Summary
Presenteras här är ett protokoll för isolering och förstärkning av aeroba och facultative anaeroba mus konjunktival kommensala bakterier med hjälp av en unik öga svabba och kultur-baserade anrikning steg med efterföljande identifiering av mikrobiologiska baserade metoder och MALDI-TOF massa spektrometri.
Abstract
Okulär ytan ansågs en gång immun privilegierad och abiotisk, men nyligen verkar det som om det finns en liten, men ihållande commensal närvaro. Identifiering och övervakning av bakteriearter vid okulär slemhinnan har varit utmanande på grund av deras låga överflöd och begränsade tillgänglighet av lämplig metodik för kommensal tillväxt och identifiering. Det finns två standardmetoder: kulturbaserade eller DNA-sekvenseringsmetoder. Den första metoden är problematisk på grund av de begränsade återvinningsbara bakterierna och det andra tillvägagångssättet identifierar både levande och döda bakterier som leder till en avvikande representation av det okulära utrymmet. Vi utvecklade en robust och känslig metod för bakteriell isolering genom att bygga vidare på standard mikrobiologiska odlingstekniker. Detta är en svabbbaserad teknik, med hjälp av en "in-lab" gjord tunn svabb som riktar sig mot den nedre bindhinnan, följt av ett förstärkningssteg för aeroba och fakultativa anaeroba släkten. Detta protokoll har gjort det möjligt för oss att isolera och identifiera konjunktival arter såsom Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. Tillvägagångssättet är lämpligt för att definiera kommensal mångfald hos möss under olika sjukdomsförhållanden.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att förbättra specifik isolering av livskraftiga och sällsynta aeroba och facultative anaeroba mikrober från okulär bindhinnan att karakterisera okulär microbiome. Omfattande studier har profilerat commensal slemhinnor på huden, tarmen, luftvägarna och könsorganen och visar att dessa samhällen påverkar utvecklingen av immunsystemet ochsvar 1,2,3. Okulär commensal samhällen har visat sig förändras under vissa sjukdom patologier, såsom Torra ögonsjukdom 4, Sjögrens syndrom5 och diabetes6. Ändå hämmas förmågan att definiera en typisk okulär yta commensal gemenskap av deras relativt låga överflöd jämfört med de andra slemhinnor6,7,8. Detta leder till en kontrovers om huruvida det finns ett resident okulärt mikrobiom och om det finns, om det skiljer sig från hudens mikrobiom och följaktligen dess lokala effekt på det medfödda immunsystemets utveckling och svar. Det här protokollet kan hjälpa till att lösa den här frågan.
I allmänhet är metoder för att definiera den okulära commensal nischen baserade på sekvensering och kulturbaserade tekniker4,7,9. 16 S rDNA-sekvensering och BRISK-analys7 visar en bredare mångfald än kulturbaserade tekniker, men kan inte skilja mellan levande och döda mikrober. Eftersom den okulära ytan är fientlig mot många mikrober på grund av att tårfilmens antimikrobiellaegenskaper 4 genererar ett stort antal DNA-fragment, kommer DNA-baserade metoder att upptäcka dessa artefakter som kan skeva data mot identifiering av döda bakterier som bosatta commensals snarare än föroreningar. Detta resulterar i avvikande kommensal identifiering och karakterisering av det okulära utrymmet som högre i mikrob överflöd och mångfald10. Detta gör det svårt att definiera det bosatta okulära mikrobiomet via DNA-baserade metoder. Standardkulturbaserade tekniker kan inte upptäcka commensals eftersom belastningen är för låg11. Vår metod förbättrar standardpraxis genom att använda en tunn svabb som kan rikta in sig på bindhinnan, vilket undviker förorening från närliggande hud, liksom konceptet att livskraftiga organismer kan berikas av kort kultur i näringsrika täta medier med målet att återuppliva livskraftiga men icke-odlingsbara, liksom berikande för sällsynta livskraftiga mikrober.
Resultaten, relativa överflöd av okulär commensals per öga svabb, karakterisera bindhinnan bosatta mikrobiom och är viktiga för jämförande ändamål. Våra data visar att det finns en skillnad mellan hud och konjunktival mikrobiota, liksom större mångfald med ökad ålder och en könsspecifik skillnad i överflöd. Dessutom har detta tillvägagångssätt reproducerbart funnit kommensala skillnader i knockout möss12. Detta protokoll kan tillämpas för att beskriva okulär mikrobiom som kan variera på grund av lokaliseringsmetoder, geografi eller sjukdomstillstånd, liksom de lokala effekterna av kommensala metaboliter och produkter på immunsystemets utveckling och svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar möss följer riktlinjerna från kommittén för institutionell djurvård och användning. Följ laboratoriesäkerhetsriktlinjerna (enligt din institutionella miljöhälso- och säkerhetsavdelning) när du arbetar med mikroorganismer och potentiellt förorenade material. Använd lämpliga avfallsbehållare och saneringsförfaranden innan potentiellt biologiskt förorenade material bortskaffas.
1. Förberedelse av ögonsvabb, arbetsfältsuppsättning, ögonsvabbning och provberikning
- Förbered sterila ögonvabbar
OBS: Sterila ögonsvabbar är tunt belagda trätandpetare med ett fibertunt lager bomullsslag och gjorda i huset.- Autoklav lämplig mängd bomullsslag och tandpetare för antal möss som ska swabbed.
- Nyp av en halv centimeter lång bomullsbit med tumme och pekfinger. Reta ut slag genom att dra i kanterna med tummar och pekfingrar för att bilda ett platt enda poröst lager, stoppa strax innan slagningen faller isär (små bitar av bomull spridda över hela den sträckta slagningen är acceptabla).
- Snurra slagningen runt en av tandpetarens vassa ändar genom att lätt hålla den utsträckta biten på tandpetarspetsen när den är vriden, se figur 1. Den "färdiga" ögonpinnen kommer att ha ett mycket tunt lager bomull sträckt över spetsen och sträcker sig ungefär en halv till en centimeter från spetsen.
- Sätt in "färdiga" svabbprover i små bägare, svabbsidan nedåt och täck. autoklav.
- Konfigurera arbetsytan
- Förbered anestesi som innehåller 2 ml ketamin (100 mg/ml), 400 μL xyzin (100 mg/ml) och 27,6 ml sterilt saltlösning (0,9 % NaCl i dH2O) i ett sterilt sterilt centrifugerör på 50 ml. Filtrera sterilisera och alikvotestesi för omedelbar användning (kan förvaras vid 4 °C i 1 månad, låt alltid ekvilibreras till rumstemperatur före användning).
- Rensa och rengör arbetsområdet med desinfektionsmedel för att minimera kontaminering.
- Alikvot 0,5 ml sterilt hjärnhjärtainfusionsmedier (BHI) till märkta 1,5 ml sterila mikrocentrifugrör (1 rör per mus och kontroll). ordna i microcentrifuge rack. Ställ hyllan på is.
- Ställ in arbetsflödet enligt följande (från vänster till höger): musbedövande station (bur som innehåller experimentella möss, tom steril bur, rumstemperaturbedövning, 25 G nål och 1 ml spruta), ögonsvabbstation (alikvoterad BHI på is, steriliserade ögonvabbar, rena pappershanddukar, 70% isopropanolspray) och pläteringsstation (rumstemperatur blodagarplattor, 10 μL pipette , 10 μL sterila engångsspetsar, behållare för biologiskt avfall).
- Ögonsvabbning
- Administrera 10 μL anestesi per 1 g musviktsdosering av ketamin respektive xylazin intraperitoneally till varje vuxen mus och placera i en autoklaverad bur. Testa bedövning genom att klämma bakfotsdyna; ingen rörelse indikerar lämplig bedövning.
- Tilldela en hand för att endast hantera sövd möss och den andra handen för att bara hantera ögonvabben och kulturen. För swabbing, ta bort den helt sövd musen från buret; placera ovanpå ren arbetsyta placerad på sidan med vänster öga exponerat. Sprayhandskehandskehänder med isopropanol, torka med ren pappershandduk.
- Uncap specifikt märkt BHI mikrocentrifugrör med dedikerad mediahanteringshand. Placera tillbaka röret i mikrocentrifugstället på is. Doppa ögonpinnen i BHI: s bomullsbelagda spets, dra ut ögonpinnen från röret som virvlar spetsen 2 gånger mot det inre röret för att avlägsna överflödig vätska.
- Håll försiktigt musen i nacken med mushanteringshanden. Med den andra handen, placera ögonspetsen mot den mediala konjunktivalregionen på vänster öga, se figur 2A. Tryck lätt in ögongloben och flytta svabbpinnen i en fönstertvättrörelse (Bild 2B) fram och tillbaka, mellan det nedre ögonlocket och ögat, 10 gånger. Håll konstant tryck.
- Utan att vidröra pälsen, ta försiktigt bort spetsen av svabbpinnen, vinkelrätt mot var den sattes in, och placera bomullssidan direkt i ett märkt mikrocentrifugerrör som innehåller BHI-media. Applicera ett smörjande ögondroppe på det svabbade ögat.
- Sätt tillbaka musen i buret.
- Låt svabbpinnen stå i 10 till 15 minuter på is och ta bort ögonpinnen med den steriliserade handsken genom att blanda spetsen i media i 10 rotationer. Dra ut svabbpinnen genom att virvla spetsen mot mikrocentrifugrörets innervägg för 5 rotationer. Kassera svabbprovet i biohazardbehållaren.
- Upprepa steg 1.3.2 till 1.3.7 för varje mus och för kontrollprover (hud- eller pälspinne). Sterilisera handskarna på lämpligt sätt mellan varje svabbprov.
- anrikning
- Berika provet genom att inkubera röret statiskt i 1 timme vid 37 °C
- Under inkubation, etikett en rumstemperatur Trypticase Soja med 5% fårblod agar tallrik (TSA tallrik) per mus och dela i hälften.
- Efter inkubation av ögonsvabbkultur, ta bort berikade prover från inkubatorn och placera på is.
- Kort virvla prover att blanda och plätera enligt schemat i figur 3A. Alikvot 10 μL av provet på TSA-plattan och luta plattan för att bilda en remsa, upprepa 2 gånger.
- På andra sidan av plattans skiljelinje, pricka 10 μL prov på agar, upprepa 9 gånger.
- Inkubera plattor vid 37 °C i 18 timmar, 2 dagar och 4 dagar (i en ren kammare som förhindrar att agarplattor torkar). Räkna kolonier i remsor, notera morfologi och beräkna kolonibildande enheter (CFUs) per svabbprov för morfologiskt liknande isolat. Titta på prickar för unika organismer som inte fångas i remsor.
2. Huvudplatta, karakterisering och identifiering av okulära mikrober
-
Huvudplatta
- Dra galler på baksidan av en TSA-platta (Figur 3B). Välj en koloni med en steril tandpetare från varje musögonsvabbplatta och strimma master plate square (galler), etikettgaller med koloninummer och musinformation. Plocka och plätera tre olika kolonier för varje morfologiskt distinkt koloni.
- Inkubera plattan över natten vid 37 °C. Fortsätt inkubation i 96 timmar, kontrollera dagligen för utseendet på nya isolat.
OBS: Commensal-befolkningen kommer att variera beroende på musålder, näring, sjukdomstillstånd och kärlksel. Isolera karakterisering är baserad på de dominerande aeroba och fakultativa anaeroba bakterierna som finns i vårt laboratorium.
-
karakterisering
- Duplicera 13 tallriksmikrober på Mannitol Salt Agar (MSA) och MacConkey (MAC) plattor, inkubera över natten vid 37 °C. Observera tillväxt för varje isolat och närvaro av vaxartade kolonier eller gula kolonier med halo på MSA.
- För Grampositiva koccia, testa med katalastestet13,14. Placera en droppe av 3% väteperoxid på en ren glasrutschbana. Använd en steril tandpetare och välj motsvarande mikrob från ögonpinneplattan. Ingen bubbelbildning indikerar Streptococcus spp., liten bubbelbildning indikerar Corynebacterium spp. och kanske Aerococcus spp. och snabb bubbelbildning indikerar Staphylococcus spp.
-
Identifiering: MALDI-TOF MS-analys
OBS: Bakteriella identifieringar utförs med hjälp av MALD-TOF och programvarudatabasen. Detta system använder matris-assisterad laser desorption jonisering-tid för flygning massa spektrometri (MALDI-TOF MS) för att utveckla spektra profiler som jämförs med kända bakteriell spektra för identifiering. E.coli, ATCC 8739, används för systemkalibrering.- Plåtbakterier isoleras på TSA-plattor som innehåller 5% fårblod och inkuberar över natten med 5% koldioxid vid 37 °C.
- Använd en 1 μL-slinga och applicera ett tunt lager av de rena bakterierna på målbilden MALD-TOF. 1 μL MALDI-TOF MS CHCA matrislösning (alfa-cyano-4-hydroxycinnamic syra) överlagras och får lufttorka helt innan glidningen laddas in i instrumentet MALD-TOF.
- Varje isolat upptäcks i duplicerat.
- Rapporter som innehåller sannolikhetspoäng som är större än 80%, vilket indikerar ett högt diskrimineringsvärde, accepteras som tillförlitliga resultat och bakteriell identifiering accepteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat för en ögonvabbplatta som visar olika metoder för plätering visas i figur 3A som visar morfologiskt olika isolat från C57BL/6 mus. För varje distinkt isolate räknades kolonierna i remsan och det relativa överflöd, unika koloniformningsenheter (CFUs) per ögonvabb, beräknade och plottade för jämförelseändamål. För mikrobiologisk karakterisering plockades bakterier från enskilda mus öga svabbplattor för att producera en master TSA platta (skapas genom att plocka morfologiskt distinkta isolat i triplicate från varje mus öga svabbplatta). Från huvudplattan, på den efterföljande dagen eller när tillväxt visas, gjordes ytterligare tester för att karakterisera eller identifiera mikroberna. Huvudplattan användes för att ge tillräckligt med inokulat för att expandera respektive isolat.
Arten karakteriserades med hjälp av mikrobiologiska tekniker och identifierades sedan av MALDI-TOF MS-analys. Varje isolat från huvudplattan testades med katalastest13,14 och odlades på selektiva medier. Eftersom de dominerande mikroberna i våra studier är Streptococcus spp., Staphylococcus spp. och Corneybacterium spp., Mannitol Salt Agar (MSA) och Mac Conkey Agar (MAC) användes som selektiv agar13. Tillväxt på Mannitol Salt Agar indikerar Staphylococcus spp13,16. Eftersom MSA innehåller fenolrött indikerar en gul halo runt kolonin mannitolfermentering och klassificering som Staphylococcus aureus (bekräfta med alternativa tester som Coagulase test)13. Tillväxt på MacConkey agar indikerar Gram negativa bakterier, eftersom gallsalter och kristallviolett kan överträda bakteriemembranet och hämma Gram positiv bakterietillväxt13. Vaxartad tillväxt på MSA indikerar produktionen av mykolicsyra och kan bero på organismer som Corneybacterium spp13. Slutligen skiljer katalastestet Streptococcus spp. från Staphylococcus spp13,16, och i vissa fall kan ett svagt positivt test indikera Aerococcus spp15.
För att identifiera isolat, en TSA platta var streaked och inkuberade över natten i en 5% koldioxid och 37 °C miljö och MALDI-TOF MS utförs. Figur 4 visar resultaten S. acidominimus (en medlem av viridaner Streptococcus spp. 17) och A. viridaner. Ofta Aerococcus spp. är felidentifierade som viridangruppen av streptokocker18,19, baserat på biokemiska och fenotypiska tester. MALDI-TOF MS kunde identifiera isolat med en konfidensnivå på 99,9 utan oidentifierbara arter.
Könsfördomar kan observeras i figur 5, där signifikant olika nivåer av kommensala organismer återfanns från manliga och kvinnliga C57BL/6 möss. Det relativa överflöd för varje isolat fastställdes. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans och coagulase negativ staphylococcus(CNS)isolerar #1 och E. coli spp. hittades hos alla möss, där hanarna visade högre relativ överflöd och större mångfald.
Bild 1: In-house eye swab.
A) En tunn, ca 1 cm, bit dragen bomullsslag hölls mellan den sterila tandpetarpunkten och pekfingret och tandpetaren rullades samtidigt som det bibehåller ett litet tryck mot pekfingret tills bomullen rullades helt på tandpetarspetsen. B)Exempel på en ögonvabb. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Muskonjunktival ögonsvabb placering.
BHI:sspets för vått öga sattes i 90°-vinkel in i det mediala hörnet av vänster öga på en bedövad mus och deprimerade ögongloben. B)Svabbpinnen flyttades längs bindhinnan samtidigt som det höll ett litet tryck på ögat i en fram och tillbaka rörelse, 10 gånger. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa resultat för ögonvabben och huvudplattorna.
A)10 μL ögonvabb inokulerat berikat medium alikvoterades på höger sida av blodagarplattan och lutade 30 till 60 grader för att mediet skulle kunna bilda remsor och på vänster sida av plattan delades tio 10 μL prickar av provet ut. Fotografiet av den inkuberade plattan visar enskilda kolonier och morfologisk mångfald. B)En huvudplatta med isolat skapades genom att plocka en koloni från ögonpinneplattan och strimma inom en av rutorna (gallret). Tre morfologiskt likartade kolonier är streckade i separata galler. Varje rutnät har tre streck av samma koloni som plockades från musens ögonvabbplatta. Efter tillväxt uppträdde på plattorna, kännetecknades isolatet av selektiv plätering och katalas testning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Exempel på resultat från MALD-TOF MS.
Varje isolat odlades på TSA över natten, applicerades på MALDI-TOF MS slide och överlagrade med MALDI-TOF MS lösning, luft torkad och upptäckt i duplikat. Resultaten för Streptococcus acidominimus (A) och Aerococcus viridans (B) identifierades positivt med ett konfidensvärde på 99,9. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Könsfördomsfull kommensal konjunktiv tillväxt.
Åldersmatchade C57BL6/N möss jämfördes för relativ kommensal mångfald. Ögonen var swabbed och commensal organismer identifierades. Den mest dominerande arten var Streptococcus acidominimus, som var betydligt rikligare hos handjur än honmöss (2-vägs ANOVA, p<0.0001). 5 olika CNS-isolat identifierades, Aerococcus viridans och E.coli. Medan några av CNS-isolat inte fanns i alla möss, streptokocker acidominimus, Aerococcus viridans, CNS isolera 1, och E. coli hittades i alla möss med distinkt överflöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av den okulära ytans paucibacterial tillstånd har många laboratorier haft svårt att isolera okulär commensals7,20, vilket resulterar i lågt antal prover med tillväxt, lågt överflöd och låg mångfald8. Denna metod förbättrar avsevärt standardkulturpraxis4,21 genom att lägga till ett anrikningssteg, samt en omdesignad ögonvabb och identifiering av MALDI-TOF MS. Anrikningssteget adresserar låg återvinningsförmåga genom att förstärka bakteriebelastningen. Den betydande ökningen av återvinningsbara bakterier från mindre än 100 CFUs till det relativa överflöd av 2 500 CFUs per ögonvabb för vilda manliga möss tyder på att inkubation i näringsrika medier återupplivar livskraftiga men icke-odlingsbara bakterier22,23, vilket möjliggör återhämtning av vilande mikrober. De senaste kulturbaserade anrikningsstegen har införlivats i mikrobiotamolekylära sekvenseringsstudier för att möjliggöra diskriminering mellan värd- och mikrobiella uttryckssignaturer24,25,26, och för att förstärka sällsynta släkten. Vårt protokoll anrikningssteg är det första som tillämpas på okulär mikrobiom studier och använder anrikning för att välja levande mikrober, utöka antalet återvinningsbara knappa isolat och kanske återuppliva livskraftiga men icke-odlingsbara commensals. Dessutom tillåter vår in house made eye swab riktad swabbing av bindhinnan, vilket minskar förorening från omgivande hud / päls på grund av dess lilla storlek och tunna spetsiga avsmalnande form. Valet av svabbbeläggningstjocklek och material är viktigt21. Detta laboratorium gjorde ögonvabb är belagt med ett tunt lager av icke-oxisk bomullsslag, vilket förhindrar swabbed commensal entrapment inom svabbmaterialet, samt att föredra framför kalciumalginat ögonsvabbar som kan vara cytoxiska27. Longitudinella tester visar att vår metod är reproducerbar; med de dominerande bakterierna återhämtade sig från ögonvabbar inklusive Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) och Corynebacterium spp. Dessa resultat överensstämma med publicerade resultat för dominerande fakultet anaeroba okulär genera7,9,20 upptäckt via kulturbaserade eller bildbaserade metoder. Denna metod har hittat ett bredare spektrum av isolat i bindhinnan, inklusive Escherichia coli och Pseudomonas spp. Dessutom möjliggör identifieringen av MALDI-TOF MS bättre diskriminering mellan släkten och arter, såsom viridansgruppen av streptokocker och Aerococci spp. 19,28.
Tre steg är avgörande för att maximera resultatet: ögonvabbtillverkning, ögonvabbteknik och unikt isolatval från ögonvabbplattan. Som diskuterats ovan är ett mycket tunt platt lager bomull viktigt för den första fångsten av commensals från den okulära ytan samt för deras efterföljande frisättning i anrikningsmedierna. Tjocka eller knöliga svabbprover kan leda till val av föroreningar, samt behålla isolat i svabbspetsen. För det andra är kontinuerlig fördjupning av ögongloben medan swabbing är nödvändig för att minimera förorening från omgivande ytor. Den idealiska swabbing tekniken innebär normala (90 grader) införandet av svabbprovet i den mediala sämre konjunktival fornix och stadig swabbing tryck i kombination med långsam kontinuerlig rörelse. Slutligen måste ögonpinneplattan övervakas dagligen för att välja för nyupptäckta isolat eller de som växer i en annan takt för att helt fånga det representativa mikrobiomet.
Det finns några protokollbegränsningar som kan åtgärdas med en tydlig förståelse för protokollets resultat eller ändring. Resultaten är ett mått på relativt livskraftiga kommensala överflöd, och inte faktisk konjunktival bakteriell börda, i syfte att definiera okulär commensal samhället. Det relativa överflöd och mångfald har använts i våra studier för jämförande ändamål i bakteriell keratit, liksom för att undersöka det medfödda immunsvaret vid knockout och vilda mösstyp 12. Dessutom är identifiering av MALDI-TOF MS beroende av en betydande databas28, vilket ger ett resultat av "inget ID" för okända isolatspektraprofiler, vilket belyser vikten av att använda en aktuell databas. Slutligen upptäcker detta protokoll endast aeroba och fakultativa anaeroba bakterier, men dess ramverk är anpassningsbart och kan byggas på för att hjälpa till att definiera det okulära mikrobiella utrymmet genom modifiering av anrikningsmedier, plåttillväxtförhållanden och urvalsmedium. Genom att ändra masterplattan och anrikningstillväxtförhållandena till anaeroba, kan en annan ofta isolerad okulär commensal, Propionibacterium spp. eller andra anaerober, detekteras; även om vi i våra händer såg nästan ingen anaerob tillväxt.
Kanske kan denna ram användas tillsammans med djupa DNA-sekvenseringstekniker. Ett stort hinder för mikrobidentifiering via DNA-sekvensering är oförmågan att bedöma livskraft10. Detta protokoll kan tillhandahålla en orthogonal metod genom att ändra anrikningsmedier och plätering villkor för att matcha en kandidat isolates (identifieras av DNA sekvensering) föredragna tillväxt kriterier. Detta kan resultera i en värdefull kulturbaserad metod för att fånga kommensaler från livskraftiga men okultivata bakterier eller nuvarande men låga överflödsarter.
Definition av den livskraftiga okulär commensal gemenskapen är avgörande för att undersöka okulär commensal uttryck profil. Bred forskning tyder på att korta kedja fettsyror och mikrobiella produkter modulerar okulär immunsvar3,29,30,31,32,33, och att deras verkan sker lokalt. Detta tyder på att det inte bara är distala produktion, utan att lokal produktion av dessa faktorer är viktig. Sjukdomsstater som torr ögonsjukdom och diabetes förändrar också okulär yta mikrobiom4,6,33,34. Detta belyser behovet av en metod som överbryggar DNA-baserad sekvensering samt kulturbaserade metoder så att det livskraftiga okulära mikrobiomet i hälsa och sjukdom kan definieras bättre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering från P30 DK034854 stödde VY, LB och studier i Massachusetts Host-Microbiome Center och finansiering från NIH / NEI R01 EY022054 stödde MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
