يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصوير النشاط السكاني للخلايا العصبية بدقة خلية واحدة في الأنواع غير اللافقارية غير المعدلة وراثيا باستخدام الأصباغ الحساسة لجهد الامتصاص ومجموعة الصمام الثنائي الضوئي. ويتيح هذا النهج سير عمل سريع، حيث يمكن متابعة التصوير والتحليل على مدار يوم واحد.
تطوير الاستعدادات اللافقارية المعدلة وراثيا التي يمكن تسجيل نشاط مجموعات محددة من الخلايا العصبية والتلاعب بها مع الضوء يمثل تقدما ثوريا لدراسات الأساس العصبي للسلوك. ومع ذلك ، فإن الجانب السلبي لهذا التطور هو ميله إلى تركيز المحققين على عدد قليل جدا من الكائنات “المصممة” (مثل C. elegans و Drosophila)، مما قد يؤثر سلبا على متابعة الدراسات المقارنة عبر العديد من الأنواع ، وهو أمر ضروري لتحديد المبادئ العامة لوظيفة الشبكة. توضح هذه المقالة كيف يمكن استخدام التسجيل البصري مع الأصباغ الحساسة للجهد في أدمغة أنواع المعدة غير المعدلة وراثيا بسرعة (أي في غضون الوقت من التجارب الفردية) تكشف عن ملامح التنظيم الوظيفي لشبكاتها العصبية بدقة خلية واحدة. نحن الخطوط العريضة بالتفصيل تشريح, تلطيخ, وتسجيل الأساليب المستخدمة من قبل مختبرنا للحصول على آثار العمل المحتملة من عشرات إلى ~ 150 الخلايا العصبية خلال البرامج الحركية ذات الصلة سلوكيا في الجهاز العصبي المركزي من أنواع متعددة gastropod, بما في ذلك واحدة جديدة لعلم الأعصاب – وdyibranch بيرغيا stephanieae. يتم إجراء التصوير مع الأصباغ الحساسة للجهد امتصاص ومجموعة من 464 عنصرا الصمام الثنائي الضوئي أن عينات في 1600 لقطة / ثانية، وبسرعة كافية لالتقاط جميع إمكانات العمل التي تولدها الخلايا العصبية المسجلة. يمكن الحصول على تسجيلات متعددة لعدة دقائق لكل إعداد مع القليل من تبييض الإشارات أو السمية الضوئية. ويمكن تحليل البيانات البصرية الخام التي تم جمعها من خلال الأساليب الموصوفة في وقت لاحق من خلال مجموعة متنوعة من الأساليب المصورة. يمكن استخدام نهج التسجيل البصري لدينا بسهولة للتحقيق في نشاط الشبكة في مجموعة متنوعة من الأنواع غير المعدلة وراثيا ، مما يجعلها مناسبة تماما للدراسات المقارنة حول كيفية توليد الأدمغة للسلوك.
وقد وفر تطوير خطوط اللافقاريات المعدلة وراثيا مثل دروسوفيلا وسي إليغانز أنظمة قوية يمكن فيها استجواب القواعد العصبية للسلوك والتلاعب بها بصريا. ومع ذلك، قد يكون لهذه الاستعدادات الخاصة الجانب السلبي للحد من الحماس لدراسات الدائرة العصبية للأنواع غير المعدلة وراثيا، لا سيما فيما يتعلق بإدخال أنواع جديدة في أبحاث علم الأعصاب. التركيز حصرا على واحد أو اثنين من النظم النموذجية يضر بالبحث عن المبادئ العامة لوظيفة الشبكة، لأن الدراسات المقارنة تمثل طريقا أساسيا يتم من خلاله اكتشاف هذه المبادئ1و2و3و4. هدفنا هنا هو إظهار نهج التصوير على نطاق واسع للحصول على نظرة سريعة في الهيكل الوظيفي للشبكات العصبية gastropod ، في محاولة لتسهيل الدراسات المقارنة لوظيفة الشبكة العصبية.
