Summary
Aqui, descrevemos um método simples, barato e rápido de limpeza para resolver a estrutura 3D do tecido adiposo branco e camundongo usando uma combinação de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células imunes, neurônios e proteínas de casaco de gotícula lipídica por imagem fluorescente.
Abstract
A obesidade é um grande problema de saúde pública mundial que aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doenças hepáticas. A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa do tecido adiposo (AT) devido à hiperplasia adipócito e/ou hipertrofia, levando à profunda remodelação de sua estrutura tridimensional. De fato, a capacidade máxima de expansão da AT durante a obesidade é fundamental para o desenvolvimento de patologias associadas à obesidade. Esta expansão AT é um importante mecanismo homeostático para permitir a adaptação a um excesso de ingestão de energia e evitar o derramamento de lipídio deletério para outros órgãos metabólicos, como músculo e fígado. Portanto, compreender a remodelagem estrutural que leva ao fracasso da expansão at é uma questão fundamental com alta aplicabilidade clínica. Neste artigo, descrevemos um método simples e rápido de limpeza que é usado rotineiramente em nosso laboratório para explorar a morfologia do tecido adiposo branco e camundongo por imagem fluorescente. Este método otimizado de limpeza AT é facilmente realizado em qualquer laboratório padrão equipado com uma capa química, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio fluorescente. Além disso, os compostos químicos utilizados estão prontamente disponíveis. É importante ressaltar que este método permite resolver a estrutura 3D AT, colorindo vários marcadores para visualizar especificamente os adipócitos, as redes neuronais e vasculares e a distribuição de células imunes inatas e adaptáveis.
Introduction
A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa tecidual adiposa e tornou-se um grande problema de saúde pública mundial, uma vez que as pessoas com obesidade têm risco aumentado de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças hepáticas e alguns cânceres.
Uma função fisiológica fundamental do tecido adiposo é modular a glicose do corpo inteiro e a homeostase lipídica1,2. Durante o período de alimentação, os adipócitos (ou seja, as principais células do tecido adiposo) armazenam o excesso de glicose e lipídios fornecidos por uma refeição em triglicérides. Durante o jejum, os adipócitos dividem os triglicérides em ácidos graxos não esterificados e glicerol para sustentar a demanda energética do corpo. Durante o desenvolvimento da obesidade, o tecido adiposo expande-se aumentando o tamanho (hipertrophia) e/ou o número (hiperplasia) dos adipócitos1, para aumentar sua capacidade de armazenamento. Quando a expansão do tecido adiposo atinge seu limite, uma constante altamente variável entre os pacientes, os lipídios restantes se acumulam em outros órgãos metabólicos, incluindo músculos e fígado3,,4, levando à sua falha funcional e iniciando complicações cardio-metabólicas relacionadas à obesidade1,,5. Portanto, identificar os mecanismos que regem a expansão do tecido adiposo é um desafio clínico fundamental.
As modificações morfológicas documentadas dentro dos tecidos adiposos durante a obesidade estão ligadas à sua disfunção patológica. Vários procedimentos de coloração têm sido utilizados para descrever a organização tecidual do tecido adiposo, incluindo actin6, marcadores vasculares7,marcadores lipídes-gotículas8, e marcadores de células imunes específicas9,,10. No entanto, devido ao enorme diâmetro dos adipócitos (50 a 200 μm)11, é essencial analisar grande parte de todo o tecido em três dimensões, a fim de analisar com precisão as dramáticas mudanças estruturais de AT observadas durante a obesidade. No entanto, como a luz não penetra em um tecido opaco, não é possível imagens em 3D dentro de uma grande amostra de tecido usando microscopia de fluorescência. Métodos de limpeza tecidual para torná-los transparentes têm sido relatados na literatura (para uma revisão, ver12) permitindo que se limpe tecidos e realize microscopia de fluorescência tecidual. Esses métodos oferecem oportunidades sem precedentes para avaliar a organização celular 3D em tecido saudável e doente. Cada um dos métodos descritos tem vantagens e desvantagens e, portanto, precisa ser cuidadosamente selecionado dependendo do tecido estudado (para uma revisão, veja13). De fato, algumas abordagens requerem um longo período de incubação e/ou o uso de materiais ou compostos que sejam caros, tóxicos ou difíceis de obter14,15,16,17,,18,19. Aproveitando um dos primeiros compostos usados há um século por Werner Spalteholz para limpar tecidos20,criamos um protocolo fácil de usar e barato que é muito bem adaptado para a limpeza de todos os depósitos de tecido adiposo humano e camundongos em qualquer laboratório com equipamento típico, incluindo um capuz químico, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo foi testado e é validado para todos os depósitos de tecido adiposo branco e de rato e humano. Os tecidos adiposos humanos e de camundongos foram coletados de acordo com as leis europeias e aprovados pelos comitês de Ética francês e sueco.
1. Fixação de tecido adiposo branco e camundongo
- Mergulhe o rato colhido ou os tecidos adiposos brancos humanos em pelo menos 10 mL de PBS contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em um tubo plástico de 15 mL.
- Agite o tubo de plástico à temperatura ambiente em uma placa de rolamento por 1h.
- Deixe o tubo de plástico a 4 °C em uma placa de rolamento durante a noite, para completar a fixação.
NOTA: Este protocolo é adaptado para grandes amostras de tecido adiposo, como almofadas de gordura epidídica inteiras obtidas de camundongos alimentados com uma dieta normal (≈250 mgs - ≈0,6 cm3). Para amostras maiores, como almofadas de gordura epidídica obtidas de camundongos, alimentaram uma dieta rica em gordura (≈1,5 g - ≈4 cm3) ou amostras de tecido adiposo humano, embora o protocolo de compensação deva funcionar perfeitamente para toda a amostra (escalando o PFA e as misturas de anticorpos), em geral, cortamos pedaços de tecido em torno de 1 g (≈2,5 cm3) para reservar as amostras restantes, seja para coloração adicional ou aplicações. Para o PFA (etapa 1.1.) recomendamos o uso de aproximadamente 10 vezes o volume do tecido. Para as misturas de anticorpos (passos 3.1. e 3.4.), aumente o volume para imergir completamente o tecido e use um tubo plástico de 15 mL (ver Tabela de Materiais) se o tecido for muito grande para um microtubo plástico de 1,5 mL (ver Tabela de Materiais).
2. Permeabilização e saturação de tecido adiposo branco e camundongo
- Enxágüe o tecido adiposo branco fixo em 10 mL de PBS por 5 minutos à temperatura ambiente para remover todos os traços de PFA.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,3% de glicina (ver Tabela de Materiais) e agite o tubo à temperatura ambiente em um agitador orbital por 1h a 100 revoluções por minuto (rpm) para saciar os restantes grupos de aldeídos livres restantes.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com Triton X-100 (ver Tabela de Materiais) e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura por 2h a 100 rpm.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100 e 20% DMSO (ver Tabela de Materiais) e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm durante a noite.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,1% Tween-20 (ver Tabela de Materiais),0,1% Triton X-100, 0,1% desoxicolato (ver Tabela de Materiais) e 20% DMSO e agitar o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por pelo menos 24 h.
- Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com Triton X-100 de 0,2% e agite o tubo à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 1 h.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA (ver Tabela de Materiais) e agitar o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 12 h, para saturar quaisquer locais que possam não especificamente ligar anticorpos.
NOTA: Na etapa 2.7, a BSA pode ser substituída pelo soro sanguíneo da espécie do anticorpo secundário utilizado.
3. Procedimento de coloração para tecido adiposo branco e de camundongos e humanos
- Transfira o tecido em um microtubo plástico de 1,5 mL contendo 300 μL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e os anticorpos primários (10x mais concentrados do que para a coloração da criosecção, mas a concentração ideal de anticorpos devem ser avaliados para cada anticorpo). Proteja o tubo da luz cobrindo com papel alumínio e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por pelo menos dois dias (veja a nota na etapa 1.1 e passo 3.7.1).
- Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo protegido da luz a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 5 h. Faça esta etapa duas vezes.
- Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por uma noite a dois dias.
- Transfira o tecido para um microtubo plástico de 1,5 mL contendo 300 μL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e anticorpos secundários (10x mais concentrados do que para a coloração da criosecção). Proteja o tubo da luz cobrindo com papel alumínio e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por pelo menos dois dias (veja a nota na etapa 1.1 e passo 3.7.1).
- Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 5 h. Faça esta etapa duas vezes.
- Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por uma noite a dois dias.
- Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 2 h.
NOTA: Para a rotulagem de estruturas específicas como núcleos ou actina, adicione 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI ou equivalente) e/ou a faloidóide fluorescentemente rotulada deve ser adicionada na etapa 3.1. quando apenas anticorpos primários fluorescentes rotulados são usados, ou na etapa 3.4. quando anticorpos secundários são usados.
NOTA: Para o procedimento de coloração, podem ser utilizados anticorpos primários já conjugados com fluorochromes (como os utilizados para citometria de fluxo) e recomendamos-no para o ganho de tempo e especificidade. De fato, mesmo que os anticorpos primários do rato possam ser usados seguidos por anticorpos anti-camundongos secundários, como demonstramos aqui, muitas vezes observamos manchas não específicas de vasos sanguíneos devido à imunoglobulina circulante. Portanto, para evitar esse problema, os anticorpos primários que já estão rotulados são altamente recomendados e aqui fornecemos evidências de que os anticorpos utilizados na citometria de fluxo são compatíveis com o nosso procedimento. No entanto, no caso específico de um antígeno expresso em níveis baixos, uma etapa de amplificação de sinal via anticorpos secundários é obrigatória; quando o único anticorpo primário disponível é feito em camundongos, uma perfusão cardíaca dos camundongos com PBS por pelo menos 5 minutos no sacrifício pode remover uma grande proporção de imunoglobulina circulante e, portanto, a coloração não específica.
4. Procedimento de limpeza para tecido adiposo branco e rato e humano
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 50% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2 h.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 70% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2 h.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 95% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2 h.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 100% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2h.
- Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 100% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm durante a noite.
- Mergulhe o tecido em uma garrafa de vidro de 20 mL com uma tampa plástica (ver tabela de materiais) contendo 5 mL de salicilato de metila (ver Tabela de Materiais) sob uma capa química e agite o recipiente de vidro, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por pelo menos 2 h.
NOTA: O procedimento de compensação pode ser significativamente acelerado (se necessário) evitando as etapas 4.3. e 4,5., embora a qualidade final de compensação seria ligeiramente reduzida.
5.3D-confocal imagem de tecido adiposo branco limpo
- Transfira o tecido para uma câmara de imagem metálica equipada com um fundo de vidro (ver Tabela de Materiais) sob uma capa química e encha a câmara com salicilato de metila fresco.
NOTA: Para fixar o tecido no lugar e, assim, evitar que ele flutua ou se mova para os lados na câmara, aplique várias tampas de vidro redondos de 18 mm (ver Tabela de Materiais) em cima do tecido ao montá-lo na câmara. - Coloque a câmara de imagem em um microscópio confocal invertido.
- Imagem do tecido usando um objetivo de baixa ampliação (por exemplo, objetivo 4x) para gerar alguns cm3d mapas de todo o tecido adiposo ou da amostra de tecido humano.
- Selecione várias áreas para a amostragem de tecidos em maior ampliação. Normalmente, use um objetivo aéreo de longa distância de 20x que forneça uma boa relação entre resolução e profundidade. Adquirimos grandes imagens de mosaico com pilhas z entre 600 e 2000 μm de profundidade.
NOTA: Use um objetivo de longa distância para se aprofundar mais no tecido.
6. Extração de resultados quantitativos das imagens de tecido adiposo 3D
NOTA: A segmentação das diferentes estruturas e a subsequente extração das informações quantitativas da pilha de imagem 3D gerada no ponto 5 podem ser realizadas usando qualquer uma das muitas opções de software de análise de imagem existentes, comercial ou freeware. Nos pontos a seguir, descrevemos uma estratégia que é rotineiramente utilizada em nosso laboratório para extrair informações quantitativas de imagens de tecido adiposo 3D usando software comercial (ver Tabela de Materiais).
- Converta as pilhas 3D no formato de software para liberar espaço de memória.
- Segmentar as células.
- Abra o módulo Cell do software.
- Alterar a configuração de detecção celular para coloração da membrana plasmática.
- Escolha o canal fluorescente do marcador usado para delinear a periferia celular (phalloidina que rotula actina cortical ou marcadores de membrana plasmática como F4/80 para macrófago, TCR-β para células T, ou aglomerado de proteínas de CD diferenciadas específicas para subtipos de células imunes).
- Configure os limites e forneça uma gama de tamanho de célula esperado (ou seja, de 1 a 200 μm para detecção celular).
- Executar a segmentação. Um volume correspondente à pilha z será gerado com as células segmentadas codificadas por cores com uma cor diferente para cada uma das células vizinhas.
- Aplique filtros estatísticos (tamanho, arredondamento, circularidade, etc.) na guia estatística para excluir artefatos de segmentação e/ou refinar as células segmentadas à célula de interesse com base em seu tamanho (ou seja, 20-200 μm para adipócitos; 5-25 μm para macrófagos; 1-3 μm para linfocitos).
- Extrair medições e dados quantitativos (volume, número, tamanho, diâmetro, etc.) da guia estatística.
- Segmentar componentes celulares (núcleos, vesículas, etc.) ou vasos como estrutura.
NOTA: Embora a segmentação de filamentos seja muito útil para estudar a conectividade dos vasos, utilizamos a segmentação do módulo de superfície para extrair dados sobre o tamanho, volume e diâmetros dos vasos. De fato, a quantificação dos tamanhos dos vasos é perdida ao usar o módulo de filamentos.- Abra o módulo Surface do software.
- Selecione o canal fluorescente do marcador usado para rotular especificamente o componente subcelular para reconstruí-lo em 3D.
- Configure os limiares e forneça uma faixa do tamanho de diâmetro esperado da estrutura (ou seja, 0,5-5 μm para núcleos; 0-100 μm para vasos; etc.).
- Executar a segmentação. Um volume com a estrutura celular segmentada será gerado. Medições e dados quantitativos (volume, número, tamanho, diâmetro, etc.) podem ser extraídos da guia estatística.
- Segmentar os vasos como um contínuo tubular.
NOTA: Embora a segmentação de filamentos seja muito útil para estudar a conectividade dos vasos, utilizamos a segmentação do módulo de superfície para extrair dados sobre o tamanho, volume e diâmetros dos vasos. De fato, a quantificação dos tamanhos dos vasos é perdida ao usar o módulo de filamentos.- Abra o módulo Filamentos do software.
- Selecione o canal fluorescente correspondente à coloração do vaso.
- Configure os limiares para a intensidade da fluorescência e selecione o número apropriado de nódulos de conexão esperados.
- Executar a segmentação. Filamentos representando a rede de navios serão gerados em 3D. As medições podem ser extraídas da guia estatística, permitindo obter dados quantitativos, incluindo comprimento do vaso, número de ramificações de embarcações, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando o procedimento descrito aqui e resumido na Figura 1,conseguimos manchar e limpar oidualizado o tecido adiposo branco humano e camundongo, conforme apresentado na Figura 2A e Figura 2B, respectivamente. O tecido limpo foi transferido para a câmara de imagem metálica para realização de imagens confocal(Figura 3A). A clareira melhorou drasticamente a profundidade das imagens teciduais que pudemos adquirir (Figura 3B e Figura 3C). Todo o tecido adiposo pode ser adquirido em 3D com baixa ampliação utilizando um objetivo de 4x (ver Filme Suplementar 1), para gerar um mapa 3D, permitindo selecionar as diferentes áreas a serem adquiridas em alta ampliação utilizando um objetivo de 20x(Figura 3D). As imagens de alta ampliação são adquiridas em 3D com profundidade de 2 mm(Figura 3E).
Este procedimento permite a rotulagem de numerosos marcadores celulares gerais, incluindo núcleos usando DAPI e actina usando phalloidina fluorescentemente rotulada. A coloração específica de gotículas lipídicas e adipócitos pode ser alcançada usando anticorpos perilipin (ver tabela de materiais; Figura 4A) e anticorpo anti-Glut4 (ver tabela de materiais; Figura 4B) Respectivamente. Os vasos sanguíneos podem ser detectados usando o anticorpo CD31 (ver tabela de materiais; Figura 4C) ou por uma injeção intravenosa de lectina-DyLight649 pouco antes do sacrifício do rato (ver tabela de materiais; Figura 4D). Macrófagos e células T podem ser visualizados usando o anticorpo anti-CD301-PhycoErythrin (ver tabela de materiais; Figura 4D) e o anticorpo anti-TCR-β-Pacífico Bleu (ver tabela de materiais; Figura 4E). A rede nervosa periférica pode ser detectada usando o anticorpo anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) (ver tabela de materiais; Figura 4F-G). Além disso, este protocolo permite a limpeza do tecido adiposo epidímico do camundongo(Figura 4A-B,E),tecido adiposo subcutâneo do rato(Figura 4D,G),tecido adiposo marrom do rato(Figura 4F)e tecido adiposo humano(Figura 4C). Usando uma combinação dessas rotulagens e um software comercial (ver tabela de materiais) para segmentar esses marcadores, podemos determinar dentro do tecido adiposo i) adipócitos de tamanho e distribuição de tamanho(Figura 5A-B) e ii) densidade da rede dos vasos sanguíneos(Figura 5C).
Figura 1: Resumo do procedimento de compensação do tecido adiposo branco. Os tecidos adiposos brancos ou camundongos são fixos, permeabilizados, saturados, manchados e limpos. As imagens são então adquiridas em 3D e analisadas usando um software comercial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fotografias de tecido adiposo branco. (A) Fotografia do tecido adiposo abdominopelo branco humano antes e depois do procedimento de compensação. (B) Fotografia do tecido adiposo branco epidídmico do rato antes e depois do procedimento de compensação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Profundidade de imagem melhorada com limpeza de tecido adiposo. (A) Montagem da câmara de imagem metálica equipada com fundo de vidro. (B) Imagens da série Z do tecido adiposo branco epidídmico do mouse manchado com fhalloidin-Alexa488 (verde) antes e depois da limpeza. (C) Projeções XZ correspondentes às linhas pontilhadas brancas através do painel B z-stack. (D) Projeção Z de 0,4 cm z-stack de tecido adiposo branco subcutâneo do mouse manchado para actina usando Phalloidin-Alexa488 e adquirido em baixa ampliação com um objetivo de 4x. As pequenas imagens à direita foram adquiridas na posição de tecido selecionado utilizando um objetivo de 20x. (E) Visão lateral da renderização de volume 3D da imagem z-stack do tecido adiposo branco do rato limpo manchado com Phalloidin-Alexa488 adquirida de forma semelhante às imagens de 20x de (D). A profundidade de imagem 3D alcançada pelo nosso procedimento de alta ampliação é demonstrada aqui e sublinhada por uma codificação de cores de profundidade z (azul escuro para z=0 mm a vermelho escuro para z=2 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tecidos adiposos brancos e mouses manchados para vários marcadores. (A) Imagem de plano único do tecido adiposo branco epidídmico do rato manchado para gotículas lipídicas usando anticorpo anti-perilipin1 e anticorpo conjugado anti-mouse-alexa647. (B) Imagem de plano único mosaico de tecido adiposo branco epidídico do rato manchado para núcleos e adipócitos usando DAPI, anticorpo anti-Glut4 e anticorpo conjugado anti-mouse-alexa647. (C) Projeção Z de 600 μm z-stack de tecido adiposo abdominopelvico branco humano manchado para vasos usando anticorpoconectado CD31-alexa647. (D) Projeção Z de 600 μm z-stack de tecido adiposo branco subcutâneo do mouse manchado para vasos e macrófagos usando injeções intravenosas lectina-DyLight649 e anticorpo anti-CD301-alexa55. O inset inferior direito é uma imagem ampliada da caixa pontilhada branca. (E) Imagem de plano único do tecido adiposo branco epidídico do rato manchado para actina e células T usando phalloidin-Alexa488 e anti-TCRβ-Pacific azul-conjugado. O inset inferior direito é uma imagem ampliada da caixa pontilhada branca. (F) Projeção Z de 50 μm z-stack de tecido adiposo marrom do rato manchado para núcleos e rede neuronal usando DAPI, anticorpo anti-TH e anticorpo conjugado anti-coelho-alexa647. (G) Projeção Z de 600 μm z-stack de tecido adiposo branco subcutâneo do rato manchado para núcleos e rede neuronal usando DAPI, anticorpo anti-TH e anticorpo conjugado anti-coelho-alexa647. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de imagens 3D utilizando software comercialmente disponível (ver tabela de materiais). (A) renderização de volume 3D de adipócitos humanos segmentados em 3D por software comercialmente disponível. Cada adipócito tem uma cor diferente do seu contato com adipócitos adjacentes. Os vasos estão representados em vermelho. (B) Quantificação de tamanho e distribuição dos adipócitos a partir da renderização de volume 3D do painel A, que contém cerca de 20.000 adipócitos. (C) renderização de volume 3D de vasos sanguíneos segmentados em 3D utilizando software comercialmente disponível e representados em vermelho ou amarelo para os vasos grandes e pequenos, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme suplementar 1: renderização de volume 3D de todo o tecido adiposo branco subcutâneo mostrado na Figura 3D. A caixa branca representa um cubo de 2 cm3. Clique aqui para baixar este vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As modificações que ocorrem dentro do tecido adiposo ao longo da progressão patológica, como a da obesidade, são fundamentais para a compreensão dos mecanismos por trás da patologia. Estudos pioneiros que revelaram tais mecanismos no tecido adiposo têm sido baseados em abordagens globais como proteômica de tecido adiposo inteiro21,citometria de fluxo22,,23e transcriômica24,25. Além disso, esforços têm sido feitos para explorar as mudanças estruturais ocorridas no tecido adiposo utilizando análises histológicas26,,27,28,,29. No entanto, a análise de seções de tecido adiposo de 5-10 μm, devido ao tamanho limitado da seção, restringe a capacidade de apreciar características estruturais importantes. Em primeiro lugar, apenas alguns núcleos de adipócito são detectáveis por seção, uma vez quethcada seção representa apenas uma pequena porção dos adipócitos (1/10). Em segundo lugar, o tamanho dos adipócitos estimados a partir de seções de tecido adiposo é impreciso porque a maioria dos adipócitos são cortados abaixo ou atrás de seu equador, levando a uma medição tendenciosa (abaixo)de seu tamanho médio. Terceiro, o vaso sanguíneo e o contínuo da fibra nervosa são perdidos durante a secção física. Em quarto lugar, a distribuição de cada subtipo de células imunes dentro do tecido é difícil de estabelecer porque as coordenadas tridimensionais são perdidas. Nesse contexto, a metodologia que propomos aqui permite que qualquer laboratório padrão exa imagem tecido adiposo branco humano e rato em três dimensões, de forma simples e barata.
Este método tem algumas limitações. Primeiro, o tempo necessário para preparar o tecido (fixação, permeabilização, coloração, clareira) é longo (mais de uma semana). Isso seria difícil de reduzir porque a maior parte deste tempo é necessária para manchar o tecido. A penetração de anticorpos dentro de amostras de tecido tão grandes requer longos tempos de incubação. Diminuir o tempo de incubação aumentaria o risco de ter penetração de anticorpos não homogêneos, o que levaria à coloração de artefatos. Portanto, a única janela possível para ganhar tempo e encurtar o procedimento é o tempo dedicado para limpar o tecido, que leva cerca de um dia quando são necessários resultados ideais, mas isso pode ser reduzido para meio dia sem uma queda dramática na qualidade. A segunda limitação é o provável encolhimento do tecido. De fato, em qualquer protocolo que desidrata o tecido usando solventes, é provável que os tecidos encolham devido à remoção da água. Estimar esse encolhimento é sempre desafiador, e é quase impossível aqui porque a borda do tecido se torna transparente quando os lipídios começam a ser extraídos durante o processo de desidratação. Assim, as estimativas de tamanho dos tecidos limpos precisam ser interpretadas com cautela. No entanto, a comparação de alterações nos tamanhos de adipócitos ou no comprimento do vaso entre tecidos derivados do camundongo com diferentes genótipos e/ou submetidos a diferentes condições ambientais permanece informativo11. A última limitação está ligada ao grande volume de todo o tecido adiposo do camundongo ou de uma grande amostra cirúrgica de tecido adiposo humano. De fato, embora o protocolo esteja perfeitamente adaptado para limpar essas grandes amostras, a imagem de um órgão inteiro é desafiadora com um microscópio confocal. A estratégia para superar essa questão e explorar todo o potencial de todo o procedimento de limpeza de órgãos, é adquirir um mapa de baixa ampliação 3D de todo o órgão usando um objetivo 4x, e selecionar áreas específicas dispersas aleatoriamente dentro do tecido onde podem ser adquiridas imagens 3D de maior ampliação usando um objetivo de longa distância de 20x. A configuração de "alta ampliação" permite a imagem do volume tecidual de cerca de 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Embora esse volume seja limitado em comparação com o volume de todo o órgão (0,5 a mais de 4 cm3), repetir as aquisições em várias posições dentro do tecido nos permite obter uma boa amostragem do tecido na resolução celular para subcelular. Observe que a imagem de grandes tecidos gerará uma quantidade significativa de dados de imagem que precisarão ser armazenados.
O procedimento tem diferenças significativas quando comparado com métodos descritos anteriormente para limpar o tecido adiposo14,30. Em primeiro lugar, ao contrário de AdipoClear, que usa metanol, diclorometano e dibenzylether14, o método aqui apresentado utiliza etanol para desidratação e salicilato de metila para compensação. Portanto, o procedimento é mais seguro porque aproveita solventes menos tóxicos que muitas vezes são usados por indústrias de processamento de alimentos/bebidas (etanol e metilsalicylate), em comparação com a alta toxicidade de diclorometano, metanol e dibenzylether. Além disso, a preparação do tecido de acordo com o protocolo é dois dias mais rápida que o protocolo AdipoClear14. Mais recentemente, outro método foi proposto por Li e colegas para limpar peças de tecido adiposo, imergindo-os em glicerol30. Este protocolo é muito simples mesmo comparado a este procedimento, e a qualidade das imagens é boa mesmo em alta ampliação. No entanto, este protocolo de compensação só funciona de forma eficiente quando se utiliza peças de tecido adiposo de 2 mm3. A secção do tecido nessas minúsculas amostras antes do procedimento de compensação impede que um deles de imagens de volumes teciduais maiores que 2 mm3 mesmo em baixa ampliação. O procedimento aqui apresentado permite o mapeamento de todo o tecido em 3D em baixa ampliação e aquisição de pilhas 3D de imagens em torno de 45 mm3 em várias posições conhecidas dentro de todo o tecido adiposo limpo em alta ampliação.
Este procedimento pode ter várias aplicações futuras. Como em qualquer método, o procedimento descrito aqui pode ser simplificado e/ou otimizado. Um avanço interessante para o procedimento poderia vir da combinação do processo de compensação, descrevemos, com abordagens adicionais de imagem. Por exemplo, configurações específicas de imagem, como tomografia de projeção óptica (OPT), microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF), Microscopia de Iluminação de Plano Seletivo (SPIM) ou Microscopia de Esgotamento de Emissões Estimuladas (STED) são, em princípio, compatíveis com o procedimento, embora isso limite sua aplicabilidade aos laboratórios equipados com esses sistemas. Alternativamente, utilizando um objetivo com um alto índice de abertura numérica e um sistema de aquisição capaz de adquirir centenas de imagens por segundo, que é encontrada em muitos laboratórios, pode-se realizar análises de super-resolução utilizando o Freewaredeanálise de imagem pós-processamento da Super Resolução Radial (SRRF). Curiosamente, os fluororomes clássicos são adaptados para a análise srrf, o que permitiria análises de super-resolução 3D de tecidos adiposos brancos humanos e camundongos inteiros.
Muitas etapas críticas no protocolo estão relacionadas ao processamento de tecidos antes da limpeza em si. Em primeiro lugar, e quanto às análises histológicas clássicas, o passo de fixação é fundamental. No caso de fixação fraca, as características estruturais não são preservadas, enquanto a fixação estendida leva ao crosslinking e bloqueio de locais específicos de antígeno e consequentes imuno-manchas não homogêneas. Outro passo sensível é a coloração do tecido, que apresenta vários pontos críticos que descreveremos abaixo. Primeiro, os anticorpos precisam ser validados testando-os em seções de criostat para confirmar que eles estão funcionais e determinar sua concentração ideal. A concentração final usada para o procedimento de compensação é dez vezes a concentração ideal para as seções criostatas. Em segundo lugar, o tempo de incubação também é crítico devido ao tamanho do tecido. Um tempo de incubação muito curto produzirá imunostaining fraco ou não homogêneo (por exemplo, coloração correta na periferia do tecido, mas sem coloração interna). Da mesma forma, as etapas de lavagem muito curtas evitarão que anticorpos não especificamente ligados sejam removidos do tecido levando a manchas não específicas. Pelo que sabemos, a incubação estendida do tecido com anticorpos não prejudica a coloração. Por isso, recomendamos fortemente longos períodos de incubação e lavagem. Em terceiro lugar, a escolha do fluorocromo deve ser adaptada ao sinal de interesse. Em amostras de tecido em geral, e especialmente tecido adiposo branco, a auto-fluorescência não desprezível é detectável a 488 nm e 555 nm. Para proteínas altamente expressas isso não é um problema e a coloração funcionará bem nesses canais. No entanto, para proteínas de baixa expressão recomendamos fortemente o uso de fluorochromes vermelhos distantes. Para a compensação, não há passos críticos, pois a metodologia é muito simples. Tenha em mente que o salicilolato de metila não é compatível com materiais plásticos, por isso recomendamos garrafas de vidro para as etapas de compensação e uma câmara metálica equipada com fundo de vidro para realizar a imagem. Alternativas para este procedimento de montagem existem usando i) um slide de vidro normal, resina dentária e tampa de vidro (para gerar uma pequena câmara de vidro), ou ii) uma placa de petri de vidro (para configurações de microscópio vertical).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho contou com o apoio da INSERM, Université Côte d'Azur, e por subsídios da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) através dos Investimentos para o Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), o programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes " e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), e o Programa Jovem Investigador para J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, e que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem IBISA Côte d'Azur (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por ajuda técnica na preparação de tecidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, visibilidade científica internacional da UCA, pela leitura do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
