Summary
ここでは、微生物学的手法とMALDI-TOF質量分析によるその後の同定を用いたユニークな眼綿棒および培養ベースの濃縮ステップを用いた有酸素性および気性嫌気性マウスの結合性のコンメンサルト菌の分離と増幅のためのプロトコルを提示する。
Abstract
眼表面はかつて免疫特権と非生物性と考えられていたが、最近では小さいが持続的な経常存在があるように見える。眼粘膜における細菌種の同定とモニタリングは、その存在量が少なく、産経的成長と同定のための適切な方法論の利用可能性が限られているため、困難であった。培養法とDNAシーケンシング法の2つの標準的なアプローチがあります。第1の方法は、限られた回収可能な細菌のために問題であり、第2のアプローチは、眼空間の異常な表現につながる生きている細菌と死んだ細菌の両方を識別する。標準的な微生物培養技術を基に、細菌の分離のための堅牢で高感度な方法を開発しました。これは、下の結膜を標的とする「ラボ内」製の薄い綿棒を利用した綿棒ベースの技術であり、続いて有酸素性および好気性嫌気性性の生殖器の増幅ステップを利用する。このプロトコルは、 コリネバクテリウムspp.、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌spp.、ストレプトコッカス属などの結膜種を分離し、同定することを可能にしました。このアプローチは、異なる疾患条件下でのマウスの男性の多様性を定義するのに適している。
Introduction
このプロトコルの目的は、眼のマイクロバイオームを特徴付けるために、眼結膜から実行可能でまれな有酸素性および気性嫌気性微生物の特異的な分離を強化することである。広範な研究は、皮膚、腸、呼吸器および生殖管上の経経膜粘膜群集をプロファイリングし、これらのコミュニティが免疫系および応答1、2、3の発達に影響を及ぼすことを示している。眼部の男性群は、ドライアイ病4、シェーグレン症候群5および糖尿病6などの特定の疾患病態の間に変化することが示されている。しかし、典型的な眼表面の連動性共同体を定義する能力は、他の粘膜部位6、7、8と比較して比較的少ない存在によって妨げられている。これは、常駐眼マイクロバイオームがあるかどうか、それが存在する場合、それが皮膚マイクロバイオームと異なるかどうか、そして結果的に、自然免疫系の発達と応答に対する局所的な影響があるかどうかについての論争を促す。このプロトコルは、この問題を解決するのに役立ちます。
一般に、連視ニッチを定義するアプローチは、シーケンシングと文化ベースの技術4、7、9に基づいています。16 S rDNAシーケンシングおよびBRISK分析7は、培養ベースの技術よりも広い多様性を示すが、生きた微生物と死んだ微生物を区別することができない。眼表面は、大量のDNA断片を生成する涙膜の抗菌特性4のために多くの微生物に敵対しているため、DNAベースのアプローチは、汚染物質ではなく常駐的な汚染物質として死んだ細菌の同定に向けてデータを歪める可能性のあるこれらのアーティファクトを検出します。これは、微生物の存在量および多様性10においてより高いとして眼空間の異常な分別識別および特徴付けをもたらす。これにより、DNAベースの方法を介して常駐眼マイクロバイオームを定義することが困難になります。一方、標準的な文化ベースの技術は、負荷が低すぎるため、コメンサルを検出することができません11.我々の方法は、結膜を標的とすることができる薄い綿棒を使用して、近隣の皮膚からの汚染を避けることによって、ならびに実行可能な生物が生存可能であるが非カルト的な、ならびに希少生存微生物を豊かにすることを目的に、栄養密度の高い培地の短い培養によって豊かにすることができるという概念を使用することによって、標準的な慣行を改善する。
結果は、眼綿棒あたりの眼のコメンの相対的な豊富さ、結膜の常駐微生物叢を特徴付け、比較目的のために重要である。我々のデータは、皮膚と結膜微生物叢の間に違いがあり、年齢の増加と性別固有の豊富な違いと共に多様性が高いことを示している。さらに、このアプローチは、ノックアウトマウス12における因果的な違いを再現的に発見した。このプロトコルは、ケージの慣行、地理、または疾患状態、および免疫系の発達および応答に対するコメンサル代謝産物および産物の局所的影響によって異なる可能性のある眼マイクロバイオームを記述するために適用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