الرخويات Gastropod مثل Aplysia، Lymnaea، Tritonia، Pleurobranchaea وغيرها منذ فترة طويلة تستخدم للتحقيق في مبادئ وظيفة الشبكة العصبية، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن يتم التوسط في سلوكياتهم من قبل الخلايا العصبية الكبيرة، وغالبا ما يمكن التعرف عليها بشكل فردي تقع على سطح العقدة، مما يجعلها في متناول بسهولة لتسجيل تقنيات5. في 1970s، تم تطوير الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) التي يمكن أن تتكامل في غشاء البلازما التي سرعان ما مكنت التسجيلات الأولى خالية من القطب الكهربائي من إمكانات العمل التي ولدتها الخلايا العصبية متعددة6. هنا، ونحن نثبت استخدامنا VSDs لدراسة نشاط الشبكة في عدة أنواع من gastropods، بما في ذلك واحد جديد لعلم الأعصاب، بيرغيا stephanieae. جهاز التصوير هو مجموعة ثنائية ضوئية متاحة تجاريا من 464 عنصرا (PDA) التي عينات في 1600 لقطة / ثانية (الشكل 1)، والتي ، عند استخدامها مع VSDs امتصاص سريع ، ويكشف عن إمكانات العمل لجميع الخلايا العصبية المسجلة7. يتم عرض الإشارات المسجلة من قبل جميع الثنائيات مباشرة بعد الاستحواذ وفرضها على صورة للعصابة في برنامج اقتناء المساعد الشخصي الرقمي ، مما يجعل من الممكن التحقيق في الخلايا العصبية ذات الاهتمام مع أقطاب كهربائية حادة في نفس الإعداد8،9.
في بيانات المساعد الشخصي الرقمي الخام، العديد من الثنائيات تسجل بشكل زائد عن الحاجة الخلايا العصبية أكبر، والعديد منها يحتوي أيضا على إشارات مختلطة من الخلايا العصبية متعددة. نقطة تحول كان تطوير آلية ارتفاع الفرز طريقة باستخدام تحليل مكون مستقل لمعالجة بسرعة كل الخام 464 قناة PDA مجموعة البيانات في مجموعة جديدة من آثار, التي تظهر كل الخلايا العصبية المسجلة في تتبع منفصل يحتوي فقط على إمكانات عملها10,11.
في هذه المقالة نوضح الخطوات الأساسية التي ينطوي عليها الحصول على تسجيلات محتملة للعمل على نطاق واسع من الجهاز العصبي gastropod مع مجموعة الصمام الثنائي الضوئي وVSDs امتصاص سريع. وعلاوة على ذلك نحن نوضح الأساليب التحليلية التي يمكن استخدامها في تجميع ورسم خرائط الخلايا العصبية المسجلة بصريا فيما يتعلق بمجموعاتها الوظيفية ، وخصائص خصائص مستوى السكان التي غالبا ما تكون غير واضحة من خلال التفتيش البسيط لآثار إطلاقالنار 12،13.
واحدة من أهم التفاصيل في تنفيذ نهجنا التصوير VSD على نطاق واسع هو تقليل الاهتزاز، والتي تنتج حركات حواف التباين عبر الثنائيات، مما أدى إلى إشارات كبيرة artifactual. لأن VSDs امتصاص تنتج تغييرات نسبة مئوية صغيرة جدا في كثافة الضوء مع إمكانات العمل، والتحف الاهتزاز، إذا لم يتم منعها، يمكن أن تحجب إشارات الخلايا العصبية من الفائدة. نحن نستخدم عدة طرق لتقليل القطع الأثرية الاهتزاز. أولا، تقع غرفة التصوير في الطابق الأرضي، والتي تعزل الإعداد عن الاهتزازات المتعلقة ببناء معدات مناولة الهواء والعديد من المصادر الأخرى. ثانيا، تم استخدام جدول العزل القائم على الربيع، والتي أكد المستخدمين المساعد الشخصي الرقمي الأخرى يوفر أفضل المثبطة الاهتزاز من الجدول الهواء أكثر شيوعا16. ثالثا، استخدمت أهداف غمر المياه، التي تقضي على تقلبات الصور الناشئة عن التموجات السطحية. رابعا، تم الضغط بخفة على التحضير الذي يتم تصويره بين قاع غطاء الغرفة وجزء غطاء مضغوط من الأعلى يتم الاحتفاظ به في مكانه بواسطة مقابس السيليكون أو هلام البترول، مما يزيد من استقرار التحضير. هذا يسطح أيضا سطح محدب من العقدة أو العقدة التي يتم تصويرها، مما أدى إلى المزيد من الخلايا العصبية في الطائرة من التركيز على الهدف، مما يزيد من عدد الخلايا العصبية المسجلة.
لتحقيق أقصى قدر من نسبة الإشارة إلى الضوضاء للتغيرات الصغيرة جدا في درجة امتصاص ضوء VSD الناتجة عن إمكانات العمل ، من الضروري تحقيق ضوء شبه مشبع من خلال التحضير إلى المساعد الشخصي الرقمي ، وفي الوقت نفسه تقليل bleaching الضوئي للصبغة. وتحقيقا لهذه الغاية، ونحن نعمل عادة في 3-4 V من شدة الضوء يستريح، كما تقاس مع لوحة التحكم المساعد الشخصي الرقمي كسب التبديل في موقف 1x (مكبرات الصوت المساعد الشخصي الرقمي 464 تشبع في 10 V من الضوء). أثناء الحصول على البيانات يتم تغيير عامل الكسب هذا إلى 100x. الحصول على ضوء كاف للوصول إلى 3-4 V كما يقاس المساعد الشخصي الرقمي يمكن تحقيقه في عدة طرق. أولا، استخدم مصدر ضوء LED فائق المرونة الذي يوفر طول موجة مناسب لخصائص امتصاص صبغة الامتصاص المستخدمة. وبناء على ذلك، تم استخدام مصباح 135 نانومتر LED collimated، الذي يتداخل مع أطوال الموجات امتصاص الأمثل من RH155 وRH482. ثانيا، إذا لزم الأمر، استخدم مكثفا تحت المرحلة العلوية يركز الضوء من مصدر ضوء LED إلى منطقة أصغر. ثالثا، ضبط ارتفاع المكثف لتحقيق إضاءة كوهلر، مما يضمن سطوعا عاليا وجودة صورة فائقة. رابعا، تأكد من عدم وجود مرشحات حرارية في المسار البصري، والتي يمكن أن تضيء الطول الموجي لمصباح LED البالغ 735 نانومتر. خامسا، إزالة الناشرون، إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الضوء، من المسار البصري. سادسا، استخدم أهداف NA العالية، التي توفر دقة مكانية عالية، وتسمح بمستويات كافية من الضوء للوصول إلى المساعد الشخصي الرقمي بكثافة مصباح أقل. وقد سمح لنا هذا لتقليل photobleaching إلى الحد الذي يمكننا الحصول على العديد من ملفات الاستحواذ من 10-20 دقيقة مدة كل إعداد باستخدام نفس كثافة الضوء عبر جميع الملفات ودون فقدان كبير من سعة إشارة أو الحاجة إلى إعادة تلطيخ. الأهم من ذلك، إذا كان المجرب يرغب في تتبع الخلايا العصبية عبر هذه الملفات أطول، وضمان أن الطائرة المحورية لا تتغير، وأن الإعداد لا يتحرك. وأخيرا ، فإن طريقة إضافية لتوجيه ضوء كاف إلى المساعد الشخصي الرقمي هو استخدام الحيوانات الأصغر سنا ، والتي لديها أرق ، وبالتالي أقل غموضا ganglia.
من وقت لآخر نجد أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للإشارات البصرية تتدهور و / أو إيقاعات البرنامج الحركي هي دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال ، بطيئة أو غير طبيعية). عندما يبدأ هذا في الحدوث باستمرار، نخلط الحلول الجديدة ل VSD. Aliquots من VSD تبقى قابلة للحياة عادة لمدة 6 أشهر في الفريزر -20 درجة مئوية. ذات الصلة, تجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة لبيرغيا, وقد تم الحصول على أفضل النتائج حتى الآن مع امتصاص VSD RH482. كما RH482 هو أكثر lipophilic من RH155، فإنه قد وصمة عار أفضل الخلايا العصبية أصغر نسبيا بيرغياأو البقاء في الأغشية العصبية بشكل أكثر فعالية في درجة حرارة ملحية تسجيل أعلى المستخدمة لهذا النوع الاستوائي.
أحد قيود التصوير القائم على المساعد الشخصي الرقمي للنشاط العصبي يتعلق باقتران التيار المتردد لإشارات الجهد في الأجهزة قبل خطوة التضخيم المسبق 100x: على الرغم من أن هذا يمثل ميزة ضرورية لإزالة إزاحة DC الكبيرة الناتجة عن مستوى الضوء العالي الذي تتطلبه هذه التقنية ، فإن اقتران AC الجوهري المساعد الشخصي الرقمي يحول دون قياس التغيرات البطيئة في إمكانات الأغشية ، مثل تلك المرتبطة المدخلات متشابك. إذا كان تسجيل التغييرات المحتملة بطيئة أو ثابتة الحالة المطلوبة، يمكن استخدام نظام التصوير كاميرا CMOS مقرونة DC لالتقاط النشاط تحت الحيازة. بيرن وزملاؤه تستخدم مؤخرا مثل هذا الإعداد مع RH155 لتصوير نشاط الخلايا العصبية في العقدة buccal من Aplysia17,18. لقد استخدمنا كلا النظامين ووجدنا أن كاميرا CMOS ، نظرا لكثافة أجهزة الكشف الأعلى بكثير (128 × 128) ، تولد ملفات بيانات أكبر 50x لنفس وقت التصوير7. تسهل الملفات الأصغر في المساعد الشخصي الرقمي المعالجة والتحليل بشكل أسرع. وهذا يتيح أيضا التسجيلات الموسعة لتجربة واحدة(الشكل 4)ودراسات التعلم ، حيث يتم ربط البيانات من تجارب متعددة في ملف واحد كبير قبل فرز الارتفاع ، مما يسمح بتتبع تنظيم الشبكة مع تطور التعلم19.
في تحقيقات أخرى تستند إلى الكاميرا ، تم استخدام VSDs الفلورية من قبل Kristan وزملاؤه لفحص وظيفة الشبكة في العقدة القطاعية لل. في دراسة مؤثرة واحدة أدى هذا إلى تحديد الخلايا العصبية المشاركة في قرار الحيوان للسباحة أو الزحف20. في دراسة أخرى، درس كريستان وآخرون مدى تحرك سلوكيات السباحة والزحف لل من قبل دوائر متعددة الوظائف مقابل مخصصة21. في الآونة الأخيرة ، استخدم Wagenaar وزملاؤه مجهرا على الوجهين لتصوير الجهد الذي يسمح لهم بتسجيل جميع الخلايا العصبية تقريبا في العقدة المجزأة22. على النقيض من العديد من أساليب التصوير القائمة على الكاميرا ، ميزة لدينا طريقة التصوير القائم على المساعد الشخصي الرقمي هو سريع وغير متحيزة ارتفاع الفرز من قبل ICA ، وهو شكل من أشكال فصل المصدر الأعمى الذي لا ينطوي على أي قرارات حول حدود الخلايا العصبية لمعالجة النتائج.
فيما يتعلق باختيار VSDs، ميزة واحدة من الأصباغ امتصاص RH155 وRH482 هو السمية الضوئية القليل إلى لا المرتبطة بها23،24،مما يتيح أوقات تسجيل أطول مما هو معتاد لVSDs الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، فإن VSDs امتصاص سريع نستخدمها هي مناسبة تماما لتسجيل إمكانات العمل الجسدي تجاوز في الاستعدادات gastropod، والتي عادة ما تكون 80 mV في السعة. كما هو مبين في الشكل 3G، يمكن أن الأسلوب البصري لدينا تسجيل العمل المحتملة undershoots (أي من التسجيلات لدينا هي تتبع المتوسط) : وهذا يشير إلى أن VSDs نستخدم ينبغي أن تكون قادرة على تمييز إمكانات العمل في أنظمة النموذج الأخرى التي تتوهين إلى حد ما ، وبالتالي لا تتجاوز بحلول الوقت الذي تصل إلى سوما. ومع ذلك، قد لا يكون نهجنا البصري مثاليا للأنواع المعروفة بأنها تظهر إمكانات عمل مخففة للغاية عند تسجيلها في سوما.
وتركز الكثير من البحوث الحالية على الشبكات العصبية على عدد قليل من الأنواع المعدلة وراثيا مصمم. ومع ذلك، يستفيد علم الأعصاب من دراسة مجموعة واسعة من الأنواع المتميزة وراثيا. دراسة العديد من الأنواع المختلفة يوفر رؤى حول كيفية تطور الدوائر25،26، ويضيء مبادئ وظيفة الشبكة التي قد تكون شائعة عبر فيلا1،2،3،4،27. لقد طبقنا حتى الآن طريقة التصوير لدينا على عدد من أنواع المعدة، بما في ذلك Aplysia californica8،11،12،13،14،28، تريتونيا ديوميديا8،9،11،14،19،28، تريتونيا فيستيفا28، Pleurobranchaea californica (بيانات غير منشورة) ، ومؤخرا بيرغيا stephanieae (الشكل 5). ومن الجاذبية التي يوجهها هذا النهج أنه يمكن تطبيقه بسهولة على العديد من الأنواع، دون الحاجة إلى معدلة وراثيا. نود أن نعترف بأن استخدامنا للتصوير VSD مع أصباغ امتصاص سريعة وPDA يسير على خطى العمل الرائد الذي أنجز هذا في شبه سليمة ، والتصرف نافاناكس29 وAplysia30 الاستعدادات. تركيزنا على سرعة نهجنا هو في جزء منه ردا على المخاوف من أن العديد من المحققين قد تكون مترددة على نحو متزايد لبدء دراسات الشبكة في الأنواع الجديدة بسبب المخاوف من أن سنوات من الدراسة ستكون ضرورية لتوصيف تنظيم الشبكة الأساسية قبل أن تكون قادرة على استكشاف المسائل العلمية ذات أهمية واسعة لعلم الأعصاب31. وبناء على ذلك، فإن هدفنا هنا هو إظهار تقنية تسرع العملية بشكل كبير – لدرجة أنه يمكن الحصول على رؤى كبيرة في نفس اليوم في تنظيم الشبكة من الاستعدادات الفردية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل 1257923 NSF والمعاهد القومية للصحة 1U01NS10837. ويرغب أصحاب البلاغ في الاعتراف بمساعدة جان وانغ في المختبر.
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |