.
- Använd funktionen Överlagra i bildframställningsprogrammet, som finns i menyalternativet "Display | Sidan Överlagra | Lägg över spår med extern bild | Lägg över bild" för att överlagra dioddata på pinholes fotot och sedan iterativt justera x-, y- och förstoringsinställningarna för fotot tills pinholesna sitter direkt ovanpå pinhole-artefakterna i dioddata.
- Spara dessa siffror för att justera förberedelsebilder tagna med kameran med dioddata i framtida experiment.
OBS: Pinhole-justeringen av handdatorn behöver endast utföras en gång efter att handdatorn har monterats på mikroskopet tills den roteras eller tas bort, då det måste göras igen.
- Spara dessa siffror för att justera förberedelsebilder tagna med kameran med dioddata i framtida experiment.
3. Dissekeringar för tre marina snäckor och snäckor
- För arter som växer till stor storlek, som Tritonia och Aplysia, börja med mindre individer, som har tunnare, mindre ogenomskinliga ganglier, vilket underlättar att få tillräckligt med ljus för optimal signal-till-ljud.
- Ha färdigfiltrerad konstgjord havsvatten som ska användas som saltlösning för dissekerings- och bildexperimenten.
OBS: I alla efterföljande steg i protokollet betecknar "saltlösning" artificiellt havsvatten. - Dissekering av Tritonia diomedea
- Placera ett djur i kylskåpet i ca 20 min för att bedöva det.
- För större djur, exponera hjärnan genom att hålla djuret i ena handen och låta huvudet sluta drapera över pekfingret för att exponera "nacken". För mindre djur, fäst dem dorsala sidan upp i en vaxfodrad dissekeringsrätt innan du exponerar hjärnan.
- Använd dissekeringssax, gör ett 3-4 cm mittlinjesnitt på djurets dorsala sida, ovanför buccalmassan (som kan kännas genom kroppsväggen).
OBS: Den nödvändiga delen av CNS, bestående av smälta, bilaterala cerebropleural och pedal ganglier, är orange och distinkt i utseende från den omgivande vävnaden; det ligger omedelbart bakre till noshörningsforerna och ovanpå buccalmassan. - Punktskatt CNS genom att skära av nerverna som innervatar djurets kropp med tång och mikrodissektionssax, och håll alla nerver som förbinder de centrala ganglierna intakta. Lämna en lång längd av pedalnerv 3 (PdN3), eller vilken nerv som stimuleras.
- Använd minutienstift för att fästa CNS på botten av en saltlösningsfylld elastomerfodrad skål för ytterligare dissekering. Håll preparatets temperatur vid 11 °C genom att perfusera skålen med saltlösning som levereras med ett återkopplingsstyrt Peltier-kylsystem i linje med hjälp av en peristaltisk pump.
- Använd tång och mikrodissektionssax och ta försiktigt bort det löst vidhäftande skiktet av bindväven från runt CNS. Lämna den fina mantan nära knuten till ganglierna.
- Kort (~ 10 s) doppa ganglierna i en lösning av 0,5% glutaraldehyd i saltlösning. Placera ganglierna tillbaka i den saltlösningsperfunderade elastomerfodrade skålen, så att saltlösningen kan tvätta bort glutaraldehyden innan VSD-färgningen påbörjas.
OBS: Denna lätta fix av bindväven och dess inneboende muskler hjälper till att förhindra rörelse under avbildning.
- Dissekering av Aplysia californica
- Söv ett cirka 40 g djur genom att injicera ~20 ml 350 mM MgCl2 i kroppen genom ventralytan (foten).
- Använd stift för att placera djuret ventral sida upp i en vaxfodrad dissekeringsform.
- Använd dissekeringssax, gör ett 2-3 cm mittlinjesnitt längs fotens mest främre utsträckning. Fäst fotens klaffar på vardera sidan av snittet för att avslöja en del av CNS och buccal massa.
OBS: Den nödvändiga delen av CNS, bestående av smälta cerebrala ganglier, och nära apposed, bilaterala pleura- och pedal ganglier, är gul-orange och distinkt i utseende från den omgivande vävnaden; den sitter dorsala och posterolateral till den bulbous muskulösa buccal massan. - Använd tång och dissekeringssax för att noggrant dissekera bort buccalmassan och avslöja cerebrala ganglier.
- Punktskatt CNS genom att skära av nerverna som innervatar djurets kropp med tång och mikrodissektionssax, och håll alla nerver som förbinder de centrala ganglierna intakta. Lämna en lång längd av pedalnerv 9 (PdN9), eller vilken nerv som kommer att stimuleras.
- Använd minutienstift för att placera CNS i en saltlösningsfylld elastomerfodrad skål. Håll preparatets temperatur vid 15-16 °C genom att genomspätt skålen med saltlösning som passerar genom en Peltier-kylanordning.
- Använd tång och mikrodissektionssax, ta bort överdriven bindväv från CNS och dissekera bort en ytlig del av hylsan på ganglion eller ganglier som ska avbildas. Var försiktig under denna process för att inte göra ett hål i mantlet, vilket skulle leda till att nervceller rinner ut inifrån.
- Kort (~ 20 s) doppa ganglierna i en lösning av 0,5% glutaraldehyd i saltlösning. Placera ganglierna tillbaka i den saltlösningsperfunderade elastomerfodrade skålen, så att saltlösningen kan tvätta bort glutaraldehyden innan VSD-färgningen påbörjas.
- Dissekering av Berghia stephanieae
- Placera ett djur i kylskåpet i ca 20 min för att bedöva det.
- Använd en elastomerfodrad skål fylld med saltlösning i rumstemperatur, placera minutienstift i både huvud och svans.
- Använd mikrodissektionssax, gör ett 5-7 mm dorsalt snitt ytligt till CNS.
OBS: Ögonen, mörka fläckar som bor inom djuret bredvid CNS, markerar bekvämt positionen för den nödvändiga delen CNS, som består av bilateralt smälta cerebropleural och pedal ganglier och sitter ovanpå buccal massan. - Punktskatt CNS genom att skära av nerverna som innervatar djurets kropp med tång och mikrodissektionssax. Låt nerven stimuleras tillräckligt länge för en sugelektrod.
4. Fläcka preparatet med ett spänningskänsligt färgämne
- Förbered lagerlösningar av antingen RH155 (även känd som NK3041) eller RH482 (även känd som NK3630 eller JPW1132).
- RH155: Lös upp 5,4 mg fast färgämne i 1 ml 100 % EtOH, pipettering 29 μL i vart och ett av 34 mikrocentrifugrör. Med innehållet i varje rör exponerat för luften, låt dem torka över natten i mörkret. Kapsla och placera de resulterande fasta alikvoterna av RH155, som var och en innehåller 0,15 mg, i en -20 °C frys.
- RH482: Lös upp 2 mg fast färgämne i 100 μL DMSO, dela lösningen i 20 alikvoter på 5 μL, som var och en innehåller 0,1 mg RH482, och förvara den i en frys med -20 °C.
OBS: För Tritonia och Aplysiakan antingen badperfusion eller tryckapplikation användas för att ladda VSD RH155 i nervcellerna i preparatet. Tryckapplikation har fördelen att exponera bara ganglion som avbildas till VSD.
- För badperfusion, tillsätt 5 ml saltlösning till var och en av de ovan nämnda alikvoterna av fast RH155 och virvel i lösningen, vilket ger en kombinerad lösning på 10 ml som innehåller 0,03 mg/ml RH155.
- Granska i mörker (för att undvika fotoblekning) i 1 till 1,5 timmar vid 11 °C för Tritonia och vid 16 °C för Aplysia. Behåll temperaturen genom att passera perfusionslösningen genom ett Peltier-kylsystem.
- För tryck applicering, tillsätt 500 μL saltlösning till en alikvot RH155 och virvel för att producera en färgämneskoncentration på 0,3 mg/ml.
- Dra ca 200 μL av lösningen i polyetenrör med hjälp av en handhållen mikrodispenser, vilket säkerställer att det finns en bra matchning mellan rördiametern och diametern på den ganglion som ska färgas.
- Använd en mikromanipulator för att försiktigt placera röränden över målgänget och sänka det tills det bildar en ombonad tätning på ganglionen. Använd den typ av kylsystem som beskrivs ovan för att hålla ganglierna vid önskad temperatur.
- Dämpa rumslamporna för att undvika fotoblekning och vrid mikrodispensatorns applikatorvrede var 5:e minut för att tvinga mer färg på ganglionen.
- Kontrollera vid 30 min för att bekräfta att bra färgning sker och fortsätt sedan under en total färgningstid på ca 1 timme.
- För färgning i Berghia, tillsätt 1 ml saltlösning till en frusen alikvot av RH482 och virvel för att lösa upp.
- Överför 200 μL av denna lösning till ett mikrocentrifugrör som innehåller 800 μL saltlösning och virvel till lösning, vilket ger en slutlig färglösning på 0,02 mg/ml RH482 i saltlösning med 0,1 % DMSO.
- Placera hela CNS i mikrocentrifugröret, linda röret i aluminiumfolie för att undvika fotoblekning och skaka för hand var 5-6 min i ca 1 h. Förvara de återstående 800 μL av den första lösningen i kylskåpet och använd i upp till 3 dagar för att färga efterföljande preparat.
5. Platta till preparatet och ställ in för nervstimulering
OBS: Stegen i detta avsnitt bör utföras under minimal belysning eller med grönt ljus för att minimera fotoblekning.
- Efter färgning, sänk ner CNS i saltlösning i bildkammaren och placera under ett dissekerande mikroskop.
- Placera silikonbitar (för Tritonia eller Aplysia)eller blobbar petroleumgel (för Berghia)till vänster och höger om ganglion/ganglierna som ska avbildas.
- Tryck ner en bit av glas eller plastskydd i lämplig storlek på preparatet för att platta till det. Tryck hårt men inte så hårt att det skadar nervcellerna.
OBS: Att platta ut preparatets konvexa yta på detta sätt kommer att göra ett större antal nervceller parfokala, vilket ökar antalet registrerade nervceller och kommer dessutom att bidra till att immobilisera preparatet under avbildning. - Om stimulera en nerv att framkalla ett fictive motorprogram, förbered en sugelektrod vars främre spets är ungefär lika bred som nervdiametern. Uppnå detta genom att noggrant smälta ett segment av PE-100 polyetenrör över en låga samtidigt som du försiktigt drar i båda ändarna av rörsegmentet och skär sedan den resulterande avsmalningen vid önskad punkt.
- Dra en liten volym saltlösning genom den avsmalnande änden av en polyetensugselektrod, följt av slutet av nerven som ska stimuleras, genom att fästa en längd av tjockväggiga, flexibla polymerrör på baksidan av elektroden och använda munsugning för att applicera negativt tryck.
- Bekräfta att saltlösningen i elektroden saknar bubblor som kan avbryta elektrisk ledning.
6. Förberedelse och optimering för avbildning
- Flytta kammaren till bildriggen. Starta saltlösningsperfusionen genom inspelningskammaren och placera temperatursonden nära preparatet. Ställ in temperaturregulatorn för önskad temperatur för de arter som avbildas (för Tritonia, 11 °C, för Aplysia, 15-16 °C eller för Berghia, 26-27 °C).
- Placera en klorerad silvertråd ner i sugelektroden, se till att den kommer i kontakt med saltlösningen i elektroden och sätt den andra Ag-AgCl-tråden (returvägen) i badhyddan, nära sugelektroden.
- Sänk ner vattensänkningslinsen i saltlösningen. Stäng basmembranet och höj eller sänk sedan delstegskondensören och justera fokus tills membranets kanter är i skarpt fokus, vilket skapar Köhler-belysning.
- Fokusera på den region i förberedelsen som ska avbildas. Bias med fokus på mindre nervceller över större, eftersom optiska signaler med ursprung i större nervceller är mer benägna än mindre att registreras även om de är något ur fokus.
- Ta en bild av ganglionen som ska avbildas med den parfokala digitalkameran.
- När kontrollpanelens förstärkningsbrytare är inställd på 1x, inspektera den vilande ljusintensiteten (RLI) i bildframställningsprogramvaran genom att klicka på "RLI"-knappen och kontrollera den genomsnittliga RLI för dioderna. Justera spänningsnivån som skickas från en stimulator till LED-lampans strömförsörjning och fortsätt att kontrollera den genomsnittliga RLI-nivån tills den är inom önskat område (vanligtvis cirka 3-4 V).
OBS: Höga RLIs, motsvarande cirka 3-4 V på handdatorn, är önskvärda. Ju högre ljus, desto bättre signal-till-brus-förhållande för de optiska signalerna, måste detta dock balanseras mot en snabbare fotobleachinghastighet vid högre RLIs. Denna risk minimeras genom att använda objektiv med högt NA-objektiv. De objektiva linserna för vattensänkning som används är 10x/0,6 NA, 20x/0,95 NA, 40x/0,8 NA och 40x/1,15 NA.
- Ställ in förstärkningsbrytaren på kontrollpanelen till 100x för inspelningen.
- Om du stimulerar en nerv, ställ in önskad spänning, frekvens och varaktighet på en separat stimulator från den som används för att ställa in ljusnivån. Bekräfta att TTL-utlösande mellan kontrollpanelen och stimulatorn är korrekt konfigurerat.
OBS: Provnervstimulansparametrar i varje art är följande: Tritonia PdN3, 2 s, 10 Hz pulståg på 5 ms, 10 V pulser; Aplysia (aplysi) PdN9, 2,5 s, 20 Hz pulståg på 5 ms, 8 V pulser; en Berghia pedal nerv, 2 s, 10 Hz pulståg på 5 ms, 5 V pulser. - Dubbelkolla att fjäder- eller luftbordet flyter.
7. Optisk inspelning
- Stäng av eller dämpa rumslamporna, inklusive eventuell överliggande lysrörsbelysning.
- Ställ in önskad filtid, sökväg och filnamn och klicka sedan på knappen "Ta data" i bildframställningsprogrammet för att hämta filer upp till kapaciteten hos datorns tillgängliga RAM-minne. Förbli stilla under den optiska inspelningen, eftersom små vibrationer kan introducera stora artefakter i de optiska inspelningsdata.
OBS: För förvärv som skulle överstiga datorns tillgängliga RAM finns ett skräddarsyt C++-förvärvsprogram tillgängligt via Dr. Jian-young Wu vid Georgetown University. - Om du vill visa data omedelbart efter förvärvet använder du funktionen Överliggande i bildframställningsprogramvaran för att lägga över data som samlats in av alla 464 dioder över bilden av ganglionen som togs tidigare avpreparatet 7. Klicka på någon av de dioder som representeras i programvaran för att utöka vad de spelade in på en separat spårningsskärm.
- Uppnå exakt justering av dioderna med avseende på preparatet genom att ange x-, y- och förstoringsfaktorerna enligt pinhole-testet.
- För att maximera åtgärdens potentiella synlighet och förbättra neuronutbytet för efterföljande spiksortering14, införa ett bandpass Butterworth-filter med 5 Hz och 100 Hz-avstängningar (finns i bildprogramvara) för att ta bort både låg- och högfrekvent brus.
- Om du vill spara filtrerade optiska data som en textfil för vidare analys i en vetenskaplig datorplattform väljer du först rutan "TP-filter" precis under skärmen "Page" i bildprogrammet. Välj sedan "Spara sida som ASCII" på fliken "Utdata" och ange önskat filnamn i dialogrutan som visas.
Representative Results
Tritonia
Hudkontakt med dess seastar rovdjur utlöser Tritonia diomedeas flyktsim, bestående av en rytmisk serie av helkroppsflexioner som driver den bort i säkerhet (Figur 3A). I isolerade hjärnpreparat framkallar en kort stimulans för att trampa nerv 3 (PdN3) det rytmiska simmotorprogrammet (SMP) för detta beteende, som lätt känns igen i optiska inspelningar från pedal ganglierna. Figur 3B visar layouten för ett VSD-bildexperiment utformat för att registrera avfyrningsaktiviteten hos nervceller på den dorsala ytan på den vänstra Tritonia-pedalen ganglion, över vilken handdatorn placerades, som en stimulans till kontralateral (höger) PdN3 framkallar SMP. Obehandlade och filtrerade data (bandpass Butterworth-filter, 5 och 100 Hz-brytpunkter) från 20 dioder som registrerar aktivitet före, under och efter stimulering av PdN3 visas i figurerna 3C,D. Nervstimulansen levererades 20 s i 2 min filen. Omedelbart efter förvärvet kan de signaler som mäts av alla 464 dioder i inspelningsmatrisen visas topografiskt över en bild av preparatet i bildprogramvaran (figur 3E). Vid denna tidpunkt innehåller många spår spikar som registrerats redundant från samma nervceller, och vissa spår innehåller spikar från mer än en neuron. Spike-sortering av de filtrerade diodspåren med ICA gav 53 unika neuronala spår, varav 30 visas i figur 3F. Kinetiken hos enskilda spikar kan uppskattas i figur 3G, som utökar ett utdrag av fyra spår från figur 3F (röd låda); noggrannheten hos ICA spike-sorteringsalgoritmen verifierades tidigare med samtidiga skarpa elektrodinspelningar, som visade att alla spikar i de sorterade spåren motsvarar intracellulärt registrerade spikar från enskilda nervceller11,14.
Aplysia (aplysi)
En starkt aversiv svansstimulans till Aplysia californica framkallar en stereotyp tvådelad rytmisk flyktrespons15. Den första fasen av svaret är en galopp av flera cykler av huvud lungor och svans drar som flyttar djuret snabbt framåt. Detta följs vanligtvis av en period av krypning, med upprepade vågor av muskulösa sammandragningar från huvud till svans som driver djuret framåt i långsammare hastighet i flera minuter (figur 4A). För att fånga dessa flyktmotorprogram i optiska inspelningar fokuserades handdatorn på den dorsala ytan av höger pedal ganglion i en isolerad hjärnberedning, och en sugelektrod placerades på kontralateral (vänster) pedalnerv 9 (PdN9; Figur 4B). En minut in i en kontinuerlig 20 min optisk inspelning (Figur 4C), pdn9 stimulerades för att framkalla galopp-crawl motor program sekvensen. De probabilistiska gaussiska rumsliga fördelningarna av signalerna från alla 81 registrerade nervceller kartlades på ganglion (Figur 4D). Dimensionalitetsminskningen som tillämpades på hela inspelningen visade att galoppfaserna (cyan) och krypningsfaserna (mörkblå) i utrymningsprogrammet upptog distinkta områden och bildade olika banor, spiral- respektive loopliknande, i huvudkomponentutrymme (figur 4E).
Tre videor baserade på Aplysia-inspelningen som visas i figur 4 visar ytterligare typer av analyser som kan utföras på sådana datamängder. Video 1 animerar avfyrningen av alla inspelade nervceller under hela inspelningen. Den första perioden efter stimulerande av flyktmotorprogrammet kännetecknades av en galopp, där aktiviteten i ganglionen präglades av alternerande sprängning av olika funktionella kluster (Video 2). Galoppen övergick därefter till en krypning, där aktiviteten över neuronala kluster förblev i stort sett fas men antog en moturs rotationsbana i ganglion (Video 3). De två senare videorna innehåller också konsensuskluster, som avslöjar avfyrningen och platserna för de olika funktionella ensemblerna för galopp- och krypningsfaserna i flyktresponsen separat. Observera att många nervceller som tilldelats samma kluster i både galopp- och krypningsfaserna uppvisade fysisk närhet till varandra i ganglion, i överensstämmelse med tidigare resultat12.
Berghia (berghia)
Aeolidkäbranch Berghia stephanieae (Figur 5A) representerar ett nytt modellsystem för neurovetenskap. Bildupplägget för ett typiskt Berghia-experiment visas i figur 5B. För att framkalla bred neuronal aktivitet placerades en sugelektrod på den mest framträdande vänstra pedalnerven, och en nervstimulans levererades 30 s till en 2 minuters inspelning. ICA-bearbetade spår visade både spontan och stimulans-framkallad aktivitet i 55 nervceller (Figur 5C). Gemenskapsidentifiering genom konsensuskluster identifierade tio distinkta funktionella ensembler, som avbildas i figur 5D i ett nätverksdiagram och i figur 5E, som omorganiserar spåren som visas i figur 5C baserat på deras klustertilldelningar. Gaussian fördelningar av signalerna från alla inspelade nervceller läggs ovanpå en bild av preparatet i figur 5F för att indikera positionerna för alla 55 registrerade nervceller.
Bild 1: Vyer över den optiska bildriggen och fotodiodmatrisen (PDA). (A) Den optiska bildriggen, med handdator, digitalkamera, mikroskop och scen. (B) Den interna utformningen av handdatorn, där fiberoptik förbinder bildöppningen med 464 fotodioder. En rad förstärkare finns ovanför fotodioderna. (C) Den sexkantiga ytan på bildöppningen, på vilken området som avbildas är fokuserat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Ett flödesschema som illustrerar det väsentliga arbetsflödet för att erhålla optiska inspelningar. De väsentliga stegen i VSD-avbildningsprotokollet, från dissekering och färgning genom detaljer i avbildning, avbildas i detta flödesschema. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Resultat från Tritonia diomedea, som illustrerar råa, filtreradeoch spiksorterade data. A) Tritonia flyr från den rovgiriga havsstjärnan Pycnopodia helianthoides genom sin simning, som består av alternerande dorsala och ventrala böjningar i kroppen. (B) Schematiskt för bildupplägget. Ce=cerebral lob av cerebropleural ganglion; Pl = pleuraloben i cerebropleural ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) Rådata från 20 fotodioder, som visar aktivitet i vänster pedal ganglion till stimulering av kontralateral PdN3 (stimulans som indikeras av pilen). (D) Filtrerade data från samma dioder som i C (5 och 100 Hz bandpass Butterworth-filter). (E) Bildåtergivningsutgång där komprimerade spår som samlats in av alla 464 dioder läggs ovanpå en bild av preparatet. Positionerna för de 20 dioderna vars spår visas i C och D markeras i rött. (F) Trettio utvalda spår av en neuron som genereras genom spiksortering via ICA. (G) En utökad vy över fyra spår av en neuron, motsvarande den röda rutan i F,visar deras åtgärdspotential vid högre temporal upplösning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Resultat från Aplysia californica, som illustrerar inspelning under lång tid, signalkartläggning och dimensionalitetsminskning. A)De två faserna i Aplysias sekventiella flyktmotorprogram, galoppen och krypningen. (B) Schematiskt för bildupplägget. Ce = cerebral ganglion; Pl = pleura ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) En 20 minuters inspelning av 81 nervceller i höger pedal ganglion svarar på en stimulans till kontralateral PdN9 (indikeras av pilen). Gröna, cyan- och mörkblå staplar under spåren indikerar pre-stimulansperioden, galoppen respektive krypningsfaserna i flyktmotorprogrammet. (D) En bild av preparatet med kartlagda probabilistiska gaussiska fördelningar av platserna för alla 81 neuronala signalkällor som identifierats av ICA. Den gröna konturen representerar positionen för handdatorns sexkantiga ansikte med avseende på ganglion. Siffrorna på varje gaussian motsvarar spårnumren i C. (E) Dimensionalitetsminskning med hjälp av huvudkomponentanalys som ritar de tre första huvudkomponenterna mot varandra under 20 minuters fil. De prestimulatoriska baslinjerna, galopp- och krypeepoken visas i grönt, cyan respektive mörkblått. Se video 1-3 för animeringar av neuronal bränning motsvarande denna inspelning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Resultat från Berghia stephanieae, en ny art för neurovetenskap, som illustrerar nätverksgrafering, funktionell klustringoch bilateral signalkartläggning. A)Ett Berghiaprov. (B) Schematiskt för bildupplägget. Ce = cerebral lob av cerebropleural ganglion; Pl = pleuraloben i cerebropleural ganglion; Pd = pedal ganglion; Rh = noshörnings ganglion. (C) Spår som visar spontan och stimulans-framkallad aktivitet av 55 bilaterala nervceller i cerebropleural ganglier (leverans av stimulansen indikeras av pilen). (D) Ett nätverksdiagram som visar de tio funktionella ensemblerna, som var och en har tilldelats en unik färg, som identifieras genom konsensuskluster. Noder i denna tomt representerar nervceller, där avstånd i nätverksutrymme representerar graden av bränningskorrelation inom och mellan ensembler. (E) Spåren i C omorganiseras och färgkodas (enligt D:sfärgschema) till funktionella ensembler. (F) En bild av preparatet som visar de kartlagda platserna för signalerna från varje inspelad neuron och de spårnummer i C och E som de motsvarar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Animering av hela, 20-minuters Aplysia escape locomotor program. Opaciteten hos de vita formerna som överliggande 81 enskilda nervceller i höger pedal ganglion (vänster panel) drevs av motsvarande neuronala spår (höger panel) och varierade linjärt som en funktion av genomsnittlig spikhastighet (binned per varje 0,61 s realtid i inspelningen). För varje neuron normaliserades full opacitet till dess maximala avfyrningshastighet under inspelningens varaktighet. En sekund av förfluten tid i videon representerar 12,2 sekunder i realtid. Skalstrecket motsvarar realtid, med de gröna, cyan- och mörkblå linjerna under spåren som indikerar förstimulansbaslinjen, galoppen respektive crawlningsfaserna i escape locomotor-programmet. De gula rutorna runt galoppfasen och en del av crawlningsfasen indikerar de inspelningsutdrag som används för att generera animationerna i video 2 och 3. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Video 2: Animering av galoppfasen i Aplysia escape locomotor-programmet. Konsensuskluster utfördes på alla 81 registrerade nervceller i bara galoppfasen av motorprogrammet för att härleda de funktionella ensemblerna, med hjälp av det tillvägagångssätt och den programvara som beskrivs och görs tillgänglig i ref.12. Neuronal ensembler som uppvisar till stor del tonic eller oregelbundna avfyrningsmönster under denna fas av flyktprogrammet utelämnades från denna video. Verkan potentialer av nervceller som tillhör de svart och olivgröna ensemblerna kan höras i ljudspåret av videon, med motsvarande nervceller och spår markerade. Genomsnittliga ökningshastigheter normaliserades som i video 1 och med motsvarande tids binning; 1 s förfluten tid i videon motsvarar 6,1 s realtid. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Video 3: Animering av crawlningsfasen i Aplysia escape lokomotor-programmet. Konsensuskluster utfördes på alla 81 registrerade nervceller i bara crawlningsfasen av motorprogrammet för att härleda de funktionella ensemblerna. Ensembler som uppvisar till stor del tonic eller oregelbundna avfyrningsmönster under denna fas av motorprogrammet utelämnades från denna video. Genomsnittliga spikhastigheter normaliserades som i video 1 och 2 och med motsvarande tids binning; 1 s förfluten tid i videon motsvarar cirka 12,2 s realtid. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Discussion
En av de viktigaste detaljerna i implementeringen av vår storskaliga VSD-bildbehandling är att minimera vibrationer, vilket ger rörelser av kontrastkanter över dioderna, vilket resulterar i stora artefaktsignaler. Eftersom absorbans VSD producerar mycket små procentuella förändringar i ljusintensitet med åtgärdspotentialer, kan vibrationsartefakter, om de inte förhindras, skymma de neuronala signalerna av intresse. Vi använder flera metoder för att minimera vibrationsartefakter. För det första ligger vårt bildrum på bottenvåningen, vilket isolerar preparatet från vibrationer relaterade till att bygga luftbehandlingsutrustning och många andra källor. För det andra användes en fjäderbaserad isoleringstabell, som andra handdatoranvändare har bekräftat ger bättre vibrationsdämpning än det vanligare luftbordet16. För det tredje användes mål för vattensänkning, vilket eliminerar bildfluktuationer som härrör från ytktueringar. För det fjärde trycktes preparatet lätt mellan kammarens täckstäppbotten och ett täcksplitter som trycktes ner ovanifrån och som hålls på plats av silikonpluggar eller petroleumgel, vilket ytterligare stabiliserar preparatet. Detta plattar också ut konvexytan av ganglion eller ganglier som avbildas, vilket resulterar i fler nervceller i målets fokusplan, vilket ökar antalet registrerade nervceller.
För att maximera signal-till-brus-förhållandet för de mycket små förändringarna i graden av VSD-ljusabsorbans till följd av en åtgärdspotential är det viktigt att uppnå nästan mättande ljus genom beredningen till handdatorn, samtidigt som man minimerar fotoblekningen av färgämnet. För detta ändamål arbetar vi vanligtvis med 3-4 V viloljusintensitet, mätt med PDA-kontrollpanelens förstärkningsbrytare i 1x-läge (handdatorns 464 förstärkare mättar vid 10 V ljus). Vid datainsamling ändras denna förstärkningsfaktor till 100x. Att få tillräckligt med ljus för att nå 3-4 V mätt med handdatorn kan uppnås på flera sätt. Använd först en ultrabright LED-ljuskälla som ger en våglängd som är lämplig för absorptionsegenskaperna hos absorbansfärgen som används. Följaktligen användes en 735 nm LED-kollimerad lampa, som överlappar de optimala absorptionsvåglängderna RH155 och RH482. För det andra, använd vid behov en flip-top understegskondensator som koncentrerar ljuset från LED-ljuskällan till ett mindre område. För det tredje justerar du kondensorhöjden för att uppnå Köhler-belysning, vilket säkerställer hög, jämn ljusstyrka och maximal bildkvalitet. För det fjärde, se till att det inte finns några värmefilter i den optiska vägen, vilket kan dämpa LED-lampans 735 nm våglängd. För det femte, ta bort diffusorer, om mer ljus behövs, från den optiska vägen. För det sjätte, använd höga NA-mål, som ger hög rumslig upplösning, och gör det möjligt för tillräckligt med ljusnivåer för att nå handdatorn vid lägre lampintensiteter. Detta har gjort det möjligt för oss att minimera fotoblekning i den utsträckning som vi kan få flera förvärvsfiler på 10-20 min varaktighet per förberedelse med samma ljusintensitet över alla filer och utan en betydande förlust av signalamlitud eller behovet av omfärgning. Avgörande, om experimenteraren vill spåra nervceller över dessa längre filer, se till att fokalplanet inte ändras och att förberedelsen inte rör sig. Slutligen är ett ytterligare sätt att dirigera tillräckligt med ljus till handdatorn att använda yngre djur, som har tunnare och därmed mindre ogenomskinliga ganglier.
Från tid till annan finner vi att signal-till-brusförhållandet för de optiska signalerna försämras och/ eller motorprogramrytmen är suboptimala (t.ex. långsamma eller onormala). När detta börjar ske konsekvent blandar vi nya lösningar av VSD. Alikvoter av VSD förblir vanligtvis livskraftiga i ca 6 månader i en -20 °C frys. Relaterat är det värt att notera att för Berghiahar de bästa resultaten hittills erhållits med absorbansen VSD RH482. Eftersom RH482 är mer lipofila än RH155, kan det bättre fläcka Berghiasjämförelsevis mindre nervceller eller förbli i neuronala membran mer effektivt vid den högre inspelnings saltlösningstemperaturen som används för denna tropiska art.
En begränsning av PDA-baserad avbildning av neural aktivitet avser AC-kopplingen av spänningssignalerna i hårdvara före 100x preamplification-steget: även om detta representerar en nödvändig funktion för att ta bort den stora DC-offset som produceras av den höga viloljusnivån som krävs enligt denna teknik, utesluter AC-kopplingen inneboende i handdatorn mätningen av långsamma förändringar i membranpotentialen, till exempel de som är associerade med synaptiska indata. Om du vill registrera potentiella förändringar i långsamt eller stabilt tillstånd kan ett DC-kopplade CMOS-kameraavbildningssystem användas för att fånga subthreshold-aktivitet. Byrne och kollegor använde nyligen en sådan inställning med RH155 för att avbilda neurons aktivitet i den buccal ganglion av Aplysia17,18. Vi har använt båda systemen och funnit att CMOS-kameran, på grund av dess mycket högre densitet av detektorer (128 x 128), genererar 50x större datafiler för samma bildtid7. Handdatorns mindre filer underlättar snabbare bearbetning och analys. Detta möjliggör också utökade inspelningar med en enda studie (figur 4) och studier av lärande, där data från flera försök sammanfogas till en stor fil före spiksortering, vilket gör det möjligt att spåra nätverksorganisation när lärandet utvecklas19.
