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Immunology and Infection

चूहों में कंजक्टिव कमेंसल आइसोलेशन और पहचान

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/61672
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 2,3, 1
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

यहां प्रस्तुत एरोबिक और संकाय एनारोबिक माउस कंजक्टिव कमेंसल बैक्टीरिया के अलगाव और प्रवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल है जो माइक्रोबायोलॉजिकल आधारित तरीकों और माल्डी-टीओएफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद की पहचान के साथ एक अद्वितीय आंख झाड़ू और संस्कृति आधारित संवर्धन कदम का उपयोग करके है।

Abstract

नेत्र सतह को एक बार प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त और अजैविक माना जाता था, लेकिन हाल ही में ऐसा लगता है कि एक छोटी, लेकिन लगातार अनुकूल उपस्थिति है। नेत्र म्यूकोसा में जीवाणु प्रजातियों की पहचान और निगरानी उनकी कम बहुतायत और कम विकास और पहचान के लिए उचित पद्धति की सीमित उपलब्धता के कारण चुनौतीपूर्ण रही है । दो मानक दृष्टिकोण हैं: संस्कृति आधारित या डीएनए अनुक्रमण विधियां। पहली विधि सीमित वसूली योग्य बैक्टीरिया के कारण समस्याग्रस्त है और दूसरा दृष्टिकोण जीवित और मृत बैक्टीरिया दोनों की पहचान करता है जिससे नेत्र अंतरिक्ष का एक गुमराह प्रतिनिधित्व होता है। हमने मानक माइक्रोबायोलॉजिकल संस्कृति तकनीकों पर निर्माण करके बैक्टीरियल अलगाव के लिए एक मजबूत और संवेदनशील विधि विकसित की है। यह एक झाड़ू आधारित तकनीक है, जो "इन-लैब" का उपयोग करते हुए पतली झाड़ू का उपयोग करता है जो निचले कंजक्टिवा को लक्षित करता है, जिसके बाद एरोबिक और संकाय एनारोबिक जेनेरा के लिए एक प्रवर्धन कदम होता है। इस प्रोटोकॉल ने हमें कोरिनेबैक्टीरियम एसपीपी, कोगुलास निगेटिव स्टेफिलोकोकस एसपीपी, स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपीआदि जैसी कंजक्टिवल प्रजातियों को अलग-थलग करने और पहचानने की अनुमति दी है। दृष्टिकोण विभिन्न रोग की स्थिति के तहत चूहों में अनुकूल विविधता को परिभाषित करने के लिए उपयुक्त है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नेत्र माइक्रोबायोम की विशेषता के लिए नेत्र कंजक्टिवा से व्यवहार्य और दुर्लभ एरोबिक और संकाय एनारोबिक रोगाणुओं के विशिष्ट अलगाव को बढ़ाना है। व्यापक अध्ययनों ने त्वचा, आंत, श्वसन और जननांग तंत्र पर कॉमेंसल म्यूकोसल समुदायों को प्रोफाइल किया है और यह दर्शाता है कि ये समुदाय प्रतिरक्षा प्रणाली और प्रतिक्रिया1,2,3के विकास को प्रभावित करते हैं। कुछ रोग विकृतियों के दौरान नेत्र समुदाय समुदायों को बदलने के लिए दिखाया गया है, जैसे सूखी आंखों की बीमारी4,Sjogren सिंड्रोम5 और मधुमेह6। फिर भी, अन्य म्यूकोसल साइटों 6 ,7,8की तुलना मेंएक विशिष्ट नेत्र सतह अनुकूल समुदाय को परिभाषित करने की क्षमता उनकी अपेक्षाकृत कम बहुतायत से बाधित होती है। यह इस बात पर विवाद का संकेत देता है कि क्या निवासी नेत्र माइक्रोबायोम है और यदि यह मौजूद है, तो चाहे वह त्वचा माइक्रोबायोम से अलग हो और इसके परिणामस्वरूप, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास और प्रतिक्रिया पर इसका स्थानीय प्रभाव। यह प्रोटोकॉल इस प्रश्न को हल करने में मदद कर सकता है।

आम तौर पर, नेत्र हास्य आला को परिभाषित करने के दृष्टिकोण अनुक्रमण और संस्कृति आधारित तकनीकों4,7,9पर आधारित होते हैं। 16 एस rDNA अनुक्रमण और तेज विश्लेषण7 संस्कृति आधारित तकनीकों की तुलना में एक व्यापक विविधता दिखाने के लिए, लेकिन जीने और मृत रोगाणुओं के बीच अंतर करने में असमर्थ हैं । चूंकि नेत्र सतह आंसू फिल्म के एंटी माइक्रोबियल गुणों के कारण कई रोगाणुओं के लिए शत्रुतापूर्ण है4 डीएनए टुकड़े की एक बड़ी सरणी पैदा, डीएनए आधारित दृष्टिकोण इन कलाकृतियों जो निवासी commensals के रूप में मृत बैक्टीरिया की पहचान की ओर डेटा तिरछा हो सकता है बजाय संदूषकों का पता लगाने जाएगा । इसके परिणामस्वरूप सूक्ष्म जीव बहुतायत और विविधता10में अधिक होने के रूप में नेत्र अंतरिक्ष की पहचान और लक्षण वर्णन होता है । इससे डीएनए आधारित तरीकों के माध्यम से निवासी नेत्र माइक्रोबायोम को परिभाषित करना मुश्किल हो जाता है। जबकि, मानक संस्कृति आधारित तकनीकें commensals का पता लगाने में असमर्थ हैं क्योंकि लोड बहुत कम11है । हमारी विधि एक पतली झाड़ू है कि कंजक्टिवा को लक्षित कर सकते हैं का उपयोग करके मानक प्रथाओं पर सुधार, इस प्रकार पड़ोसी त्वचा से संदूषण से बचने, साथ ही अवधारणा है कि व्यवहार्य जीवों को पोषक तत्व घने मीडिया में संक्षिप्त संस्कृति द्वारा समृद्ध किया जा सकता है व्यवहार्य लेकिन गैर-कृषि योग्य, साथ ही, दुर्लभ व्यवहार्य रोगाणुओं के लिए समृद्ध ।

परिणाम, आंखों के झाड़ू के प्रति नेत्र commensals के सापेक्ष बहुतायत, कंजक्टिवा निवासी माइक्रोबायोम की विशेषता है और तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए महत्वपूर्ण हैं । हमारे डेटा से पता चलता है कि त्वचा और कंजक्टिव माइक्रोबायोटा के बीच एक अंतर है, साथ ही बढ़ी हुई उम्र के साथ अधिक विविधता और बहुतायत में एक सेक्स विशिष्ट अंतर है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण ने नॉक-आउट चूहों12में कमोरी अंतर पाया है। इस प्रोटोकॉल को नेत्र माइक्रोबायोम का वर्णन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो कैगिंग प्रथाओं, भूगोल या रोग राज्य के साथ-साथ प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास और प्रतिक्रिया पर कॉमेंसल मेटाबोलाइट्स और उत्पादों के स्थानीय प्रभावों के कारण भिन्न हो सकता है।

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Protocol

चूहों से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों का पालन करती हैं । सूक्ष्मजीवों और संभावित दूषित सामग्रियों के साथ काम करते समय प्रयोगशाला सुरक्षा दिशानिर्देशों (जैसा कि आपके संस्थागत पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा विभाग द्वारा निर्देशित) का पालन करें। संभावित बायोहैजार्ड दूषित सामग्रियों के निपटान से पहले उचित अपशिष्ट गोदाम और विसंदूषण प्रक्रियाओं का उपयोग करें।

1. आंख झाड़ू तैयारी, काम क्षेत्र सेट अप, माउस आंख स्वैबिंग और नमूना संवर्धन

  1. बाँझ आंख झाड़ू तैयार
    नोट: बाँझ आंख झाड़ू बारीकी कपास बल्लेबाजी की एक फाइबर पतली परत के साथ लकड़ी के टूथपिक्स लेपित कर रहे है और घर में बनाया है ।
    1. ऑटोक्लेव चूहों की संख्या के लिए कपास बल्लेबाजी और टूथपिक्स की उचित मात्रा में स्वैब किया जा सकता है ।
    2. अंगूठे और तर्जनी के साथ कपास बल्लेबाजी के एक आधा सेंटीमीटर लंबे टुकड़े से चुटकी । अंगूठे और तर्जनी के साथ किनारों पर खींच कर बल्लेबाजी चिढ़ाने के लिए एक फ्लैट एक असुरक्षित परत बनाने के लिए, बस से पहले बल्लेबाजी के अलावा गिर जाता है (कपास के छोटे टुकड़े फैला बल्लेबाजी भर में फैला स्वीकार्य हैं) ।
    3. टूथपिक के तेज सिरों में से एक के चारों ओर बल्लेबाजी को हल्के से टूथपिक टिप पर फैला हुआ टुकड़ा पकड़ कर घूमता है क्योंकि यह मुड़ गया है, चित्रा 1देखें । "पूरा" आंख झाड़ू कपास की एक बहुत पतली परत टिप पर फैला होगा, लगभग एक आधा से एक सेंटीमीटर दूर टिप से विस्तार ।
    4. छोटे बीकर में "पूरा" झाड़ू डालें, नीचे की ओर झाड़ू और कवर। ऑटोक्लेव।
  2. कार्यक्षेत्र की स्थापना करें
    1. केटामाइन (100 मिलीग्राम/एमएल), 400 माइक्रोनल ऑफ जाइलाज़ीन (100 मिलीग्राम/एमएल) और 27.6 एमएल बाँझ खारा (डीएच2ओ में 0.9% एनएसीएल) वाले एनेस्थीसिया को बाँझ 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैयार करें। तत्काल उपयोग के लिए छानें और एलिकोट संज्ञाहरण (1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; हमेशा उपयोग से पहले कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें)।
    2. प्रदूषण को कम करने के लिए कीटाणुनाशक के साथ कार्य क्षेत्र को साफ और साफ करें।
    3. बाँझ मस्तिष्क हृदय जलसेक मीडिया (बीएचआई) के एलिकोट 0.5 एमएल को लेबल 1.5 एमएल बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (माउस प्रति 1 ट्यूब और नियंत्रण) में; माइक्रोसेंट्रफ्यूज रैक में व्यवस्था करें। बर्फ पर रैक सेट करें।
    4. इस प्रकार के रूप में काम के प्रवाह की स्थापना (बाएं से दाएं): माउस एनेस्थेटाइजिंग स्टेशन (प्रयोगात्मक चूहों युक्त पिंजरे, खाली बाँझ पिंजरे, कमरे का तापमान संज्ञाहरण, 25 जी सुई और 1 मिलील सिरिंज), आंख स्वैबिंग स्टेशन (बर्फ पर aliquoted BHI, निष्फल आंख झाड़ू, साफ कागज तौलिए, ७०% आइसोप्रोपनोल स्प्रे) और चढ़ाना स्टेशन (कमरे का तापमान रक्त आगर प्लेटें, 10 μl pipette , 10 μL बाँझ डिस्पोजेबल युक्तियां, बायोहैजार्ड अपशिष्ट कंटेनर)।
  3. आंखों की झाड़ी
    1. प्रत्येक वयस्क माउस और एक ऑटोक्लेव पिंजरे में जगह करने के लिए क्रमशः केटामाइन और जाइलाज़ीन के माउस वजन खुराक के प्रति 1 ग्राम संज्ञाहरण के 10 μL प्रशासन । हिंडफुट पैड को निचोड़कर एनेस्थेटाइजेशन का परीक्षण करें; कोई आंदोलन उचित एनेस्थेटाइजेशन को इंगित नहीं करता है।
    2. केवल एनेस्थेटाइज्ड चूहों को संभालने के लिए एक हाथ असाइन करें और दूसरा हाथ केवल आंखों की झाड़ू और संस्कृति को संभालने के लिए। स्वैबिंग के लिए, पिंजरे से पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड माउस को हटा दें; स्वच्छ काम सतह के शीर्ष पर जगह बाईं आंख के साथ अपनी ओर तैनात उजागर । आइसोप्रोपैनॉल के साथ दस्ताने हाथ स्प्रे करें, साफ कागज तौलिया के साथ सूखें।
    3. अनकैप ने विशेष रूप से समर्पित मीडिया हैंडलिंग हैंड के साथ बीएचआई माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब को लेबल किया। ट्यूब को बर्फ पर माइक्रो-सेंट्रलाइज रैक में वापस रखें।  भी में आंखों के झाड़ू के कपास लेपित टिप डुबकी, अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए आंतरिक ट्यूब के खिलाफ टिप 2 बार घूमता ट्यूब से आंख झाड़ू वापस लें ।
    4. माउस हैंडलिंग हाथ के साथ, धीरे गर्दन के स्क्रफ द्वारा माउस पकड़ो। दूसरे हाथ से, बाईं आंख के मध्यीय कंजक्टिवल क्षेत्र के खिलाफ आंखों की तलहट रखें, चित्र 2 एदेखें। हल्के से आंखों की पुतली दबाना और एक खिड़की धोने की गति में झाड़ू ले जाने(चित्रा 2B)आगे और पीछे, निचली पलक और आंख के बीच, 10 बार । लगातार दबाव बनाए रखें।
    5. फर को छूने के बिना, धीरे-धीरे झाड़ू की नोक को हटा दें, जहां इसे डाला गया था, उसके लिए लंबवत, और झाड़ू कपास की ओर सीधे एक लेबल माइक्रो-अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें जिसमें बीएचआई मीडिया होता है। स्वैब्ड आई पर लुब्रिकेंट आई ड्रॉप लगाएं।
    6. पिंजरे में माउस वापस।
    7. झाड़ू बर्फ पर 10 से 15 मिनट के लिए खड़े हो जाओ और 10 घूर्णन के लिए मीडिया में टिप मिश्रण द्वारा निष्फल दस्ताने हाथ से आंख झाड़ू हटा दें । 5 घूर्णन के लिए माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब की भीतरी दीवार के खिलाफ घूमता हुआ टिप द्वारा झाड़ू वापस लें। बायोहैजार्ड कंटेनर में झाड़ू का निपटान करें।
    8. प्रत्येक माउस के लिए और नियंत्रण नमूनों (त्वचा या फर झाड़ू) के लिए 1.3.2 से 1.3.7 चरणों को दोहराएं। प्रत्येक झाड़ू के बीच दस्ताने उचित रूप से स्टरलाइज करें।
  4. सम्पन्नीकरण
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए स्थिर रूप से ट्यूब को इनक्यूबेटिंग करके नमूने को समृद्ध करें
    2. इनक्यूबेशन के दौरान, माउस प्रति 5% भेड़ के रक्त आगार प्लेट (टीएसए प्लेट) के साथ एक कमरे के तापमान ट्रिप्पीकेस सोया को लेबल करें और आधे में विभाजित करें।
    3. आंखों के झाड़ू संस्कृति इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेटर से समृद्ध नमूनों को हटा दें और बर्फ पर रखें।
    4. चित्रा 3 एमें योजनाबद्ध के अनुसार मिश्रण और प्लेट करने के लिए संक्षेप में भंवर के नमूने । TSA प्लेट पर नमूने के 10 μL Aliquot और प्लेट झुकाव एक पट्टी बनाने के लिए, 2 बार दोहराएं ।
    5. प्लेट की विभाजक रेखा के दूसरी ओर, आगर पर नमूने के 10 माइक्रोन डॉट, 9 बार दोहराएं।
    6. 18 घंटे, 2 दिन और 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें (एक साफ कक्ष में जो आगर प्लेटों को सूखने से रोकती है)। स्ट्रिप्स में कॉलोनियों की गणना करें, आकृति विज्ञान नोट करें और आकृति रूप से समान आइसोले के लिए प्रति झाड़ू कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीयूज) की गणना करें। स्ट्रिप्स में कैप्चर नहीं किए गए अद्वितीय जीवों के लिए डॉट्स को देखें।

2. मास्टर प्लेट, लक्षण वर्णन, और नेत्र रोगाणुओं की पहचान

  1. मास्टर प्लेट
    1. एक टीएसए प्लेट(चित्रा 3B)के पीछे ग्रिड बनाएं। प्रत्येक माउस आंख झाड़ू प्लेट से एक बाँझ टूथपिक के साथ एक कॉलोनी उठाओ और मास्टर प्लेट स्क्वायर (ग्रिड), कॉलोनी नंबर और माउस जानकारी के साथ लेबल ग्रिड लकीर। प्रत्येक रूपात्मक रूप से अलग कॉलोनी के लिए तीन अलग-अलग कॉलोनियों को चुनें और प्लेट करें।
    2. थाली को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 96 घंटे के लिए इनक्यूबेशन जारी रखें, नए आइसोले की उपस्थिति के लिए दैनिक जांच करें।
      नोट: कॉमेंसल आबादी माउस उम्र, पोषण, रोग राज्य और caging प्रथाओं के आधार पर भिन्न होगी। अलग लक्षण वर्णन हमारी प्रयोगशाला में पाए जाने वाले प्रमुख एरोबिक और संकाय एनारोबिक बैक्टीरिया पर आधारित है।
  2. वर्णन
    1. मैनिटोल साल्ट एगर (एमएसए) और मैककोंकी (मैक) प्लेटों पर डुप्लीकेट13 प्लेट रोगाणुओं, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट । एमएसए पर प्रभामंडल के साथ मोमी उपनिवेशों या पीले उपनिवेशों की प्रत्येक अलग और उपस्थिति के लिए विकास पर ध्यान दें।
    2. ग्राम सकारात्मक कोसीसीआई के लिए, कैटालेज टेस्ट13,14के साथ परीक्षण करें। एक साफ ग्लास स्लाइड पर 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एक बूंद रखें। एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करना, आंख झाड़ू की थाली से इसी माइक्रोब उठाओ । कोई बुलबुला गठन स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपीको इंगित नहीं करता है।
  3. पहचान: माल्डी-TOF एमएस विश्लेषण
    नोट: मैल्डी-TOF और सॉफ्टवेयर डेटाबेस का उपयोग करके बैक्टीरियल पहचान की जाती है। यह प्रणाली स्पेक्ट्रा प्रोफाइल विकसित करने के लिए मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसेक्शन आयनीकरण-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालडी-टीओएफ एमएस) का समय कार्य करती है जो पहचान के लिए ज्ञात बैक्टीरियल स्पेक्ट्रा की तुलना में होती है। ई.कोलाई, एटीसीसी8739, सिस्टम अंशांकन के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. प्लेट बैक्टीरियल 5% भेड़ रक्त युक्त टीएसए प्लेटों पर अलग करता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ रात भर इनक्यूबेट करता है।
    2. 1 μL लूप का उपयोग करके, माल्डी-टीईएफ लक्ष्य स्लाइड पर शुद्ध बैक्टीरिया की एक पतली परत लागू करें; माल्डी-TOF एमएस CHCA मैट्रिक्स समाधान (अल्फा-साइनो-4-हाइड्रोक्सीसिननामिक एसिड) का 1 माइक्रोन मढ़ा जाता है और मालडी-TOF उपकरण में स्लाइड लोड करने से पहले पूरी तरह से सूखने की अनुमति दी जाती है।
    3. प्रत्येक आइसोसेट डुप्लिकेट में देखा जाता है।
    4. 80% से अधिक संभावना स्कोर वाली रिपोर्ट, जो उच्च भेदभाव मूल्य का संकेत देती है, विश्वसनीय परिणाम के रूप में स्वीकार की जाती है और बैक्टीरियल पहचान स्वीकार की जाती है।

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Representative Results

चढ़ाना के लिए विभिन्न तरीकों का प्रदर्शन एक आंख झाड़ू प्लेट के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3A C57BL/6 माउस से रूपात्मक विविध आइसोले दिखा में चित्र हैं । प्रत्येक अलग अलग के लिए, कालोनियों पट्टी और सापेक्ष बहुतायत में गिना जाता था, अद्वितीय कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) प्रति आंख झाड़ू, गणना और तुलना प्रयोजनों के लिए साजिश रची । माइक्रोबायोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए, बैक्टीरिया को एक मास्टर टीएसए प्लेट का उत्पादन करने के लिए व्यक्तिगत माउस आंख झाड़ू प्लेटों से चुना गया था (प्रत्येक माउस आंख झाड़ू प्लेट से त्रिपालेट में रूपात्मक रूप से अलग आइसोलेशन चुनकर बनाया गया था)। मास्टर प्लेट से, बाद के दिन या जब विकास दिखाई देता है, तो रोगाणुओं की विशेषता या पहचान करने के लिए अतिरिक्त परीक्षण चलाए गए थे। मास्टर प्लेट का उपयोग संबंधित आइसोले का विस्तार करने के लिए पर्याप्त इनोकुलम प्रदान करने के लिए किया गया था।

प्रजातियों को माइक्रोबायोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके चित्रित किया गया था और फिर माल्डी-TOF एमएस विश्लेषण द्वारा पहचाना गया था। मास्टर प्लेट से प्रत्येक को अलग किया गया था, कैटालेज़ परीक्षण13,14 द्वारा परीक्षण किया गया था और चयनात्मक मीडिया पर उगाया गया था। चूंकि हमारे अध्ययनों में प्रमुख रोगाणु स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपीहैं । , स्टेफिलोकोकस एसपीपी और कॉर्नेबैक्टीरियम एसपीपी,मैनिटोल साल्ट एगर (एमएसए) और मैक कॉनकी एगर (मैक) का उपयोग चयनात्मक एगर13के रूप में किया गया था। मैनिटोल साल्ट एगर पर वृद्धि स्टेफिलोकोकस 13,16को इंगित करती है । चूंकि एमएसए में फिनोल लाल होता है, इसलिए कॉलोनी के चारों ओर एक पीला प्रभामंडल मैनिटॉल किण्वन और वर्गीकरण को स्टेफिलोकोकस ऑरियस (कोगुलास परीक्षण जैसे वैकल्पिक परीक्षणों के साथ पुष्टि)13इंगित करता है। मैककॉन्की एगर पर विकास ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया को इंगित करता है, क्योंकि पित्त लवण और क्रिस्टल वायलेट बैक्टीरियल झिल्ली का उल्लंघन करने और ग्राम सकारात्मक जीवाणु विकासकोबाधित करने में सक्षम हैं। एमएसए पर मोमी की वृद्धि माइकोलिक एसिड के उत्पादन को इंगित करती है और कॉर्नेबैक्टीरियम एसपीपी13जैसे जीवों के कारण हो सकतीहै। अंत में, कैटालस परीक्षण स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपी को अलग करता है। स्टेफिलोकोकस एसपीपी13,16से, और कुछ मामलों में, एक कमजोर सकारात्मक परीक्षण एरोकोकस एसपीपी15का संकेत दे सकता है।

आइसोले की पहचान करने के लिए, एक टीएसए प्लेट को 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 37 डिग्री सेल्सियस पर्यावरण और मालडी-टीओएफ एमएस प्रदर्शन में रातोंरात स्ट्रीक किया गया था। चित्रा 4 परिणाम एस एसिडोमिनिमस (विरिडांस स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपी का सदस्य) दिखाता है। 17) और ए विरिडंस । अक्सर एरोकोकस स्पीप। बायोकेमिकल और फेनोटाइपिक परीक्षणों के आधार पर स्ट्रेप्टोकोसी18, 19के विरिडंस समूह के रूप में गलत पहचान की जाती है। माल्डी-TOF एमएस कोई अज्ञात प्रजाति के साथ ९९.९ के विश्वास स्तर के साथ आइसोले की पहचान करने में सक्षम था ।

लिंग पक्षपातपूर्ण मतभेद चित्रा 5 में देखा जा सकता है,जहां पुरुष और महिला C57BL/6 चूहों से काफी अलग स्तर के अनुकूल जीवों को बरामद किया गया था । प्रत्येक अलग के लिए सापेक्ष बहुतायत निर्धारित किया गया था । स्ट्रेप्टोकोकस एसिडोमिनिमस, एरोकोकस विरिडन्स और कोगुलैस निगेटिव स्टेफिलोकोकस(सीएनएस)#1 और ई कोलाई एसपीपीको अलग करते हैं । सभी चूहों में पाए गए, पुरुषों के साथ उच्च सापेक्ष बहुतायत और अधिक विविधता दिखा।

Figure 1
चित्रा 1: घर में आंख झाड़ू ।
(क)एक पतली, लगभग 1 सेमी, खींची गई कपास बल्लेबाजी का टुकड़ा बाँझ टूथपिक पॉइंट और इंडेक्स फिंगर के बीच आयोजित किया गया था और इंडेक्स फिंगर के खिलाफ मामूली दबाव बनाए रखते हुए टूथपिक को तब तक लुढ़का दिया गया जब तक कि कपास पूरी तरह से टूथपिक टिप पर नहीं लुढ़काया गया । (ख)एक आंख झाड़ू का उदाहरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस कंजक्टिवल आंख झाड़ू प्लेसमेंट।
(क)बीएचआई गीली आंखों की झाड़ू टिप को 90 डिग्री कोण पर, एक एनेस्थेटाइज्ड माउस की बाईं आंख के मध्यीय कोने में डाला गया था, जो आंखों की पुतली को निराशाजनक था। (ख)झाड़ू को 10 बार आगे-पीछे की गति में आंखों पर मामूली दबाव बनाए रखते हुए कंजक्टिवा के साथ ले जाया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आंख झाड़ू और मास्टर प्लेटों के लिए प्रतिनिधि परिणाम।
(क)आंखों के 10 माइक्रोनल को रक्त आगर प्लेट के दाईं ओर अलीकोट किया गया था और 30 से 60 डिग्री झुका हुआ था ताकि मीडिया स्ट्रिप्स बना सके और प्लेट के बाईं ओर, नमूने के दस 10 माइक्रोन डॉट्स को तिरस्कृत किया गया। इनक्यूबेटेड प्लेट की तस्वीर व्यक्तिगत उपनिवेशों और रूपात्मक विविधता को दर्शाती है। (ख)आइसोले की एक मास्टर प्लेट आंख झाड़ू प्लेट से एक कॉलोनी उठा और चौकों (ग्रिड) में से एक के भीतर लकीर द्वारा बनाया गया था । तीन रूपात्मक रूप से समान उपनिवेशों को अलग-अलग ग्रिडों में जाता है। हर ग्रिड में एक ही कॉलोनी की तीन धारियां होती हैं जिन्हें माउस आई स्वैब प्लेट से उठाया जाता था। प्लेटों पर विकास दिखाई देने के बाद, आइसो आइसोलेड को चयनात्मक चढ़ाना और कैटालेज़ परीक्षण की विशेषता थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माल्डी-टीईएफ एमएस परिणामों का उदाहरण।
प्रत्येक आइसोल्ड को रातोंरात टीएसए पर सुसंस्कृत किया गया था, माल्डी-टीओएफ एमएस स्लाइड पर लागू किया गया था और माल्डी-TOF एमएस समाधान के साथ मढ़ा गया था, हवा सूख गई और डुप्लिकेट में देखा गया। स्ट्रेप्टोकोकस एसिडोमिनिमस (ए)और एरोकोकस विरिडन्स (बी)के परिणामों को 99.9 के आत्मविश्वास मूल्य के साथ सकारात्मक रूप से पहचाना गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सेक्स-पक्षपातपूर्ण अनुकूलसंबद्ध विकास।
आयु मिलान C57BL6/N चूहों रिश्तेदार commensal विविधता के लिए तुलना में किया गया । आंखों को स्वैब किया गया और संभक्षी जीवों की पहचान की गई । सबसे प्रमुख प्रजातियां स्ट्रेप्टोकोकस एसिडोमिनिमसथीं, जो मादा चूहों (2-वे एनोवा, पी<0.0001) की तुलना में पुरुष में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थी। 5 अलग सीएनएस आइसोलेट की पहचान की गई, एयरोकोकस विरिडान्स और ई कोलाई। जबकि सीएनएस आइसोलेट के कुछ सभी चूहों में मौजूद नहीं थे, स्ट्रेप्टोकोकस एसिडोमिनिमस, एयरोकोकस विरिडान्स, सीएनएस अलग 1, और ई कोलाई सभी चूहों में अलग बहुतायत के साथ पाए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

नेत्र सतह की कमी की स्थिति के कारण, कई प्रयोगशालाओं को नेत्र कॉमेंसल7,20को अलग करने में कठिनाई हुई है, जिसके परिणामस्वरूप विकास, कम बहुतायत और कम विविधतावालेनमूनों की संख्या कम हो गई है। इस विधि में एक संवर्धन कदम के अलावा मानक संस्कृति प्रथाओं4,21 पर काफी सुधार होता है, साथ ही माल्डी-टोफ एमएस द्वारा एक बदल दी गई आंख झाड़ू और पहचान भी होती है। संवर्धन चरण बैक्टीरियल लोड को बढ़ाकर कम वसूली की क्षमता को संबोधित करता है। जंगली प्रकार के पुरुष चूहों के लिए प्रति आंख झाड़ू 2,500 सीएफओ की सापेक्ष बहुतायत तक 100 सीएफयू से वसूली योग्य बैक्टीरिया में महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है कि पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया में इनक्यूबेशन व्यवहार्य लेकिन गैर-खेती करने योग्य बैक्टीरिया22, 23को पुनर्जीवित करता है, इस प्रकार निष्क्रिय रोगाणुओं की वसूली की अनुमति देता है। हाल ही में संस्कृति आधारित संवर्धन कदमों को माइक्रोबायोटा आणविक अनुक्रमण अध्ययनों में शामिल किया गया है ताकि मेजबान और माइक्रोबियल अभिव्यक्तिहस्ताक्षर24, 25,26के बीच भेदभाव को सक्षम किया जा सके और दुर्लभ जेनेरा को बढ़ाना हो । हमारा प्रोटोकॉल संवर्धन कदम सबसे पहले नेत्र माइक्रोबायोम अध्ययनों पर लागू किया जाता है और जीवित रोगाणुओं का चयन करने के लिए संवर्धन का उपयोग करता है, वसूली योग्य दुर्लभ आइसोलेशन की संख्या का विस्तार करता है और शायद व्यवहार्य लेकिन गैर-कृषि योग्य commensals को पुनर्जीवित करता है। इसके अलावा, हमारे घर में बनाया आंख झाड़ू कंजक्टिवा के लक्षित स्वैबिंग की अनुमति देता है, आसपास की त्वचा से संदूषण को कम करने/ झाड़ू कोटिंग मोटाई और सामग्री का चुनाव महत्वपूर्ण है21. इस प्रयोगशाला में बनी आंखों की झाड़ू को नॉनटॉक्सिक कॉटन बल्लेबाजी की पतली परत से लेपित किया जाता है, जो झाड़ू सामग्री के भीतर स्वैब्स्ड कॉमेंसल फंसाने को रोकता है, साथ ही कैल्शियम एल्गिनेट आंख झाड़ू के लिए बेहतर है जो साइटॉक्सिक27हो सकता है। देशांतर परीक्षणों से पता चलता है कि हमारी विधि प्रजनन योग्य है; स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपीसहित आंखों के झाड़ू से बरामद प्रमुख बैक्टीरिया के साथ। ये परिणाम संस्कृति आधारित या इमेजिंग-आधारित तरीकों के माध्यम से पता लगाने वाले प्रमुख संकाय एनारोबिक नेत्र जेनेरा7,9,20 के लिए प्रकाशित निष्कर्षों से सहमत हैं। इस विधि में कंजक्टिवा में आइसोलेटिव का एक व्यापक स्पेक्ट्रम पाया गया है, जिसमें एस्चेरिचिया कोलाई और स्यूडोमोनास स्पीपशामिल हैं। इसके अलावा, माल्डी-TOF एमएस द्वारा पहचान जेनेरा और प्रजातियों के बीच बेहतर भेदभाव को सक्षम बनाती है, जैसे स्ट्रेप्टोकोसी और एयरोकोसी एसपीपी के विरिडन्स समूह। 19,28.

तीन कदम परिणाम को अधिकतम करने में महत्वपूर्ण हैं: आंख झाड़ू निर्माण, आंख झाड़ू तकनीक और आंख झाड़ू प्लेट से अद्वितीय अलग चयन । जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, कपास की एक बहुत पतली सपाट परत नेत्र सतह से कॉमेंसल्स के प्रारंभिक कब्जे के साथ-साथ संवर्धन मीडिया में उनके बाद की रिहाई के लिए महत्वपूर्ण है। मोटी या ढेलेदार झाड़ू संदूषकों के चयन के साथ-साथ झाड़ू टिप के भीतर आइसोलेट को बनाए रख सकती है। दूसरे, आसपास की सतहों से संदूषण को कम करने के लिए स्वैबिंग करते समय आंखों की पुतली का निरंतर अवसाद आवश्यक है। आदर्श स्वैबिंग तकनीक में धीमी गति से निरंतर आंदोलन के साथ मिलकर मध्यापण अवर कंजक्टिव फोरनिक्स और स्थिर स्वैबिंग दबाव में झाड़ू का सामान्य (90 डिग्री) सम्मिलन शामिल है। अंत में, आंख झाड़ू प्लेट को प्रतिनिधि माइक्रोबायोम को पूरी तरह से पकड़ने के लिए नए दिखने वाले आइसोले या एक अलग दर से बढ़ने वालों के लिए चयन करने के लिए दैनिक निगरानी की जानी चाहिए।

कुछ प्रोटोकॉल सीमाएं हैं जिन्हें परिणामों की स्पष्ट समझ या प्रोटोकॉल के संशोधन के साथ संबोधित किया जा सकता है। परिणाम सापेक्ष व्यवहार्य हास्य बहुतायत का एक उपाय कर रहे हैं, और नहीं वास्तविक कंजक्टिव जीवाणु बोझ, नेत्र commensal समुदाय को परिभाषित करने के उद्देश्य से । सापेक्ष बहुतायत और विविधता बैक्टीरियल केराटिटिस में तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए हमारे अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, साथ ही, नॉक आउट और जंगली प्रकार चूहों12में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए । इसके अलावा, माल्डी-टीओएफ एमएस द्वारा पहचान एक पर्याप्त डेटाबेस28पर निर्भर करती है, जो अज्ञात अलग-थलग स्पेक्ट्रा प्रोफाइल के लिए "नो आईडी" का परिणाम देता है, जो वर्तमान डेटाबेस का उपयोग करने के महत्व को रेखांकित करता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल केवल एरोबिक और संकाय एनारोबिक बैक्टीरिया का पता लगाता है, लेकिन इसका ढांचा अनुकूलनीय है और संवर्धन मीडिया, प्लेट विकास की स्थिति और चयन माध्यम के संशोधन द्वारा नेत्र माइक्रोबियल अंतरिक्ष को परिभाषित करने में मदद करने के लिए बनाया जा सकता है। मास्टर प्लेट और संवर्धन विकास की स्थिति को एनारोबिक में बदलकर, फिर एक और आमतौर पर अलग-थलग नेत्र संवहनी, प्रोपियोनिबैक्टीरियम स्प्प या अन्य एनारोबका पता लगाया जा सकता है; हालांकि, हमारे हाथों में हमने लगभग कोई अवायवीय विकास नहीं देखा।

शायद, इस ढांचे का उपयोग गहरे डीएनए अनुक्रमण तकनीकों के साथ किया जा सकता है। डीएनए अनुक्रमण के माध्यम से सूक्ष्म जीव पहचान में एक बड़ी बाधा व्यवहार्यता का आकलन करने में असमर्थता है10. यह प्रोटोकॉल एक उम्मीदवार को अलग-थलग करने के लिए संवर्धन मीडिया और चढ़ाना शर्तों को संशोधित करके एक आर्थोगोनल विधि प्रदान कर सकता है (डीएनए अनुक्रमण द्वारा पहचाना गया) पसंदीदा विकास मानदंड। इसके परिणामस्वरूप व्यवहार्य लेकिन अकांगत बैक्टीरिया या वर्तमान लेकिन कम बहुतायत प्रजातियों से commensals पर कब्जा करने के लिए एक मूल्यवान संस्कृति आधारित दृष्टिकोण हो सकता है ।

नेत्र संचारी समुदाय की परिभाषा नेत्र संचारी अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच के लिए आवश्यक है। व्यापक शोध से पता चलता है कि शॉर्ट चेन फैटी एसिड और माइक्रोबियल उत्पाद नेत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया3, 29, 30,31,32,33को संशोधित करते हैं, और उनकी कार्रवाई स्थानीय रूप से होती है। इससे पता चलता है कि न केवल डिस्टल उत्पादन है, बल्कि इन कारकों का स्थानीय उत्पादन महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, शुष्क नेत्र रोग और मधुमेह जैसे रोग राज्य नेत्र सतह माइक्रोबायोम4,6,33, 34बदलते हैं । यह एक ऐसी विधि की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है जो डीएनए आधारित अनुक्रमण के साथ-साथ संस्कृति आधारित दृष्टिकोणों को पुल करती है ताकि स्वास्थ्य और रोग में व्यवहार्य नेत्र माइक्रोबायोम को बेहतर तरह से परिभाषित किया जा सके ।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

P30 DK034854 से धन का समर्थन किया VY, पौंड और मैसाचुसेट्स मेजबान में अध्ययन-माइक्रोबायोम केंद्र और NIH/NEI R01 EY022054 से धन एमजी का समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 to 10 µl pipet tip USA Scientific 1110-300 autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet Fisher Scientific 13-690-026
1 ml syringe Fisher Scientific BD309623 1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 autoclave before use
1000 µ ml pipet tip USA Scientific 1111-2021 autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) Fisher Scientific F123602G
25 G needle Fisher Scientific 14-826AA 1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide Fisher Scientific S25359
37 ° C Incubator Lab equipment
70 % Isopropanol Fisher Scientific PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) Santa Cruz Animal Health SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit Fisher Scientific B12539
Bunsen Burner Lab equipment
Clean paper towels Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton CVS
Disposable 1 ml Pipets Fisher Scientific 13-711-9AM for Gram stain and catalase tests
E.coli ATTC ATCC 8739
Glass slides Fisher Scientific 12-550-A3 for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml) Henry Schein 9950001
Mac Conkey Agar Plates Fisher Scientific 4321270 store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar Carolina Biological Supply 784641 Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice Jackson Labs C57/BL6J
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12 for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media Fisher Scientific 50-488525 prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) EMD/Millipore, Fisher Scientifc SCGP00525 to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube Fisher Scientific 430829 anesthesia preparation
Sterile mouse cage Lab equipment
Tooth picks (round bamboo) Kitchen Essentials autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates Fisher Scientific 4321261 store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution BioMerieux Inc. Durham, NC 411071
Single use eye drops CVS Pharmacy Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each

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References

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Smith-Page, K., Kugadas, A., Lin, T., Delaney, M., Bry, L., Gadjeva, M. Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice. J. Vis. Exp. (171), e61672, doi:10.3791/61672 (2021).

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