マウスを含むすべての手順は、制度的動物ケアと使用委員会のガイドラインに従います。微生物や汚染される可能性のある材料を扱う際には、(お客様の機関環境安全衛生部門が指示する)実験室の安全ガイドラインに従ってください。バイオハザード汚染材料の廃棄前に、適切な廃棄物容器と除染手順を使用してください。
1.アイスワブの準備、作業場のセットアップ、マウスの目のスワッピングとサンプル濃縮
- 滅菌眼綿棒を準備する
注:滅菌眼綿棒は、綿のバッティングの繊維薄い層で薄くコーティングされた木製のつまようじで、家で作られています。- 綿棒と爪楊枝の適切な量を切り取るマウスの数を振り回します。
- 親指と人差し指で綿のバッティングの半分のセンチメートルの部分をつまみます。親指と人差し指で端を引っ張ってバッティングをいじめて平らな単一の多孔質層を形成し、バッティングがばらばらになる直前に停止します(伸びたバッティング全体に分散した綿の小さなビットは許容されます)。
- 爪楊枝の鋭い端の1つの周りにバッティングを回し、爪楊枝の先端に伸ばした部分をねじったまま軽く持ち続けて、 図1を参照してください。「完成した」アイ綿棒は、先端の上に伸ばされた綿の非常に薄い層を持ち、先端から約半分から1センチメートル離れています。
- 小さなビーカー、綿棒側を下にしてカバーに「完了」綿棒を挿入します。オートクレーブ。
- ワークスペースを設定する
- 2 mLのケタミン(100 mg/mL)、400 μLのキシラジン(100 mg/ml)、滅菌生理食い(0.9% NaCl in dH2O)を無菌50 mLの無菌遠心分離チューブに含む麻酔を調製します。フィルター滅菌とアリコート麻酔を即時使用(4°Cで1ヶ月間保存してもよいが、常に使用前に室温に平衡化可能)
- 汚染を最小限に抑えるために、消毒剤で作業領域をクリアして清掃してください。
- アリコート 0.5 mL の無菌脳心臓注入培地 (BHI) ラベル付け 1.5 mL 無菌マイクロ遠心チューブ (1 本のマウスおよびコントロール);マイクロ遠心分離ラックに配置します。ラックを氷の上に置く。
- 作業フローを次のように設定する(左から右へ):マウス麻酔ステーション(実験マウス、空の滅菌ケージ、室温麻酔、25G針、1mLシリンジを含むケージ)、アイスワッピングステーション(氷上のBHI、滅菌されたアイ綿棒、きれいなペーパータオル、70%イソプロパノール)とメッキステーション(室温10、10 μLの無菌使い捨てチップ、バイオハザード廃棄物容器)。
- 目のスワッピング
- ケタミンおよびキシラジンのマウス重量投与量1g当たり10μLの麻酔を各成体マウスにそれぞれ腹腔内投与し、オートクレーブケージに入れる。後足パッドを絞ることによって麻酔をテストする;動きがない場合、適切な麻酔を示さない。
- 一方の手は麻酔付きマウスのみを扱い、もう一方の手は目の綿棒と培養のみを処理するように割り当てます。スワッピングの場合は、完全に麻酔をしたマウスをケージから取り出します。左目を露出させた状態で、その側面に配置されたきれいな作業面の上に置きます。手袋をした手にイソプロパノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで乾かします。
- アンキャップは専用の媒体処理手が付いているBHIマイクロ遠心分離管を特にラベル付けした。チューブを氷の上のマイクロ遠心分離器ラックに戻します。 BHIで目の綿状の先端を浸し、余分な液体を取り除くために、内側のチューブに対して2回旋回するチューブから目の綿棒を引き出す。
- マウスハンドで、首の擦り傷でマウスをそっと握りしめる。一方、左目の内側結膜領域に対して、目の先端の綿棒を置いて、 図2Aを参照してください。眼球を軽く押し下げ、窓の洗浄動作(図2B)でスワブを上下に、下まぶたと目の間で10回動かす。一定の圧力を維持します。
- 毛皮に触れることなく、綿棒の先端を挿入した場所に垂直にそっと取り除き、BHI培地を含むラベル付きのマイクロ遠心分離チューブに綿綿を直接下に置きます。スワッピングアイに潤滑アイドロップを適用します。
- マウスをケージに戻します。
- 綿棒を氷の上に10〜15分間放置し、10回転のためにメディアに先端を混合することによって、滅菌された手袋をした手で目の綿棒を取り除きます。5回転のためのマイクロ遠心分離管の内壁に対して渦巻く先端によって綿棒を引き出す。バイオハザード容器に綿棒を処分する。
- 各マウスとコントロールサンプル(スキンまたはファースワブ)に対して、手順1.3.2~1.3.7を繰り返します。各綿棒の間に手袋を適切に殺菌する。
- 濃縮
- 37°Cで1時間静かにチューブをインキュベートしてサンプルを濃縮
- インキュベーション中に、1匹のマウスにつき5%の羊の血寒天プレート(TSAプレート)で1つの室温トリプティケース大豆をラベル付けし、半分に分けます。
- 目の綿棒培養後、濃縮サンプルをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。
- 図3Aの回路図に従って混合およびプレートする渦サンプルを簡単に説明します。サンプルのアリコート10μLをTSAプレートに傾け、プレートを傾けてストリップを形成し、2回繰り返します。
- プレートの分割線の反対側に、寒天上のサンプルのドット10 μL、9回繰り返します。
- 37°Cでプレートを18時間、2日間、4日間インキュベートします(寒天プレートの乾燥を防ぐクリーンチャンバー内)。ストリップ内のコロニーを数え、形態に注意し、形態学的に類似した分離物のための綿棒当たりのコロニー形成単位(CFUs)を計算する。ストリップで捕獲されていないユニークな生物のためのドットを見てください。
2. マスタープレート、特徴付け、および眼内微生物の同定
-
マスタープレート
- TSA プレートの背面にグリッドを描画します (図 3B)。各マウスの目の綿棒プレートから滅菌爪楊枝でコロニーを選び、マスタープレートスクエア(グリッド)、コロニー番号とマウス情報を持つラベルグリッドをストリーク。各形態学的に異なるコロニーのための3つの異なるコロニーを選んでプレートします。
- プレートを一晩37°Cでインキュベートする。 新しい分離物の出現を毎日チェックし、96時間インキュベーションを続けます。
注:コメンサルの人口は、マウスの年齢、栄養、病気の状態およびケージの慣行に基づいて異なります。分離特性は、当研究室で見られる優勢な有酸素性および栄養性嫌気性細菌に基づいています。
-
評価
- マンニトール塩寒天(MSA)およびマッコンキー(MAC)プレートに13 プレートの微生物を複製し、37°Cで一晩インキュベートします。 MSA上のハローを有するワックス状のコロニーまたは黄色のコロニーの各単離および存在に対する成長に注意してください。
- グラム陽性コッチの場合、カタラーゼ試験13,14で試験を行う。きれいなガラススライドに過酸化水素3%の低下を置きます。無菌爪楊枝を使用して、目の綿棒プレートから対応する微生物を選びます。泡形成はストレプトコッカスsppを示さないが、わずかな気泡形成はコリネバクテリウム属のppを示し、おそらくアエロコッカス属を示し、急速な気泡形成はブドウ球菌sppを示す。
-
識別: マルディ-トフ MS 分析
メモ: 細菌の識別は、MALDI-TOFおよびソフトウェアデータベースを使用して行われます。このシステムは、同定のために既知の細菌スペクトルと比較されるスペクトルプロファイルを開発するための飛行質量分析(MALDI-TOF MS)のマトリックス支援レーザー脱離イオン化時間を採用しています。 大腸菌、ATCC 8739は、システムキャリブレーションに使用されます。- プレート細菌は、5%の羊の血液を含むTSAプレート上に分離し、37°Cで5%の二酸化炭素で一晩インキュベートする。
- 1 μLループを使用して、純粋な細菌の薄い層をMALDI-TOFターゲットスライドに適用します。MALDI-TOF MS CHCA マトリックス溶液(α-シアノ-4-ヒドロキシシンナミン酸)の1 μLは重ね合わされ、MALDI-TOF装置にスライドをロードする前に完全に空気乾燥させます。
- 各分離は重複して発見されます。
- 80%を超える確率スコアを含むレポートは、高い判別値を示し、信頼できる結果として受け入れられ、細菌同定が受け入れられます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
めっきのための異なる方法を示す目の綿棒板の代表的な結果は、C57BL/6マウスからの形態学的に多様な分離株を示す 図3A に示されている。各別個の分離物について、コロニーはストリップに数え、相対的な豊富さ、目の綿棒あたりのユニークなコロニー形成単位(CFUs)を計算し、比較目的でプロットした。微生物学的特徴付けのために、細菌を個々のマウスアイスワブプレートから摘み取り、マスターTSAプレートを生成した(各マウスアイ綿棒プレートから三重に形態学的に異なる分離株を選ぶことによって作成された)。マスタープレートから、その後の日または成長が現れたときに、微生物を特徴付けるか識別するために追加のテストが行われました。マスタープレートは、それぞれの分離株を拡大するのに十分な接種を提供するために使用された。
この種は微生物学的技術を用いて特徴付け、次いでMALDI-TOF MS分析によって同定された。マスタープレートから各分離を、カタラーゼ試験13、14により試験し、選択的培地上で増殖させた。我々の研究における主要な微生物は、ストレプトコッカス属である.,黄色ブドウ球菌属及びコーニーバクテリウム属,マンニトール塩寒天(MSA)及びマック・コンキー寒天(MAC)が選択的寒天13として使用された。マンニトール塩寒天の成長は、黄色ブドウ球菌spp13、16を示す。MSAはフェノールレッドを含んでいるため、コロニー周囲の黄色いハローは、黄色のハローが黄色ブドウ球菌としてのマンニトール発酵および分類を示す(コアグラーゼ試験などの代替試験で確認する)13。MacConkey寒天上の増殖はグラム陰性菌を示し、胆汁塩および結晶バイオレットは細菌膜を突き進み、グラム陽性細菌増殖を阻害することができるので13。MSA上のワックス状の成長は、マイコール酸の産生を示し、コーニーバクテリウムspp13などの生物に起因する可能性があります。最後に、カタラーゼ試験は、Streptococcus spp.と黄色ブドウ球菌spp13,16を区別し、場合によっては、弱陽性試験がアエロコッカスspp15を示し得る。
分離株を同定するために、TSAプレートをストリークし、5%の二酸化炭素および37°C環境で一晩インキュベートし、MALDI-TOF MSを行った。図4は、結果S.アシドーミニマス(ビリダンストレプトコッカスsppのメンバー)を示す。17)とA.ビリダン。多くの場合、エアロコッカスspp.生化学的および表現型のテストに基づいて、レンサ球菌18、19のビリダン群として誤認されている。MALDI-TOF MSは、識別できない種を持たない99.9の信頼レベルを持つ分離株を同定することができた。
男性および雌のC57BL/6マウスから有意に異なるレベルの分位の異なるレベルのコメンサル生物が回収された図5では、性偏差が観察される。各分離株の相対的な存在量を決定した。連鎖球菌酸菌、アエロコッカスビリダンおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)は、#1および大腸菌sppを単離する。すべてのマウスで発見され、雄は相対的な存在量が高く、多様性が高かった。
図1:社内の目の綿棒。
(A)細い約1cmの引っ張られた綿のバッティングを無菌爪楊枝ポイントと人差し指の間に保持し、その後、綿が爪楊枝の先端に完全に転がされるまで人差し指に対してわずかな圧力を維持しながら、爪楊枝を転がした。(B) 目の綿棒の例。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス結膜眼綿棒配置
(A)BHIウェットアイスワブチップを、90°の角度で、麻酔マウスの左目の内側角に挿入し、眼球を押し下げた。(B) 綿棒は、前後の動きで目にわずかな圧力を保ちながら、結膜に沿って10回動かされた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:目の綿棒とマスタープレートの代表的な結果。
