Summary
Ультра-высокоскоростной западный метод blotting разработан путем улучшения кинетики антиген-антител связывания через циклические слива и пополнения (CDR) технологии в сочетании с иммунореакцией повышения агента.
Abstract
Западная помарка (также известная как иммуноблот) является каноническим методом биомедицинских исследований. Он обычно используется для определения относительного размера и обилия конкретных белков, а также пост-трансляционных белковых модификаций. Этот метод имеет богатую историю и по-прежнему широко используется из-за своей простоты. Тем не менее, западная процедура blotting лихо занимает несколько часов, даже дней, чтобы завершить, с критическим узким местом является долго инкубации раз, которые ограничивают его пропускную способность. Эти инкубационные шаги необходимы из-за медленного диффузии антител от раствора навалом до обездвиженные антигены на мембране: концентрация антител вблизи мембраны намного ниже, чем концентрация навалом. Здесь мы представляем новшество, которое резко сокращает эти инкубационые интервалы за счет улучшения связывания антигенов через циклическое осушение и пополнение (CDR) раствора антител. Мы также использовали иммунореакцию повышения технологии для сохранения чувствительности анализа. Сочетание метода CDR с коммерческим иммунореакцией повышающий агент увеличило выходной сигнал и существенно сократило время инкубации антител. В результате ультра-высокоскоростной западной пятно может быть достигнуто в 20 минут без потери чувствительности. Этот метод может быть применен к западным пятнам, используя как хемилюминесцентные, так и флуоресцентные обнаружения. Этот простой протокол позволяет исследователям лучше исследовать анализ экспрессии белка во многих образцах.
Introduction
Западная помарка (также известная как иммуноблот) является мощным и фундаментальным методом в широком диапазоне научных и клинических дисциплин. Этот метод используется для изучения присутствия, относительного изобилия, относительной молекулярной массы и пост-трансляционных модификаций белков1. В сочетании с цифровым анализом изображений, этот метод может надежно анализировать обилие белков и белковых модификаций2. Хотя западная помарка выполняется регулярно, это трудоемкий и трудоемкий метод. Требуются длительные инкубации антител с мембранами. Здесь мы описываем модификацию метода инкубации, которая преодолевает это ограничение без ущерба для чувствительности.
Во время инкубации мембраны антитела плавают в растворе, в то время как антигены обездвижены на мембране. Из-за их высокой близости, скорость связывания антител к антигену быстрее, чем диффузия антител от массового раствора к мембране. Это создает низкую концентрацию "слой истощения"(рисунок 1). Это может занять несколько часов для более отдаленных антител, чтобы достичь мембраны через пассивную диффузию, которая является основным фактором, ответственным за долгое время инкубации в этой технике. Этот эффект называется ограничением общественного транспорта (MTL)3. Было предложено, что повторяющиеся слива и пополнения антител содержащие раствор может нарушить слой истощения и преодолеть MTL4. Здесь мы разработали уникальный метод, который реализует эту циклическую концепцию осушения и пополнения (CDR), чтобы уменьшить эффект MTL в традиционном западном протоколе blotting и заметил, сократить необходимый инкубационный период.
Для того, чтобы сохранить чувствительность обнаружения с коротким временем инкубации, мы использовали иммунореакцию повышения технологии, которая ускоряет реакцию антиген-антитела, тем самым улучшая соотношение сигнала кшуму 5. Многие коммерчески доступные иммунореакции повышения агентов (IRE) состоят из 2 компонентов (Решение 1 и 2, см. Таблицу материалов). Запатентованный состав или механизм действия IRE не был раскрыт, но мы ранее обнаружили, что IRE уменьшила константу диссоциации между антигеном и антителами в твердых фазообразующих анализах, что указывает на увеличение сродства, по крайней мере частично, ответственного за усиливающий эффект IRE6. Сочетание CDR с IRE дает ультра-высокоскоростной западный протокол blotting, который уменьшает все время процедуры без ущерба для чувствительности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE и переход на мембрану PVDF
- Выполните SDS-PAGE, чтобы отделить белки на основе относительного размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любая коммерческая или домашняя система геля в порядке. Пожалуйста, следуйте протоколу производителя. - Передача разделенных белков из геля на мембрану PVDF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общие методы передачи (полусухая или влажная передача) подходят. Пожалуйста, следуйте протоколу производителя.
2. Блокирование мембран PVDF
- Инкубировать мембраны в соответствующих блокирующих буферов в течение 1 ч с агитацией при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от первичной системы антител и обнаружения следует выбрать соответствующий блокирующий буфер. Например, наиболее типичными блокаторами являются BSA, обезжиренное сухое молоко, кейсин и коммерческие синтетические полимеры. PBS и/или TBS с 0,1% Tween20 являются наиболее часто используемыми буферами. Этот блокирующий шаг может быть сделан в течение ночи при 4 градусов по Цельсию.
3. Инкубация первичными антителами
- Подготовка 10% иммунореакции повышения агента-1 раствор (IRE-1) с дистиллированной водой. Вортекс хорошо.
- Приготовьте разбавленное первичное антитело с 10% IRE-1. Смешайте его осторожно и тщательно.
- При использовании более крупной мембраны (4 см х 8 см - 8 см х 8 см), добавьте 8 мл раствора антител в 50 мл конической центрифуги трубок. При использовании меньшей мембраны (2 см х 8 см - 4 см х 8 см), добавьте 3 мл раствора антител в 14 мл круглого дна полипропиленовой трубки(таблица материалов).
- Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте блокирующий раствор кратко. Вставьте мембрану PVDF в эту трубку с пальцами в перчатках и убедитесь, что вся мембрана прилипает к стене трубки. Когда мембрана PVDF вставляется в трубку, лицо "белковой стороне" мембраны, которая была первоначально в контакте с гелем внутрь. Закройте крышку плотно.
- Вставьте трубку 50 мл в стеклянную бутылку для гибридизации печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда 14 мл трубки используются для этой инкубации, вставьте 14 мл трубки в 50 мл трубки, используя пару пластиковых держателей кольца держать внутреннюю трубку в центре 50 мл трубки. - Включите печь гибридизации.
- Инкубировать мембрану с 6 оборотов в минуту вращения, по крайней мере 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мембрана всегда прилипает к стене и что (внутренняя) трубка горизонтальная, чтобы равномерно покрыть мембрану раствором антител. Калибруйте разбавление антитела и инкубационное время до фактического эксперимента.
4. Мембранная стирка
- Остановите вращение.
- Аккуратно удалите мембрану PVDF из трубки с помощью пинцета и поместите мембрану в контейнер с 50 мл PBS-T.
- Промыть мембрану кратко с PBS-T.
- Промыть мембрану в контейнере дистиллированной водой, пока не появятся пузырьки. Это для удаления большинства антител.
- Перенесите мембрану PVDF из контейнера в салатный спиннер, содержащий 250 мл PBS-T.
- Поместите корзину ситечко в спиннер. Убедитесь, что крышка была поставлена на надежно.
- Активировать спиннер и запустить его около 20-30 с.
- Отбросьте раствор и кратко промойте внутреннюю часть спиннера дистиллированной водой.
- Добавьте 250 мл PBS-T в спиннер снова.
- Повторите шаги 4.6 и 4.7.
5. Инкубация со вторичным антителом
- Подготовка 10% иммунореакции повышения агента-2 раствор (IRE-2) с дистиллированной водой. Вортекс хорошо.
- Приготовьте разбавленное вторичное антитело с 10% IRE-2. Смешайте его осторожно и тщательно.
- Выберите объем раствора антитела и трубки, как указано в шаге 3.3.
- Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор кратко. Вставьте мембрану PVDF в трубку, как указано в шаге 3.4.
- Вставьте трубку 50 мл в стеклянную бутылку для гибридизации печи.
- Включите печь гибридизации.
- Инкубировать мембрану с 6 оборотов в минуту вращения, по крайней мере 5 мин. Убедитесь, что мембрана постоянно прилипает к стене и что (внутренняя) трубка горизонтальная, чтобы равномерно покрыть мембрану раствором антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Откалибровать инкубационное время до фактического эксперимента. Когда вторичное антитело флуоресцентно конъюгированных, выполнять инкубацию в темноте.
6. Мембранная стирка
- Следуйте шагам от 4.1 до 4.10.
7. Приобретение изображений
- Обнаружение химилюминесцентных ламп
- Поместите кусок полуплантплантной гибкой пленки (10 см х 15 см) на плоскую поверхность.
- Смешайте 2 компонента химилюминесцентного субстрата в трубке объемом 5 мл.
- Немедленно перенесите 1,5 мл смешанного субстрата на полусплантную гибкую пленку и поместите на нее мембрану PVDF. Затем перенесите оставшуюся часть субстратного раствора на мембрану.
- Инкубировать мембрану PVDF со смешанным субстратом на полупрозрачной гибкой пленке в течение 1 мин.
- Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор субстрата кратко.
- Сэндвич мембраны между парой прозрачности фильмов.
- Приобрети изображение в режиме хемилюминесцентных ламп.
- Флуоресцентное обнаружение
- Возьмите мембрану PVDF с помощью пинцета и слейте раствор кратко.
- Сэндвич мембраны между парой прозрачности фильмов.
- Приобрети изображение в флуоресцентном режиме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.1 и 7.2 должны выполняться в непосредственной близости от аппарата визуализации для обеспечения максимальной чувствительности. - Когда фоновый сигнал высок, выполните шаг стирки в контейнере с 80-100 мл PBS-T: 10 мин промыть 3 раза для первичного антитела и 5 мин промыть 6 раз для вторичного антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как первичные, так и вторичные антитела, разбавленные 10% IRE решениями, могут быть использованы до 8-10 раз без потеричувствительности 6. Раствор следует хранить при 4 градусах Цельсия в течение 1 месяца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот пример иллюстрирует эффективность метода CDR вместе с технологией иммуноэнгенса на западной помарке. Статическая инкубация проводилась на полупрозрачной гибкой пленке, где мембраны PVDF инкубировались раствором антитела, в то время как инкубация CDR находилась в печи гибридизации вращающимися трубками, содержащими мембраны и раствор антитела (Movie). На рисунке 2 показаны количества антигена и антитела, соответственно, необходимые для обнаружения хемилюминесцентных веществ на западных помарках. Как в статических, так и в инкубациях CDR использование решения IRE увеличило чувствительность: IRE уменьшил наименьшее количество лизатов клеток (антигенов), необходимых для обнаружения q-actin, с 2,2 мкг до 1,1 мкг в статических условиях и еще больше сократился с 1,1 мкг до 0,275 мкг с использованием CDR(рисунок 2A). Аналогичным образом, минимальная концентрация анти-6x Его тег антитела была снижена со 100 нг/мл до 50 нг/мл в статических условиях и со 100 нг/мл до 12,5 нг/мл при условии CDR(рисунок 2B). Инкубация CDR в течение 5 мин или 10 мин резко снизила предел обнаружения по сравнению со статической инкубацией (60 мин с первичными и 30 мин со вторичными антителами). Наконец, сочетание CDR с IRE показало превосходную чувствительность на западной помарке (0,275 мкг клеточных лизатов для обнаружения а-актина и 12,5 нг/мл анти-6x его тегов антитела) даже в течение этого чрезвычайно короткого инкубационное периода.
Второй пример демонстрирует успешное применение этого метода к западной помарке с флуоресцентным обнаружением(рисунок 3). Флуоресцентное обнаружение, в отличие от обнаружения хемилюминесцентных веществ, имеет уникальную способность обнаруживать несколько целей на одной и той же помарке одновременно без зачистки/повторного зондирования антител. (Его) 6 помеченных AP и -actin в ликатах клетки были одновременно обнаружены с помощью двухцветного флюорофора. Инкубация CDR с IRE не только ускорила обнаружение, но и увеличила чувствительность, что привело к разоблачению деградации (Его)6 помеченных AP (Рисунок 3A).
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация метода циклического дренажного пополнения (CDR).
(A) слой истощения вблизи мембраны быстро образуется в статических условиях, когда зонд имеет высокое сродство к антигену, но ограниченную способность рассеиться через раствор. Таким образом, переход зонда к мембране становится ограничивающим шагом скорости и длительное время инкубации компенсирует ограничение массового переноса. (B) метод CDR путем вращать пробку пока мембрана придерживается к стене исключает слой истощения и пополняет такое же разрешение зонда для того чтобы держать концентрацию зонда около мембраны постоянн. Эта цифра была изменена с Higashi и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: (A) Различные количества 293 лизят клеток (1:2 серийных разбавлений от 8,8 мкг/лейн) были разделены SDS-PAGE, а затем переход на мембрану PVDF и блокирование с 5% обезжиренного молока в PBS-T. Помарка была исследована с антителом мыши anti-a-actin (1:3,000 разбавления). (B) После разделения условных средств массовой информации, полученных из трансфицированных 293 клеток с pAPTAG5 (GenHunter), содержащий выделяется (Его)6 помечены щелочной фосфатазы (AP, 8 х 10-14 моль / переулок), белки были переданы в PVDF мембран. Каждая мембрана подвергалась западной помарке с различными концентрациями анти-6x Его тег антитела (1:2 серийных разбавлений от 400 нг/мл). Мембраны были изображены как единое изображение и пунктирные линии указывают на границу отдельных мембран. Эта цифра была изменена с Higashi и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Одновременное обнаружение нескольких целей на западной помарке с использованием флуоресцентного обнаружения и CDR в сочетании с IRE.
Различные количества лизатов (1:2 серийных разбавления от 10 мкг/лейн) от 293 клеток, трансфицированных pAPTAG5, были отделены и перенесены на мембрану PVDF. После блокирования с блокирующим буфером для флуоресцентного обнаружения (BFD) в течение 1 ч, пятно было исследовано с анти-6X Его тег и анти-актин антитела, а затем IRDye 800CW коза анти-кролик IgG и IRDye 680RD коза анти-мышь IgG. A: антитела разбавленные с раствором 10% IRE под условием CDR, B: антитела разбавленные с BFD содержа 0.1% Tween20 под статическим состоянием. Из-за более высокой чувствительности с комбинацией CDR и IRE была замечена деградация(Его) 6 помеченных AP. Эта цифра была изменена с Higashi и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схематическая иллюстрация улучшенной и сверхвысокой скорости западной помарки CDR по сравнению с традиционным статическим методом.
Эта цифра была изменена с Higashi и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Западная помарка широко используемая аналитическая техника для того чтобы обнаружить специфически протеины которые были натыся 40 леттому назад 7,8. С тех пор техника продолжает развиваться, с последующими нововведениями, улучшая чувствительность, скорость иколичественную оценку техники 2,9,10,11,12,13. Улучшенный ультра-высокоскоростной западный протокол blotting представленный здесь делает несколько существенных улучшений к существующей технике. Мы уменьшаем время инкубации, не жертвуя чувствительностью, снижая порог обнаружения с помощью IRE. Специального или дорогостоящего оборудования не требуется: для преодоления MTL достаточно вращающейся трубки в гибридной печи. Ключевым нововведением является то, что CDR эффективно устраняет слой истощения в анализе. Хотя аппарат роликовой культуры обычно используется для уменьшения объема раствора, потенциал этого метода для преодоления MTL и сокращения инкубации раз не был проиллюстрирован. Из-за резкого сокращения общего времени для всей процедуры(рисунок 4), гораздо большее количество западных данных пятно в день могут быть получены, когда заблокированные мембраны находятся в руке, что почти невозможно сделать это с традиционным западным протоколом blotting. Следует отметить, что инкубация мембраны на качалки платформы шейкера эквивалентна статической инкубации4,6. Промывка мембран PVDF в бытовом коммерческом салатном спиннере с большим объемом стирального раствора также уменьшает продолжительность процедуры(рисунок 4).
Успешное использование этого протокола зависит от оптимизации разбавления антител раствором IRE и инкубации времени. Широкий спектр титровати антител рекомендуется в начале анализов, так как CDR в сочетании с IRE существенно повышаетчувствительность (рисунок 2). Еще одним фактором, который следует учитывать, является время инкубации. Когда один имеет хорошие западные результаты пятно с 1 ч инкубации с первичными антителами в статических условиях, инкубацио время может быть сокращено до 5-10 мин в условиях CDR в целом. Например, при ночной инкубации с первичными антителами следует оценить чуть более длительное время инкубации CDR (30 мин - 6 ч). Время разбавления и инкубации вторичными антителами также имеет решающее значение. Инкубации более 30 мин в условиях CDR обычно дают более высокий фон. Таким образом, требуется тщательная титрование вторичных антител с инкубацией до 30 мин. Когда фоновый сигнал высок после тщательного титровавания антител, должны быть выполнены обширные шаги стирки (10 мин полоскания 3 раза для первичного антитела и 5 мин полоскания 6 раз для вторичного антитела в контейнере с 80-100 мл стирального раствора).
Качество западных данных пятно часто зависит от антител, используемых. Когда у нас было трудное антитело, используемое для западной помарки, белковые маркеры иногда показывали существенные сигналы даже после тщательного титровавания антител и обширного мытья. Так как мы заметили, что метод CDR с IRE имеет тенденцию к увеличению неспецифической привязки, добавление блокирующих реагентов (таких как обезжиренное молоко и другие) в разбавивки антител может улучшить соотношение сигнала кшуму 14. Это трудоемкий скрининг шаг, но это стоит попробовать.
Западная помарка стала важной для количественныхприменений 2. Полукомантификация может быть выполнена с помощью обнаружения хемилюминесцентных веществ. Процедура, представленная здесь, применима к зачистке и повторному зондированию с этой целью6. Из-за более широкого динамического диапазона, флуоресцентное обнаружение является лучшим вариантом. С помощью этого протокола флуоресцентное обнаружение обеспечивает линейный динамический диапазон для количественногоанализа 6. Стоит отметить, что время инкубации CDR с флуоресцентным обнаружением кажется более длительным, чем при обнаружении гемилюминесцентных ламп.
Западная помарка имеет широкий спектр применений и остается универсальным методом для изучения изобилия белка, белково-белковых взаимодействий и пост-трансляционных модификаций. Например, антиуглеводные антитела могут быть легко использованы для западной пятно с этимпротоколом 14. Поскольку различные углеводные moieties, выраженные на внешней поверхности вирусных, бактериальных и фугу являются патоген-специфическими, они являются бесценными целями для распознавания патогенов и диагностики инфекционных заболеваний. Таким образом, применение этого простого протокола может повлиять на многие области исследования, бритья часов ожидания не только для экспериментов, но и клинические иммунодиагностики, которые полагаются на западные технологии blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили, что не имеют прямого отношения к содержанию этой статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Отделом интрамуральных исследований, Национальным институтом сердца, легких и крови, Национальными институтами здравоохранения. S.H. была поддержана Японской программой государственно-частного партнерства по обучению студентов за рубежом, а H.N. и K.Y. были стипендией Valor и V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
