Denne protokollen presenterer en metode for avbildning av nevron populasjonsaktivitet med encellet oppløsning i ikke-transgene hvirvelløse arter ved hjelp av absorbansspenningssensitive fargestoffer og en fotodiodematrise. Denne tilnærmingen muliggjør en rask arbeidsflyt, der avbildning og analyse kan forfølges i løpet av en enkelt dag.
Utviklingen av transgene hvirvelløse preparater der aktiviteten til spesifiserbare sett med nevroner kan registreres og manipuleres med lys representerer et revolusjonerende fremskritt for studier av det nevrale grunnlaget for atferd. Imidlertid er en ulempe med denne utviklingen dens tendens til å fokusere undersøkere på et svært lite antall “designer” organismer (f.eks. C. elegans og Drosophila), potensielt negativ innvirkning på jakten på komparative studier på tvers av mange arter, noe som er nødvendig for å identifisere generelle prinsipper for nettverksfunksjon. Den nåværende artikkelen illustrerer hvordan optisk opptak med spenningssensitive fargestoffer i hjernen til ikke-transgene gastropodarter kan brukes til raskt (dvs. innen enkelteksperimenter) avslører funksjoner i den funksjonelle organiseringen av deres nevrale nettverk med encellet oppløsning. Vi skisserer i detalj disseksjons-, fargings- og registreringsmetodene som brukes av laboratoriet vårt for å oppnå handlingspotensiale spor fra dusinvis til ~ 150 nevroner under atferdsrelevante motorprogrammer i CNS av flere gastropodarter, inkludert en ny til nevrovitenskap – nudibranch Berghia stephanieae. Avbildning utføres med absorbansspenningssensitive fargestoffer og en 464-element fotodiode array som prøver på 1600 bilder / sekund, raskt nok til å fange opp alle handlingspotensialer generert av de registrerte nevronene. Flere flerminutters opptak kan oppnås per tilberedning med liten eller ingen signalbleking eller fototoksisitet. De rå optiske dataene som samles inn gjennom metodene som er beskrevet, kan deretter analyseres gjennom en rekke illustrerte metoder. Vår optiske registreringstilnærming kan lett brukes til å sondere nettverksaktivitet i en rekke ikke-transgene arter, noe som gjør den godt egnet for komparative studier av hvordan hjerner genererer atferd.
Utviklingen av transgene linjer av hvirvelløse dyr som Drosophila og C. elegans har gitt kraftige systemer der nevrale baser av atferd kan bli optisk forhørt og manipulert. Imidlertid kan disse spesielle preparatene ha ulempen med å redusere entusiasme for nevrale kretsstudier av ikke-transgene arter, spesielt med hensyn til innføring av nye arter i nevrovitenskapelig forskning. Å fokusere utelukkende på ett eller to modellsystemer er skadelig for søket etter generelle prinsipper for nettverksfunksjon, fordi komparative studier representerer en viktig rute der slike prinsipper oppdages1,2,3,4. Vårt mål her er å demonstrere en storskala bildemetode for å oppnå rask innsikt i den funksjonelle strukturen til gastropod nevrale nettverk, i et forsøk på å lette komparative studier av nevral nettverksfunksjon.
Gastropodmollusker som Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea og andre har lenge blitt brukt til å undersøke prinsipper for nevral nettverksfunksjon, i stor grad fordi deres oppførsel er mediert av store, ofte individuelt identifiserbare nevroner plassert på overflaten av ganglia, noe som gjør dem lett tilgjengelige for opptaksteknikker5. På 1970-tallet ble spenningsfølsomme fargestoffer (VSDs) som kan integreres i plasmamembranen utviklet som snart aktiverte de første elektrodefrie opptakene av handlingspotensialene generert av flere nevroner6. Her demonstrerer vi vår bruk av VSDer for å undersøke nettverksaktivitet i flere arter av gastropoder, inkludert en ny til nevrovitenskap, Berghia stephanieae. Bildeenheten er en kommersielt tilgjengelig 464-element fotodiodematrise (PDA) som tar prøver ved 1600 bilder/sekund (figur 1), som, når den brukes med rask absorbans VSDs, avslører virkningspotensialene til alle registrerte nevroner7. Signalene registrert av alle dioder vises umiddelbart etter oppkjøp og legges på et bilde av ganglion i PDA-oppkjøpsprogramvaren, noe som gjør det mulig å undersøke nevroner av interesse med skarpe elektroder i samme forberedelse8,9.
I de rå PDA-dataene registrerer mange dioder overflødig de større nevronene, og mange inneholder også blandede signaler fra flere nevroner. Et vendepunkt var utviklingen av en automatisert spike-sorteringsmetode ved hjelp av uavhengig komponentanalyse for raskt å behandle hvert rå 464-kanals PDA-datasett til et nytt sett med spor, der hver innspilte nevron vises i et eget spor som bare inneholder handlingspotensialene10,11.
I denne artikkelen skisserer vi de viktigste trinnene som er involvert i å skaffe store action potensielle opptak fra gastropodnervesystemer med en fotodiodematrise og raske absorbering VSDer. Vi illustrerer videre analytiske metoder som kan brukes til klynging og kartlegging av optisk innspilte nevroner med hensyn til deres funksjonelle ensembler, og for å karakterisere funksjoner på befolkningsnivå som ofte ikke er tydelige gjennom enkel inspeksjon av avfyringssporene12,13.
En av de viktigste detaljene i implementeringen av vår store VSD-bildemetode er å minimere vibrasjoner, noe som gir bevegelser av kontrastkanter over diodene, noe som resulterer i store artefaktuelle signaler. Fordi absorbans VSDs produserer svært små prosentvise endringer i lysintensitet med virkningspotensialer, kan vibrasjonsartefakter, hvis de ikke forhindres, skjule de nevronale signalene av interesse. Vi bruker flere metoder for å minimere vibrasjonsartefakter. For det første ligger bilderommet vårt i første etasje, som isolerer preparatet fra vibrasjoner knyttet til bygging av luftbehandlingsutstyr og mange andre kilder. For det andre ble det brukt et fjærbasert isolasjonsbord, som andre PDA-brukere har bekreftet gir bedre vibrasjonsdemping enn det vanligste luftbordet16. For det tredje ble det brukt vanninnlevelsesmål, noe som eliminerer bildesvingninger som oppstår fra overflate krusninger. For det fjerde ble preparatet som ble avbildet lett presset mellom kammerdekslene og et coverlipfragment presset ned ovenfra som holdes på plass av silikonplugger eller petroleumjell, noe som ytterligere stabiliserer preparatet. Dette flater også ut den konvekse overflaten av ganglion eller ganglia som blir avbildet, noe som resulterer i flere nevroner i fokusplanet til målet, noe som øker antall nevroner som er registrert.
For å maksimere signal-til-støy-forholdet for de svært små endringene i graden av VSD-lysabsorbering som følge av et handlingspotensial, er det viktig å oppnå nesten mettende lys gjennom forberedelsen til PDA, samtidig som fotobleaching av fargestoffet minimeres. For dette formål jobber vi vanligvis med 3-4 V hvilelysintensitet, målt med PDA-kontrollpanelets forsterkningsbryter i 1x-posisjon (PDAs 464 forsterkere metter ved 10 V lys). Under datainnsamlingen endres denne gevinstfaktoren til 100x. Å få tilstrekkelig lys til å nå 3-4 V målt ved PDA kan oppnås på flere måter. Bruk først en ultrabright LED-lyskilde som leverer en bølgelengde som passer til absorpsjonsegenskapene til absorbansfargen som er i bruk. Følgelig ble det brukt en 735 nm LED-kollatert lampe, som overlapper med de optimale absorpsjonsbølgelengdene til RH155 og RH482. For det andre, om nødvendig, bruk en flip-top substage kondensator som konsentrerer lyset fra LED-lyskilden til et mindre område. For det tredje justerer du kondensatorhøyden for å oppnå Köhler-belysning, noe som sikrer høy, jevn lysstyrke og maksimal bildekvalitet. For det fjerde, sørg for at det ikke er varmefiltre i den optiske banen, noe som kan dempe LED-lampens bølgelengde på 735 nm. For det femte, fjern diffusorer, hvis mer lys er nødvendig, fra den optiske banen. For det sjette, bruk høye NA-mål, som gir høy romlig oppløsning, og la tilstrekkelige lysnivåer nå PDA ved lavere lampeintensiteter. Dette har gjort det mulig for oss å minimere fotobleaching i den grad vi kan få flere oppkjøpsfiler på 10-20 min varighet per forberedelse ved hjelp av samme lysintensitet på tvers av alle filer og uten betydelig tap av signalamplitude eller behovet for gjenfarging. Avgjørende, hvis eksperimentet ønsker å spore nevroner over disse lengre filene, må du sørge for at fokusplanet ikke endres, og at preparatet ikke beveger seg. Til slutt er en ekstra måte å rute tilstrekkelig lys til PDA å bruke yngre dyr, som har tynnere, og dermed mindre ugjennomsiktig ganglia.
Fra tid til annen finner vi at signal-til-støy-forholdet mellom de optiske signalene forverres og/ eller motorprogramrytmene er suboptimale (f.eks. sakte eller unormale). Når dette begynner å skje konsekvent, blander vi ferske løsninger av VSD. Aliquots av VSD forblir vanligvis levedyktig i ca 6 måneder i en -20 °C fryser. Relatert er det verdt å merke seg at for Berghiaer de beste resultatene så langt oppnådd med absorbansen VSD RH482. Siden RH482 er mer lipofil enn RH155, kan det bedre flekke Berghiasrelativt mindre nevroner eller forbli i nevronmembranene mer effektivt ved høyere registrerings saltvannstemperatur som brukes til denne tropiske arten.
En begrensning ved PDA-basert avbildning av nevral aktivitet er knyttet til vekselstrømskoblingen av spenningssignalene i maskinvare før 100x preamplifiseringstrinnet: Selv om dette representerer en nødvendig funksjon for å fjerne den store DC-forskyvningen produsert av det høye hvilelysnivået som kreves av denne teknikken, utelukker AC-koblingen iboende til PDA måling av langsomme endringer i membranpotensialet, for eksempel de som er forbundet med synaptiske innganger. Hvis det ønskes å registrere potensielle endringer i langsom eller steady-state, kan et DC-koblet CMOS-kameraavbildningssystem brukes til å fange opp subthreshold-aktivitet. Byrne og kollegene brukte nylig et slikt oppsett med RH155 for å avbilde aktiviteten til nevroner i den bukkale ganglion av Aplysia17,18. Vi har brukt begge systemene og funnet ut at CMOS-kameraet, på grunn av sin mye høyere tetthet av detektorer (128 x 128), genererer 50 ganger større datafiler for samme bildetid7. PDAs mindre filer muliggjør raskere behandling og analyse. Dette muliggjør også utvidede opptak med én prøve (figur 4) og studier av læring, der data fra flere forsøk settes sammen til én stor fil før toppsortering, slik at nettverksorganisasjonen kan spores etter hvert som læring utviklerseg 19.
I andre kamerabaserte undersøkelser har fluorescerende VSDer blitt brukt av Kristan og kolleger til å undersøke nettverksfunksjonen i segmentet ganglia i leech. I en innflytelsesrik studie førte dette til identifisering av en nevron involvert i dyrets beslutning om å svømme eller å krype20. I en annen studie undersøkte Kristan et al. i hvilken grad leechs svømming og krypende oppførsel er drevet av multifunksjonelle vs. dedikerte kretser21. Mer nylig brukte Wagenaar og kolleger et tosidig mikroskop for spenningsavbildning som gjør at de kan registrere fra nesten alle nevroner i en leech segmental ganglion22. I motsetning til mange kamerabaserte bildemetoder er en fordel med vår PDA-baserte bildemetode rask og objektiv spike-sortering av ICA, en form for blind kildeseparasjon som ikke innebærer noen beslutninger om nevronale grenser for resultatbehandling.
Med hensyn til valg av VSDs, en fordel med absorbans fargestoffer RH155 og RH482 er den lille til ingen fototoksisitet forbundet med dem23,24, noe som muliggjør lengre opptakstider enn det som er typisk for fluorescerende VSDer. Videre er de raske absorbans VSDene vi bruker godt egnet til å registrere de overskytende somatiske virkningspotensialene i gastropodpreparater, som vanligvis er 80 mV i amplitude. Som vist i figur 3G, kan vår optiske metode registrere handlingspotensiale undershoots (ingen av opptakene våre er sporgjennomsnittet): Dette antyder at VSD-ene vi bruker skal kunne skjelne handlingspotensialer i andre modellsystemer som til en viss grad demper og dermed ikke overskyter når de når soma. Likevel er vår optiske tilnærming kanskje ikke ideell for arter som er kjent for å vise svært svekkede virkningspotensialer når de registreres i soma.
Mye aktuell forskning på nevrale nettverk er fokusert på et lite antall designertransgene arter. Imidlertid drar nevrovitenskap nytte av studiet av et bredt utvalg av fylogentisk distinkte arter. Å studere mange forskjellige arter gir innsikt i hvordan kretser utvikler seg25,26, og belyser prinsipper for nettverksfunksjon som kan være vanlige på tvers av phyla1,2,3,4,27. Vi har så langt brukt vår bildemetode på en rekke gastropodarter, inkludert Aplysia californica8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (upubliserte data), og senest Berghia stephanieae (Figur 5). En appell til denne tilnærmingen er at den lett kan brukes på mange arter, uten behov for transgene dyr. Vi ønsker å erkjenne at vår bruk av VSD-avbildning med raske absorbansfargestoffer og en PDA følger i fotsporene til banebrytende arbeid som oppnådde dette i semi-intakte, oppføre seg Navanax29 og Aplysia30 preparater. Vår vektlegging av hurtigheten i vår tilnærming er delvis et svar på bekymringer om at mange etterforskere kan bli stadig mer motvillige til å initiere nettverksstudier i nye arter på grunn av frykt for at mange års studier vil være nødvendige for å karakterisere grunnleggende nettverksorganisasjon før de kan utforske vitenskapelige spørsmål av stor interesse for nevrovitenskap31. Derfor er målet vårt her å demonstrere en teknikk som i stor grad fremskynder prosessen – til det punktet at betydelig innsikt samme dag i nettverksorganisasjonen kan fås fra enkeltforberedelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NSF 1257923 og NIH 1U01NS10837. Forfatterne ønsker å anerkjenne Jean Wangs hjelp i laboratoriet.
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |