Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Konjunktival commensal isolasjon og identifikasjon hos mus

Published: May 1, 2021 doi: 10.3791/61672
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 2,3, 1
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

Presentert her er en protokoll for isolering og forsterkning av aerob og fakultets anaerob mus konjunktivale kommensale bakterier ved hjelp av en unik øyepinne og kulturbasert berikelse trinn med påfølgende identifikasjon av mikrobiologiske baserte metoder og MALDI-TOF masse spektrometri.

Abstract

Den okulære overflaten ble en gang ansett som immunprivilegert og abiotisk, men nylig ser det ut til at det er en liten, men vedvarende commensal tilstedeværelse. Identifisering og overvåking av bakteriearter ved okulær slimhinne har vært utfordrende på grunn av deres lave overflod og begrensede tilgjengelighet av passende metodikk for commensal vekst og identifisering. Det er to standard tilnærminger: kulturbaserte eller DNA-sekvenseringsmetoder. Den første metoden er problematisk på grunn av de begrensede utvinnbare bakteriene, og den andre tilnærmingen identifiserer både levende og døde bakterier som fører til en avvikende representasjon av okulærrommet. Vi utviklet en robust og sensitiv metode for bakteriell isolasjon ved å bygge videre på standard mikrobiologiske kultiveringsteknikker. Dette er en vattpinnebasert teknikk, ved hjelp av en "in-lab" laget tynn vattpinne som retter seg mot nedre konjunktiv, etterfulgt av et forsterkningstrinn for aerob og fakultets anaerob slekt. Denne protokollen har gjort det mulig for oss å isolere og identifisere konjunktivale arter som Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. Tilnærmingen er egnet til å definere commensal mangfold hos mus under forskjellige sykdomstilstander.

Introduction

Målet med denne protokollen er å forbedre spesifikk isolasjon av levedyktige og sjeldne aerobe og fakultets anaerobe mikrober fra okulær konjunktiv for å karakterisere okulær mikrobiomet. Omfattende studier har profilert commensal mucosal samfunn på hud, tarm, luftveier og kjønnsorganer og viser at disse samfunnene påvirker utviklingen av immunsystemet og responsen1,2,3. Okulære commensale samfunn har vist seg å endre seg under visse sykdomspatologier, for eksempel Tørr øyesykdom4, Sjogrens syndrom5 og diabetes6. Likevel er evnen til å definere et typisk okulært overflatekompmensalt samfunn hemmet av deres relativt lave overflod sammenlignet med de andre mucosalstedene6,7,8. Dette fører til en kontrovers om hvorvidt det er et bosatt okulært mikrobiom og om det eksisterer, om det er forskjellig fra hudens mikrobiom og følgelig den lokale effekten på den medfødte immunsystemutviklingen og responsen. Denne protokollen kan bidra til å løse dette spørsmålet.

Generelt er tilnærminger for å definere okulær commensal nisje basert på sekvensering og kulturbaserte teknikker4,7,9. 16 S rDNA-sekvensering og BRISK-analyse 7 viser etbredere mangfold enn kulturbaserte teknikker, men klarer ikke å skille mellom levende og døde mikrober. Siden den okulære overflaten er fiendtlig innstilt til mange mikrober på grunn av tårefilmens antimikrobielle egenskaper4 som genererer et stort utvalg av DNA-fragmenter, vil DNA-baserte tilnærminger oppdage disse artefaktene som kan forskyve dataene mot identifisering av døde bakterier som bosatte commensals i stedet for forurensninger. Dette resulterer i avvikende commensal identifikasjon og karakterisering av okulærrommet som høyere i mikrobe overflod og mangfold10. Dette gjør det vanskelig å definere det beboende okulære mikrobiomet via DNA-baserte metoder. Standard kulturbaserte teknikker kan imidlertid ikke oppdage commensals fordi belastningen er for lav11. Vår metode forbedrer standardpraksis ved å bruke en tynn vattpinne som kan målrette konjunktivene, og dermed unngå forurensning fra nærliggende hud, samt konseptet om at levedyktige organismer kan berikes av kort kultur i næringstett media med mål om å gjenopplive levedyktige, men ikke-kultiverbare, samt berike for sjeldne levedyktige mikrober.

Resultatene, relativ overflod av okulære commensals per øyepinne, karakteriserer konjunktiv bosatt mikrobiom og er viktige for komparative formål. Våre data viser at det er forskjell på hud og konjunktiv mikrobiota, samt større mangfold med økt alder og en kjønnsspesifikk forskjell i overflod. Videre har denne tilnærmingen reprodusert funnet commensal forskjeller i knock-out mus12. Denne protokollen kan brukes til å beskrive okulært mikrobiom som kan variere på grunn av caging praksis, geografi eller sykdom tilstand, samt lokale effekter av commensal metabolitter og produkter på immunsystem utvikling og respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer mus følger retningslinjene fra Institusjonelt dyrepleie- og bruksutvalg. Følg laboratoriets sikkerhetsretningslinjer (som anvist av din institusjonelle miljøhelse- og sikkerhetsavdeling) når du arbeider med mikroorganismer og potensielt forurensede materialer. Bruk egnede avfallsbeholdere og dekontamineringsprosedyrer før avhending av potensielt biofarlige forurensede materialer.

1. Forberedelse av øyepinne, oppsett av arbeidsfelt, museøyeswabbing og prøveberikelse

  1. Forbered sterile øyepinner
    MERK: Sterile øyepinner er tynt belagte tannpirkere i tre med et fibertynt lag av bomullsslag og laget i huset.
    1. Autoklaver passende mengde bomullsslag og tannpirkere for antall mus som skal swabbes.
    2. Klyp av et halvt centimeter langt stykke bomull som slår med tommel og pekefinger. Ert ut batting ved å trekke på kantene med tommelen og pekefingere for å danne et flatt enkelt porøst lag, stopper like før batting faller fra hverandre (små biter av bomull spredt over hele den strakte batting er akseptabelt).
    3. Virvle batting rundt en av de skarpe endene av tannpirkeren ved å holde det utstrakte stykket lett på tannpirkerspissen når den er vridd, se figur 1. Den "ferdige" øyepinnen vil ha et veldig tynt lag bomull strukket over spissen, som strekker seg omtrent en halv til en centimeter fra spissen.
    4. Sett "ferdige" vattpinner inn i små beger, vattpinne side ned og deksel. autoklav.
  2. Konfigurere arbeidsområdet
    1. Forbered anestesi som inneholder 2 ml ketamin (100 mg/ml), 400 μL xylazin (100 mg/ml) og 27,6 ml steril saltvann (0,9 % NaCl i dH2O) i et sterilt 50 ml sterilt sentrifugerør. Filtersteriliser og aliquot anestesi til umiddelbar bruk (kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned, la det alltid likevekte romtemperatur før bruk).
    2. Fjern og rengjør arbeidsområdet med desinfeksjonsmiddel for å minimere forurensning.
    3. Aliquot 0,5 ml sterile Brain Heart Infusion media (BHI) i merkede 1,5 ml sterile mikrocentrifugerør (1 rør per mus og kontroll); ordnes i mikrosentrifugestativet. Sett stativet på is.
    4. Sett opp arbeidsflyt som følger (fra venstre til høyre): musbedøvelsesstasjon (bur som inneholder eksperimentelle mus, tomt sterilt bur, romtemperaturbedøvelse, 25 G nål og 1 ml sprøyte), øyeswabbingstasjon (aliquoted BHI på is, steriliserte øyepinner, rene papirhåndklær, 70% isopropanolspray) og platingstasjon (romtemperaturblod agarplater, 10 μL , 10 μL sterile engangstips, biofare avfallsbeholder).