I andra kamerabaserade undersökningar har fluorescerande VSDs använts av Kristan och kollegor för att undersöka nätverksfunktionen i leechens segmentella ganglier. I en inflytelserik studie ledde detta till identifiering av en neuron som är involverad i djurets beslut att simma eller krypa20. I en annan studie undersökte Kristan et al. i vilken utsträckning leechs simning och krypande beteenden drivs av multifunktionella kontra dedikerade kretsar21. Mer nyligen använde Wagenaar och kollegor ett tvåsidigt mikroskop för spänningsavbildning som gör det möjligt för dem att spela in från nästan alla nervceller i en leech segmental ganglion22. Till skillnad från många kamerabaserade bildframställningsmetoder är en fördel med vår PDA-baserade bildmetod snabb och opartisk spiksortering av ICA, en form av blind källseparation som inte innebär några beslut om neuronala gränser för resultatbehandling.
När det gäller valet av VSDs är en fördel med absorbansfärgerna RH155 och RH482 den lilla till ingen fototoxicitet som är associerad med dem23,24, vilket möjliggör längre inspelningstider än vad som är typiskt för fluorescerande VSDs. Dessutom är de snabba absorbans VSD: er vi använder väl lämpade för att registrera de överspäckande somatiska åtgärdspotentialerna i snäckor, som vanligtvis är 80 mV i amplitud. Som visas i figur 3Gkan vår optiska metod registrera potentiella undershoots (ingen av våra inspelningar är spårgenomsnitt): Detta tyder på att de VSDs vi använder bör kunna urskilja åtgärdspotentialer i andra modellsystem som dämpas i viss utsträckning och därmed inte överskrider när de når soma. Ändå kanske vår optiska metod inte är idealisk för arter som är kända för att uppvisa mycket försvagade verkning potentialer när de registreras i soma.
Mycket aktuell forskning om neurala nätverk fokuseras på ett litet antal designer transgena arter. Neurovetenskap drar dock nytta av studien av en mängd olika fylogenetiskt distinkta arter. Att studera många olika arter ger insikter om hur kretsar utvecklas25,26, och belyser principer för nätverksfunktion som kan vara vanliga över phyla1,2,3,4,27. Vi har hittills tillämpat vår bildframställningsmetod på ett antal snäckor, inklusive Aplysia californica8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (opublicerade data) och nu senast Berghia stephanieae (Figur 5). En vädjan till detta tillvägagångssätt är att det lätt kan tillämpas på många arter, utan behov av transgena djur. Vi vill erkänna att vår användning av VSD-avbildning med snabba absorbansfärger och en handdator följer i fotspåren av banbrytande arbete som uppnådde detta i halv intakta, beter sig Navanax29 och Aplysia30 förberedelser. Vår betoning på snabbheten i vårt tillvägagångssätt är delvis ett svar på oro för att många utredare kan vara alltmer ovilliga att initiera nätverksstudier på nya arter på grund av rädsla för att år av studier kommer att vara nödvändiga för att karakterisera grundläggande nätverksorganisation innan de kan utforska vetenskapliga frågor av brett intresse för neurovetenskap31. Vårt mål här är därför att demonstrera en teknik som i hög grad påskyndar processen – till den grad att betydande insikter samma dag om nätverksorganisation kan erhållas från enstaka förberedelser.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF 1257923 och NIH 1U01NS10837. Författarna vill erkänna Jean Wangs hjälp i laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
| Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
| Digital camera | Optronics | S97808 | |
| Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
| Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
| Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
| Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
| Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
| Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
| Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
| Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
| NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
| Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
| PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
| Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
| Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
| Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
| RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
| RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
| Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
| Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |
References
- Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).
- Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).
- Bolker, J. Model organisms: There's more to life than rats and flies. Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).
- Carlson, B. A. Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology. JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).
- Chase, R. Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons. Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).
- Frost, W. N., et al. Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).
- Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).
- Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. Basic Electrophysiological Methods. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).
- Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. Independent component analysis at the neural cocktail party. Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).
- Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program. Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).
- Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. A spiral attractor network drives rhythmic locomotion. ELife. 6, 27342 (2017).
- Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).
- Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia. Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).
- Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).
- Neveu, C. L., et al. Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia. eNeuro. 4 (5), 17 (2017).
- Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. Inferring neuronal network functional connectivity with directed information. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons. Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).
- Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. Optical imaging of neuronal populations during decision-making. Science. 307 (5711), 896-901 (2005).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).
- Tomina, Y., Wagenaar, D. A. A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech. ELife. 6, 29839 (2017).
- Chang, P. Y., Jackson, M. B. Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes. Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).
- Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons. Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).
- Katz, P. S. Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours. Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).
- Moroz, L. L. Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era. Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).
- Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. A cellular mechanism for prepulse inhibition. Neuron. 40, 991-1001 (2003).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).
- London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax. Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).
- Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization. Science. 263 (5148), 820-823 (1994).
- Marder, E. Searching for insight. In Invertebrate Neurobiology. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).
