Summary
Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.
Abstract
La obesidad es un importante problema de salud pública en todo el mundo que aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2 y enfermedades hepáticas. La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa del tejido adiposo (AT) debido a la hiperplasia de adipocitos y/o hipertrofia, lo que conduce a una profunda remodelación de su estructura tridimensional. De hecho, la capacidad máxima de AT para expandirse durante la obesidad es fundamental para el desarrollo de patologías asociadas a la obesidad. Esta expansión AT es un importante mecanismo homeostático para permitir la adaptación a un exceso de ingesta de energía y para evitar el derrame de lípidos nocivos a otros órganos metabólicos, como el músculo y el hígado. Por lo tanto, entender la remodelación estructural que conduce al fracaso de la expansión AT es una cuestión fundamental con alta aplicabilidad clínica. En este artículo, describimos un método de limpieza simple y rápido que se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para explorar la morfología del ratón y el tejido adiposo blanco humano por imágenes fluorescentes. Este método de compensación AT optimizado se realiza fácilmente en cualquier laboratorio estándar equipado con una capucha química, un agitador orbital con temperatura controlada y un microscopio fluorescente. Además, los compuestos químicos utilizados están fácilmente disponibles. Es importante destacar que este método permite resolver la estructura 3D AT manchando varios marcadores para visualizar específicamente los adipocitos, las redes neuronales y vasculares, y la distribución de células inmunitarias innatas y adaptativas.
Introduction
La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa de tejido adiposo y se ha convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo, dado que las personas con obesidad tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, enfermedades hepáticas y algunos tipos de cáncer.
Una función fisiológica fundamental del tejido adiposo es modular la glucosa de todo el cuerpo y la homeostasis lipídica1,2. Durante el período de alimentación, los adipocitos (es decir, las células principales del tejido adiposo) almacenan el exceso de glucosa y lípidos proporcionado por una comida en triglicéridos. Durante el ayuno, los adipocitos descomponen los triglicéridos en ácidos grasos no esterificados y glicerol para mantener la demanda de energía del cuerpo. Durante el desarrollo de la obesidad, el tejido adiposo se expande aumentando el tamaño (hipertrofa) y/o el número (hiperplasia) de adipocitos1,para aumentar su capacidad de almacenamiento. Cuando la expansión del tejido adiposo alcanza su límite, una constante altamente variable entre los pacientes, los lípidos restantes se acumulan en otros órganos metabólicos incluyendo músculos e hígado3,,4, lo que conduce a su fracaso funcional e inicia complicaciones cardio-metabólicas relacionadas con la obesidad1,,5. Por lo tanto, identificar los mecanismos que rigen la expansión del tejido adiposo es un desafío clínico clave.
Las modificaciones morfológicas documentadas dentro de los tejidos adiposos durante la obesidad están vinculadas a su disfunción patológica. Se han utilizado varios procedimientos de tinción para describir la organización tisular del tejido adiposo, incluyendo actina6,marcadores vasculares7, marcadores de gotas de lípidos8, y marcadores específicos de células inmunitarias9,10. Sin embargo, debido al enorme diámetro de los adipocitos (50 a 200 m)11, es esencial analizar una gran parte de todo el tejido en tres dimensiones con el fin de analizar con precisión los dramáticos cambios estructurales de AT observados durante la obesidad. Sin embargo, debido a que la luz no penetra en un tejido opaco, no es posible tomar imágenes en 3D dentro de una gran muestra de tejido utilizando microscopía de fluorescencia. En la literatura se han notificado métodos de limpieza de tejidos para hacerlos transparentes (para una revisión, véase12), lo que permite limpiar los tejidos y realizar una microscopía de fluorescencia de tejido entero en profundidad. Estos métodos ofrecen oportunidades sin precedentes para evaluar la organización celular 3D en tejido sano y enfermo. Cada uno de los métodos descritos tiene ventajas e inconvenientes, y por lo tanto debe ser cuidadosamente seleccionado dependiendo del tejido estudiado (para una revisión, ver13). De hecho, algunos enfoques requieren un largo período de incubación y/o el uso de materiales o compuestos que sean caros, tóxicos o difíciles de obtener14,,15,,16,,17,,18,,19. Aprovechando uno de los primeros compuestos utilizados hace un siglo por Werner Spalteholz para limpiar los tejidos20,hemos establecido un protocolo fácil de usar y económico que está muy bien adaptado para la limpieza de todos los depósitos de tejido adiposo humano y ratón en cualquier laboratorio con equipos típicos que incluyen una capucha química, un agitador orbital controlado por temperatura y un microscopio confocal.
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Protocol
Este protocolo fue probado y validado para todos los depósitos de ratón y tejido adiposo blanco humano. Los tejidos adiposos humanos y de ratón fueron recogidos en consecuencia a las leyes europeas y aprobados por los comités éticos franceses y suecos.
1. Fijación del ratón y el tejido adiposo blanco humano
- Sumerja el ratón cosechado o los tejidos adiposos blancos humanos en al menos 10 ml de PBS que contengan un 4% de paraformaldehído (PFA) en un tubo de plástico de 15 ml.
- Agitar el tubo de plástico a temperatura ambiente en una placa de rodadura durante 1 h.
- Deje el tubo de plástico a 4 oC en una placa enrollable durante la noche, para completar la fijación.
NOTA: Este protocolo está adaptado para muestras de tejido adiposo grandes, como las almohadillas de grasa epidídmica enteras obtenidas de ratones alimentados con una dieta normal (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Para muestras más grandes como almohadillas epidídmicas de grasa obtenidas de ratones alimentados con una dieta alta en grasas (≈1,5 g - ≈4 cm3) o muestras de tejido adiposo humano, aunque el protocolo de compensación debería funcionar perfectamente para toda la muestra (ampliando la PFA y las mezclas de anticuerpos), en general, cortamos piezas de tejido alrededor de 1 g (≈2,5 cm3)para reservar las muestras restantes ya sea para tinciones adicionales o aplicaciones. Para el PFA (paso 1.1.) recomendamos usar aproximadamente 10 veces el volumen del tejido. Para las mezclas de anticuerpos (pasos 3.1. y 3.4.), aumente el volumen para sumergir completamente el tejido y utilice un tubo de plástico de 15 ml (ver Tabla de Materiales)si el tejido es demasiado grande para un microtubo de plástico de 1,5 ml (ver Tabla de materiales).
2. Permeabilización y saturación del ratón y el tejido adiposo blanco humano
- Enjuague el tejido adiposo blanco fijo en 10 ml de PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los restos de PFA.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,3% de glicina (ver Tabla de materiales)y agitar el tubo a temperatura ambiente en un agitador orbital durante 1 h a 100 revoluciones por minuto (rpm) para apagar los grupos de aldehídos libres restantes.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100 (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37oC en un agitador orbital con temperatura controlada durante 2 h a 100 rpm.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100 y un 20% de DMSO (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante la noche.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,1% de interpolación-20 (ver Tabla de Materiales),0,1% Tritón X-100, 0,1% desoxicolato (ver Tabla de Materiales)y 20% DMSO y agitar el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos 24 h.
- Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Triton X-100 y agitar el tubo a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 1 h.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA (ver Tabla de Materiales)y agitar el tubo a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante 12 h, para saturar cualquier sitio que no pueda enlazar específicamente anticuerpos.
NOTA: En el paso 2.7, la BSA puede sustituirse por el suero sanguíneo de las especies del anticuerpo secundario utilizado.
3. Procedimiento de tinción para ratón y tejido adiposo blanco humano
- Transfiera el tejido en un microtubo plástico de 1,5 ml que contenga 300 l de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100, un 10% de DMSO, un 3% de BSA y los anticuerpos primarios (10 veces más concentrados que para la tinción por criocirios, pero se debe evaluar la concentración óptima de anticuerpos para cada anticuerpo). Proteja el tubo de la luz cubriendo con papel de aluminio y agite el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos dos días (véase la nota en los pasos 1.1 y paso 3.7.1).
- Enjuague el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agite el tubo protegido de la luz a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante 5 h. Realice este paso dos veces.
- Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante una noche a dos días.
- Transfiera el tejido a un microtubo de plástico de 1,5 ml que contenga 300 l de PBS complementado con un 0,2% de Tritón X-100, un 10% de DMSO, un 3% de BSA y los anticuerpos secundarios (10 veces más concentrados que para la tinción por criocirión). Proteja el tubo de la luz cubriendo con papel de aluminio y agite el tubo a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante al menos dos días (véase la nota en los pasos 1.1 y paso 3.7.1).
- Enjuague el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agite el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante 5 h. Realice este paso dos veces.
- Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS complementado con 0,2% de Tritón X-100, 10% DMSO y 3% BSA y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital controlado por temperatura a 100 rpm durante una noche a dos días.
- Enjuagar el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de PBS y agitar el tubo, protegido de la luz, a 37 oC en un agitador orbital con temperatura controlada a 100 rpm durante 2 h.
NOTA: Para el etiquetado de estructuras específicas como núcleos o actina, añadir 4o,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI o equivalente) y/o el fluorescente etiquetado-phalloidin deben añadirse en el paso 3.1. cuando sólo se utilizan anticuerpos primarios con etiqueta fluorescente, o en el paso 3.4. cuando se utilizan anticuerpos secundarios.
NOTA: Para el procedimiento de tinción, se pueden utilizar anticuerpos primarios ya conjugados con fluorocromos (como los utilizados para la citometría de flujo) y lo recomendamos para la ganancia de tiempo y especificidad. De hecho, incluso si los anticuerpos primarios del ratón pueden ser utilizados seguidos de anticuerpos anti-ratón secundarios, como lo demostramos aquí, a menudo hemos observado tinción no específica de los vasos sanguíneos debido a la inmunoglobulina circulante. Por lo tanto, para evitar este problema, los anticuerpos primarios que ya están etiquetados son muy recomendables y aquí proporcionamos evidencia de que los anticuerpos utilizados en la citometría de flujo son compatibles con nuestro procedimiento. Sin embargo, en el caso específico de un antígeno que se expresa en niveles bajos, un paso de amplificación de señal a través de anticuerpos secundarios es obligatorio; cuando el único anticuerpo primario disponible se hace en ratón, una perfusión cardíaca de los ratones con PBS durante al menos 5 minutos en el sacrificio puede eliminar una gran proporción de inmunoglobulina circulante y, por lo tanto, la tinción no específica.
4. Procedimiento de limpieza para el ratón y el tejido adiposo blanco humano
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 50% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 70% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 95% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 100% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante 2 h.
- Sumergir el tejido en un tubo de plástico de 15 ml que contenga 10 ml de etanol al 100% y agitar el tubo, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante la noche.
- Sumergir el tejido en una botella de vidrio de 20 ml con una tapa de plástico (ver tabla de materiales) que contenga 5 ml de salicilato de metilo (ver Tabla de materiales)bajo una capucha química y agitar el recipiente de vidrio, protegido de la luz, a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 rpm durante al menos 2 h.
NOTA: El procedimiento de compensación podría acelerarse significativamente (si fuera necesario) evitando los pasos 4.3. y 4.5., aunque la calidad final de compensación se reduciría ligeramente.
5.3D-confocal imágenes de tejido adiposo blanco transparente
- Transfiera el tejido a una cámara de imágenes metálicas equipada con un fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales)bajo una capucha química y llene la cámara con salicilato de metilo fresco.
NOTA: Para asegurar el tejido en su lugar, y así evitar que flote o se mueva hacia los lados en la cámara, aplique múltiples cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm (ver Tabla de Materiales)en la parte superior del tejido al montarlo en la cámara. - Coloque la cámara de imágenes en un microscopio confocal invertido.
- Imagen del tejido utilizando un objetivo de baja ampliación (por ejemplo, objetivo 4x) para generar unos pocos cm3 mapas 3D de todo el tejido adiposo o de la muestra de tejido humano.
- Seleccione varias áreas para el muestreo de tejido con mayor aumento. Normalmente, utilice un objetivo de aire de larga distancia de 20x que proporcione una buena relación entre resolución y profundidad. Adquirimos grandes imágenes de mosaico con pilas z de entre 600 y 2000 m de profundidad.
NOTA: Utilice un objetivo de larga distancia para profundizar en el tejido.
6. Extracción de resultados cuantitativos de las imágenes de tejido adiposo 3D
NOTA: La segmentación de las diferentes estructuras y la posterior extracción de la información cuantitativa de la pila de imágenes 3D generada en el punto 5 se pueden realizar utilizando cualquiera de las muchas opciones de software de análisis de imágenes existentes, ya sea comercial o freeware. En los siguientes puntos, describimos una estrategia que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio para extraer información cuantitativa de imágenes de tejido adiposo 3D utilizando software comercial (ver Tabla de materiales).
- Convierta las pilas 3D en el formato de software para liberar espacio de memoria.
- Segmente las celdas.
- Abra el módulo Cell del software.
- Cambie el ajuste de Detección celular a Tinción de membrana plasmática.
- Elija el canal fluorescente del marcador utilizado para delinear la periferia celular (phalloidina que etiqueta la actina cortical o marcadores de membrana plasmática como F4/80 para macrófagos, TCR-β para células T o racimo de proteínas CD de diferenciación específicas para subtipos de células inmunitarias).
- Configure los umbrales y proporcione un rango de tamaño de celda esperado (es decir, de 1 a 200 m para la detección de celdas).
- Ejecute la segmentación. Se generará un volumen correspondiente a la pila z con las celdas segmentadas codificadas por colores con un color diferente para cada una de las celdas vecinas.
- Aplicar filtros estadísticos (tamaño, redondez, circularidad, etc.) en la pestaña estadística para excluir artefactos de segmentación y/o refinar las celdas segmentadas a la célula de interés en función de su tamaño (es decir, 20-200 m para los adipocitos; 5-25 m para macrófagos; 1-3 m para linfocitos).
- Extraiga medidas y datos cuantitativos (volumen, número, tamaño, diámetro, etc.) de la pestaña de estadísticas.
- Segmente componentes celulares (núcleos, vesículas, etc.) o vasos como estructura.
NOTA: Aunque la segmentación del filamento es muy útil para estudiar la conectividad de los recipientes, utilizamos la segmentación del módulo de superficie para extraer datos sobre el tamaño, volumen y diámetros de los recipientes. De hecho, la cuantificación de los tamaños de los recipientes se pierde cuando se utiliza el módulo de filamentos.- Abre el módulo Surface del software.
- Seleccione el canal fluorescente del marcador utilizado para etiquetar específicamente el componente subcelular para reconstruirlo en 3D.
- Configure los umbrales y proporcione un rango del tamaño de diámetro esperado de la estructura (es decir, 0,5-5 m para núcleos; 0-100 m para recipientes; etc.).
- Ejecute la segmentación. Se generará un volumen con la estructura celular segmentada. Las mediciones y los datos cuantitativos (volumen, número, tamaño, diámetro, etc.) se pueden extraer de la pestaña de estadísticas.
- Segmentar los vasos como un continuo tubular.
NOTA: Aunque la segmentación del filamento es muy útil para estudiar la conectividad de los recipientes, utilizamos la segmentación del módulo de superficie para extraer datos sobre el tamaño, volumen y diámetros de los recipientes. De hecho, la cuantificación de los tamaños de los recipientes se pierde cuando se utiliza el módulo de filamentos.- Abra el módulo Filamentos del software.
- Seleccione el canal fluorescente correspondiente a la tinción del recipiente.
- Configure los umbrales para la intensidad de fluorescencia y seleccione el número adecuado de nodos de conexión esperados.
- Ejecute la segmentación. Los filamentos que representan la red de buques se generarán en 3D. Las mediciones se pueden extraer de la pestaña de estadísticas, lo que permite obtener datos cuantitativos, incluida la longitud del buque, el número de ramificaciones de los buques, etc.
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Representative Results
Usando el procedimiento descrito aquí y resumido en la Figura 1,pudimos manchar y limpiar ópticamente el tejido adiposo blanco humano y ratón como se presenta en la Figura 2A y la Figura 2B,respectivamente. El tejido transparente se transfirió a la cámara de imágenes metálicas para realizar imágenes confocales(Figura 3A). El aclaramiento mejoró drásticamente la profundidad de las imágenes tisulares que pudimos adquirir(Figura 3B y Figura 3C). Todo el tejido adiposo se puede adquirir en 3D a bajo aumento utilizando un objetivo 4x (ver Película Suplementaria 1),para generar un mapa 3D, permitiendo seleccionar las diferentes áreas a adquirir con un alto aumento utilizando un objetivo 20x(Figura 3D). Las imágenes de alto aumento se adquieren en 3D con una profundidad de 2 mm(Figura 3E).
Este procedimiento permite el etiquetado de numerosos marcadores celulares generales, incluidos los núcleos mediante el uso de DAPI y actina mediante el uso de Phalloidin con etiqueta fluorescente. La tinción específica de gotas de lípidos y adipocitos se puede lograr mediante el uso de anticuerpos perilipinas (ver tabla de materiales; Figura 4A) y anticuerpos anti-Glut4 (ver tabla de materiales; Figura 4B) Respectivamente. Los vasos sanguíneos se pueden detectar utilizando el anticuerpo CD31 (ver tabla de materiales; Figura 4C) o por una inyección intravenosa de lectina-DyLight649 poco antes del sacrificio del ratón (ver tabla de materiales; Figura 4D). Los macrófagos y las células T se pueden visualizar utilizando el anticuerpo anti-CD301-PhycoErythrin (ver tabla de materiales; Figura 4D) y el anticuerpo anti-TCR-β-Pacific Bleu (ver tabla de materiales; Figura 4E). La red nerviosa periférica se puede detectar utilizando el anticuerpo antitirosina hidroxilasa (TH) (ver tabla de materiales; Figura 4F-G). Además, este protocolo permite la limpieza del tejido adiposo epididimal del ratón (Figura 4A-B,E), tejido adiposo subcutáneo del ratón (Figura 4D,G), tejido adiposo marrón del ratón(Figura 4F), y tejido adiposo humano (Figura 4C). Utilizando una combinación de estos etiquetados y un software comercial (ver tabla de materiales) para segmentar estos marcadores, podemos determinar dentro del tejido adiposo i) adipocitos media tamaño y distribución del tamaño (Figura 5A-B) y ii) densidad de la red de los vasos sanguíneos (Figura 5C).
Figura 1: Resumen del procedimiento de aclaramiento para el tejido adiposo blanco. Los tejidos adiposos blancos o de ratón son fijos, permeabilizados, saturados, manchados y despejados. Las imágenes se adquieren en 3D y se analizan utilizando un software comercial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fotografías de tejido adiposo blanco. (A) Fotografía del tejido adiposo abdominopelvic blanco humano antes y después del procedimiento de aclaramiento. (B) Fotografía del tejido adiposo blanco epidídmico del ratón antes y después del procedimiento de aclaramiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Profundidad de imagen mejorada con aclaramiento de tejido adiposo. (A) Montaje de la cámara de imágenes metálicas equipada con fondo de cristal. (B) Imágenes de la serie Z del ratón epididimal blanco tejido adiposo manchado con faloideina-Alexa488 (verde) antes y después de la limpieza. (C) Proyecciones XZ correspondientes a las líneas de puntos blancas a través del panel B z-stack. (D) Proyección Z de 0,4 cm z-pila de ratón subcutáneo blanco adiposo teñido para actina utilizando Phalloidin-Alexa488 y adquirido a bajo aumento con un objetivo 4x. Las pequeñas imágenes de la derecha fueron adquiridas en la posición de tejido seleccionada usando un objetivo 20x. (E) Vista lateral de la representación de volumen 3D de la pila z de la imagen a partir de tejido adiposo blanco del ratón borrado manchado con Phalloidin-Alexa488 adquirido de forma similar a las imágenes de 20x de (D). La profundidad de imagen 3D lograda por nuestro procedimiento de gran magnificación se demuestra aquí y se subraya mediante una codificación de color de profundidad z (azul oscuro para z-0 mm a rojo oscuro para z-2 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tejidos adiposos blancos humanos y ratones manchados para varios marcadores. (A) Imagen de plano único del tejido adiposo blanco epidídmico del ratón manchado para gotas lipídicas utilizando anticuerpo antiperilipin1 y anticuerpo conjugado anti-ratón-alexa647. (B) Imagen de plano único mosaico del tejido adiposo blanco epidídmico del ratón manchado para núcleos y adipocitos utilizando DAPI, anticuerpo anti-Glut4 y anticuerpos conjugados anti-ratón-alexa647. (C) Proyección Z de 600 m de pila z de tejido adiposo abdominopelvic blanco humano teñido para vasos que utilizan anticuerpo conjugado CD31-alexa647. (D) Proyección Z de 600 m z-pila de tejido adiposo blanco subcutáneo de ratón manchado para vasos y macrófagos utilizando inyecciones intravenosas de lectina-DyLight649 y anticuerpos anti-CD301-alexa555. El recuadro inferior derecho es una imagen ampliada del cuadro de puntos blanco. (E) Imagen de plano único del tejido adiposo blanco epidídmico del ratón manchado para células actina y T utilizando falhalloidin-Alexa488 y anti-TCR-Pacific azul-conjugado. El recuadro inferior derecho es una imagen ampliada del cuadro de puntos blanco. (F) Proyección Z de 50 m de pila z de tejido adiposo marrón de ratón manchado para núcleos y red neuronal utilizando DAPI, anticuerpo anti-TH y anticuerpo anti-conejo-alexa647-conjugado. (G) Proyección Z de 600 m de pila z de tejido adiposo blanco subcutáneo de ratón manchado para núcleos y red neuronal utilizando DAPI, anticuerpo anti-TH y anticuerpos conjugados anti-conejo-alexa647. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de imágenes 3D utilizando software disponible comercialmente (ver tabla de materiales). (A) Representación en volumen 3D de adipocitos humanos segmentados en 3D por software disponible comercialmente. Cada adipocitos tiene un color diferente a sus adipocitos adyacentes en contacto. Los recipientes están representados en rojo. (B) Cuantificación y distribución de tamaños de los adipocitos a partir de la representación de volumen 3D del panel A, que contiene alrededor de 20.000 adipocitos. (C) Representación en volumen 3D de vasos sanguíneos segmentados en 3D utilizando software disponible comercialmente y representados en rojo o amarillo para los vasos grandes y pequeños, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementaria 1: Renderizado de volumen 3D de todo el tejido adiposo blanco subcutáneo que se muestra en la Figura 3D. La caja blanca representa un cubo de 2 cm3. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Las modificaciones que se producen dentro del tejido adiposo a lo largo de la progresión patológica, como la de la obesidad, son fundamentales para la comprensión de los mecanismos detrás de la patología. Estudios pioneros que revelaron estos mecanismos en el tejido adiposo se han basado en enfoques globales como la proteómica entera del tejido adiposo21,la citometría de flujo22,,23,y la transcriptómica24,,25. Además, se han realizado esfuerzos para explorar los cambios estructurales que se producen en el tejido adiposo utilizando análisis histológicos26,27,28,29. Sin embargo, el análisis de las secciones de tejido adiposo de 5-10 m, debido al tamaño limitado de la sección, restringe la capacidad de apreciar características estructurales importantes. En primer lugar, sólo unos pocos núcleos de adipocitos son detectables por sección, ya que cadathsección representa sólo una pequeña porción de los adipocitos (1/10o). En segundo lugar, el tamaño de los adipocitos estimados a partir de secciones de tejido adiposo es inexacto porque la mayoría de los adipocitos se cortan por debajo o detrás de su ecuador, lo que conduce a una medición sesgada (inferior) de su tamaño medio. En tercer lugar, el continuo de los vasos sanguíneos y la fibra nerviosa se pierden durante la sección física. En cuarto lugar, la distribución de cada subtipo de células inmunitarias dentro del tejido es difícil de establecer porque se pierden las coordenadas tridimensionales. En este contexto, la metodología que proponemos aquí permite a cualquier laboratorio estándar tomar imágenes de tejido adiposo blanco humano y ratón en tres dimensiones, de una manera sencilla y económica.
Este método tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el tiempo necesario para preparar el tejido (fijación, permeabilización, tinción, limpieza) es largo (más de una semana). Esto sería difícil de reducir porque la mayoría de este tiempo se requiere para manchar el tejido. La penetración de anticuerpos dentro de muestras de tejido tan grandes requiere largos tiempos de incubación. Disminuir el tiempo de incubación aumentaría el riesgo de tener una penetración de anticuerpos no homogéneos, lo que llevaría a la tinción de artefactos. Por lo tanto, la única ventana posible para ganar tiempo y acortar el procedimiento es el tiempo dedicado a limpiar el tejido, que toma alrededor de un día cuando se requieren resultados óptimos, pero esto se puede reducir a medio día sin una caída dramática en la calidad. La segunda limitación es la probable contracción del tejido. De hecho, en cualquier protocolo que deshidrate el tejido usando disolventes, es probable que los tejidos se encojan debido a la extracción de agua. Estimar esta contracción siempre es difícil, y es casi imposible aquí porque el borde del tejido se vuelve transparente cuando los lípidos comienzan a extraerse durante el proceso de deshidratación. Por lo tanto, las estimaciones de tamaño de los tejidos despejados deben interpretarse con precaución. Sin embargo, la comparación de los cambios en el tamaño de los adipocitos o la longitud del recipiente entre tejidos derivados del ratón con diferentes genotipos y/o sometidos a diferentes condiciones ambientales sigue siendo informativo11. La última limitación está relacionada con el gran volumen de todo el ratón tejido adiposo o de una gran muestra quirúrgica de tejido adiposo humano. De hecho, aunque el protocolo está perfectamente adaptado para limpiar estas grandes muestras, la toma de imágenes de todo un órgano es un desafío con un microscopio confocal. La estrategia para superar este problema y explotar todo el potencial de todo el procedimiento de compensación de órganos, es adquirir un mapa de baja ampliación 3D de todo el órgano mediante el uso de un objetivo 4x, y seleccionar áreas específicas aleatoriamente dispersas dentro del tejido donde se pueden adquirir imágenes 3D de mayor aumento utilizando un objetivo de larga distancia 20x. La configuración de "alto aumento" permite tomar imágenes del volumen tisular de alrededor de 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Aunque este volumen es limitado en comparación con el volumen de todo el órgano (0,5 a más de 4 cm3),la repetición de las adquisiciones en varias posiciones dentro del tejido nos permite obtener una buena muestra del tejido a resolución celular a subcelular. Tenga en cuenta que la creación de imágenes de tejidos grandes generará una cantidad significativa de datos de imágenes que deberán almacenarse.
El procedimiento tiene diferencias significativas en comparación con los métodos que se han descrito previamente para eliminar el tejido adiposo14,,30. En primer lugar, a diferencia de AdipoClear, que utiliza metanol, diclorometano, y dibenzylether14, el método presentado aquí utiliza etanol para la deshidratación y salicilato de metilo para la limpieza. Por lo tanto, el procedimiento es más seguro porque se aprovecha de los disolventes de limpieza menos tóxicos que a menudo son utilizados por las industrias de procesamiento de alimentos/bebidas (etanol y metilsalicilato), en comparación con la alta toxicidad del diclorometano, metanol y dibenzylether. Además, la preparación del tejido según el protocolo es dos días más rápida que el protocolo AdipoClear14. Más recientemente, Li y sus colegas propusieron otro método para limpiar las piezas de tejido adiposo sumergiéndolas en glicerol30. Este protocolo es muy simple incluso en comparación con este procedimiento, y la calidad de las imágenes es buena incluso con un alto aumento. Sin embargo, este protocolo de compensación sólo funciona de manera eficiente cuando se utilizan piezas de tejido adiposo de 2 mm3. La sección del tejido en estas pequeñas muestras antes del procedimiento de limpieza evita que uno esté imágenes de volúmenes de tejido superiores a 2 mm3 incluso con bajo aumento. El procedimiento presentado aquí permite mapear todo el tejido en 3D con bajo aumento y adquisición de pilas 3D de imágenes alrededor de 45 mm3 en varias posiciones conocidas dentro de todo el tejido adiposo despejado a un alto aumento.
Este procedimiento puede tener varias aplicaciones futuras. Al igual que con cualquier método, el procedimiento descrito aquí se puede simplificar y/o optimizar aún más. Un avance interesante para el procedimiento podría provenir de la combinación del proceso de compensación, describimos, con enfoques de imagen adicionales. Por ejemplo, configuraciones de imágenes específicas, como Tomografía de Proyección Óptica (OPT), Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF), Microscopía de Iluminación de Plan Selectivo (SPIM) o Microscopía de Agotamiento de Emisiones Estimuladas (STED) son en principio compatibles con el procedimiento, aunque esto limitará su aplicabilidad a aquellos laboratorios que están equipados con estos sistemas. Alternativamente, utilizando un objetivo con un alto índice de apertura numérica y un sistema de adquisición que es capaz de adquirir cientos de imágenes por segundo, que se encuentra en muchos laboratorios, se podría realizar análisis de superrescidad mediante el uso de la Super Resolución De fluctuaciones radiales (SRRF) análisis de imagen de post-procesamiento freeware31. Curiosamente, los fluorocromos clásicos están adaptados para el análisis SRRF, lo que permitiría análisis de superresor resolución 3D de tejidos adiposos enteros humanos y blancos de ratón.
Muchos pasos críticos en el protocolo están relacionados con el procesamiento de tejido antes de la limpieza en sí. En primer lugar, y en cuanto a los análisis histológicos clásicos, el paso de fijación es fundamental. En el caso de la fijación débil, las características estructurales no se conservan, mientras que la fijación extendida conduce a la reticulación y bloqueo de sitios específicos de antígenos y consecuente inmunomantelación no homogénea. Otro paso sensible es la tinción del tejido, que presenta varios puntos críticos que describiremos a continuación. En primer lugar, los anticuerpos deben validarse probándolos en secciones de criostatos para confirmar que son funcionales y determinar su concentración óptima. La concentración final que se utiliza para el procedimiento de compensación es diez veces la concentración óptima para las secciones de criostato. En segundo lugar, el tiempo de incubación también es crítico debido al tamaño del tejido. Un tiempo de incubación demasiado corto producirá una inmunostaintening débil o no homogénea (por ejemplo, una tinción correcta en la periferia del tejido pero sin manchas internas). Del mismo modo, las medidas de lavado que son demasiado cortas evitarán que los anticuerpos no unidos específicamente se eliminen del tejido, lo que provocará manchas no específicas. Hasta bien conocidos, la incubación prolongada del tejido con anticuerpos no afecta la tinción. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente largos períodos de incubación y lavado. En tercer lugar, la elección del fluorocromo debe adaptarse a la señal de interés. En las muestras de tejido en general, y especialmente en el tejido adiposo blanco, la autofluorescencia no despreciable es detectable a 488 nm y 555 nm. Para proteínas altamente expresadas esto no es un problema y la tinción funcionará bien en estos canales. Sin embargo, para proteínas con baja expresión recomendamos encarecidamente el uso de fluorocromos de color rojo lejano. Para la compensación, no hay pasos críticos ya que la metodología es muy simple. Tenga en cuenta que el salicilato de metilo no es compatible con materiales plásticos, por lo que recomendamos botellas de vidrio para los escalones de limpieza y una cámara metálica equipada con un fondo de vidrio para realizar la toma de imágenes. Existen alternativas para este procedimiento de montaje utilizando i) un portaobjetos de vidrio normal, resina dental y cubreobjetos de vidrio (para generar una pequeña cámara de vidrio), o ii) una placa de petri-dish de vidrio (para configuraciones de microscopio vertical).
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Universidad De Costa Azul, y con subvenciones de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través de las Inversiones para el Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), el programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) a través de Academy 2 "Syst-mes Complexes" y Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", La Fundación para la Recherche Médical (quipe FRM DEQ20180839587), y el Programa de Jóvenes Investigadores a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos también el Fondo Básico de Imagen del C3M financiado por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, y que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imagen de IBISA (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por la ayuda técnica en la preparación de tejidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, por la lectura comprobante del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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