Summary
Здесь представлен протокол выделения и амплификации аэробных и факультативных анаэробных конъюнктивальных комменсальных бактерий мышей с использованием уникального глазного мазка и этапа обогащения на основе культуры с последующей идентификацией микробиологическими методами и масс-спектрометрией MALDI-TOF.
Abstract
Глазная поверхность когда-то считалась иммунной привилегированной и абиотической, но в последнее время кажется, что существует небольшое, но постоянное комменсальное присутствие. Идентификация и мониторинг видов бактерий в слизистой оболочке глаз были сложными из-за их низкой численности и ограниченной доступности соответствующей методологии для комменсального роста и идентификации. Существует два стандартных подхода: культуральные или методы секвенирования ДНК. Первый метод проблематичен из-за ограниченных восстанавливаемых бактерий, а второй подход идентифицирует как живые, так и мертвые бактерии, что приводит к аберрантному представлению глазного пространства. Мы разработали надежный и чувствительный метод бактериальной изоляции, основываясь на стандартных методах микробиологического культивирования. Это метод на основе тампонов, использующий «лабораторный» тонкий тампон, который нацелен на нижнюю конъюнктиву, за которым следует этап амплификации для аэробных и факультативных анаэробных родов. Этот протокол позволил нам выделить и идентифицировать виды конъюнктивы, такие как Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.и т. Д. Этот подход подходит для определения комменсального разнообразия у мышей в различных условиях заболевания.
Introduction
Целью этого протокола является усиление специфического выделения жизнеспособных и редких аэробных и факультативных анаэробных микробов из глазной конъюнктивы для характеристики глазного микробиома. Обширные исследования профилировали комменсальные сообщества слизистой оболочки на коже, кишечнике, дыхательных и половых путях и показывают, что эти сообщества влияют на развитие иммунной системы и ответ1,2,3. Было показано, что глазные комменсальные сообщества изменяются во время некоторых патологий заболевания, таких как болезнь сухого глаза4,синдром Шегрена5 и диабет6. Тем не менее, способность определять типичную комменсальную общность глазной поверхности затруднена их относительно низким содержанием по сравнению с другими участками слизистойоболочки 6,7,8. Это вызывает споры о том, существует ли резидентный глазной микробиом и если он существует, отличается ли он от микробиома кожи и, следовательно, его местное влияние на развитие и реакцию врожденной иммунной системы. Этот протокол может помочь решить этот вопрос.
Как правило, подходы к определению окулярной комменсальной ниши основаны на методах секвенирования и культуры4,7,9. 16 Секвенирование S рДНК и анализ BRISK7 показывают более широкое разнообразие, чем методы, основанные на культурах, но не могут различать живые и мертвые микробы. Поскольку поверхность глаза враждебна многим микробам из-за антимикробных свойств слезной пленки4, генерирующих большой массив фрагментов ДНК, подходы, основанные на ДНК, будут обнаруживать эти артефакты, которые могут исказить данные в сторону идентификации мертвых бактерий как резидентных комменсалов, а не загрязняющих веществ. Это приводит к аберрантной комменсальной идентификации и характеристике глазного пространства как более высокого по численности и разнообразию микробов10. Это затрудняет определение резидентного глазного микробиома с помощью методов на основе ДНК. Принимая во внимание, что стандартные методы, основанные на культуре, не могут обнаружить комменсалы, потому что нагрузка слишком низкая11. Наш метод улучшает стандартную практику, используя тонкий тампон, который может нацеливаться на конъюнктиву, тем самым избегая загрязнения от соседней кожи, а также концепцию, что жизнеспособные организмы могут быть обогащены кратковременной культурой в питательных плотных средах с целью реанимации жизнеспособных, но не культивируемых, а также обогащения редкими жизнеспособными микробами.
Результаты, относительное обилие глазных комменсалов на глазной мазок, характеризуют конъюнктивный резидентный микробиом и важны для сравнительных целей. Наши данные показывают, что существует разница между микробиотой кожи и конъюнктивы, а также большее разнообразие с увеличением возраста и специфической для пола разницей в изобилии. Кроме того, этот подход воспроизводимо обнаружил комменсальные различия у нокаут-мышей12. Этот протокол может быть применен для описания глазного микробиома, который может варьироваться из-за практики клетки, географии или состояния заболевания, а также местных эффектов комменсальных метаболитов и продуктов на развитие и реакцию иммунной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием мышей соответствуют руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Следуйте лабораторным рекомендациям по безопасности (по указанию вашего институционального отдела гигиены и безопасности окружающей среды) при работе с микроорганизмами и потенциально загрязненными материалами. Использовать соответствующие сосуды для отходов и процедуры дезактивации до удаления потенциально биологически опасных загрязненных материалов.
1. Подготовка глазного тампона, настройка рабочего поля, мазок глаз мыши и обогащение образца
- Подготовьте стерильные глазные тампоны
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные глазные тампоны представляют собой тонко покрытые деревянные зубочистки с тонким волокнистым слоем хлопчатобумажной ватины и изготовленные в домашних условиях.- Автоклав соответствующего количества хлопчатобумажных ватин и зубочисток для количества мышей, которые должны быть промапаны.
- Отщипьте кусок хлопчатобумажной ваты длиной в полсантиметра большим и указательным пальцами. Дразните ватин, потянув за края большими и указательными пальцами, чтобы сформировать плоский одиночный пористый слой, останавливаясь непосредственно перед тем, как ватин развалится (допускаются небольшие кусочки хлопка, рассеянные по всему растянутой ватине).
- Покрутите ватин вокруг одного из острых концов зубочистки, слегка удерживая растянутый кусок на кончике зубочистки, когда он скручен, см. Рисунок 1. «Завершенный» тампон для глаз будет иметь очень тонкий слой хлопка, натянутый на кончик, простирающийся примерно на половину до одного сантиметра от кончика.
- Вставьте «готовые» тампоны в маленький яблочник, смаковейте его стороной вниз и накройте крышкой. автоклав.
- Настройка рабочей области
- Готовят анестезию, содержащую 2 мл кетамина (100 мг/мл), 400 мкл ксилазина (100 мг/мл) и 27,6 мл стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl в dH2O) в стерильной 50 мл стерильной центрифужной трубке. Фильтр стерилизуют и аликвотную анестезию для немедленного применения (могут храниться при 4 °C в течение 1 месяца; всегда позволяют уравновесить до комнатной температуры перед использованием).
- Очистите и очистите рабочую зону дезинфицирующим средством, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- Aliquot 0,5 мл стерильной мозговой инфузионной среды сердца (BHI) в меченые 1,5 мл стерильных микроцентрифужных пробирок (1 трубка на мышь и контроль); устроить в стойку микроцентрифуги. Установите стойку на лед.
- Настройка рабочего потока следующим образом (слева направо): станция анестезии мыши (клетка, содержащая экспериментальных мышей, пустая стерильная клетка, анестезия комнатной температуры, игла 25 Г и шприц 1 мл), станция для мазка глаз (аликвотированный BHI на льду, стерилизованные глазные тампоны, чистые бумажные полотенца, 70% изопропаноловый спрей) и станция покрытия (пластины для агара крови комнатной температуры, пипетка 10 мкл , 10 мкл стерильных одноразовых наконечников, контейнер для отходов биологической безопасности).
- Мазок глаз
- Вводят 10 мкл анестезии на 1 г мышиной массы дозы кетамина и ксилазина соответственно внутрибрюшинно каждой взрослой мыши и помещают в автоклавную клетку. Испытать анестезию путем сдавливания подушечки задней ноги; ни одно движение не указывает на надлежащую анестезию.
- Назначьте одну руку, чтобы обрабатывать только анестезированных мышей, а другую руку, чтобы обрабатывать только мазок из глаз и культуру. Для мазка извлеките из клетки полностью обезболенную мышь; поместить поверх чистой рабочей поверхности, расположенной на боку с открытым левым глазом. Распылите на руки в перчатках изопропанол, сухая чистым бумажным полотенцем.
- Специально маркированная трубка для микроцентрифуги BHI с специальной рукой для обработки среды. Поместите трубку обратно в стойку микроцентрифуги на льду. Окуните покрытый ватой кончик глазного тампона в BHI, выньте глазной тампон из трубки, вращая наконечник 2 раза о внутреннюю трубку, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Рукой мыши осторожно держите мышь за шею. Другой рукой поместите кончик глазного тампона против медиал-конъюнктивальной области левого глаза, см. Рисунок 2А. Слегка прижмите глазное яблоко и переместите тампон в движении мытья окна(рисунок 2B)вперед и назад, между нижним веком и глазом, 10 раз. Поддерживайте постоянное давление.
- Не касаясь меха, аккуратно извлеките кончик тампона, перпендикулярно тому месту, куда он был вставлен, и поместите тампон ватной стороной вниз непосредственно в меченую микроцентрифужную трубку, содержащую жижи BHI. Нанесите смазывающую глазную каплю на смазанный глаз.
- Верните мышь в клетку.
- Дайте тампону постоять в течение 10-15 минут на льду и удалите глазной тампон стерилизованной рукой в перчатке, перемешав наконечник в среде в течение 10 оборотов. Выньте тампон закручивающимся наконечником о внутреннюю стенку трубки микроцентрифуги на 5 оборотов. Утилизируйте тампон в контейнере для биологической области.
- Повторите шаги 1.3.2-1.3.7 для каждой мыши и для контрольных образцов (мазок из кожи или меха). Стерилизуйте перчатки соответствующим образом между каждым тампоном.
- обогащение
- Обогащайте образец путем статической инкубации трубки в течение 1 ч при 37 °C
- Во время инкубации маркируют одну триптиказу сои комнатной температуры 5% агаром овечьей крови (пластина TSA) на мышь и делят пополам.
- После инкубации посева мазка глаз вынимают обогащенные образцы из инкубатора и помещают на лед.
- Кратко вихревые образцы смешать и нанести по схеме на рисунке 3А. Аликвота 10 мкл образца на пластину TSA и наклон пластины для формирования полосы, повторите 2 раза.
- С другой стороны разделительной линии пластины, уставьте точку 10 мкл образца на агаров, повторите 9 раз.
- Инкубировать пластины при 37 °C в течение 18 ч, 2 дней и 4 дней (в чистой камере, которая предотвращает высыхание агаровых пластин). Подсчитайте колонии в полосках, обратите внимание на морфологию и рассчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) на мазок для морфологически сходных изолятов. Посмотрите на точки для уникальных организмов, не захваченных в полосках.
2. Главная пластина, характеристика и идентификация глазных микробов
-
Мастер-пластина
- Нарисуйте сетки на обратной стороне пластины TSA(рисунок 3B). Выберите колонию со стерильной зубочисткой из каждой пластины для тампона глаз мыши и проведите квадрат (сетки) мастер-пластины, сетку меток с номером колонии и информацию о мыши. Выберите и размахйте три разные колонии для каждой морфологически отличной колонии.
- Инкубировать пластину в течение ночи при 37 °C. Продолжайте инкубацию в течение 96 часов, ежедневно проверяя появление новых изолятов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Комменсальная популяция будет варьироваться в зависимости от возраста мыши, питания, состояния болезни и практики ведения в цех. Характеристика изолята основана на преобладающих аэробных и факультативных анаэробных бактериях, обнаруженных в нашей лаборатории.
-
характеристика
- Дубликаты13 пластинчатых микробов на пластинах Маннитол Соляной Агар (MSA) и МакКонки (MAC), инкубируются в течение ночи при 37 °C. Обратите внимание на рост для каждого изолята и наличие восковых колоний или желтых колоний с ореолом на MSA.
- Для грамположительных кокков тест с каталазойтест 13,14. Поместите каплю 3% перекиси водорода на чистую стеклянную горку. Используя стерильную зубочистку, выхватывайте соответствующий микроб из глазной тампоновой пластины. Отсутствие образования пузырьков указывает на Streptococcus spp.,незначительное образование пузырьков указывает на Corynebacterium spp. и, возможно, Aerococcus spp., а быстрое образование пузырьков указывает на Staphylococcus spp.
-
Идентификация: анализ MALDI-TOF MS
ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная идентификация осуществляется с использованием MALDI-TOF и базы данных программного обеспечения. Эта система использует матричную лазерную десорбционную ионизацию масс-спектрометрии времени полета (MALDI-TOF MS) для разработки профилей спектров, которые сравниваются с известными бактериальными спектрами для идентификации. E.coli,ATCC 8739, используется для калибровки системы.- Пластинчатые бактериальные изоляты на пластинах TSA, содержащих 5% овечьей крови, и инкубируют в течение ночи с 5% углекислым газом при 37 °C.