  3. Øye swabbing
    1. Administrer 10 μL anestesi per 1 g musevektdosering av henholdsvis ketamin og xylazin intraperitonealt til hver voksen mus og plasser i et autoklavert bur. Test bedøvelse ved å klemme bakfotputen; ingen bevegelse indikerer passende bedøvelse.
    2. Tildel den ene hånden for å bare håndtere bedøvede mus og den andre hånden for å bare håndtere øyepinnen og kulturen. For swabbing, fjern den fullstendig bedøvede musen fra buret; på toppen av en ren arbeidsflate plassert på siden med venstre øye eksponert. Spray hanskede hender med isopropanol, tørk med rent papirhåndkle.
    3. Uncap spesielt merket BHI mikro-sentrifuge rør med dedikert mediehåndtering hånd. Sett røret tilbake i mikrosentrifugestativet på is.  Dypp den bomullsbelagte spissen av øyepinnen i BHI, trekk øyepinnen ut av røret som virvler spissen 2 ganger mot det indre røret for å fjerne overflødig væske.
    4. Med musens håndteringshånd holder du forsiktig musen ved halsen. Med den annen side, plasser spissen av øyepinne mot medial konjunktivalområdet i venstre øye, se figur 2A. Trykk øyebollet lett ned og beveg vattpinnen i en vindusvaskbevegelse (Figur 2B) frem og tilbake, mellom nedre øyelokk og øye, 10 ganger. Oppretthold konstant trykk.
    5. Uten å berøre pelsen, fjern forsiktig spissen av vattpinnen, vinkelrett på hvor den ble satt inn, og plasser vattpinne bomullssiden direkte ned i et merket mikrosentrifugerør som inneholder BHI-medier. Påfør en smørende øyedråpe på det vattende øyet.
    6. Returner musen til buret.
    7. La vattpinnen stå i 10 til 15 minutter på isen og fjern øyepinnen med den steriliserte hanskede hånden ved å blande spissen i mediet i 10 rotasjoner. Trekk vattpinnen ved å virvle spissen mot den indre veggen på mikrosentrifugerøret i 5 rotasjoner. Kast vattpinnen i biofarebeholderen.
    8. Gjenta trinn 1.3.2 til 1.3.7 for hver mus og for kontrollprøver (skall eller pelspinne). Steriliser hansker på riktig måte mellom hver vattpinne.
  4. anriking
    1. Berik prøven ved å inkubere røret statisk i 1 time ved 37 °C
    2. Under inkubasjon, merk en romtemperatur Trypticase Soy med 5% saueblodagarplate (TSA-plate) per mus og del i halvparten.
    3. Etter øyepinnekulturinkubasjon, fjern berikede prøver fra inkubatoren og legg på is.
    4. Kort virvelprøver for å blande og plate i henhold til skjematisk i figur 3A. Aliquot 10 μL av prøven på TSA-platen og vipp platen for å danne en stripe, gjenta 2 ganger.
    5. På den andre siden av platens delelinje, prikk 10 μL prøve på agar, gjenta 9 ganger.
    6. Inkuber plater ved 37 °C i 18 timer, 2 dager og 4 dager (i et rent kammer som forhindrer at agarplater tørker). Telle kolonier i strimler, notere morfologi og beregne kolonidannende enheter (CFUer) per vattpinne for morfologisk lignende isolasjoner. Se på prikker for unike organismer som ikke er fanget i strimler.

2. Masterplate, karakterisering og identifisering av okulære mikrober

  1. Hovedplate
    1. Tegn rutenett på baksiden av en TSA-plate (Figur 3B). Velg en koloni med en steril tannpirker fra hver museøyepinneplate og strekk hovedplaten firkantet (rutenett), etikettgitter med koloninummer og museinformasjon. Plukk og plate tre forskjellige kolonier for hver morfologisk distinkt koloni.
    2. Inkuber platen over natten ved 37 °C. Fortsett inkubasjon i 96 timer, sjekk daglig for utseendet av nye isolasjoner.
      MERK: Commensal-befolkningen vil variere avhengig av musalder, ernæring, sykdomstilstand og caging praksis. Isoler karakterisering er basert på de dominerende aerobe og fakultets anaerobe bakteriene som finnes i laboratoriet vårt.
  2. Karakterisering
    1. Dupliser13 platemikrober på Mannitol Salt Agar (MSA) og MacConkey (MAC)-plater, inkuber over natten ved 37 °C. Legg merke til vekst for hver isolering og tilstedeværelse av voksaktige kolonier eller gule kolonier med halo på MSA.
    2. For Gram positiv cocci, test med katase test13,14. Legg en dråpe 3% hydrogenperoksid på en ren glasssklie. Bruk en steril tannpirker, velg den tilsvarende mikroben fra øyepinneplaten. Ingen bobledannelse indikerer Streptococcus spp., liten bobledannelse indikerer Corynebacterium spp. og kanskje Aerococcus spp. og rask bobledannelse indikerer Staphylococcus spp.
  3. Identifikasjon: MALDI-TOF MS-analyse
    MERK: Bakterielle identifikasjoner utføres ved hjelp av MALDI-TOF og Software Database. Dette systemet bruker matriseassistert laseravledningsioniseringstid for flymassespektrometri (MALDI-TOF MS) for å utvikle spektraprofiler som sammenlignes med kjent bakteriespektra for identifikasjon. E.coli, ATCC 8739, brukes til systemkalibrering.
    1. Platebakterielle isolerer på TSA-plater som inneholder 5% saueblod og inkuberer over natten med 5% karbondioksid ved 37 °C.
    2. Bruk en 1 μL sløyfe til å påføre et tynt lag av de rene bakteriene på maldivet-TILF-målsklien. 1 μL MALDI-TOF MS CHCA matriseløsning (alfa-cyano-4-hydroksycinnamic acid) er lagt over og får lufttørke helt før du laster lysbildet inn i MALDI-TOF-instrumentet.
    3. Hver isoler oppdages i duplikat.
    4. Rapporter som inneholder sannsynlighetspoeng som er større enn 80 %, noe som indikerer en høy diskrimineringsverdi, godtas som pålitelige resultater og bakterieidentifikasjonen aksepteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative resultater for en øyepinneplate som demonstrerer forskjellige metoder for plating er avbildet i figur 3A som viser morfologiske forskjellige isolasjoner fra C57BL / 6 mus. For hver distinkt isolasjon ble koloniene telt i stripen og den relative overfloden, unike Colony Forming Units (CFUer) per øyepinne, beregnet og plottet for sammenligningsformål. For mikrobiologisk karakterisering ble bakterier plukket fra individuelle museøyepinneplater for å produsere en master TSA-plate (opprettet ved å plukke morfologiske distinkte isolasjoner i triplikat fra hver museøyepinneplate). Fra hovedplaten, på den påfølgende dagen eller når veksten vises, ble ytterligere tester kjørt for å karakterisere eller identifisere mikrober. Hovedplaten ble brukt til å gi nok inokulum til å utvide de respektive isolasjonene.

Arten ble karakterisert ved hjelp av mikrobiologiske teknikker og deretter identifisert av MALDI-TOF MS-analyse. Hver isolerer fra hovedplaten, ble testet ved katasetest13,14 og vokst på selektive medier. Siden de dominerende mikrober i våre studier er Streptococcus spp., Staphylococcus spp. og Corneybacterium spp., Mannitol Salt Agar (MSA) og Mac Conkey Agar (MAC) ble brukt som selektiv agar13. Vekst på Mannitol Salt Agar indikerer Staphylococcus spp13,16. Siden MSA inneholder fenolrød, indikerer en gul glorie rundt kolonien mannitolgjæring og klassifisering som Staphylococcus aureus (bekreft med alternative tester som Coagulase test)13. Vekst på MacConkey agar indikerer Gram negative bakterier, siden gallesalter og krystallfiolett er i stand til å overskride bakteriemembranen og hemme Gram positiv bakterievekst13. Voksaktig vekst på MSA indikerer produksjon av myksyre og kan skyldes organismer som Corneybacterium spp13. Til slutt skiller katarasetesten Streptococcus spp. fra Staphylococcus spp13,16, og i noen tilfeller kan en svak positiv test indikere Aerococcus spp15.

For å identifisere isolasjoner ble en TSA-plate strødd og inkubert over natten i et 5% karbondioksid og 37 °C miljø og MALDI-TOF MS utført. Figur 4 viser resultatene S. acidominimus (medlem av viridans Streptococcus spp. 17) og A. viridans. Ofte Aerococcus spp. misidentifisert som viridansgruppen streptokokker18,19, basert på biokjemiske og fenotypiske tester. MALDI-TOF MS var i stand til å identifisere isolasjonene med et tillitsnivå på 99,9 uten uidentifiserbare arter.

Kjønnsforskjeller kan observeres i figur 5, hvor betydelig forskjellige nivåer av kommensale organismer ble gjenopprettet fra mannlige og kvinnelige C57BL / 6 mus. Den relative overfloden for hver isolasjon ble bestemt. Streptokokker acidominimus, Aerococcus viridans og coagulase negative stafylokokker (CNS) isolerer #1 og E. coli spp. ble funnet hos alle mus, med hannene som viste høyere relativ overflod og større mangfold.

Figure 1
Figur 1: Intern øyepinne.
(A) Et tynt, ca. 1 cm, stykke trukket bomullsslaging ble holdt mellom det sterile tannpirkerpunktet og pekefingeren, og tannpirkeren ble rullet samtidig som det opprettholdes et lite trykk mot pekefingeren til bomullen ble fullstendig rullet på tannpirkerspissen. (B) Eksempel på øyepinne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Plassering av musekonjunktiv øyepinne.
(A) BHI våt øyepinne spissen ble satt inn, i en 90 ° vinkel, inn i medial hjørnet av venstre øye av en bedøvet mus, deprimerende øyebollet. (B) Vattpinnen ble flyttet langs konjunktivene samtidig som den opprettholder et lite trykk på øyet i en frem og tilbake bevegelse, 10 ganger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater for øyepinnen og masterplatene.
(A) 10 μL øyepinne inokulert beriket media ble aliquoted på høyre side av blod agar plate og vippet 30 til 60 grader for å tillate media å danne strimler og på venstre side av platen, ti 10 μL prikker av prøven ble dispensert. Bildet av den inkuberte platen viser individuelle kolonier og morfologisk mangfold. (B) En hovedplate av isolasjoner ble opprettet ved å plukke en koloni fra øyepinneplaten og strekke seg innenfor en av rutene (rutenett). Tre morfologisk like kolonier er stripet i separate rutenett. Hvert rutenett har tre striper av samme koloni som ble plukket fra museøyepinneplaten. Etter at veksten dukket opp på platene, ble isolasjonen preget av selektiv plating og katasetesting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på MS-resultater for Maldiven-TILF.
Hver isolering ble dyrket på TSA over natten, brukt på MALDI-TOF MS lysbilde og lagt over med MALDI-TOF MS løsning, luft tørket og oppdaget i duplikat. Resultatene for Streptococcus acidominimus (A) og Aerococcus viridans (B) ble positivt identifisert med en konfidensverdi på 99,9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sex-partisk konjunktiv vekst.
Alderstilpassede C57BL6/N-mus ble sammenlignet med relativt kommensalt mangfold. Øynene ble vattsteins- og kommensale organismer identifisert. Den mest dominerende arten var Streptococcus acidominimus, som var betydelig mer rikelig hos mannlige enn kvinnelige mus (2-veis ANOVA, p<0.0001). 5 forskjellige CNS-isolasjoner ble identifisert, Aerococcus viridans og E.coli. Mens noen av CNS-isolasjonene ikke var til stede i alle mus, ble Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, CNS isolate 1 og E. coli funnet i alle mus med tydelig overflod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grunn av den paucibakterielle tilstanden til okulær overflate har mange laboratorier hatt problemer med å isolere okulære commensals7,20, noe som resulterer i lavt antall prøver med vekst, lav overflod og lavt mangfold8. Denne metoden forbedrer standard kulturpraksisbetydelig 4,21 ved å legge til et berikelsestrinn, samt en redesignet øyepinne og identifikasjon av MALDI-TOF MS. Berikelsestrinnet tar for seg lav utvinnbarhet ved å forsterke bakteriebelastningen. Den betydelige økningen i utvinnbare bakterier fra mindre enn 100 CFUer til den relative overfloden av 2500 CFUer per øyepinne for ville mannlige mus antyder at inkubasjon i næringsrike medier gjenoppliver levedyktige, men ikke-dyrkelige bakterier22,23, og dermed tillater utvinning av sovende mikrober. Nylige kulturbaserte berikelsestrinn har blitt innlemmet i mikrobiota molekylær sekvenseringsstudier for å muliggjøre diskriminering mellom verts- og mikrobielle uttrykkssignaturer24,25,26, og for å forsterke sjeldne slekter. Vårt protokollberikelsestrinn er det første som brukes på okulære mikrobiomestudier og benytter berikelse for å velge levende mikrober, utvide antall utvinnbare knappe isolasjoner og kanskje gjenopplive levedyktige, men ikke-kultiverbare commensals. Videre tillater vår egenproduserte øyepinne målrettet swabbing av konjunktivene, noe som reduserer forurensning fra omkringliggende hud / pels på grunn av sin lille størrelse og tynne spisse koniske form. Valget av vattpinnebeleggtykkelse og materiale er viktig21. Dette laboratoriet laget øyepinne er belagt med et tynt lag av ikke-giftig bomullsslag, som forhindrer swabbed commensal entrapment i vattpinnematerialet, samt å være å foretrekke å kalsiumalginat øyepinner som kan være cytoksiske27. Langsgående tester viser at vår metode er reproduserbar; med de dominerende bakteriene gjenvunnet fra øyepinner inkludert Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) og Corynebacterium spp. Disse resultatene er enige med publiserte funn for de dominerende fakultets anaerobe okulære slektene7,9,20 oppdaget via kulturbaserte eller bildebaserte metoder. Denne metoden har funnet et bredere spekter av isolasjoner i konjunktivene, inkludert Escherichia coli og Pseudomonas spp. Videre muliggjør identifiseringen av MALDI-TOF MS bedre diskriminering mellom slekter og arter, for eksempel viridansgruppen streptokokker og Aerococci spp. 19,28.

Tre trinn er avgjørende for å maksimere utfallet: øyepinneproduksjon, øyepinneteknikk og unikt isolerende utvalg fra øyepinneplaten. Som diskutert ovenfor er et veldig tynt flatt lag av bomull viktig for den første fangsten av commensals fra okulær overflate, så vel som for deres påfølgende utgivelse i berikelsesmediene. Tykke eller klumpete vattpinner kan føre til valg av forurensninger, samt beholde isolerer i vattpinnespissen. For det andre er kontinuerlig depresjon av øyebollet mens swabbing er nødvendig for å minimere forurensning fra omkringliggende overflater. Den ideelle swabbing teknikken innebærer normal (90 graders) innsetting av vattpinnen i medial dårligere konjunktival fornix og jevn swabbing trykk kombinert med langsom kontinuerlig bevegelse. Til slutt må øyepinneplaten overvåkes daglig for å velge for nylig vises isolerer eller de som vokser i en annen hastighet for å fullt ut fange det representative mikrobiomet.

Det er noen få protokollbegrensninger som kan løses med en klar forståelse av resultatene eller modifikasjonen av protokollen. Resultatene er et mål på relativ levedyktig commensal overflod, og ikke faktisk konjunktiv bakteriell byrde, med sikte på å definere okulære commensal samfunnet. Den relative overflod og mangfold har blitt brukt i våre studier for komparative formål i bakteriell keratitt, samt å undersøke den medfødte immunresponsen i knock-out og wild type mus12. I tillegg avhenger identifikasjon av MALDI-TOF MS av en betydelig database28, som gir et resultat av "ingen ID" for ukjente isolerte spektraprofiler, noe som fremhever viktigheten av å bruke en gjeldende database. Til slutt oppdager denne protokollen bare aerobe og fakultets anaerobe bakterier, men rammen er tilpasningsdyktig og kan bygges på for å bidra til å definere det okulære mikrobielle rommet ved modifikasjon av berikelsesmedier, platevekstforhold og utvalgsmedium. Ved å endre hovedplaten og berikelsesvekstforholdene til anaerob, kan en annen ofte isolert okulær commensal, Propionibacterium spp. eller andre anaerober, oppdages; Selv om vi i våre hender så nesten ingen anaerob vekst.

Kanskje kan dette rammeverket brukes sammen med dype DNA-sekvenseringsteknikker. Et stort hinder i mikrobeidentifikasjon via DNA-sekvensering er manglende evne til å vurdere levedyktighet10. Denne protokollen kan gi en ortogonal metode ved å endre berikelsesmedier og plating betingelser for å matche en kandidat isolerer (identifisert av DNA-sekvensering) foretrukne vekstkriterier. Dette kan resultere i en verdifull kulturbasert tilnærming for å fange opp commensals fra levedyktige, men ukulturelle bakterier eller nåværende, men lave overflodsarter.

Definisjon av det levedyktige okulære commensal samfunnet er avgjørende for å undersøke okulær commensal uttrykk profil. Bred forskning antyder at korte kjedefettsyrer og mikrobielle produkter modulerer okulær immunrespons3,29,30,31,32,33, og at deres handling skjer lokalt. Dette antyder at ikke bare er distal produksjon, men lokal produksjon av disse faktorene er viktig. Også sykdomstilstander som tørr øyesykdom og diabetes endrer okulær overflatemikrobiomet4,6,33,34. Dette understreker behovet for en metode som bygger bro over DNA-basert sekvensering samt kulturbaserte tilnærminger, slik at det levedyktige okulære mikrobiomet i helse og sykdom kan defineres bedre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

Støtte fra P30 DK034854 støttet VY, LB og studier i Massachusetts Host-Microbiome Center og finansiering fra NIH/NEI R01 EY022054 støttet MG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 to 10 µl pipet tip USA Scientific 1110-300 autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet Fisher Scientific 13-690-026
1 ml syringe Fisher Scientific BD309623 1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 autoclave before use
1000 µ ml pipet tip USA Scientific 1111-2021 autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) Fisher Scientific F123602G
25 G needle Fisher Scientific 14-826AA 1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide Fisher Scientific S25359
37 ° C Incubator Lab equipment
70 % Isopropanol Fisher Scientific PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) Santa Cruz Animal Health SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit Fisher Scientific B12539
Bunsen Burner Lab equipment
Clean paper towels Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton CVS
Disposable 1 ml Pipets Fisher Scientific 13-711-9AM for Gram stain and catalase tests
E.coli ATTC ATCC 8739
Glass slides Fisher Scientific 12-550-A3 for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml) Henry Schein 9950001
Mac Conkey Agar Plates Fisher Scientific 4321270 store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar Carolina Biological Supply 784641 Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice Jackson Labs C57/BL6J
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12 for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media Fisher Scientific 50-488525 prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) EMD/Millipore, Fisher Scientifc SCGP00525 to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube Fisher Scientific 430829 anesthesia preparation
Sterile mouse cage Lab equipment
Tooth picks (round bamboo) Kitchen Essentials autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates Fisher Scientific 4321261 store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution BioMerieux Inc. Durham, NC 411071
Single use eye drops CVS Pharmacy Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
  2. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
  3. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
  4. Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
  5. Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
  6. Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
  7. Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
  8. Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
  9. Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
  10. Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
  11. Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
  12. Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
  13. Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
  14. Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
  15. UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
  16. Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
  17. Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
  18. Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
  19. Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
  20. Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
  21. Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
  22. Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
  23. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
  24. Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
  25. Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
  26. Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
  27. Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
  28. Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
  29. Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
  30. Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
  31. Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
  32. Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
  33. Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
  34. Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 171 mus okulær eller konjunktiv mikrobiome unik øyepinne aerob / fakultets anaerob kommensal forsterkning mikrobiologisk klassifisering matriseassistert laser desorpsjonstid for flymassespektrofotometriidentifikasjon MALDI-TOF-identifikasjon relativ commensal overflod
Konjunktival commensal isolasjon og identifikasjon hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith-Page, K., Kugadas, A., Lin,… More

Smith-Page, K., Kugadas, A., Lin, T., Delaney, M., Bry, L., Gadjeva, M. Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice. J. Vis. Exp. (171), e61672, doi:10.3791/61672 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter