Summary
מוצג כאן פרוטוקול לבידוד והגברה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטטיביים של עכבר אנאירובי באמצעות ספוגית עיניים ייחודית וצעד העשרה מבוסס תרבות עם זיהוי עוקב על ידי שיטות מבוססות מיקרוביולוגיות וספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.
Abstract
פני העין נחשבו בעבר מיוחסים חיסוניים ואביוטיים, אך לאחרונה נראה כי קיימת נוכחות קומית קטנה אך מתמשכת. זיהוי וניטור של מיני חיידקים ברירית העין היו מאתגרים בשל השפע הנמוך שלהם וזמינות מוגבלת של מתודולוגיה מתאימה לצמיחה וזיהוי commensal. ישנן שתי גישות סטנדרטיות: שיטות מבוססות תרבות או רצף DNA. השיטה הראשונה בעייתית בשל החיידקים המוגבלים הניתנים לשחזור והגישה השנייה מזהה חיידקים חיים ומתים המובילים לייצוג חריג של מרחב העין. פיתחנו שיטה חזקה ורגישה לבידוד חיידקים על ידי בנייה על טכניקות פולחן מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. זוהי טכניקה מבוססת ספוגית, תוך שימוש ב"מעבדה" העשויה ספוגית דקה המכוונת ללחמית התחתונה, ואחריה צעד הגברה עבור סוגים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים. פרוטוקול זה אפשר לנו לבודד ולזהות מינים הלחמית כגון קורינבקטריום spp., קוגולאז סטפילוקוקוס שלילי spp., סטרפטוקוקוס spp., וכו '. הגישה מתאימה להגדרת גיוון קומנסלי בעכברים בתנאי מחלה שונים.
Introduction
מטרת פרוטוקול זה היא לשפר את הבידוד הספציפי של מיקרואורגניזמים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים בני קיימא ונדירים מהלחמית העין כדי לאפיין את המיקרוביום העין. מחקרים מקיפים פרופיל קהילות הרירית commensal על העור, המעיים, דרכי הנשימה ואברי המין ולהראות כי קהילות אלה משפיעים על התפתחות המערכת החיסונית ואת התגובה1,2,3. קהילות עיניים הוכחו להשתנות במהלך פתולוגיות מחלה מסוימות, כגון מחלת עיניים יבשות4, תסמונת סיוגרן5 וסוכרת6. עם זאת, היכולת להגדיר קהילה טיפוסית של משטח עיני מעוכבת על ידי השפע הנמוך יחסית שלהם בהשוואה לאתרי הרירית האחרים6,7,8. זה מעורר מחלוקת אם יש מיקרוביום עיני תושב ואם הוא קיים, אם זה שונה מיקרוביום העור וכתוצאה מכך, ההשפעה המקומית שלה על התפתחות מערכת החיסון המולדת ותגובה. פרוטוקול זה יכול לסייע בפתרון שאלה זו.
בדרך כלל, גישות להגדרת הנישה העין commensal מבוססים על רצף וטכניקות מבוססות תרבות4,7,9. ריצוף 16 S rDNA וניתוח BRISK7 מראים מגוון רחב יותר מאשר טכניקות מבוססות תרבות, אך אינם מסוגלים להבחין בין מיקרואורגניזמים חיים למתים. מכיוון שפני השטח העין עוינים למיקרואורגניזמים רבים בשל תכונות אנטי-מיקרוביאליות של סרט דמעה4 היוצרים מגוון גדול של שברי דנ"א, גישות מבוססות DNA יזהו את הממצאים הללו אשר עשויים להטות את הנתונים לזיהוי חיידקים מתים כחיידקים מקומיים ולא כמזהמים. התוצאה היא זיהוי ואפיון חריגים של מרחב העין כ גבוה יותר בשפע החיידקים ובמגוון10. זה מקשה להגדיר את המיקרוביום העין תושב באמצעות שיטות מבוססות DNA. בעוד, טכניקות סטנדרטיות המבוססות על תרבות אינן מסוגלות לזהות commensals כי העומס הוא נמוך מדי11. השיטה שלנו משפרת על פרקטיקות סטנדרטיות באמצעות ספוגית דקה שיכולה למקד את הלחמית, ובכך למנוע זיהום מעור שכן, כמו גם את הרעיון כי אורגניזמים קיימא יכולים להיות מועשרים על ידי תרבות קצרה בתקשורת צפופה מיזינים במטרה להחיות קיימא אך לא culturable, כמו גם, העשרה עבור מיקרואורגניזמים קיימא נדירים.
התוצאות, שפע יחסי של קומנסלים עיניים לכל ספוגית עיניים, מאפיינות את המיקרוביום תושב הלחמית והן חשובות למטרות השוואתיות. הנתונים שלנו מראים כי יש הבדל בין עור מיקרוביוטה הלחמית, כמו גם מגוון גדול יותר עם גיל מוגבר הבדל ספציפי למין בשפע. יתר על כן, גישה זו מצאה באופן שכפול הבדלים commensal בעכברים בנוקאאוט12. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לתאר את המיקרוביום העין אשר עשוי להשתנות עקב שיטות caging, גיאוגרפיה, או מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות המקומיות של מטבוליטים commensal ומוצרים על התפתחות המערכת החיסונית ותגובה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הכרוכים בעכברים פועלים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות במעבדה (בהתאם להנחיות המחלקה לבריאות ובטיחות סביבתית מוסדית) בעת עבודה עם מיקרואורגניזמים וחומרים שעלולים להיות מזוהמים. השתמש בכלי קיבול פסולת מתאימים ונהלי טיהור לפני סילוק חומרים מזוהמים שעלולים להיות מזוהמים ביולוגית.
1. הכנת ספוגית עיניים, הגדרת שדה עבודה, עין העכבר מנגבת והעשרה לדוגמה
- הכן ספוגיות עיניים סטריליות
הערה: ספוגיות עיניים סטריליות הן קיסמים מעץ מצופים דק עם שכבה דקה סיבים של כותנה חבטות ועשה בבית.- Autoclave כמות מתאימה של כותנה חבטות קיסמים עבור מספר העכברים להיות מנוכה.
- צבוט את חתיכת כותנה באורך חצי סנטימטר עם אגודל ואצבע. להקניט את החבטות על ידי משיכת בקצוות עם אגודלים ואצבעות כדי ליצור שכבה נקבובית אחת שטוחה, לעצור רק לפני החבטות מתפרק (חתיכות קטנות של כותנה מפוזרים לאורך החבטות מתוח מקובלים).
- ערבלו את החבטות סביב אחד הקצוות החדים של קיסם השיניים על ידי החזקה קלה של החתיכה המתוחה על קצה קיסם השיניים כשהוא מעוות, ראו איור 1. ספוגית העין "הושלמה" תהיה שכבה דקה מאוד של כותנה נמתח על הקצה, המשתרעת כחצי עד סנטימטר אחד מהקצה.
- הכנס ספוגיות "הושלמו" לתוך קסה קטנה, ספוגית בצד למטה לכסות. מובלעת אוטומטית.
- הגדרת סביבת העבודה
- הכן הרדמה המכילה 2 מ"ל קטמין (100 מ"ג / מ"ל), 400 μL של xylazine (100 מ"ג / מ"ל) ו 27.6 מ"ל של מלוחים סטריליים (0.9% NaCl ב dH2O) בצינור סטרילי 50 mL סטרילי צנטריפוגה. מסנן לעקר ולהרדים aliquot לשימוש מיידי (ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש אחד, תמיד לאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר לפני השימוש).
- לנקות ולנקות את אזור העבודה עם חיטוי כדי למזער את הזיהום.
- Aliquot 0.5 מ"ל של מדיה סטרילית לב המוח עירוי (BHI) לתוך שכותרתו 1.5 מ"ל סטרילי microcentrifuge צינורות (1 צינור לכל עכבר ושליטה); מסדרים בארון תקשורת מיקרוצנטריפוגה. שים את המדף על קרח.
- הגדרת זרימת עבודה כדלקמן (משמאל לימין): תחנת הרדמה לעכבר (כלוב המכיל עכברים ניסיוניים, כלוב סטרילי ריק, הרדמה בטמפרטורת החדר, מחט 25 G ומזרק 1 מ"ל), תחנת ניקוי עיניים (BHI על קרח, ספוגיות עיניים מעוקרות, מגבות נייר נקיות, תרסיס 70% isopropanol) ותחנת ציפוי (צלחות אגר דם בטמפרטורת החדר, 10 μL פיפטה , 10 טיפים חד פעמיים סטריליים μL, מיכל פסולת biohazard).
- עין ספוגה
- לנהל 10 μL של הרדמה לכל 1 גרם של מינון משקל העכבר של קטמין ו xylazine בהתאמה תוך-אופן לכל עכבר בוגר ומניחים לתוך כלוב autoclaved. בדיקת הרדמה על ידי סחיטת כרית אחורית; אין תנועה המצביעה על ההמתה המתאימה.
- הקצה יד אחת לטיפול רק בעכברים מורדמת וביד השנייה כדי לטפל רק בספוגית העין ובתרבות. לריב, להסיר את העכבר מורדם לחלוטין מהכלוב; מניחים על משטח עבודה נקי ממוקם על צידו עם עין שמאל חשופה. ריסוס ידיים כפפות עם isopropanol, יבש עם מגבת נייר נקייה.
- Uncap במיוחד שכותרתו צינור מיקרו צנטריפוגה BHI עם יד ייעודית לטיפול במדיה. מחזירים את הצינור למדף המיקרו-צנטריפוגות על הקרח. טובלים את קצה כותנה מצופה של ספוגית העין ב BHI, למשוך את ספוגית העין מן הצינור מסתחרר קצה 2 פעמים נגד הצינור הפנימי כדי להסיר נוזל עודף.
- עם יד טיפול העכבר, בעדינות להחזיק את העכבר על ידי עורף הצוואר. מצד שני, הניחו את קצה העין על אזור הלחמית המדיאלי של העין השמאלית, ראו איור 2A. לדכא קלות את גלגל העין ולהזיז את הספוגית בתנועת שטיפת חלונות (איור 2B)קדימה ואחורה, בין העפעף התחתון לעין, 10 פעמים. לשמור על לחץ מתמיד.
- מבלי לגעת בפרווה, הסר בעדינות את קצה הספוגית, בניצב למקום שבו הוכנס, והנח את צד הכותנה ספוגית למטה ישירות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שכותרתו המכיל מדיה BHI. יש למרוח טיפת עין משומנת על העין המטונפת.
- תחזיר את העכבר לכלוב.
- תן את ספוגית לעמוד במשך 10 עד 15 דקות על קרח ולהסיר ספוגית עיניים עם יד כפפות מעוקרות על ידי ערבוב הקצה במדיה במשך 10 סיבובים. משוך את הספוגית על ידי מערבולת קצה על הקיר הפנימי של צינור מיקרו צנטריפוגה עבור 5 סיבובים. להשליך את הספוגית במיכל biohazard.
- חזור על שלבים 1.3.2 עד 1.3.7 עבור כל עכבר ועבור דגימות בקרה (ספוגית עור או פרווה). לעקר כפפות כראוי בין כל ספוגית.
- העשרה
- להעשיר את המדגם על ידי דגירה של הצינור סטטי במשך 1 שעה ב 37 °C (69 °F)
- במהלך הדגירה, תווית טמפרטורת חדר אחד Trypticase סויה עם 5% צלחת אגר דם כבשים (צלחת TSA) לכל עכבר ולחלק לשניים.
- לאחר הדגירה של תרבות ספוגית העיניים, יש להסיר דגימות מועשרות מהחממה ומניחים על הקרח.
- דגימות מערבולת לערבב ולצלחת בקצרה לפי השרטוט באיור 3A. Aliquot 10 μL של המדגם על צלחת TSA להטות את הצלחת כדי ליצור רצועה, לחזור 2 פעמים.
- בצד השני של קו החלוקה של הצלחת, נקודה 10 μL של מדגם על אגר, לחזור 9 פעמים.
- צלחות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות, 2 ימים, ו 4 ימים (בתא נקי המונע צלחות אגר ייבוש). מחוזות מושבות ברצועות, הערה מורפולוגיה ולחשב יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לכל ספוגית עבור מבודדים דומים מורפולוגית. תסתכל על נקודות עבור אורגניזמים ייחודיים לא שנתפסו ברצועות.
2. צלחת מאסטר, אפיון וזיהוי של מיקרואורגניזמים עיניים
-
לוח ראשי
- ציירו רשתות בגב לוחית TSA (איור 3B). בחר מושבה עם קיסם סטרילי מכל צלחת ספוגית עין העכבר פס ריבוע הלוח הראשי (רשתות), רשת תווית עם מספר המושבה ומידע העכבר. בחר ופלט שלוש מושבות שונות עבור כל מושבה ברורה מורפולוגית.
- דגירה את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. המשך דגירה במשך 96 שעות, בדיקת מדי יום עבור המראה של מבודדים חדשים.
הערה: אוכלוסיית Commensal תשתנה בהתאם לגיל העכבר, תזונה, מצב המחלה ושיטות caging. אפיון מבודד מבוסס על חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים השולטים שנמצאו במעבדה שלנו.
-
איפיון
- לשכפל13 חיידקים צלחת על מניטול מלח אגר (MSA) ו MacConkey (MAC) צלחות, דגירה לילה ב 37 °C (69 °F). הערה צמיחה עבור כל בידוד ונוכחות של מושבות שעווה או מושבות צהובות עם הילה על MSA.
- עבור cocci חיובי גרם, מבחן עם מבחן קטלאז13,14. מניחים טיפה של 3% מי חמצן על מגלשת זכוכית נקייה. באמצעות קיסם סטרילי, לבחור את החיידק המתאים מצלחת ספוגית העין. אין היווצרות בועה מציין סטרפטוקוקוס spp., היווצרות בועה קלה מצביעה על Corynebacterium spp. ואולי Aerococcus spp. היווצרות בועה מהירה מציין סטפילוקוקוס spp.
-
זיהוי: ניתוח MS של MALDI-TOF
הערה: זיהויים חיידקיים מתבצעים באמצעות MALDI-TOF ומסד הנתונים של התוכנה. מערכת זו משתמשת בינון ינון לינון בלייזר בסיוע מטריצה של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF MS) לפיתוח פרופילי ספקטרום אשר מושווים לספקטרום חיידקי ידוע לזיהוי. E.coli, ATCC 8739, משמש לכיול המערכת.- חיידקי צלחת מבודדים על לוחות TSA המכילים 5% דם כבשים ודגרת לילה עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
- באמצעות לולאת μL 1, להחיל שכבה דקה של החיידקים הטהורים על שקופית היעד MALDI-TOF; 1 μL של MALDI-TOF MS CHCA פתרון מטריקס (חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית) מכוסה ומורשה להתייבש באוויר לחלוטין לפני טעינת השקופית לתוך מכשיר MALDI-TOF.
- כל מבודד מזוהה בכפילות.
- דוחות המכילים ציוני הסתברות העולים על 80%, המצביעים על ערך אפליה גבוה, מתקבלים כתוצאות מהימנות והזיהוי החיידקי מתקבל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות מייצגות של לוחית ספוגית עיניים המדגימות שיטות שונות לציפוי מוצגות באיור 3A ומציגות מבודדים מגוונים מבחינה מורפולוגית מעכבר C57BL/6. עבור כל איזולט מובהק, המושבות נספרו ברצועה והשפע היחסי, יחידות יוצרות מושבה ייחודיות (CFUs) לכל ספוגית עיניים, מחושבות ומותוות למטרות השוואה. עבור אפיון מיקרוביולוגי, חיידקים נקטפו מצלחות ספוגיות עכבר בודדות כדי לייצר צלחת TSA מאסטר (נוצר על ידי קטיף מבודדים ברורים מורפולוגית משולש מכל צלחת ספוגית עין העכבר). מלוח האב, ביום שלאחר מכן או כאשר הצמיחה מופיעה, נערכו בדיקות נוספות כדי לאפיין או לזהות את המיקרואורגניזמים. הלוח הראשי שימש כדי לספק מספיק inoculum כדי להרחיב את המבודדים בהתאמה.
המין התאפיין בטכניקות מיקרוביולוגיות ולאחר מכן זוהה על ידי ניתוח MS MALDI-TOF. כל בידוד מלוחית האב, נבדק על ידי מבחן קטלאז13,14 וגדל על מדיה סלקטיבית. מאז המיקרואורגניזמים השולטים במחקרים שלנו הם סטרפטוקוקוס spp., סטפילוקוקוס spp. ו Corneybacterium spp., מניטול מלח אגר (MSA) ו Mac Conkey אגר (MAC) שימשו אגר סלקטיבי13. צמיחה על מניטול מלח אגר מציין סטפילוקוקוס עמ'13,16. מאז MSA מכיל פנול אדום, הילה צהובה סביב המושבה מצביע על תסיסה מניטול וסיווג כמו סטפילוקוקוס אוראוס (לאשר עם בדיקות חלופיות כגון מבחן Coagulase)13. צמיחה על אגר MacConkey מציין חיידקים שליליים גרם, שכן מלחי מרה וסגול גביש מסוגלים לעבור את קרום חיידקי לעכב גרם צמיחה חיידקית חיובית13. צמיחה שעווה על MSA מציין את הייצור של חומצה מיקולית, יכול להיות בגלל אורגניזמים כגון קורניבקטריום עמ'13. לבסוף, בדיקת קטלאז מבדיל סטרפטוקוקוס spp. מ Staphylococcus עמ'13,16, ובמקרים מסוימים, בדיקה חיובית חלשה עשויה להצביע על Aerococcus spp15.
כדי לזהות מבודדים, צלחת TSA היה פסים דגירה לילה 5% פחמן דו חמצני ו 37 °C (69 °F) ו MALDI-TOF MS שבוצעו. איור 4 מציג את התוצאות S. אסידומינימוס (חבר של viridans סטרפטוקוקוס spp. 17) ו א. וירידנים. לעתים קרובות אארוקוקוס spp. זוהו בטעות כקבוצת הווירידנים סטרפטוקוצ'י18,19, המבוססת על בדיקות ביוכימיות ופנוטיפיות. MALDI-TOF MS הצליח לזהות את המבודדים עם רמת ביטחון של 99.9 ללא מינים בלתי מזוהים.
הבדלים מוטים מין ניתן לראות באיור 5, שבו רמות שונות באופן משמעותי של אורגניזמים commensal התאוששו עכברים זכר ונקבה C57BL/6. השפע היחסי לכל מבודד נקבע. סטרפטוקוקוס אסידומינימוס, אירוקוקוס וורידנים וסטפילוקוקוס שלילי קרישה (מערכת העצבים המרכזית) מבודדים #1 ו- E. coli spp. נמצאו בכל העכברים, כאשר הזכרים הראו שפע יחסי גבוה יותר ומגוון גדול יותר.
איור 1: ספוגית עיניים פנימית.
(A)חתיכת כותנה דקה, כ-1 ס"מ, הוחזקה בין נקודת קיסם סטרילית לאצבע המורה וקיסם השיניים התגלגל תוך שמירה על לחץ קל על האצבע המורה עד שהכותנה התגלגלה לחלוטין על קצה קיסם השיניים. (B) דוגמה לספוגית עיניים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקום ספוגית עין הלחמית של העכבר.
(A)קצה ספוגית העין הרטובה BHI הוכנס, בזווית של 90 מעלות, לפינה המדיאלית של העין השמאלית של עכבר מורדם, מדכא את גלגל העין. (B)הספוגית הועברה לאורך הלחמית תוך שמירה על לחץ קל על העין בתנועה הלוך ושוב, 10 פעמים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מייצגות עבור ספוגית העיניים ולוחות האב.
(A)10 μL של ספוגית עיניים מחוסן מדיה מועשרת היה aliquoted בצד ימין של צלחת אגר הדם מוטה 30 עד 60 מעלות כדי לאפשר למדיה ליצור רצועות בצד שמאל של הצלחת, עשר 10 נקודות μL של המדגם חולק. התצלום של הלוחית הדגירה מראה מושבות בודדות ומגוון מורפולוגי. (B)צלחת הורים של מבודדים נוצרה על ידי בחירת מושבה מלוח ספוגית העין ופסים בתוך אחד הריבועים (רשתות). שלוש מושבות דומות מבחינה מורפולוגית מפוספסות ברשתות נפרדות. לכל רשת יש שלושה פסים של אותה מושבה שנקטפה מלוחית ספוגית עין העכבר. לאחר שהצמיחה הופיעה על הצלחות, האי מבודד התאפיין על ידי ציפוי סלקטיבי ובדיקות קטלאז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמה לתוצאות MS של MALDI-TOF.
כל מבודד היה תרבותי על TSA לילה, מוחל על שקופית MS MALDI-TOF מכוסה עם פתרון MALDI-TOF MS, אוויר מיובש ומנוקד כפול. התוצאות עבור סטרפטוקוקוס אסידומינימוס (A) ו- Aerococcus viridans (B) זוהו באופן חיובי עם ערך ביטחון של 99.9. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צמיחה הלחמית הקומית מוטה המין.
עכברי C57BL6/N תואמי גיל הושוו למגוון יחסי. העיניים נוקו ואורגניזמים קומנסליים זוהו. המין השולט ביותר היה סטרפטוקוקוס אסידומינימוס, אשר היה באופן משמעותי יותר בשפע זכר מאשר עכברים נקבה (2-way ANOVA, p<0.0001). 5 מבודדים שונים של מערכת העצבים המרכזית זוהו, אירוקוקוס וורידנים ואי קולי. בעוד שחלק מהמבודדים של מערכת העצבים המרכזית לא היו קיימים בכל העכברים, סטרפטוקוקוס אסידומינימוס, אירוקוקוס וורידנים, מערכת העצבים המרכזית מבודדים 1 ו- E. coli נמצאו בכל העכברים עם שפע מובהק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל המצב paucibacterial של פני השטח העין, מעבדות רבות התקשו לבודד commensals עינית7,20, וכתוצאה מכך מספר נמוך של דגימות עם צמיחה, שפע נמוך ומגוון נמוך8. שיטה זו משפרת באופן משמעותי על פרקטיקות תרבות סטנדרטיות4,21 על ידי תוספת של צעד העשרה, כמו גם ספוגית עיניים מעוצבת מחדש וזיהוי על ידי MALDI-TOF MS. שלב ההעשרה מטפל ביכולת התאוששות נמוכה על ידיהגברת העומס החיידקי. העלייה המשמעותית בחיידקים הניתנים לשחזור מפחות מ-100 CFUs לשפע היחסי של 2,500 CFUs לכל ספוגית עיניים לעכברים זכרים מסוג בר מרמזת על כך שהדגירה במדיה עשירה בחומרים מזינים ממריצה מחדש חיידקים בני קיימא אך לא ניתנים לעיבוד22,23, ובכך מאפשרת התאוששות של מיקרואורגניזמים רדומים. צעדי העשרה מבוססי תרבות אחרונים שולבו במחקרי רצף מולקולריים של מיקרוביוטה כדי לאפשר אפליה בין חתימות ביטוי מארח ומיקרוביאלי24,25,26, ולהגביר סוגים נדירים. שלב העשרת הפרוטוקולים שלנו הוא הראשון שיוחל על מחקרי מיקרוביום עיניים ומשתמש בהעשרה כדי לבחור מיקרואורגניזמים חיים, להרחיב את מספר המבודדים הנדירים הניתנים לשחזור ואולי להחיות commensals קיימא אך לא cultivable. יתר על כן, שלנו בבית עשה ספוגית עיניים מאפשר ניקוי ממוקד של הלחמית, הפחתת זיהום מן העור שמסביב / פרווה בשל גודלו הקטן וצורתו מחודד דק מחודד. הבחירה של עובי ציפוי ספוגית וחומר חשוב21. מעבדה זו עשויה ספוגית עיניים מצופה שכבה דקה של חבטות כותנה nontoxic, אשר מונע מלכודת commensal מנוקה בתוך החומר ספוגית, כמו גם, להיות עדיף על סידן אלגינט מטליות עיניים אשר יכול להיות ציטוטוקסי27. בדיקות אורך מראות כי השיטה שלנו ניתנת לשחזור; עם החיידקים הדומיננטיים התאוששו ספוגיות עיניים כולל סטרפטוקוקוס spp., קוגולאז סטפילוקוקוס שלילי (מערכת העצבים המרכזית), ו קורינבקטריום spp. תוצאות אלו מסכימות עם ממצאים שפורסמו עבור הסוג העין האנאירובי הפקולטתי הדומיננטי7,9,20 זוהה באמצעות שיטות מבוססות תרבות או מבוססות הדמיה. שיטה זו מצאה קשת רחבה יותר של מבודדים בלחמית, כולל Escherichia coli ו Pseudomonas spp. יתר על כן, הזיהוי על ידי MALDI-TOF MS מאפשר אפליה טובה יותר בין סוגים ומינים, כגון קבוצת viridans של סטרפטוקוצ'י ו Aerococci spp. 19,28.
שלושה שלבים הם קריטיים למקסום התוצאה: ייצור ספוגיות עיניים, טכניקת ספוגית עיניים ובחירת בידוד ייחודית מלוח ספוגית העין. כפי שנדון לעיל, שכבה שטוחה דקה מאוד של כותנה חשובה ללכידה הראשונית של commensals מפני השטח העין, כמו גם לשחרורם לאחר מכן לתוך התקשורת העשרה. ספוגיות עבות או גושיות יכולות להוביל לבחירת מזהמים, כמו גם לשמירה על מבודדים בתוך קצה הספוגית. שנית, דיכאון מתמשך של גלגל העין בזמן ההיתוך יש צורך למזער את הזיהום מהמשטחים שמסביב. טכניקת הסנאבק האידיאלית כרוכה בהחדרת ספוגית תקינה (90 מעלות) לתוך הלחמית הנחותה המדיאלית ולחץ סנפלינג יציב בשילוב עם תנועה רציפה איטית. לבסוף, צלחת ספוגית העין חייבת להיות מנוטרת מדי יום כדי לבחור עבור מבודדים שהופיעו לאחרונה או אלה הגדלים בקצב שונה על מנת ללכוד באופן מלא את המיקרוביום הייצוגי.
קיימות מספר מגבלות פרוטוקול שניתן לטפל בהן מתוך הבנה ברורה של התוצאות או השינוי של הפרוטוקול. התוצאות הן מדד לשפע קומנסלי בר קיימא יחסית, ולא נטל חיידקי הלחמית הלחמית בפועל, במטרה להגדיר את הקהילה העין. השפע היחסי והמגוון שימשו במחקרים שלנו למטרות השוואתיות בקרטיטיס חיידקית, כמו גם, כדי לחקור את התגובה החיסונית המולדת בעכברים מסוג נוקאאוט ופראי12. בנוסף, זיהוי על ידי MALDI-TOF MS תלוי במסד נתונים משמעותי28, מתן תוצאה של "אין מזהה" עבור פרופילי ספקטרום לבודד לא ידוע, המדגיש את החשיבות של שימוש במסד נתונים נוכחי. לבסוף, פרוטוקול זה מזהה רק חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים, אך המסגרת שלו ניתנת להתאמה וניתן לבנות עליה כדי לסייע בהגדרת המרחב המיקרוביאלי העין על ידי שינוי של מדיית העשרה, תנאי צמיחת צלחת ומדיום בחירה. על ידי שינוי צלחת האב ותנאי הצמיחה העשרה כדי אנאירובי, אז עוד קומנסל עיני מבודד בדרך כלל, Propionibacterium spp. או anaerobes אחרים, עשוי להתגלות; אמנם, בידיים שלנו ראינו כמעט שום צמיחה אנאירובית.
אולי, מסגרת זו עשויה לשמש בשילוב עם טכניקות רצף DNA עמוק. משוכה מרכזית בזיהוי חיידקים באמצעות רצף DNA היא חוסר היכולת להעריך את הכדאיות10. פרוטוקול זה עשוי לספק שיטה אורתוגונלית על-ידי שינוי מדיית העשרה ותנאי ציפוי כך שיתאימו לקריטריוני הצמיחה המועדפים של מבודד מועמד (המזוהה על-ידי רצף DNA). זה עלול לגרום לגישה מבוססת תרבות יקרת ערך כדי ללכוד commensals מחיידקים קיימא אך unultivatable או מינים נוכחים אך בשפע נמוך.
ההגדרה של קהילת העין העין בת קיימא חיונית לבחינת פרופיל הביטוי העין. מחקרים נרחבים מראים כי חומצות שומן קצרות שרשרת ומוצרים מיקרוביאליים לווסת את התגובה החיסונית העין3,29,30,31,32,33, וכי הפעולה שלהם מתרחשת באופן מקומי. זה מרמז כי לא רק ייצור דיסטלי, אבל הייצור המקומי של גורמים אלה חשוב. כמו כן, מצבי מחלה כגון מחלת עיניים יבשות וסוכרת לשנות את המיקרוביום פני השטח העין4,6,33,34. זה מדגיש את הצורך בשיטה המגשרת על רצף מבוסס DNA, כמו גם גישות מבוססות תרבות כך מיקרוביום העין קיימא בבריאות ומחלות יכול להיות מוגדר טוב יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מימון P30 DK034854 נתמך VY, LB ומחקרים במרכז המארח-מיקרוביום של מסצ'וסטס ומימון מ NIH / NEI R01 EY022054 נתמך MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