(A)10μLの眼綿棒を接種濃縮した濃縮培地を血液寒天板の右側にアリクォートし、30~60度傾けて、メディアがストリップを形成できるようにし、プレートの左側に、サンプルの10μLドットを10個ずつ分配した。インキュベートされたプレートの写真は、個々のコロニーと形態学的多様性を示しています。(B) アイスワブプレートからコロニーを摘み取り、正方形(格子)の1つ内でストリーキングすることにより、分離物のマスタープレートが作成されました。3つの形態学的に類似したコロニーは、別々のグリッドに縞模様である。すべてのグリッドには、マウスの目の綿棒プレートから摘み取られた同じコロニーの3つの筋があります。成長がプレートに現れた後、分離株は選択的めっきおよびカタラーゼ試験によって特徴付けられる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マルディ-TOF MSの結果の例。
各分離株をTSA上で一晩培養し、MALDI-TOF MSスライドに塗布し、MALDI-TOF MS溶液で重ね合わせた、空気乾燥し、重複して発見した。レンサ球菌酸小化(A)およびアエロコッカス・ビリダン(B)の結果は、99.9の信頼値で肯定的に同定された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:性偏った結膜の成長
年齢に一致したC57BL6/Nマウスを、相対的な男性の多様性について比較した。目はスワッピングされ、コメンサル生物が同定された。最も優勢な種は、雌マウス(2ウェイANOVA、p<0.0001)よりも雄が有意に豊富であったレンサ球菌性アシドミニムスであった。5つの異なるCNS分離株が同定された、アエロコッカス・ビリダンおよび大腸菌.CNS分離株の一部はすべてのマウスに存在しなかったが、レンサ球菌アシドミニムス、アエロコッカスビリダン、CNS分離物1、大腸菌は、明確な豊富さを有するすべてのマウスで発見された。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
眼表面の小児性細菌状態のために、多くの研究室は、7、20の眼部の分離が困難であり、その結果、成長、低存在量、低多様性8の低いサンプル数を生じる。この方法は、濃縮工程の追加、およびMALDI-TOF MSによるアイスワブおよび同定を加えることによって、標準的な培養プラクティス4,21を大幅に改善する。濃縮工程は、細菌負荷を増幅することにより、低回収性に対処します。100未満のCFUsから野生型雄マウスの目の綿棒あたり2,500 CFUsの相対的な豊富さに回復可能な細菌の有意な増加は、栄養豊富な培地のインキュベーションが生存可能であるが、非耕作細菌22、23を再活性化し、休眠微生物の回復を可能にすることを示唆している。最近の培養ベースの濃縮工程は、宿主と微生物発現シグネチャ24、25、26の間の差別を可能にする微生物分子シーケンシング研究に組み込まれ、希少な属を増幅する。私たちのプロトコルエンリッチメントステップは、眼マイクロバイオーム研究に適用される最初のものであり、生きた微生物を選択し、回収可能な希少分離株の数を拡大し、おそらく実行可能だが非カルト的な昏睡状態を蘇生するために濃縮を利用する。さらに、私たちの家で作られた目の綿棒は、結膜の標的スワッピングを可能にし、その小さなサイズと薄い尖った先取り形状による周囲の皮膚/毛皮からの汚染を減らします。綿棒のコーティングの厚さと材料の選択は重要である21.この実験室では、目の綿棒を無毒な綿棒の薄い層で被覆し、綿棒材料内の綿棒の経膜の封入を防ぎ、また、27の細胞を傷害することができるアルギン酸眼綿棒をカルシウムよりも好ましい。縦方向のテストは、我々の方法が再現可能であることを示しています。ストレプトコッカス属、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)、コリネバクテリウム属などの目の綿棒から回収された優勢な細菌と共に。これらの結果は、培養ベースまたはイメージングベースの方法を介して検出された支配的な気性嫌気性眼属7、9、20に関する公表された知見と一致する。この方法は、大腸菌およびシュードモナス属を含む結膜内の分離株のより広いスペクトルを発見した。さらに、MALDI-TOF MSによる同定は、レンサ球菌およびアエロコッチ属のビリダン群のような属と種とのより良い差別を可能にする。19,28.
結果を最大化する上で重要な3つのステップ:目の綿棒の製造、目の綿棒の技術および目綿棒の版からの独特な分離の選択。上で説明したように、綿の非常に薄い平らな層は、眼表面からのコメンサルの最初の捕獲のためだけでなく、その後の濃縮メディアへの放出のために重要である。厚いまたは塊状の綿棒は、汚染物質の選択につながるだけでなく、綿棒の先端内の分離株を保持することができます。第二に、スワッピング中の眼球の連続的なくぼみは、周囲の表面からの汚染を最小限に抑えるために必要である。理想的なスワッピング技術は、内側の劣った結膜のフォルニックスと遅い連続運動と相まって安定したスワッピング圧力に綿棒の正常(90度)挿入を含む。最後に、目の綿棒プレートは、代表マイクロバイオームを完全に捕捉するために、新たに出現する分離株または異なる速度で成長しているものを選択するために毎日監視する必要があります。
プロトコルの結果または変更を明確に理解して対処できるプロトコルの制限がいくつかあります。結果は、眼部のコメンザルコミュニティを定義することを目的として、相対的に生存可能な分量の豊富さの尺度であり、実際の結膜細菌負担ではない。この相対的な存在量と多様性は、細菌性角膜炎における比較目的のために我々の研究において使用されてきたが、ならびに、ノックアウトおよび野生型マウス12における自然免疫応答を調べる。さらに、MALDI-TOF MSによる同定は、実質的なデータベース28に依存し、未知の分離スペクトルプロファイルに対して「IDなし」の結果を提供し、現在のデータベースを使用することの重要性を強調する。最後に、このプロトコルは、好気性および栄養性嫌気性細菌のみを検出するが、そのフレームワークは適応可能であり、濃縮培地、プレート成長条件および選択媒体の改変によって眼部微生物空間を定義するのを助けるために構築することができる。マスタープレートと濃縮成長条件を嫌気性に変えることによって、別の一般的に孤立した眼内膜、 プロピオニバクテリウム属 または他の嫌気性が検出される可能性があります 。しかし、私たちの手の中ではほとんど嫌気性の成長を見なかった。
おそらく、このフレームワークは深いDNAシーケンシング技術と組み合わせて使用することができる。DNAシーケンシングによる微生物同定の大きなハードルは、生存率を評価できないことです 10.このプロトコルは、候補の分離物(DNAシーケンシングによって識別される)の好ましい成長基準に一致するように濃縮媒体およびめっき条件を修飾することによって直交的な方法を提供し得る。これは、生存可能だが栽培不可能な細菌または存在するが、存在するが、より少ない存在種からコメンサルを捕獲するための貴重な培養ベースのアプローチをもたらす可能性があります。
実行可能な眼部のコメンサルコミュニティの定義は、眼部の経月発現プロファイルを調べる上で不可欠である。幅広い研究では、短鎖脂肪酸と微生物製品が眼の免疫応答3、29、30、31、32、33を調節し、その作用が局所的に起こることを示唆している。これは、遠位生産であるだけでなく、これらの要因のローカル生産が重要であることを示唆している。また、ドライアイ病や糖尿病などの疾患状態は、眼表面マイクロバイオーム4、6、33、34を変化させる。これは、健康と病気における実行可能な眼マイクロバイオームをより明確に定義できるように、DNAベースのシーケンシングと培養ベースのアプローチを橋渡しする方法の必要性を強調している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
P30 DK034854からの資金は、マサチューセッツ州ホストマイクロバイオームセンターでのVY、LBおよび研究を支援し、NIH/ NEI R01 EY022054からの資金提供はMGをサポートしました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