- Используя петлю 1 мкл, нанесите тонкий слой чистых бактерий на целевой слайд MALDI-TOF; 1 мкл матричного раствора MALDI-TOF MS CHCA (альфа-циано-4-гидроксициновая кислота) накладывают и дают полностью высохнуть на воздухе перед загрузкой слайда в прибор MALDI-TOF.
- Каждый изолят замечен в двух экземплярах.
- Отчеты, содержащие оценки вероятности более 80%, которые указывают на высокое значение дискриминации, принимаются как надежные результаты, а бактериальная идентификация принимается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные результаты для глазной тампоновой пластины, демонстрирующие различные методы нанесения покрытия, изображены на рисунке 3A, показывающем морфологически разнообразные изоляты от мыши C57BL/6. Для каждого отдельного изолята колонии были подсчитаны в полосе и относительное изобилие, уникальные колониеобразующие единицы (КОЕ) на глазной мазок, рассчитаны и построены для целей сравнения. Для микробиологической характеристики бактерии были отобраны из отдельных пластин для мазков глаз мыши для получения главной пластины TSA (созданной путем выбора морфологически отличных изолятов в трехместном размере от каждой пластины мазка глаза мыши). С главной пластины на следующий день или при появлении роста были проведены дополнительные тесты для характеристики или идентификации микробов. Мастер-пластина использовалась для обеспечения достаточного количества инокулята для расширения соответствующих изолятов.
Виды были охарактеризованы с использованием микробиологических методов, а затем идентифицированы анализом MALDI-TOF MS. Каждый изолят из мастер-пластины тестировал каталазным тестом13,14 и выращивали на селективных средах. Поскольку преобладающими микробами в наших исследованиях являются Streptococcus spp., Staphylococcus spp. и Corneybacterium spp., в качестве селективного агара13использовались маннитоловый солевой агар (MSA) и агар Мак Конки (MAC). Рост на маннитоловом солью агаров указывает на стафилококк spp13,16. Поскольку MSA содержит фенол красный, желтый ореол вокруг колонии указывает на ферментацию маннитола и классификацию как Staphylococcus aureus (подтверждается альтернативными тестами, такими как тест коагулазы)13. Рост на агаре МакКонки указывает на грамотрицательные бактерии, так как желчные соли и кристаллическая фиалка способны трансгрессировать бактериальную мембрану и ингибировать грамположительный рост бактерий13. Восковой рост на MSA указывает на выработку миколиновой кислоты и может быть связан с такими организмами, как Corneybacterium spp13. Наконец, тест каталазы дифференцирует Streptococcus spp. от Staphylococcus spp13,16,а в некоторых случаях слабый положительный тест может указывать на Aerococcus spp15.
Для идентификации изолятов пластину TSA проводили и инкубировали в течение ночи в среде с содержанием углекислого газа 5% и 37 °C, и выполняли MALDI-TOF MS. На рисунке 4 показаны результаты S. acidominimus (входит в состав вириданов Streptococcus spp. 17)и A. viridans. Часто Aerococcus spp. ошибочно идентифицированы как виридановая группа стрептококков18,19,на основе биохимических и фенотипических тестов. MALDI-TOF MS удалось идентифицировать изоляты с уровнем достоверности 99,9 без неидентифицируемых видов.
Различия в половых различиях можно наблюдать на рисунке 5,где у самцов и самок мышей C57BL/6 были извлечены значительно разные уровни комменсальных организмов. Определяли относительную численность для каждого изолята. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans и coagulase отрицательный стафилококк(ЦНС)выделяют #1 и E. coli spp. были обнаружены у всех мышей, причем самцы показали более высокую относительную численность и большее разнообразие.
Рисунок 1: Мазок из глаз.
Тонкий,примерно 1 см, кусок вытянутой ватной ваты удерживался между стерильной точкой зубочистки и указательным пальцем, и зубочистка сворачивалась, сохраняя небольшое давление на указательный палец, пока хлопок не был полностью свернут на кончик зубочистки. (B) Пример мазка из глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Размещение мазка из конъюнктивы глаз мыши.
(A)Кончик влажного тампона BHI был вставлен под углом 90° в медиальный угол левого глаза анестезированной мыши, угнетая глазное яблоко. (B)Тампон перемещался вдоль конъюнктивы, сохраняя при этом небольшое давление на глаз в движении вперед и назад, 10 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты для глазного тампона и мастер-пластин.
(A)10 мкл глазного тампона, инокулированного обогащенного среды, аликвотировали на правой стороне пластины агара крови и наклоняли на 30-60 градусов, чтобы позволить среде образовывать полоски, а на левой стороне пластины дозировали десять 10 мкл точек образца. На фотографии инкубированной пластины показаны отдельные колонии и морфологическое разнообразие. (B)Главная пластина изолятов была создана путем выбора колонии из глазной тампонной пластины и распыления в пределах одного из квадратов (сеток). Три морфологически похожие колонии разделены отдельными сетками. Каждая сетка имеет три полосы той же колонии, которая была выбрана из пластины для мазка глаз мыши. После того, как на пластинах появился рост, изолят характеризовался селективным покрытием и каталазным тестированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример результатов MALDI-TOF MS.
Каждый изолят культивировали на TSA в течение ночи, наносили на слайд MALDI-TOF MS и накладывали раствор MALDI-TOF MS, сушили на воздухе и пятнистили в двух экземплярах. Результаты для Streptococcus acidominimus (A)и Aerococcus viridans (B)были положительно идентифицированы с доверительным значением 99,9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Смещенный по полу комменсальный рост конъюнктивы.
Соответствующих возрасту мышей C57BL6/N сравнивали по относительному комменсальному разнообразию. Глаза были замаспаны, а комменсальные организмы идентифицированы. Наиболее преобладающим видом был Streptococcus acidominimus,который был значительно более распространен у самцов, чем у самок мышей (2-way ANOVA, p<0.0001). Было идентифицировано 5 различных изолятов ЦНС, Aerococcus viridans и E.coli. В то время как некоторые из изолятов ЦНС присутствовали не у всех мышей, Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, изолят ЦНС 1 и E. coli были обнаружены у всех мышей с различнымизобилием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за пауцибактериального состояния глазной поверхности многие лаборатории испытывали трудности с выделением глазных комменсалов7,20,что приводило к низкому количеству образцов с ростом, низкой численностью и низким разнообразием8. Этот метод значительно улучшает стандартную культурную практику4,21 путем добавления этапа обогащения, а также переработанного мазка для глаз и идентификации MALDI-TOF MS. Этап обогащения направлен на решение проблемы низкой восстанавливаемости путем усиления бактериальной нагрузки. Значительное увеличение количества восстанавливаемых бактерий с менее чем 100 КОЕ до относительного изобилия 2 500 КОЕ на глазной мазок для самцов мышей дикого типа предполагает, что инкубация в богатых питательными веществами средах оживляет жизнеспособные, но некультивируемые бактерии22,23,что позволяет восстанавливать спящие микробы. Недавние этапы обогащения на основе культур были включены в исследования молекулярного секвенирования микробиоты, чтобы обеспечить дискриминацию между сигнатурами экспрессии хозяина и микроба24,25,26и ампликации редких родов. Наш этап обогащения протокола является первым, который будет применен к исследованиям глазного микробиома и использует обогащение для отбора живых микробов, расширения числа восстанавливаемых дефицитных изолятов и, возможно, реанимации жизнеспособных, но не поддаются культивированию комменсалов. Кроме того, наш домашний тампон для глаз позволяет целенаправленно мазать конъюнктиву, уменьшая загрязнение окружающей кожи / меха благодаря ее небольшому размеру и тонкой заостренной конусообразной форме. Важен выбор толщины и материала тампонного покрытия21. Этот лабораторный глазной тампон покрыт тонким слоем нетоксичной ватной ваты, которая предотвращает смазывание комменсальной ловушки в материале тампона, а также, будучи предпочтительнее альгинатных глазных тампонов кальция, которые могут быть цитоксичными27. Продольные испытания показывают, что наш метод воспроизводим; с доминирующими бактериями, извлеченными из глазных тампонов, включая Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) и Corynebacterium spp. Эти результаты согласуются с опубликованными результатами для доминантных факультативных анаэробных глазных родов7,9,20, обнаруженных с помощью методов, основанных на культуре или визуализации. Этот метод обнаружил более широкий спектр изолятов в конъюнктиве, включая Escherichia coli и Pseudomonas spp. Кроме того, идентификация MALDI-TOF MS позволяет лучше различать роды и виды, такие как группа стрептококков viridans и Aerococci spp. 19,28.
Три шага имеют решающее значение для максимизации результата: производство глазного тампона, техника глазного тампона и уникальный выбор изолята из глазной тампоновой пластины. Как обсуждалось выше, очень тонкий плоский слой хлопка важен для первоначального захвата комменсалов с глазной поверхности, а также для их последующего высвобождения в обогащенную жиму. Толстые или комковатые тампоны могут привести к выбору загрязняющих веществ, а также к сохранению изолятов в кончике тампона. Во-вторых, постоянное угнетение глазного яблока во время мазка необходимо для минимизации загрязнения окружающих поверхностей. Идеальная техника мазка включает в себя нормальное (90 градусов) введение тампона в медиальную нижнюю конъюнктивальную форникс и устойчивое давление мазка в сочетании с медленным непрерывным движением. Наконец, пластина глазного тампона должна ежедневно контролироваться для выбора вновь появляющихся изолятов или тех, которые растут с другой скоростью, чтобы полностью захватить репрезентативный микробиом.
Существует несколько ограничений протокола, которые могут быть устранены с четким пониманием результатов или модификации протокола. Результаты являются мерой относительно жизнеспособной комменсальной численности, а не фактической конъюнктивальной бактериальной нагрузки, с целью определения глазной комменсальной общности. Относительное изобилие и разнообразие были использованы в наших исследованиях для сравнительных целей при бактериальном кератите, а также для изучения врожденного иммунного ответа у нокаут-и диких мышей12. Кроме того, идентификация с помощью MALDI-TOF MS зависит от существенной базы данных28,что дает результат «no ID» для неизвестных профилей спектров изоляции, подчеркивая важность использования текущей базы данных. Наконец, этот протокол обнаруживает только аэробные и факультативные анаэробные бактерии, но его структура адаптируема и может быть построена, чтобы помочь определить глазное микробное пространство путем модификации сред обогащения, условий роста пластин и селекционной среды. При изменении главной пластины и условий роста обогащения на анаэробные, тогдаможет быть обнаружен другой обычно изолированный глазной комменсал, Propionibacterium spp. или другие анаэробы; Хотя, в наших руках мы почти не видели анаэробного роста.
Возможно, эта структура может быть использована в сочетании с методами глубокого секвенирования ДНК. Основным препятствием в идентификации микробов с помощью секвенирования ДНК является неспособность оценить жизнеспособность10. Этот протокол может обеспечить ортогональный способ путем модификации сред обогащения и условий покрытия в соответствии с предпочтительными критериями роста изолята-кандидата (идентифицированного секвенированием ДНК). Это может привести к ценному культуральному подходу к захвату комменсалов от жизнеспособных, но неультивируемых бактерий или присутствующих, но малообеспеченных видов.
Определение жизнеспособного глазного комменсального сообщества имеет важное значение для изучения профиля глазной комменсальной экспрессии. Широкие исследования показывают, что короткоцепочечные жирные кислоты и микробные продукты модулируют глазной иммунный ответ3,29,30, 31,32,33и что их действие происходит локально. Это говорит о том, что важна не только дистальная продукция, но и местное производство этих факторов. Кроме того, болезненные состояния, такие как болезнь сухого глаза и диабет, изменяют микробиом глазной поверхности4,6,33,34. Это подчеркивает необходимость метода, который соединяет секвенирование на основе ДНК, а также подходы, основанные на культурах, чтобы жизнеспособный глазной микробиом в здоровье и болезни мог быть лучше определен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Финансирование от P30 DK034854 поддержало VY, LB и исследования в Массачусетском центре микробиома хозяина, а финансирование от NIH / NEI R01 EY022054 поддержало MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
