Summary
Hier beschreiben wir eine einfache, kostengünstige und schnelle Clearing-Methode, um die 3D-Struktur von Maus- und menschlichem weiß-fettgewebe mithilfe einer Kombination von Markern zu lösen, um Vaskulatur, Kerne, Immunzellen, Neuronen und Lipid-Tröpfchen-Beschichtungsproteine durch fluoreszierende Bildgebung zu visualisieren.
Abstract
Adipositas ist ein weltweit wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit, das das Risiko erhöht, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes und Lebererkrankungen zu entwickeln. Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse (AT) aufgrund von Adipozytenhyperplasie und/oder Hypertrophie gekennzeichnet, was zu einer tiefgreifenden Umgestaltung seiner dreidimensionalen Struktur führt. Tatsächlich ist die maximale Fähigkeit von AT, während Adipositas zu expandieren, von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Adipositas-assoziierten Pathologien. Diese AT-Erweiterung ist ein wichtiger homöostatischer Mechanismus, um die Anpassung an einen Überschuss an Energiezufuhr zu ermöglichen und schädliche Lipid-Spillover auf andere Stoffwechselorgane wie Muskel und Leber zu vermeiden. Daher ist das Verständnis der strukturellen Umgestaltung, die zum Scheitern der AT-Erweiterung führt, eine grundlegende Frage mit hoher klinischer Anwendbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache und schnelle Clearing-Methode, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wird, um die Morphologie von Maus und menschlichem weiß fettem Gewebe durch fluoreszierende Bildgebung zu erforschen. Diese optimierte AT-Clearing-Methode wird problemlos in jedem Standardlabor durchgeführt, das mit einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem Fluoreszenzmikroskop ausgestattet ist. Darüber hinaus sind die verwendeten chemischen Verbindungen leicht verfügbar. Wichtig ist, dass diese Methode es ermöglicht, die 3D-AT-Struktur aufzulösen, indem verschiedene Marker gefärbt werden, um die Adipozyten, die neuronalen und vaskulären Netzwerke sowie die angeborene und adaptive Immunzellenverteilung gezielt zu visualisieren.
Introduction
Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse gekennzeichnet und hat sich zu einem wichtigen weltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, da Menschen mit Adipositas ein erhöhtes Risiko haben, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Lebererkrankungen und einige Krebsarten zu entwickeln.
Eine grundlegende physiologische Funktion des Fettgewebes ist es, Ganzkörperglukose und Lipidhomöostase1,2zu modulieren. Während der Fütterungszeit speichern die Adipozyten (d. h. die Hauptzellen des Fettgewebes) den Überschuss an Glukose und Lipiden, die durch eine Mahlzeit in Triglyceride bereitgestellt werden. Während des Fastens brechen die Adipozyten die Triglyceride in nicht veresterte Fettsäuren und Glycerin auf, um den Energiebedarf des Körpers zu decken. Während der Entwicklung von Adipositas, Fettgewebe erweitern, indem sie die Größe (Hypertrophe) und/oder die Anzahl (Hyperplasie) der Adipozyten1, um ihre Speicherkapazität zu erhöhen. Wenn die Ausdehnung des Fettgewebes an seine Grenze stößt, eine konstante, sehr variable unter den Patienten, akkumulieren sich die verbleibenden Lipide in anderen Stoffwechselorganen einschließlich Muskeln und Leber3,4, was zu ihrem funktionellen Versagen führt und adipositasbedingte kardiometabolische Komplikationen einleitet1,5. Daher ist die Identifizierung der Mechanismen, die die Fettgewebeexpansion steuern, eine zentrale klinische Herausforderung.
Die morphologischen Veränderungen, die während der Fettleibigkeit in Fettgewebe dokumentiert werden, sind mit seiner pathologischen Dysfunktion verbunden. Mehrere Färbungsverfahren wurden verwendet, um die Gewebeorganisation des Fettgewebes zu beschreiben, einschließlich Actin6, Gefäßmarker7, Lipid-Tröpfchen-Marker8, und spezifische Immunzellmarker9,10. Aufgrund des enormen Durchmessers von Adipozyten (50 bis 200 m)11ist es jedoch wichtig, einen großen Teil des gesamten Gewebes in drei Dimensionen zu analysieren, um die dramatischen strukturellen AT-Veränderungen, die während Adipositas beobachtet wurden, genau zu analysieren. Da das Licht jedoch nicht in ein undurchsichtiges Gewebe eindringt, ist eine Bildgebung in 3D innerhalb einer großen Gewebeprobe mittels Fluoreszenzmikroskopie nicht möglich. Methoden der Geweberäumung, um sie transparent zu machen, wurden in der Literatur berichtet (für eine Überprüfung, siehe12), die es einem ermöglichen, Gewebe zu löschen und eine gründliche, ganzgewebte Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Diese Methoden bieten beispiellose Möglichkeiten, die 3D-Zellorganisation in gesundem und krankem Gewebe zu bewerten. Jede der beschriebenen Methoden hat Vor- und Nachteile und muss daher je nach untersuchtem Gewebe sorgfältig ausgewählt werden (für eine Überprüfung siehe13). In der Tat erfordern einige Ansätze eine lange Inkubationszeit und/oder die Verwendung von Materialien oder Verbindungen, die entweder teuer, toxisch oder schwer zu erhalten sind14,,15,16,17,18,19. Unter Ausnutzung einer der ersten Verbindungen, die Werner Spalteholz vor einem Jahrhundert zur Reinigung von Geweben20verwendet hat, haben wir ein benutzerfreundliches und kostengünstiges Protokoll eingerichtet, das sehr gut für die Räumung aller Maus- und menschlichen Fettgewebedepots in jedem Labor mit typischen Geräten wie einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem konfokalen Mikroskop geeignet ist.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde getestet und ist für alle Maus- und menschlichen weißen Fettgewebedepots validiert. Mensch und Maus fettgewebe wurden entsprechend den europäischen Gesetzen gesammelt und von französischen und schwedischen Ethik-Ausschüssen genehmigt.
1. Fixierung von Maus und menschlichem weißem Fettgewebe
- Tauchen Sie die geernteten Maus- oder menschlichen weißen Fettgewebe in mindestens 10 ml PBS ein, die 4% Paraformaldehyd (PFA) in einem 15 ml Kunststoffrohr enthalten.
- Schütteln Sie das Kunststoffrohr bei Raumtemperatur auf einer Rollplatte für 1 h.
- Lassen Sie das Kunststoffrohr bei 4 °C über Nacht auf einer Rollplatte liegen, um die Fixierung abzuschließen.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für große Fettgewebeproben geeignet, wie z. B. ganze epididymale Fettpolster, die von Mäusen mit normaler Ernährung gewonnen werden (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Bei größeren Proben wie epididymalen Fettpolstern, die von Mäusen mit einer fettreichen Ernährung (≈1,5 g - ≈4 cm3) oder menschlichen Fettgewebeproben gewonnen wurden, obwohl das Clearing-Protokoll für die gesamte Probe (durch Skalieren des PFA und der Antikörpergemische) perfekt funktionieren sollte, schneiden wir im Allgemeinen Gewebestücke um 1 g (≈2,5 cm3), um die restlichen Proben entweder für zusätzliche Färbung oder Anwendungen zu reservieren. Für die PFA (Schritt 1.1.) empfehlen wir die Verwendung des etwa 10-fachen Volumens des Gewebes. Erhöhen Sie bei den Antikörpermischungen (Schritte 3.1. und 3.4.) das Volumen, um das Gewebe vollständig einzutauchen, und verwenden Sie ein 15 ml Kunststoffrohr (siehe Materialtabelle), wenn das Gewebe für ein 1,5 ml Kunststoffmikrorohr zu groß ist (siehe Materialtabelle).
2. Permeabilisierung und Sättigung von Maus und menschlichem weiß fettem Gewebe
- Spülen Sie das feste weiße Fettgewebe in 10 ml PBS für 5 min bei Raumtemperatur, um alle Spuren von PFA zu entfernen.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,3% Glycin (siehe Tabelle der Materialien) und schütteln Sie das Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker für 1 h bei 100 Umdrehungen pro Minute (Rpm), um die verbleibenden freien Aldehydgruppen zu löschen.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100 (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker für 2 h bei 100 U/min.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100 und 20% DMSO (siehe Materialtabelle)und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min über Nacht.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt durch 0,1% Tween-20 (siehe Materialtabelle),0,1% Triton X-100, 0,1% Desoxycholat (siehe Materialtabelle)und 20 % DMSO und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für mindestens 24 h.
- Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, und schütteln Sie das Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 1 h.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA (siehe Materialtabelle)und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für 12 h, um Standorte zu sättigen, die nicht spezifisch gegen Antikörper binden könnten.
HINWEIS: In Schritt 2.7 kann die BSA durch Blutserum der Art des verwendeten sekundären Antikörpers ersetzt werden.
3. Färbung verfahren für Maus und menschliches weißes Fettgewebe
- Übertragen Sie das Gewebe in ein 1,5 ml Kunststoff-Mikrorohr, das 300 l PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA und die primären Antikörper (10x konzentrierter als bei Kryosection-Färbung, aber für jeden Antikörper sollte eine optimale Antikörperkonzentration bewertet werden). Schützen Sie das Rohr vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken und das Rohr mindestens zwei Tage lang in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min schütteln (siehe Anmerkung in Schritt 1.1 und Schritt 3.7.1).
- Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für 5 h. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus.
- Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für eine Nacht bis zwei Tage.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein 1,5 ml Kunststoff-Mikrorohr mit 300 l PBS, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA und die sekundären Antikörper (10x konzentrierter als bei Kryosektionsfärbung). Schützen Sie das Rohr vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken und das Rohr mindestens zwei Tage lang in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min schütteln (siehe Anmerkung in Schritt 1.1 und Schritt 3.7.1).
- Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min für 5 h. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus.
- Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min für eine Nacht bis zwei Tage.
- Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
HINWEIS: Für die Kennzeichnung spezifischer Strukturen wie Kerne oder Aktin müssen bei Schritt 3.1 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI oder gleichwertig) und/oder das fluoreszierend gekennzeichnete Phalloidin hinzugefügt werden. wenn nur fluoreszierend gekennzeichnete Primärantikörper oder in Schritt 3.4 verwendet werden. wenn sekundäre Antikörper verwendet werden.
HINWEIS: Für das Färbeverfahren können primäre Antikörper verwendet werden, die bereits mit Fluorchromen konjugiert sind (wie sie für die Durchflusszytometrie verwendet werden), und wir empfehlen sie zur Zeitgewinnen und Spezifität. Selbst wenn primäre Mausantikörper verwendet werden können, gefolgt von sekundären Anti-Maus-Antikörpern, wie wir es hier gezeigt haben, haben wir oft unspezifische Färbungen von Blutgefäßen aufgrund zirkulierendes Immunglobulins beobachtet. Um dieses Problem zu vermeiden, werden primäre Antikörper, die bereits gekennzeichnet sind, dringend empfohlen, und hier liefern wir Beweise dafür, dass die in der Durchflusszytometrie verwendeten Antikörper mit unserem Verfahren kompatibel sind. Im konkreten Fall eines Antigens, das auf niedrigem Niveau exprimiert wird, ist jedoch ein Signalverstärkungsschritt über sekundäre Antikörper obligatorisch; Wenn der einzige verfügbare Primärantikörper in der Maus hergestellt wird, kann eine Herzperfusion der Mäuse mit PBS für mindestens 5 min am Opfer einen großen Teil des zirkulierenden Immunglobulins und damit die unspezifische Färbung entfernen.
4. Clearingverfahren für Maus und menschliches weißes Fettgewebe
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 50% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 70% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 95% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 100% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
- Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 100% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur bei 100 U/min über Nacht in einem Orbitalshaker.
- Tauchen Sie das Gewebe in eine 20 ml Glasflasche mit einer Kunststoffkappe (siehe Materialtabelle) ein, die 5 ml Methylsalicylat (siehe Materialtabelle)unter einer chemischen Haube enthält, und schütteln Sie den vor Licht geschützten Glasbehälter bei Raumtemperatur bei 100 U/min bei 100 U/min für mindestens 2 h.
HINWEIS: Das Clearingverfahren könnte (falls erforderlich) erheblich beschleunigt werden, indem die Schritte 4.3 vermieden werden. und 4.5., obwohl die endgültige Clearingqualität leicht reduziert würde.
5.3D-konfokale Bildgebung des gereinigten weißen Fettgewebes
- Übertragen Sie das Gewebe in eine metallische Bildkammer, die mit einem Glasboden (siehe Materialtabelle)unter einer chemischen Haube ausgestattet ist, und füllen Sie die Kammer mit frischem Methylsalicylat.
HINWEIS: Um das Gewebe an Ort und Stelle zu sichern und so zu verhindern, dass es in der Kammer schwimmt oder sich seitlich bewegt, tragen Sie bei der Montage in die Kammer mehrere 18 mm runde Glasabdeckungen (siehe Materialtabelle)auf das Gewebe auf. - Platzieren Sie die Bildkammer auf einem invertierten konfokalen Mikroskop.
- Stellen Sie das Gewebe mit einem objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 4x Objektiv) dar, um einige cm3 3D-Karten des gesamten Fettgewebes oder der menschlichen Gewebeprobe zu erzeugen.
- Wählen Sie mehrere Bereiche für die Gewebeprobenahme bei höherer Vergrößerung aus. Verwenden Sie in der Regel ein 20-faches Fernluftobjektiv, das ein gutes Verhältnis zwischen Auflösung und Tiefe bietet. Wir erfassen große Mosaikbilder mit Z-Stacks zwischen 600 und 2000 m Tiefe.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Fernziel, um tiefer in das Gewebe einzutauchen.
6. Extraktion quantitativer Ergebnisse aus den 3D-Fettgewebebildern
HINWEIS: Die Segmentierung der verschiedenen Strukturen und die anschließende Extraktion der quantitativen Informationen aus dem in Punkt 5 generierten 3D-Bildstapel kann mit einer der vielen vorhandenen Softwareoptionen für Bildanalyse, kommerziell oder Freeware, durchgeführt werden. In den folgenden Punkten beschreiben wir eine Strategie, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wird, um quantitative Informationen aus 3D-Fettgewebebildern mit kommerzieller Software zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien).
- Konvertieren Sie die 3D-Stacks in das Softwareformat in freien Speicherplatz.
- Segmentieren Sie die Zellen.
- Öffnen Sie das Cell-Modul der Software.
- Ändern Sie die Einstellung Zellerkennung in Plasmamembranfärbung.
- Wählen Sie den fluoreszierenden Kanal des Markers, der zur Abgrenzung der Zellperipherie verwendet wird (Phalloidin, das kortikale Aktin- oder Plasmamembranmarker wie F4/80 für Makrophagen, TCR-β für T-Zellen oder Cluster von Differenzierungs-CD-Proteinen speziell für Immunzellsubtypen kennzeichnet).
- Richten Sie die Schwellenwerte ein, und stellen Sie einen Bereich der erwarteten Zellgröße bereit (d. h. 1 bis 200 m für die Zellerkennung).
- Führen Sie die Segmentierung aus. Ein dem Z-Stack entsprechendes Volumen wird mit den segmentierten Zellen generiert, die für jede der benachbarten Zellen mit einer anderen Farbe kodiert sind.
- Wenden Sie statistische Filter (Größe, Rundheit, Zirkularität usw.) in der Statistik-Registerkarte an, um Segmentierungsartefakte auszuschließen und/oder die segmentierten Zellen auf die Zelle von Interesse basierend auf ihrer Größe zu verfeinern (d. h. 20-200 m für Adipozyten; 5-25 m für Makrophagen; 1-3 m für Lymphozyten).
- Extrahieren Sie Messungen und quantitative Daten (Volumen, Anzahl, Größe, Durchmesser usw.) aus der Registerkarte Statistik.
- Segment zelluläre Komponenten (Kerne, Vesikel, etc.) oder Gefäße als Struktur.
HINWEIS: Obwohl die Filamentsegmentierung sehr nützlich ist, um die Konnektivität der Gefäße zu untersuchen, verwenden wir die Segmentierung des Oberflächenmoduls, um Daten über Größe, Volumen und Durchmesser der Gefäße zu extrahieren. Tatsächlich geht die Quantifizierung der Größe der Gefäße bei Verwendung des Filamentmoduls verloren.- Öffnen Sie das Surface-Modul der Software.
- Wählen Sie den Fluoreszenzkanal des Markers aus, der verwendet wird, um die subzelluläre Komponente speziell zu beschriften, um sie in 3D zu rekonstruieren.
- Richten Sie die Schwellenwerte ein und bieten Sie einen Bereich der erwarteten Durchmessergröße der Struktur (d. h. 0,5-5 m für Kerne; 0-100 m für Schiffe; usw.).
- Führen Sie die Segmentierung aus. Es wird ein Volume mit der segmentierten Zellstruktur generiert. Messungen und quantitative Daten (Volumen, Anzahl, Größe, Durchmesser usw.) können aus der Registerkarte Statistik extrahiert werden.
- Segmentieren Sie die Gefäße als Röhrenkontinuum.
HINWEIS: Obwohl die Filamentsegmentierung sehr nützlich ist, um die Konnektivität der Gefäße zu untersuchen, verwenden wir die Segmentierung des Oberflächenmoduls, um Daten über Größe, Volumen und Durchmesser der Gefäße zu extrahieren. Tatsächlich geht die Quantifizierung der Größe der Gefäße bei Verwendung des Filamentmoduls verloren.- Öffnen Sie das Filamentmodul der Software.
- Wählen Sie den Fluoreszenzkanal aus, der der Gefäßfärbung entspricht.
- Richten Sie die Schwellenwerte für die Fluoreszenzintensität ein, und wählen Sie die entsprechende Anzahl der erwarteten Verbindungsknoten aus.
- Führen Sie die Segmentierung aus. Filamente, die das Schiffsnetz darstellen, werden in 3D erzeugt. Die Messungen können aus der Registerkarte Statistik extrahiert werden, so dass quantitative Daten wie Schiffslänge, Anzahl der Verzweigung stäpohnen usw. erhalten werden können.
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Representative Results
Mit dem hier beschriebenen und in Abbildung 1zusammengefassten Verfahren konnten wir weißes Fettgewebe von Mensch und Maus färben und optisch klarmachen, wie in Abbildung 2A bzw. Abbildung 2Bdargestellt. Das gereinigte Gewebe wurde in die metallische Bildgebungskammer übertragen, um eine konfokale Bildgebung durchzuführen (Abbildung 3A). Die Lichtung hat die Tiefe der Gewebebilder, die wir erfassen konnten, drastisch verbessert (Abbildung 3B und Abbildung 3C). Das gesamte Fettgewebe kann in 3D bei geringer Vergrößerung mit einem 4x Objektiv (siehe Ergänzender Film 1)erworben werden, um eine 3D-Karte zu erzeugen, die es ermöglicht, die verschiedenen Bereiche auszuwählen, die bei hoher Vergrößerung mit einem 20-fachen Objektiv erfasst werden sollen (Abbildung 3D). Die Hochvergrößerungsbilder werden in 3D mit einer Tiefe von 2 mm aufgenommen (Abbildung 3E).
Dieses Verfahren ermöglicht die Kennzeichnung zahlreicher allgemeiner Zellmarker, einschließlich Kerne, durch Verwendung von DAPI und Actin unter Verwendung von fluoreszierend markiertem Phalloidin. Spezifische Färbung von Lipidtröpfchen und Adipozyten kann durch die Verwendung von Perilipin-Antikörpern erreicht werden (siehe Tabelle der Materialien; Abbildung 4A) und Anti-Glut4-Antikörper (siehe Materialtabelle; Abbildung 4B) Bzw. Blutgefäße können entweder mit dem CD31-Antikörper nachgewiesen werden (siehe Materialtabelle; Abbildung 4C) oder durch eine intravenöse Injektion von Lectin-DyLight649 kurz vor dem Opfer der Maus (siehe Materialtabelle; Abbildung 4D). Makrophagen und T-Zellen können mit dem Anti-CD301-PhycoErythrin-Antikörper visualisiert werden (siehe Materialtabelle; Abbildung 4D) und den Anti-TCR-β-Pacific Bleu Antikörper (siehe Materialtabelle; Abbildung 4E). Das periphere Nervennetz kann mit dem Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper (TH) nachgewiesen werden (siehe Materialtabelle; Abbildung 4F-G). Zusätzlich ermöglicht dieses Protokoll die Reinigung von mausepididymalem Fettgewebe (Abbildung 4A-B,E), maussubkutanes Fettgewebe (Abbildung 4D,G), Mausbraunfettgewebe (Abbildung 4F) und menschliches Fettgewebe (Abbildung 4C). Mit einer Kombination dieser Kennzeichnung und einer kommerziellen Software (siehe Materialtabelle) zur Segmentierung dieser Marker können wir innerhalb des Fettgewebes i) Adipozyten mittelgroße Größen- und Größenverteilung (Abbildung 5A-B) und ii) Blutgefäßnetzdichte ( Abbildung5C) bestimmen.
Abbildung 1: Zusammenfassung des Clearingverfahrens für weißes Fettgewebe. Maus- oder menschliches weiß fetten Gewebe sind fixiert, permeabilisiert, gesättigt, gebeizt und gereinigt. Bilder werden dann in 3D erfasst und mit einer kommerziellen Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fotos von weißem Fettgewebe. (A) Foto des menschlichen weißen abdominopelvicen Fettgewebes vor und nach dem Clearing-Verfahren. (B) Foto von Maus epididymal weißem Fettgewebe vor und nach dem Clearing-Verfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Verbesserte Bildgebungstiefe mit Fettgewebeklärung. (A) Montage der metallischen Bildkammer mit Glasboden. (B) Bilder der Z-Serie von Maus epididymal weißem Fettgewebe, gefärbt mit Phalloidin-Alexa488 (grün) vor und nach der Räumung. (C) XZ-Projektionen entsprechend den weißen gepunkteten Linien über dem Panel B z-stack. (D) Z-Projektion von 0,4 cm Z-Stack der Maus subkutanen weißen Fettgewebe für Actin mit Phalloidin-Alexa488 gefärbt und bei geringer Vergrößerung mit einem 4x Objektiv erworben. Die kleinen Bilder auf der rechten Seite wurden an der ausgewählten Gewebeposition mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. (E) Seitenansicht der 3D-Volumenwiedergabe des Bildes z-stack aus dem gelöschten Mausweißfettgewebe, das mit Phalloidin-Alexa488 gefärbt ist, ähnlich wie die 20x-Bilder von (D) aufgenommen wurden. Die durch unser hohe Vergrößerungsverfahren erreichte 3D-Bildtiefe wird hier demonstriert und durch eine Z-Tiefe-Farbcodierung (dunkelblau für z=0 mm bis dunkelrot für z=2 mm) unterstrichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Maus- und menschliches weißes Fettgewebe, das für mehrere Marker gebeizt wird. (A) Einzelebene Bild der Maus epididymal weiße Siezgewebe für Lipidtröpfchen mit Anti-Perilipin1-Antikörper und Anti-Maus-alexa647-konjugierten Antikörper gefärbt. (B) Mosaik-Einzelebenenbild des Maus-Epididymal-Weißen Fettgewebes, gefärbt für Kerne und Adipozyten mit DAPI, Anti-Glut4-Antikörper und Anti-Maus-Alexa647-konjugiertem Antikörper. (C) Z-Projektion von 600 m z-Stack des menschlichen weißen abdominopelvicen Fettgewebes, das für Gefäße mit CD31-alexa647-konjugiertem Antikörper gefärbt ist. (D) Z-Projektion von 600 m z-Stack von Maus subkutanen weißen Fettgewebe für Gefäße und Makrophagen mit Lektin-DyLight649 intravenösen Injektionen und Anti-CD301-alexa555 Antikörper gefärbt. Der untere rechte Einset ist ein vergrößertes Bild des weißen gepunkteten Feldes. (E) Ein-Ebenen-Bild der Maus epididymal weiße Fettgewebe für Aktin und T-Zellen mit Phalloidin-Alexa488 und Anti-TCR-Pacific blau konjugiert gefärbt. Der untere rechte Einset ist ein vergrößertes Bild des weißen gepunkteten Feldes. (F) Z-Projektion von 50 m z-Stack von Mausbraunfettgewebe für Kerne und neuronale Netzwerk mit DAPI, Anti-TH-Antikörper und Anti-Kaninchen-Alexa647-konjugierten Antikörpern. (G) Z-Projektion von 600 m z-Stack von Maus subkutanem weißem Fettgewebe, das für Kerne und neuronale Netzwerke mit DAPI, Anti-TH-Antikörper und Anti-Kaninchen-Alexa647-konjugiertem Antikörper gebeizt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Analyse von 3D-Bildern mit kommerziell verfügbarer Software (siehe Materialtabelle). (A) 3D-Volumenwiedergabe menschlicher Adipozyten, segmentiert in 3D durch handelsübliche Software. Jede Adipozyten hat eine andere Farbe als ihre Kontaktierung angrenzenden Adipozyten. Schiffe sind rot dargestellt. (B) Größenquantifizierung und Verteilung der Adipozyten aus dem 3D-Volumenrendering des Panels A, das rund 20.000 Adipozyten enthält. (C) 3D-Volumenwiedergabe von in 3D segmentierten Blutgefäßen mit handelsüblicher Software, die für die großen bzw. kleinen Gefäße rot bzw. gelb dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzender Film 1: 3D-Volumenwiedergabe des gesamten subkutanen weißen Fettgewebes, das in Abbildung 3Ddargestellt ist. Der weiße Kasten stellt einen 2 cm3 Würfel dar. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die Veränderungen, die im Verlauf des pathologischen Verlaufs des Fettgewebes auftreten, wie die von Adipositas, sind für das Verständnis der Mechanismen hinter der Pathologie von grundlegender Bedeutung. Wegweisende Studien, die solche Mechanismen im Fettgewebe aufdeckten, basierten auf globalen Ansätzen wie der gesamten Fettgewebeproteomik21, der Durchflusszytometrie22,23und der Transkriptomik24,25. Darüber hinaus wurden Anstrengungen unternommen, um die strukturellen Veränderungen im Fettgewebe mit hilfe histologischer Analysen26,27,28,29zu untersuchen. Die Analyse von 5-10 m Fettgewebeabschnitten, aufgrund der begrenzten Größe des Abschnitts, schränkt jedoch die Fähigkeit ein, wichtige strukturelle Merkmale zu schätzen. Erstens sind pro Abschnitt nur wenige Adipozytenkerne nachweisbar, da jeder Abschnitt nur einen kleinen Teilthder Adipozyten darstellt (1/10. ). Zweitens ist die Größe der adipozyten, die aus Fettgewebeabschnitten geschätzt werden, ungenau, da die meisten Adipozyten unterhalb oder hinter ihrem Äquator geschnitten werden, was zu einer voreingenommenen (unter)Messung ihrer mittleren Größe führt. Drittens gehen das Blutgefäß und das Nervenfaserkontinuum beim physikalischen Schnitt verloren. Viertens ist die Verteilung der einzelnen Subtypen von Immunzellen innerhalb des Gewebes schwer zu bestimmen, da die dreidimensionalen Koordinaten verloren gehen. In diesem Zusammenhang ermöglicht die hier vorgeschlagene Methodik jedem Standardlabor, weißes Fettgewebe von Mensch und Maus in drei Dimensionen auf einfache und kostengünstige Weise abzubilden.
Diese Methode hat einige Einschränkungen. Erstens ist die Zeit, die für die Vorbereitung des Gewebes benötigt wird (Fixierung, Permeabilisation, Färbung, Clearing) lang (mehr als eine Woche). Dies wäre schwer zu reduzieren, da die Mehrheit dieser Zeit erforderlich ist, um das Gewebe zu färben. Das Eindringen von Antikörpern in solche großen Gewebeproben erfordert lange Inkubationszeiten. Eine Verkürzung der Inkubationszeit würde das Risiko einer nicht homogenen Antikörperdurchdringung erhöhen, was zu Färbeartefakten führen würde. Daher ist das einzig mögliche Zeitfenster, um Zeit zu gewinnen und das Verfahren zu verkürzen, die Zeit, die für die Beseitigung des Gewebes vorgesehen ist, die etwa einen Tag dauert, wenn optimale Ergebnisse erforderlich sind, aber dies kann auf einen halben Tag ohne einen dramatischen Qualitätsverlust verringert werden. Die zweite Einschränkung ist die wahrscheinliche Schrumpfung des Gewebes. Tatsächlich ist es in jedem Protokoll, das Gewebe mit Lösungsmitteln dehydriert, wahrscheinlich, dass das Gewebe aufgrund der Wasserentfernung schrumpft. Die Abschätzung dieser Schrumpfung ist immer eine Herausforderung, und es ist hier fast unmöglich, weil die Kante des Gewebes transparent wird, wenn Lipide während des Dehydrierungsprozesses extrahiert werden. Daher sind die Größenschätzungen der gegclearten Gewebe mit Vorsicht zu interpretieren. Der Vergleich von Veränderungen der Adipozytengrößen oder der Gefäßlänge zwischen aus der Maus gewonnenen Geweben mit unterschiedlichen Genotypen und/oder unter verschiedenen Umweltbedingungen bleibt jedoch informativ11. Die letzte Einschränkung ist mit dem großen Volumen des gesamten Fettgewebes der Maus oder einer großen chirurgischen Probe des menschlichen Fettgewebes verbunden. Obwohl das Protokoll perfekt angepasst ist, um diese großen Proben zu löschen, ist die Bildgebung eines ganzen Organs mit einem konfokalen Mikroskop eine Herausforderung. Die Strategie, dieses Problem zu überwinden und das volle Potenzial des gesamten Organclearing-Verfahrens auszuschöpfen, besteht darin, eine 3D-Karte mit geringer Vergrößerung des gesamten Organs mit einem 4-fachen Objektiv zu erfassen und bestimmte Bereiche auszuwählen, die zufällig innerhalb des Gewebes verteilt sind, wo eine höhere Vergrößerung 3D-Bilder mit einem 20-fachen Fernziel erhalten werden kann. Das Setup "hohe Vergrößerung" ermöglicht die Abbildung des Gewebevolumens von rund 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Obwohl dieses Volumen im Vergleich zum Volumen des gesamten Organs (0,5 bis mehr als 4 cm3)begrenzt ist, ermöglicht die Wiederholung der Erfassungen an mehreren Positionen innerhalb des Gewebes eine gute Probenahme des Gewebes bei zellulärer bis subzellulärer Auflösung. Beachten Sie, dass die Abbildung großer Gewebe eine erhebliche Menge an Bildgebungsdaten generiert, die gespeichert werden müssen.
Das Verfahren weist erhebliche Unterschiede im Vergleich zu Methoden auf, die zuvor beschrieben wurden, um Fettgewebe zu entfernen14,30. Im Gegensatz zu AdipoClear, das Methanol, Dichlormethan und Dibenzylether14verwendet, verwendet das hier vorgestellte Verfahren Ethanol zur Dehydrierung und Methylsalicylat zur Reinigung. Daher ist das Verfahren sicherer, da es weniger toxische Clearing-Lösungsmittel nutzt, die häufig von lebensmittel-/getränkeverarbeitenden Industrien (Ethanol und Methylsalicat) verwendet werden, im Vergleich zur hohen Toxizität von Dichlormethan, Methanol und Dibenzylether. Darüber hinaus ist die Vorbereitung des Gewebes nach dem Protokoll zwei Tage schneller als das AdipoClear-Protokoll14. In jüngerer Zeit wurde eine andere Methode von Li und Kollegen vorgeschlagen, um Fettgewebestücke zu löschen, indem sie in Glycerin30eintauchen. Dieses Protokoll ist sehr einfach, auch im Vergleich zu diesem Verfahren, und die Qualität der Bilder ist gut, auch bei hoher Vergrößerung. Dieses Clearing-Protokoll funktioniert jedoch nur effizient, wenn 2 mm3 Fettgewebeteile verwendet werden. Die Verteilung des Gewebes in diese winzigen Proben vor dem Clearing-Verfahren verhindert, dass man Gewebevolumina größer als 2 mm3 auch bei geringer Vergrößerung abbilden kann. Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die Kartierung des gesamten Gewebes in 3D bei geringer Vergrößerung und die Erfassung von 3D-Stapeln von Bildern um 45 mm3 an mehreren bekannten Positionen innerhalb des gesamten gelöschten Fettgewebes bei hoher Vergrößerung.
Dieses Verfahren kann mehrere zukünftige Anwendungen haben. Wie bei jeder Methode kann das hier beschriebene Verfahren vereinfacht und/oder weiter optimiert werden. Ein interessanter Fortschritt für das Verfahren könnte aus der Kombination des Clearing-Prozesses kommen, beschrieben wir, mit zusätzlichen bildgebenden Ansätzen. Beispielsweise sind spezifische bildgebende Setups wie Optische Projektionstomographie (OPT), Total Internal Reflection Fluorescence Microscence Microscopy (TIRF), Selective Plan Illumination Microscopy (SPIM) oder Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) grundsätzlich mit dem Verfahren kompatibel, obwohl dies seine Anwendbarkeit auf die Laboratorien beschränkt, die mit diesen Systemen ausgestattet sind. Alternativ könnte man mit einem Objektiv mit einem hohen numerischen Blendenindex und einem Erfassungssystem, das Hunderte von Bildern pro Sekunde erfassen kann, das in vielen Laboratorien zu finden ist, Super-Auflösungsanalysen durchführen, indem man die Super Resolution Radial Fluctuations (SRRF) Nachbearbeitungs-Bildanalyse-Freeware31verwendet. Interessanterweise sind klassische Fluorchrome für die SRRF-Analyse adaptiert, die 3D-Superauflösungsanalysen von ganzen weißen Fettgeweben von Mensch und Maus ermöglichen würde.
Viele kritische Schritte im Protokoll beziehen sich auf die Gewebeverarbeitung vor der Reinigung selbst. Zunächst einmal, und was die klassischen histologischen Analysen betrifft, ist der Fixierungsschritt von grundlegender Bedeutung. Bei schwacher Fixierung bleiben strukturelle Merkmale nicht erhalten, während eine erweiterte Fixierung zu Vernetzung und Blockierung spezifischer Antigenstellen und damit zu nicht homogener Immunfärbung führt. Ein weiterer sensibler Schritt ist die Färbung des Gewebes, die mehrere kritische Punkte darstellt, die wir unten beschreiben werden. Zunächst müssen die Antikörper validiert werden, indem sie an Kryostatabschnitten getestet werden, um zu bestätigen, dass sie funktionsfähig sind und um ihre optimale Konzentration zu bestimmen. Die endgültige Konzentration, die für das Clearingverfahren verwendet wird, ist das Zehnfache der optimalen Konzentration für die Kryostatabschnitte. Zweitens ist die Zeit der Inkubation auch wegen der Größe des Gewebes kritisch. Eine zu kurze Inkubationszeit führt zu schwachen oder nicht homogenen Immunostainierungen (z. B. korrekte Färbung an der Peripherie des Gewebes, aber keine innere Färbung). In ähnlicher Weise verhindern zu kurze Waschschritte, dass nicht spezifisch gebundene Antikörper aus dem Gewebe entfernt werden, was zu einer unspezifischen Färbung führt. Unserer Kenntnis nach beeinträchtigt eine ausgedehnte Inkubation des Gewebes mit Antikörpern die Färbung nicht. Daher empfehlen wir dringend lange Inkubations- und Waschzeiten. Drittens muss die Wahl des Fluorchroms an das Signal des Interesses angepasst werden. In Gewebeproben im Allgemeinen, insbesondere weißem Fettgewebe, ist eine nicht vernachlässigbare Autofluoreszenz bei 488 nm und 555 nm nachweisbar. Für hochgradig exprimierte Proteine ist dies kein Problem und die Färbung wird in diesen Kanälen gut funktionieren. Für Proteine mit niedriger Expression empfehlen wir jedoch dringend die Verwendung von weitroten Fluorchromen. Für das Clearing gibt es keine kritischen Schritte, da die Methodik sehr einfach ist. Beachten Sie, dass Methylsalicylat nicht mit Kunststoffmaterialien kompatibel ist, daher empfehlen wir Glasflaschen für die Räumschritte und eine Metallkammer, die mit einem Glasboden ausgestattet ist, um die Bildgebung durchzuführen. Alternativen für dieses Montageverfahren gibt es mit i) einem normalen Glasschlitten, Zahnharz und Glasabdeckung (um eine kleine Glaskammer zu erzeugen) oder ii) einer Glaspetrischale (für aufrechte Mikroskop-Setups).
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von INSERM, Université Céte d'Azur, und durch Stipendien der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) über die Investitionen für die Zukunft Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), das Programm UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) über Academy 2 "Systémes Complexes" und Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Equipe FRM DEQ20180839587) und das Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON ). Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und die auch von der IBISA-Plattform für Mikroskopie und Bildgebungsplattform Céte d'Azur (MICA) unterstützt wird. Wir danken Marion Dussot für die technische Hilfe bei der Gewebeaufbereitung. Wir danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, für die beweissichere Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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