Summary
Présenté ici est un protocole pour l’isolement et l’amplification des bactéries commensales conjonctivales anaérobies aérobies et facultatives de souris utilisant un écouvillon unique d’oeil et une étape basée sur culture d’enrichissement avec l’identification suivante par des méthodes basées microbiologiques et la spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Abstract
La surface oculaire a été une fois considérée privilégiée et abiotique immunisée, mais récemment il s’affiche qu’il y ait une petite, mais persistante présence commensale. L’identification et la surveillance des espèces bactériennes au niveau de la muqueuse oculaire ont été difficiles en raison de leur faible abondance et de la disponibilité limitée de la méthodologie appropriée pour la croissance et l’identification commensales. Il existe deux approches standard : les méthodes de séquençage de l’ADN basées sur la culture ou les méthodes de séquençage de l’ADN. La première méthode est problématique en raison des bactéries récupérables limitées et la seconde approche identifie les bactéries vivantes et mortes conduisant à une représentation aberrante de l’espace oculaire. Nous avons développé une méthode robuste et sensible pour l’isolement bactérien en nous appuyant sur des techniques de culture microbiologique standard. Il s’agit d’une technique basée sur un écouvillon, utilisant un écouvillon mince « en laboratoire » qui cible la conjonctive inférieure, suivi d’une étape d’amplification pour les genres aérobies et anaérobies facultatifs. Ce protocole nous a permis d’isoler et d’identifier des espèces conjonctivales telles que Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. L’approche convient pour définir la diversité commensale chez les souris dans différentes conditions de maladie.
Introduction
Le but de ce protocole est d’améliorer l’isolement spécifique des microbes aérobies et anaérobies facultatifs viables et rares de la conjonctive oculaire pour caractériser le microbiome oculaire. Des études approfondies ont profilé les communautés muqueuses commensales sur la peau, l’intestin, les voies respiratoires et génitales et montrent que ces communautés influencent le développement du système immunitaire et la réponse1,2,3. Il a été démontré que les communautés commensales oculaires changent au cours de certaines pathologies, telles que la sécheresse oculaire4,le syndrome de Sjögren5 et le diabète6. Pourtant, la capacité de définir une communauté commensale de surface oculaire typique est entravée par leur abondance relativement faible par rapport aux autres sites muqueux6,7,8. Cela suscite une controverse sur l’existence d’un microbiome oculaire résident et, s’il existe, s’il diffère du microbiome cutané et, par conséquent, de son effet local sur le développement et la réponse du système immunitaire inné. Ce protocole peut aider à résoudre cette question.
Généralement, les approches pour définir la niche commensale oculaire sont basées sur des techniques de séquençage et de culture4,7,9. Le séquençage de l’ADNr 16 S et l’analyse BRISK7 montrent une plus grande diversité que les techniques basées sur la culture, mais sont incapables de faire la différence entre les microbes vivants et morts. Étant donné que la surface oculaire est hostile à de nombreux microbes en raison des propriétés antimicrobiennes du film lacryptique4 générant un large éventail de fragments d’ADN, les approches basées sur l’ADN détecteront ces artefacts qui peuvent biaiser les données vers l’identification des bactéries mortes en tant que commensaux résidents plutôt que contaminants. Il en résulte une identification et une caractérisation commensales aberrantes de l’espace oculaire comme étant plus élevées en abondance et en diversité microbles10. Il est donc difficile de définir le microbiome oculaire résident par des méthodes basées sur l’ADN. Considérant que les techniques standard basées sur la culture sont incapables de détecter les commensaux parce que la charge est trop faible11. Notre méthode améliore les pratiques standard en utilisant un écouvillon mince qui peut cibler la conjonctive, évitant ainsi la contamination de la peau voisine, ainsi que le concept selon lequel les organismes viables peuvent être enrichis par une brève culture dans des milieux denses en nutriments dans le but de ressusciter viable mais non cultivable, ainsi que d’enrichir pour les microbes viables rares.
Les résultats, l’abondance relative des commensaux oculaires par écouvillonnage oculaire, caractérisent le microbiome résident de la conjonctive et sont importants à des fins de comparaison. Nos données montrent qu’il y a une différence entre la peau et le microbiote conjonctival, ainsi qu’une plus grande diversité avec l’âge et une différence d’abondance spécifique au sexe. De plus, cette approche a permis de trouver de manière reproductible des différences commensales chez les souris knock-out12. Ce protocole peut être appliqué pour décrire le microbiome oculaire qui peut varier en raison des pratiques de mise en cage, de la géographie ou de l’état pathologique, ainsi que des effets locaux des métabolites et des produits commensaux sur le développement et la réponse du système immunitaire.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des souris suivent les lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux. Suivez les directives de sécurité du laboratoire (selon les directives de votre service d’intégrité et de sécurité environnementales en établissement) lorsque vous travaillez avec des micro-organismes et des matières potentiellement contaminées. Utiliser des récipients à déchets et des procédures de décontamination appropriés avant d’éliminer les matières potentiellement contaminées par des biorisques.
1. Préparation de l’écouvillonnage oculaire, mise en place du terrain de travail, écouvillonnage de l’œil de souris et enrichissement de l’échantillon
- Préparer des écouvillons oculaires stériles
REMARQUE: Les écouvillons stériles sont des cure-dents en bois finement enduits avec une fine couche de fibres de coton et fabriqués à l’interne.- Autoclave quantité appropriée de lamation de coton et de cure-dents pour le nombre de souris à écouvillons.
- Pincez un morceau de coton d’un demi-centimètre de long avec le pouce et l’index. Taquinez la batte en tirant sur les bords avec les pouces et les index pour former une seule couche poreuse plate, en s’arrêtant juste avant que la batte ne s’effondre (de petits morceaux de coton dispersés dans la batte étirée sont acceptables).
- Faites pivoter la batte autour de l’une des extrémités pointues du cure-dent en maintenant légèrement la pièce étirée sur la pointe du cure-dent pendant qu’elle est tordue , voir la figure 1. L’écouvillonnage oculaire « terminé » aura une très fine couche de coton tendue sur la pointe, s’étendant sur environ un demi-centimètre à un centimètre de la pointe.
- Insérer les écouvillons « terminés » dans le petit bécher, l’écouvillon côté vers le bas et le couvercle. autoclave.
- Configurer l’espace de travail
- Préparer une anesthésie contenant 2 mL de kétamine (100 mg/mL), 400 μL de xylazine (100 mg/ml) et 27,6 mL de solution saline stérile (NaCl à 0,9 % dans dH2O) dans un tube de centrifugation stérile de 50 mL. Stériliser le filtre et aliquoter l’anesthésie pour une utilisation immédiate (peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois; toujours laisser s’équilibrer à la température ambiante avant l’utilisation).
- Nettoyez et nettoyez l’aire de travail avec du désinfectant pour minimiser la contamination.
- Aliquote 0,5 mL de milieu stérile d’infusion de cœur de cerveau (BHI) dans des tubes de microcentrifugation stériles étiquetés de 1,5 mL (1 tube par souris et témoin); disposer en rack microcentrifuge. Placez le rack sur la glace.
- Configurez le flux de travail comme suit (de gauche à droite) : station d’anesthésie de souris (cage contenant des souris expérimentales, cage stérile vide, anesthésie à température ambiante, aiguille de 25 G et seringue de 1 ml), station d’écouvillonnage des yeux (BHI aliquoted sur glace, écouvillons stériles, serviettes en papier propre, pulvérisation d’isopropanol à 70 %) et station de placage (plaques de gélose au sang à température ambiante, pipette de 10 μL , 10 μL de décharges stériles jetables, contenant de déchets à biorisque).
- Écouvillonnage
- Administrer 10 μL d’anesthésie par 1 g de dose de kétamine et de xylazine respectivement par voie intrapéritonéale à chaque souris adulte et placer dans une cage autoclavée. Tester l’anesthésie en serrant le coussinet du pied arrière; aucun mouvement n’indique une anesthésie appropriée.
- Assignez une main pour ne manipuler que les souris anesthésiées et l’autre main pour ne manipuler que l’écouvillon oculaire et la culture. Pour l’écouvillonnage, retirez la souris entièrement anesthésiée de la cage; placer sur le dessus de la surface de travail propre positionnée sur son côté avec l’œil gauche exposé. Vaporisez les mains gantées avec de l’isopropanol, sec avec une serviette en papier propre.
- Uncap spécifiquement étiqueté tube micro-centrifugeuse BHI avec main de manipulation de support dédiée. Replacez le tube dans le rack de micro-centrifugeuse sur de la glace. Trempez la pointe enduite de coton de l’écouvillon dans BHI, retirez l’écouvillon oculaire du tube en faisant tourbillonner la pointe 2 fois contre la chambre à air pour éliminer l’excès de liquide.
- Avec la main de manipulation de la souris, tenez doucement la souris par la peau du cou. D’autre part, placez le bout de l’écouvillon contre la région conjonctivale médiale de l’œil gauche, voir la figure 2A. Relâchez légèrement le globe oculaire et déplacez l’écouvillon dans un mouvement de lavage de fenêtre(figure 2B)d’avant en arrière, entre la paupière inférieure et l’œil, 10 fois. Maintenez une pression constante.
- Sans toucher la fourrure, retirez délicatement la pointe de l’écouvillon, perpendiculairement à l’endroit où elle a été insérée, et placez le côté coton-tige de l’écouvillon directement dans un tube à micro-centrifugeuse étiqueté contenant un milieu BHI. Appliquez une goutte oculaire lubrifiante sur l’œil écouvillonné.
- Retournez la souris dans la cage.
- Laissez reposer l’écouvillon pendant 10 à 15 min sur de la glace et retirez l’écouvillonnage avec la main gantée stérilisée en mélangeant la pointe dans le support pendant 10 rotations. Retirer l’écouvillon en faisant tourbillonner la pointe contre la paroi interne du tube de micro-centrifugeuse pendant 5 rotations. Jetez l’écouvillon dans un contenant de biorisque.
- Répéter les étapes 1.3.2 à 1.3.7 pour chaque souris et pour les échantillons témoins (écouvillonnage de peau ou de fourrure). Stérilisez les gants de manière appropriée entre chaque écouvillon.
- enrichissement
- Enrichir l’échantillon en incubant le tube statiquement pendant 1 h à 37 °C
- Pendant l’incubation, étiquetez une trypticase à température ambiante Soja avec 5% de plaque de gélose sanguine de mouton (plaque TSA) par souris et divisez-la en deux.
- Après l’incubation de la culture par écouvillonnage oculaire, retirer les échantillons enrichis de l’incubateur et les placer sur de la glace.
- Brièvement des échantillons de vortex à mélanger et à plaquer selon le schéma de la figure 3A. Aliquote 10 μL de l’échantillon sur la plaque TSA et incliner la plaque pour former une bande, répéter 2 fois.
- De l’autre côté de la ligne de séparation de la plaque, point 10 μL d’échantillon sur gélose, répéter 9 fois.
- Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 h, 2 jours et 4 jours (dans une chambre propre qui empêche les plaques de gélose de sécher). Comptez les colonies en bandes, notez la morphologie et calculez les unités formant colonies (UFC) par écouvillon pour les isolats morphologiquement similaires. Regardez les points pour les organismes uniques qui ne sont pas capturés dans des bandes.
2. Plaque maîtresse, caractérisation et identification des microbes oculaires
-
Plaque maîtresse
- Dessinez des grilles à l’arrière d’une plaque TSA (Figure 3B). Choisissez une colonie avec un cure-dent stérile dans chaque plaque d’écouvillonnage des yeux de souris et stries le carré de la plaque maîtresse (grilles), étiquetez la grille avec le numéro de colonie et les informations sur la souris. Choisissez et plaquez trois colonies différentes pour chaque colonie morphologiquement distincte.
- Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C. Poursuivre l’incubation pendant 96 heures, en vérifiant quotidiennement l’apparition de nouveaux isolats.
REMARQUE: La population commensale variera en fonction de l’âge de la souris, de la nutrition, de l’état de la maladie et des pratiques de mise en cage. La caractérisation des isolats est basée sur les bactéries anaérobies aérobies et facultatives prédominantes trouvées dans notre laboratoire.
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caractérisation
- Dupliquer13 microbes sur les plaques de gélose au sel de mannitol (MSA) et de MacConkey (MAC), incuber pendant la nuit à 37 °C. Notez la croissance pour chaque isolat et la présence de colonies cireuses ou de colonies jaunes avec halo sur MSA.
- Pour les cocci Gram positif, test avec le test de catalase13,14. Placez une goutte de peroxyde d’hydrogène à 3% sur une lame de verre propre. À l’aide d’un cure-dent stérile, choisissez le microbe correspondant dans la plaque d’écouvillonnage oculaire. Aucune formation de bulles n’indique Streptococcus spp.,une légère formation de bulles indique Corynebacterium spp. et peut-être Aerococcus spp. et la formation rapide de bulles indique Staphylococcus spp.
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Identification : Analyse maldi-tof ms
REMARQUE: Les identifications bactériennes sont effectuées à l’aide du MALDI-TOF et de la base de données logicielle. Ce système utilise la spectrométrie de masse à ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) pour développer des profils de spectres qui sont comparés aux spectres bactériens connus pour l’identification. E.coli, ATCC 8739, est utilisé pour l’étalonnage du système.- Plaquer les isolats bactériens sur les plaques de TSA contenant 5% de sang de mouton et incuber pendant la nuit avec 5% de dioxyde de carbone à 37 °C.
- À l’aide d’une boucle de 1 μL, appliquez une fine couche de bactéries pures sur la lame cible MALDI-TOF; 1 μL de solution matricielle MALDI-TOF MS CHCA (acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) est superposée et laissée sécher complètement à l’air avant de charger la lame dans l’instrument MALDI-TOF.
- Chaque isolat est repéré en double.
- Les rapports contenant des scores de probabilité supérieurs à 80%, qui indiquent une valeur de discrimination élevée, sont acceptés comme des résultats fiables et l’identification bactérienne acceptée.
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Representative Results
Des résultats représentatifs pour une plaque d’écouvillonnage montrant différentes méthodes de placage sont illustrés à la figure 3A montrant des isolats morphologiquement divers de souris C57BL/6. Pour chaque isolat distinct, les colonies ont été comptées dans la bande et l’abondance relative, unités formant colonies (UFC) uniques par écouvillonnage oculaire, a été calculée et tracée à des fins de comparaison. Pour la caractérisation microbiologique, les bactéries ont été prélevées à partir de plaques d’écouvillonnage individuelles pour produire une plaque TSA maîtresse (créée en choisissant des isolats morphologiquement distincts en triple exemplaire à partir de chaque plaque d’écouvillonnage oculaire de souris). À partir de la plaque maîtresse, le jour suivant ou lorsque la croissance apparaît, des tests supplémentaires ont été effectués pour caractériser ou identifier les microbes. La plaque maîtresse a été utilisée pour fournir suffisamment d’inoculum pour élargir les isolats respectifs.
Les espèces ont été caractérisées à l’aide de techniques microbiologiques, puis identifiées par l’analyse maldi-tof ms. Chaque isolat de la plaque maîtresse, a été testé par l’essai de catalase13,14 et cultivé sur des milieux sélectifs. Étant donné que les microbes prédominants dans nos études sont Streptococcus spp., Staphylococcus spp. et Corneybacterium spp., mannitol salt agar (MSA) et Mac Conkey Agar (MAC) ont été utilisés commegélose sélective 13. La croissance sur la gélose au sel de mannitol indique Staphylococcus spp13,16. Étant donné que msa contient du rouge de phénol, un halo jaune autour de la colonie indique la fermentation de mannitol et la classification comme Staphylococcus aureus (confirmer avec des tests alternatifs tels que le test de coagulase)13. La croissance sur la gélose MacConkey indique des bactéries à Gram négatif, car les sels biliaires et le violet cristallin sont capables de transgresser la membrane bactérienne et d’inhiber la croissance bactérienne à Gram positif13. La croissance cireuse sur MSA indique la production d’acide mycolique et peut être due à des organismes tels que Corneybacterium spp13. Enfin, le test de catalase différencie Streptococcus spp. de Staphylococcusspp. 13,16,et dans certains cas, un test faiblement positif peut indiquer Aerococcus spp15.
Pour identifier les isolats, une plaque de TSA a été strié et incubée pendant la nuit dans un environnement à 5% de dioxyde de carbone et à 37 °C et MALDI-TOF MS a été réalisée. La figure 4 montre les résultats de S. acidominimus (un membre de viridans Streptococcus spp. 17) et A. viridans. Souvent Aerococcus spp. sont identifiés à tort comme le groupe viridans des streptocoques18,19, sur la base de tests biochimiques et phénotypiques. MALDI-TOF MS a pu identifier les isolats avec un niveau de confiance de 99,9 sans espèces non identifiables.
Des différences biaisées par sexe peuvent être observées dans la figure 5, où des niveaux significativement différents d’organismes commensaux ont été récupérés chez des souris C57BL/6 mâles et femelles. L’abondance relative de chaque isolat a été déterminée. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans et staphylocoque négatif de la coagulase(SNC) isolent #1 et E. coli spp. ont été trouvés chez toutes les souris, les mâles montrant une abondance relative plus élevée et une plus grande diversité.
Ill. 1 : Écouvillonnage interne.
(A) Un mince morceau d’environ 1 cm de coton tiré a été maintenu entre le point de cure-dent stérile et l’index et le cure-dent a été roulé tout en maintenant une légère pression contre l’index jusqu’à ce que le coton soit complètement roulé sur la pointe du cure-dent. (B) Exemple d’écouvillonnage oculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 2 : Placement de l’écouvillonnage conjonctival de la souris.
(A) La pointe de l’écouvillonnage humide BHI a été insérée, à un angle de 90°, dans le coin médial de l’œil gauche d’une souris anesthésiée, déprimant le globe oculaire. (B) L’écouvillon a été déplacé le long de la conjonctive tout en maintenant une légère pression sur l’œil dans un mouvement de va-et-vient, 10 fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Résultats représentatifs pour l’écouvillon oculaire et les plaques maîtresses.
(A) 10 μL de milieux enrichis inoculés par écouvillonnage oculaire ont été aliquoted sur le côté droit de la plaque de gélose sanguine et inclinés de 30 à 60 degrés pour permettre au milieu de former des bandes et sur le côté gauche de la plaque, dix points de 10 μL de l’échantillon ont été distribués. La photographie de la plaque incubée montre des colonies individuelles et une diversité morphologique. (B) Une plaque maîtresse d’isolats a été créée en cueillant une colonie dans la plaque d’écouvillonnage oculaire et en striant dans l’un des carrés (grilles). Trois colonies morphologiquement similaires sont striées dans des grilles séparées. Chaque grille a trois stries de la même colonie qui a été cueillie dans la plaque d’écouvillonnage de l’œil de souris. Après que la croissance soit apparue sur les plaques, l’isolat a été caractérisé par le placage sélectif et l’essai de catalase. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Exemple de résultats de MALDI-TOF MS.
Chaque isolat a été cultivé sur TSA pendant la nuit, appliqué sur la lame MALDI-TOF MS et recouvert d’une solution MALDI-TOF MS, séché à l’air et repéré en double. Les résultats pour Streptococcus acidominimus (A) et Aerococcus viridans (B) ont été identifiés positivement avec une valeur de confiance de 99,9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Croissance conjonctivale commensale biaisée selon le sexe.
Des souris C57BL6/N d’âge assorti ont été comparées pour la diversité commensale relative. Des yeux ont été écouvillonnés et des organizations commensales identifiées. L’espèce la plus prédominante était Streptococcus acidominimus, qui était significativement plus abondante chez les souris mâles que femelles (ANOVA à 2 voies, p<0,0001). 5 isolats différents du SNC ont été identifiés, Aerococcus viridans et E. coli. Alors que certains des isolats du SNC n’étaient pas présents chez toutes les souris, le Streptococcus acidominimus, l’Aerococcus viridans, l’isolat 1 du SNC et E. coli ont été trouvés chez toutes les souris ayant des abondances distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En raison de l’état paucibactérien de la surface oculaire, de nombreux laboratoires ont eu du mal à isoler les commensaux oculaires7,20,ce qui a entraîné un faible nombre d’échantillons avec croissance, une faible abondance et une faible diversité8. Ce procédé améliore significativement les pratiques de culture standard4,21 par l’ajout d’une étape d’enrichissement, ainsi que d’un écouvillonnage oculaire redessiné et d’une identification par MALDI-TOF MS. L’étape d’enrichissement traite de la faible capacité de récupération en amplifiant la charge bactérienne. L’augmentation significative des bactéries récupérables de moins de 100 UFC à l’abondance relative de 2 500 UFC par écouvillonnage oculaire pour les souris mâles de type sauvage suggère que l’incubation dans des milieux riches en nutriments revigore les bactéries viables mais non cultivables22,23, permettant ainsi la récupération des microbes dormants. Des étapes récentes d’enrichissement basées sur la culture ont été incorporées dans les études de séquençage moléculaire du microbiote pour permettre la discrimination entre les signatures d’expression hôte et microbienne24,25, 26et pour amplifier les genres rares. Notre étape d’enrichissement protocolaire est la première à être appliquée aux études du microbiome oculaire et utilise l’enrichissement pour sélectionner des microbes vivants, augmenter le nombre d’isolats rares récupérables et peut-être réanimer des commensaux viables mais non cultivables. De plus, notre écouvillonnage oculaire fait maison permet d’écouvillonner la conjonctive de manière ciblée, réduisant ainsi la contamination de la peau / fourrure environnante en raison de sa petite taille et de sa forme conique pointue mince. Le choix de l’épaisseur et du matériau du revêtement de l’écouvillon est important21. Cet écouvillonnage oculaire fabriqué en laboratoire est recouvert d’une fine couche de coton non toxique, ce qui empêche le piégeage commensal écouvillonné dans le matériau de l’écouvillon, ainsi que, étant préférable aux écouvillons oculaires d’alginate de calcium qui peuvent être cytoxiques27. Les tests longitudinaux montrent que notre méthode est reproductible; avec les bactéries dominantes récupérées à partir d’écouvillons oculaires, y compris Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS), et Corynebacterium spp. Ces résultats concordent avec les résultats publiés pour les genres oculaires anaérobies facultatifsdominants 7,9,20 détectés par des méthodes basées sur la culture ou sur l’imagerie. Cette méthode a trouvé un spectre plus large d’isolats dans la conjonctive, y compris Escherichia coli et Pseudomonas spp. En outre, l’identification par MALDI-TOF MS permet une meilleure discrimination entre les genres et les espèces, telles que le groupe viridans des streptocoques et Aerococci spp. 19,28.
Trois étapes sont essentielles pour maximiser le résultat : la fabrication d’écouvillons oculaires, la technique d’écouvillonnage oculaire et la sélection unique d’isolats à partir de la plaque d’écouvillonnage oculaire. Comme nous l’avons vu ci-dessus, une très fine couche plane de coton est importante pour la capture initiale des commensaux de la surface oculaire ainsi que pour leur libération ultérieure dans le milieux d’enrichissement. Les écouvillons épais ou grumeleux peuvent mener à la sélection de contaminants, ainsi qu’à la rétention des isolats à l’intérieur de l’extrémité de l’écouvillon. Deuxièmement, une dépression continue du globe oculaire pendant l’écouvillonnage est nécessaire pour minimiser la contamination des surfaces environnantes. La technique idéale d’écouvillonnage implique l’insertion normale (90 degrés) de l’écouvillon dans le fornix conjonctival inférieur médial et la pression d’écouvillonnage régulière couplée au mouvement continu lent. Enfin, la plaque d’écouvillonnage oculaire doit être surveillée quotidiennement pour sélectionner les isolats nouvellement apparus ou ceux qui poussent à un rythme différent afin de capturer complètement le microbiome représentatif.
Il existe quelques limitations du protocole qui peuvent être abordées avec une compréhension claire des résultats ou de la modification du protocole. Les résultats sont une mesure de l’abondance commensale relativement viable, et non de la charge bactérienne conjonctivale réelle, dans le but de définir la communauté commensale oculaire. L’abondance relative et la diversité ont été utilisées dans nos études à des fins de comparaison dans la kératite bactérienne, ainsi que pour étudier la réponse immunitaire innée chez les souris knock-out et de type sauvage12. En outre, l’identification par MALDI-TOF MS dépend d’une base de données substantielle28, fournissant un résultat de « pas d’ID » pour les profils de spectres d’isolats inconnus, soulignant l’importance d’utiliser une base de données actuelle. Enfin, ce protocole ne détecte que les bactéries aérobies et anaérobies facultatives, mais son cadre est adaptable et peut être développé pour aider à définir l’espace microbien oculaire par modification du milieu d’enrichissement, des conditions de croissance des plaques et du milieu de sélection. En changeant la plaque maîtresse et les conditions de croissance d’enrichissement en anaérobie, puis un autre commensal oculaire couramment isolé, Propionibacterium spp. ou d’autres anaérobies, peut être détecté; bien que, dans nos mains, nous n’avons vu presque aucune croissance anaérobie.
Peut-être, ce cadre peut être utilisé en conjonction avec des techniques de séquençage de l’ADN profond. Un obstacle majeur à l’identification des microbes par séquençage de l’ADN est l’incapacité d’évaluer la viabilité10. Ce protocole peut fournir une méthode orthogonale en modifiant les milieux d’enrichissement et les conditions de placage pour correspondre aux critères de croissance préférés d’un isolat candidat (identifié par séquençage de l’ADN). Cela peut donner lieu à une approche précieuse basée sur la culture pour capturer les commensaux de bactéries viables mais incultivables ou d’espèces présentes mais peu abondantes.
La définition de la communauté commensale oculaire viable est essentielle pour examiner le profil d’expression commensale oculaire. De vastes recherches suggèrent que les acides gras à chaîne courte et les produits microbiens modulent la réponse immunitaire oculaire3,29,30,31,32,33,et que leur action se produit localement. Ceci suggère que non seulement la production distale est, mais la production locale de ces facteurs est importante. En outre, les états pathologiques tels que la sécheresse oculaire et le diabète modifient le microbiome de surface oculaire4,6,33,34. Cela souligne la nécessité d’une méthode qui relie le séquençage basé sur l’ADN ainsi que les approches basées sur la culture afin que le microbiome oculaire viable dans la santé et la maladie puisse être mieux défini.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Le financement de P30 DK034854 a soutenu VY, LB et des études dans le Massachusetts Host-Microbiome Center et le financement de NIH / NEI R01 EY022054 a soutenu MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
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