Denne protokol præsenterer en metode til billeddannelse neuronal befolkning aktivitet med enkelt-celle opløsning i ikke-transgene hvirvelløse arter ved hjælp af absorbans spænding-følsomme farvestoffer og en fotodiode array. Denne tilgang muliggør en hurtig arbejdsgang, hvor billeddannelse og analyse kan forfølges i løbet af en enkelt dag.
Udviklingen af transgene hvirvelløse præparater, hvor aktiviteten af specifikke sæt neuroner kan registreres og manipuleres med lys, repræsenterer et revolutionerende fremskridt for undersøgelser af det neurale adfærdsgrundlag. En ulempe ved denne udvikling er imidlertid dens tendens til at fokusere efterforskere på et meget lille antal “designer” organismer (f.eks. C. elegans og Drosophila), hvilket potentielt har en negativ indvirkning på forfølgelsen af sammenlignende undersøgelser på tværs af mange arter, hvilket er nødvendigt for at identificere generelle principper for netværksfunktion. Denne artikel illustrerer, hvordan optisk optagelse med spændingsfølsomme farvestoffer i hjernen hos ikke-transgene gastropodarter kan bruges til hurtigt (dvs. inden for tidsforløbet af enkelte eksperimenter) afsløre funktioner i den funktionelle organisering af deres neurale netværk med enkeltcelleopløsning. Vi skitserer i detaljer dissektion, farvning og registreringsmetoder, der bruges af vores laboratorium til at opnå potentielle spor fra snesevis til ~ 150 neuroner under adfærdsmæssigt relevante motorprogrammer i CNS af flere gastropodarter, herunder en ny til neurovidenskab – nudibranch Berghia stephanieae. Imaging udføres med absorbans spændingsfølsomme farvestoffer og en 464-element fotodiode array, prøver på 1.600 billeder / sekund, hurtigt nok til at fange alle handling potentialer genereret af de registrerede neuroner. Flere flere minutters optagelser kan opnås pr. præparat med lidt eller ingen signalblegning eller fototoksicitet. De rå optiske data, der indsamles ved hjælp af de beskrevne metoder, kan efterfølgende analyseres ved hjælp af en række illustrerede metoder. Vores optiske optagelse tilgang kan let bruges til sonde netværk aktivitet i en række ikke-transgene arter, hvilket gør det velegnet til sammenlignende undersøgelser af, hvordan hjerner generere adfærd.
Udviklingen af transgene linjer af hvirvelløse dyr som Drosophila og C. elegans har givet kraftfulde systemer, hvor de neurale baser af adfærd kan være optisk forhørt og manipuleret. Disse særlige præparater kan dog have den ulempe, at de reducerer begejstringen for neurale kredsløbsundersøgelser af ikke-transgene arter, især med hensyn til indførelsen af nye arter i neurovidenskabsforskning. Det er skadeligt for søgningen efter generelle principper for netværksfunktionen udelukkende at fokusere på et eller to modelsystemer, fordi sammenlignende undersøgelser udgør en væsentlig vej, hvormed sådanne principper opdages1,2,3,4. Vores mål her er at demonstrere en storstilet billeddannelse tilgang til at opnå hurtig indsigt i den funktionelle struktur af gastropod neurale netværk, i et forsøg på at lette sammenlignende undersøgelser af neurale netværk funktion.
Gastropod bløddyr som Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea og andre har længe været brugt til at undersøge principper for neural netværksfunktion, for en stor del fordi deres adfærd formidles af store, ofte individuelt identificerbare neuroner placeret på overfladen af ganglier, hvilket gør dem let tilgængelige for registreringsteknikker5. I 1970’erne blev spændingsfølsomme farvestoffer (VSD’er), der kan integreres i plasmamembranen, udviklet, der snart muliggjorde de første elektrodefrie optagelser af handlingspotentialerne genereret af flere neuroner6. Her demonstrerer vi vores brug af VSD’er til at undersøge netværksaktivitet i flere arter af gastropoder, herunder en ny til neurovidenskab, Berghia stephanieae. Billedbehandlingsenheden er et kommercielt tilgængeligt 464-element fotodiode array (PDA), der prøver ved 1.600 billeder / sekund (Figur 1), som, når de bruges med hurtig absorbans VSD’er, afslører handlingspotentialerne for alle registrerede neuroner7. De signaler, der registreres af alle dioder, vises umiddelbart efter erhvervelsen og overlejret på et billede af ganglionen i PDA-erhvervelsessoftwaren, hvilket gør det muligt at undersøge neuroner af interesse med skarpe elektroder i samme forberedelse8,9.
I de rå PDA-data registrerer mange dioder overflødigt de større neuroner, og mange indeholder også blandede signaler fra flere neuroner. Et vendepunkt var udviklingen af en automatiseret spike-sorteringsmetode ved hjælp af uafhængig komponentanalyse til hurtigt at behandle hver rå 464-kanals PDA-datasæt til et nyt sæt spor, hvor hver registreret neuron vises i et separat spor, der kun indeholder dets handlingspotentialer10,11.
I denne artikel skitserer vi de væsentlige trin, der er involveret i at opnå store handlingspotentiale optagelser fra gastropodnervesystemer med et fotodiode array og hurtige absorbans-VSD’er. Vi illustrerer desuden analytiske metoder, der kan anvendes til klyngedannelse og kortlægning af de optisk registrerede neuroner med hensyn til deres funktionelle ensembler, og til at karakterisere befolkningsniveaufunktioner, der ofte ikke er synlige gennem simpel inspektion af affyringssporene12,13.
En af de vigtigste detaljer i implementeringen af vores store VSD-billedbehandlingsmetode er at minimere vibrationer, der producerer bevægelser af kontrastkanter på tværs af dioder, hvilket resulterer i store artefaktistiske signaler. Fordi absorbans VSD’er producerer meget små procentvise ændringer i lysintensiteten med handlingspotentialer, kan vibrationsartefakter, hvis de ikke forhindres, skjule de neuronale signaler af interesse. Vi anvender flere metoder til at minimere vibrationsartefakter. For det første er vores billedrum placeret i stueetagen, hvilket isolerer præparatet fra vibrationer relateret til opbygning af lufthåndteringsudstyr og mange andre kilder. For det andet blev der anvendt et fjederbaseret isolationsbord, som andre PDA-brugere har bekræftet giver bedre vibrationsdæmpning end det mere almindelige luftbord16. For det tredje blev der anvendt målsætninger for nedsænkning af vand, som eliminerer billedudsving som følge af overflade krusninger. For det fjerde blev det præparat, der afbildes, let presset mellem kammerdækslet og et coverlipfragment presset ned ovenfra, der holdes på plads af silikonepropper eller vaseline, hvilket yderligere stabiliserer præparatet. Dette flader også konvekse overfladen af ganglion eller ganglier bliver afbildet, hvilket resulterer i flere neuroner i flyet af fokus på målet, hvilket øger antallet af registrerede neuroner.
For at maksimere signal-til-støj-forholdet for de meget små ændringer i graden af VSD-lysabsorpræsorpion som følge af et handlingspotentiale er det vigtigt at opnå næsten mættet lys gennem præparatet til PDA’en, samtidig med at fotobleaching af farvestoffet minimeres. Til dette formål arbejder vi typisk ved 3-4 V hvilelysintensitet, målt med PDA-kontrolpanelets forstærkningskontakt i 1x-positionen (PDA’ens 464 forstærkere mættes ved 10 V lys). Under dataindsamlingen ændres denne gevinstfaktor til 100x. Kom tilstrækkeligt lys til at nå 3-4 V målt ved PDA kan opnås på flere måder. Brug først en ultrabright LED-lyskilde, der leverer en bølgelængde, der passer til absorptionsegenskaberne for det absorberende farvestof, der er i brug. Derfor blev der anvendt en 735-nm LED-kollimeret lampe, som overlapper med de optimale absorptionsbølgelængder på RH155 og RH482. For det andet skal du om nødvendigt bruge en flip-top subtage kondensator, der koncentrerer lyset fra LED-lyskilden til et mindre område. For det tredje skal kondensatorhøjden justeres for at opnå Köhler-belysning, hvilket sikrer høj, jævn lysstyrke og maksimal billedkvalitet. For det fjerde skal du sikre dig, at der ikke er varmefiltre i den optiske vej, som kan dæmpe LED-lampens bølgelængde på 735 nm. For det femte skal du fjerne diffusorer, hvis der er behov for mere lys, fra den optiske vej. For det sjette skal du bruge målsætninger med høj NA, som giver høj rumlig opløsning, og tillade tilstrækkelige lysniveauer til at nå PDA’en ved lavere lampeintensiteter. Dette har gjort det muligt for os at minimere photobleaching i det omfang, at vi kan få flere erhvervelse filer på 10-20 min varighed pr forberedelse ved hjælp af samme lysintensitet på tværs af alle filer og uden et betydeligt tab af signal amplitude eller behovet for re-farvning. Afgørende, hvis eksperimentatoren ønsker at spore neuroner på tværs af disse længere filer, skal du sikre dig, at brændplanet ikke ændres, og at præparatet ikke bevæger sig. Endelig er en yderligere måde at dirigere tilstrækkeligt lys til PDA’en på at bruge yngre dyr, som har tyndere og dermed mindre uigennemsigtige ganglier.
Fra tid til anden finder vi, at signal-til-støj-forholdet mellem de optiske signaler forringes, og / eller motorprogrammets rytmer er suboptimale (f.eks. langsomme eller unormale). Når dette begynder at ske konsekvent, blander vi friske løsninger af VSD. Aliquots af VSD forbliver typisk levedygtige i ca. 6 måneder i en -20 °C fryser. Relateret er det værd at bemærke, at for Berghia, de bedste resultater er hidtil opnået med absorbans VSD RH482. Da RH482 er mere lipofil end RH155, kan det bedre plette Berghia‘s forholdsvis mindre neuroner eller forblive i neuronale membraner mere effektivt ved den højere registrering saltvand temperatur, der anvendes til denne tropiske art.
En begrænsning af PDA-baseret billeddannelse af neural aktivitet vedrører AC-koblingen af spændingssignalerne i hardware før 100x forforstærkningstrinnet: Selv om dette udgør en nødvendig funktion til at fjerne den store DC-forskydning, der produceres af det høje hvilelysniveau, der kræves af denne teknik, udelukker AC-koblingen, der er indbygget i PDA’en, måling af langsomme ændringer i membranpotentialet, f.eks. dem, der er forbundet med synaptiske input. Hvis du ønsker at optage langsomme eller konstante potentielle ændringer, kan et DC-koblet CMOS-kamerabilledsystem bruges til at registrere subthreshold-aktivitet. Byrne og kolleger for nylig brugt en sådan opsætning med RH155 at billedet aktiviteten af neuroner i buccal ganglion af Aplysia17,18. Vi har brugt begge systemer og konstateret, at CMOS kameraet, på grund af sin meget højere tæthed af detektorer (128 x 128), genererer 50x større datafiler til samme billedbehandling tid7. PDA’s mindre filer letter hurtigere behandling og analyse. Dette gør det også muligt at udvide enkeltforsøgsoptagelser (Figur 4) og undersøgelser af læring, hvor data fra flere forsøg sammenkædes i en stor fil før spike-sortering, så netværksorganisation kan spores, efterhånden som læring udviklersig 19.
I andre kamerabaserede undersøgelser er fluorescerende VSD’er blevet brugt af Kristan og kolleger til at undersøge netværksfunktionen i iglens segmentale ganglier. I en indflydelsesrig undersøgelse førte dette til identifikation af en neuron, der var involveret i dyrets beslutning om at svømme eller gennemgå20. I en anden undersøgelse undersøgte Kristan et al. i hvilket omfang iglens svømning og krybende adfærd er drevet af multifunktionelle vs. dedikerede kredsløb21. For nylig brugte Wagenaar og kolleger et tosidet mikroskop til spændingsbilleddannelse, der giver dem mulighed for at optage fra næsten alle neuroner i en iglesegmental ganglion22. I modsætning til mange kamerabaserede billeddannelsesmetoder er en fordel ved vores PDA-baserede billeddannelsesmetode hurtig og upartisk spike-sortering af ICA, en form for blind kildeadskillelse, der ikke involverer beslutninger om neuronale grænser for resultatbehandling.
Med hensyn til valget af VSD’er er en fordel ved absorbansfarverne RH155 og RH482 den lille til ingen fototoksicitet, der er forbundet med dem23,24, hvilket muliggør længere optagelsestider end det er typisk for fluorescerende VSD’er. Desuden er de hurtige absorbans-VSD’er, vi bruger, velegnede til registrering af de overshooting somatiske virkningspotentialer i gastropodpræparater, som typisk er 80 mV i amplitude. Som vist i figur 3Gkan vores optiske metode registrere handlingspotentialeundershoots (ingen af vores optagelser er sporgennemsnit): Dette tyder på, at de VSD’er, vi bruger, bør være i stand til at skelne handlingspotentialer i andre modelsystemer, der dæmper til en vis grad og derfor ikke overskrides, når de når soma. Ikke desto mindre er vores optiske tilgang muligvis ikke ideel til arter, der er kendt for at udvise meget svækkede virkningspotentialer, når de registreres i soma.
Meget aktuel forskning på neurale netværk er ved at blive fokuseret på et lille antal designer transgene arter. Neurovidenskab nyder dog godt af undersøgelsen af en bred vifte af fylogentisk forskellige arter. At studere mange forskellige arter giver indsigt i, hvordan kredsløb udvikler sig25,26, og belyser principper for netværksfunktion, der kan være almindelige på tværs af phyla1,2,3,4,27. Vi har hidtil anvendt vores billeddannelse metode til en række gastropod arter, herunder Aplysia californica8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (ikke offentliggjorte data) og senest Berghia stephanieae (figur 5). En appel af denne tilgang er, at den let kan anvendes på mange arter uden behov for transgene dyr. Vi ønsker at anerkende, at vores brug af VSD billeddannelse med hurtige absorbans farvestoffer og en PDA følger i fodsporene på banebrydende arbejde, der opnåede dette i semi-intakt, opfører Navanax29 og Aplysia30 præparater. Vores vægt på hurtigheden af vores tilgang er til dels et svar på bekymringer om, at mange efterforskere kan være mere og mere tilbageholdende med at indlede netværksundersøgelser i nye arter på grund af frygt for, at års studier vil være nødvendige for at karakterisere grundlæggende netværksorganisation, før de kan udforske videnskabelige spørgsmål af bred interesse for neurovidenskab31. Derfor er vores mål her at demonstrere en teknik, der i høj grad fremskynder processen – til det punkt, at betydelige samme dag indsigt i netværksorganisation kan opnås fra enkelt forberedelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NSF 1257923 og NIH 1U01NS10837. Forfatterne ønsker at anerkende Jean Wangs hjælp i laboratoriet.
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |