Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور اللقاءات المجيبة مع آفة حجب مستضد موسومة

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

في حين أن تصادم شوكة النسخ المتماثل مع الحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى فواصل مزدوجة ، لا يعرف الكثير عن التفاعل بين الردود والآفات المانعة. لقد استخدمنا مقايسة ربط القرب لتصور هذه اللقاءات وتوصيف العواقب المترتبة على التكوين الردوي.

Abstract

توجد نظرة ثاقبة كبيرة في الاستجابة الخلوية لفواصل الشريط المزدوج (DSBs) ، التي تسببها النيوكليازات والإشعاع وقواطع الحمض النووي الأخرى. ويعكس ذلك جزئيا توافر أساليب لتحديد مواقع الاستراحة، وتوصيف العوامل المجندة في هيئات تسوية المنازعات في تلك التسلسلات. ومع ذلك ، تظهر DSBs أيضا كمواد وسيطة أثناء معالجة مضافات الحمض النووي التي تشكلها مركبات لا تسبب فواصل مباشرة ، ولا تتفاعل في مواقع تسلسل محددة. وبالتالي ، بالنسبة لمعظم هذه العوامل ، فإن التقنيات التي تسمح بتحليل تفاعلات الارتباط مع عوامل الاستجابة وإصلاح البروتينات غير معروفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي الارتباطات المتقاطعة بين خيوط الحمض النووي (ICLs) إلى حدوث فواصل بعد لقاءات شوكة النسخ المتماثل. على الرغم من أنها تشكلت من الأدوية المستخدمة على نطاق واسع كعلاج كيميائي للسرطان ، إلا أنه لم تكن هناك منهجية لمراقبة تفاعلاتها مع بروتينات النسخ المتماثل.

نصف هنا استراتيجيتنا لمتابعة الاستجابة الخلوية لتصادمات الشوكة مع هذه المضافات الصعبة. لقد ربطنا مستضد الستيرويد بالسورالين ، الذي يشكل ICLs المعتمدة على التنشيط الضوئي في نوى الخلايا الحية. تم تصور ICLs عن طريق التألق المناعي ضد علامة المستضد. يمكن أن تكون العلامة أيضا شريكا في اختبار ربط القرب (PLA) الذي يبلغ عن الارتباط الوثيق بين اثنين من المستضدات. تم استغلال جيش التحرير الشعبى الصينى لتمييز البروتينات التي كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا ب ICLs الموسومة من تلك التي لم تكن كذلك. كان من الممكن تحديد البروتينات المستجيبة التي تم الاحتفاظ بها بعد المواجهات مع ICLs وتحديد البروتينات الأخرى المفقودة. ينطبق هذا النهج على أي بنية أو تقريب الحمض النووي الذي يمكن اكتشافه مناعيا.

Introduction

تم توثيق الاستجابة الخلوية لفواصل الخيوط المزدوجة بشكل جيد بسبب سلسلة من الأساليب القوية بشكل متزايد لتوجيه الفواصل إلى مواقع جينومية محددة1،2،3. يتيح اليقين من الموقع توصيفا لا لبس فيه للبروتينات والعوامل الأخرى التي تتراكم في الموقع وتشارك في استجابة تلف الحمض النووي (DDR) وبالتالي دفع مسارات الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (HR) التي تعمل على إصلاح الكسور. بالطبع ، يتم إدخال العديد من الفواصل بواسطة عوامل مثل الإشعاع والأنواع الكيميائية التي لا تهاجم تسلسلات محددة4. ومع ذلك ، بالنسبة لهذه الإجراءات المتاحة التي يمكن أن تحول النهايات إلى هياكل قابلة لوضع العلامات والتوطين 5,6. يتم إدخال الفواصل أيضا من خلال العمليات البيولوجية ، مثل إعادة ترتيب الغلوبولين المناعي ، وتسمح التكنولوجيا الحديثة بتوطينها ، وكذلك7. يمكن بعد ذلك تحديد العلاقة بين عوامل الاستجابة وتلك المواقع.

تظهر الفواصل أيضا كنتيجة غير مباشرة للمضافات التي تشكلها المركبات التي ليست قواطع متأصلة ولكنها تعطل معاملات الحمض النووي مثل النسخ والتكرار. قد تتشكل كسمة من سمات الاستجابة الخلوية لهذه العوائق ، ربما أثناء الإصلاح أو لأنها تثير بنية عرضة لهجوم النيوكلياز. عادة ما تكون العلاقة الفيزيائية بين التقريب والكسر والارتباط بعوامل الاستجابة استدلالية. على سبيل المثال ، يتم تشكيل ICLs بواسطة العلاج الكيميائي مثل سيسبلاتين وميتوميسين C8 وكمنتج تفاعل للمواقع غير الأساسية9. تعرف ICLs جيدا باسم الكتل القوية لشوكات النسخالمتماثل 10 ، وبالتالي توقف الشوكات التي يمكن شقها بواسطة النيوكليازات11. غالبا ما يتم تخفيف الارتباط التساهمي بين الخيوط من خلال المسارات التي لها فواصل ملزمة كوسيطة 12,13 ، مما يستلزم إعادة التركيب المتماثل لإعادة بناء شوكة النسخ المتماثل14. في معظم التجارب ، يتبع الباحث استجابة العوامل ذات الأهمية للفواصل التي تتشكل في اتجاه مجرى تصادم شوكة النسخ المتماثل مع ICL. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود تقنية لتوطين آفة استفزازية ، لا يمكن افتراض قرب الرد ، وأجزائه المكونة ، من ICL إلا.

لقد طورنا استراتيجية لتمكين تحليل ارتباطات البروتين مع المضافات التساهمية غير المحددة للتسلسل ، كما هو موضح هنا بواسطة ICLs. في نظامنا يتم تقديمها بواسطة السورالين ، وهو منتج طبيعي نشط ضوئيا يستخدم منذ آلاف السنين كعلاج لاضطرابات الجلد15. يعتمد نهجنا على ميزتين مهمتين من السورالين. الأول هو ترددها العالي لتشكيل الوصلات المتقاطعة ، والتي يمكن أن تتجاوز 90٪ من المواد المقرب ، على عكس أقل من 10٪ التي تشكلها المركبات الشائعة مثل سيسبلاتين أو ميتوميسين C 8,16. والثاني هو إمكانية وصول المركب إلى الاقتران دون فقدان القدرة المتشابكة. لقد ربطنا تساهميا ثلاثي ميثيل السورالين ب Digoxigenin (Dig) ، وهو علامة مناعية راسخة. يتيح ذلك الكشف عن السورالين في الحمض النووي الجينومي عن طريق التلوين المناعي لعلامة Dig ، والتصور بواسطة التألق المناعي التقليدي17.

تم تطبيق هذا الكاشف ، في عملنا السابق ، على تحليل لقاءات شوكة النسخ المتماثل مع ICLs باستخدام مقايسة تعتمد على ألياف الحمض النووي16. في هذا العمل وجدنا أن النسخ المتماثل يمكن أن يستمر بعد ICL سليمة. كان هذا يعتمد على ATR كيناز ، والذي يتم تنشيطه عن طريق إجهاد النسخ المتماثل. كانت إعادة تشغيل النسخ المتماثل غير متوقعة نظرا لهيكل اللولب المتماثل CMG. يتكون هذا من سداسي MCM غير المتجانس (M) الذي يشكل حلقة إزاحة حول حبلا القالب لتخليق الشريط الرائد الذي يتم قفله بواسطة بروتينات مجمع GINS (G ، الذي يتكون من PSF1 و 2 و 3 و SLD5) و CDC45 (C) 18. الاقتراح القائل بأن النسخ المتماثل يمكن أن يعاد تشغيله على جانب ICL البعيد إلى جانب التصادم الردي جادل بتغيير في بنية الرد. للإجابة على السؤال حول المكونات التي كانت في الرد في وقت المواجهة مع ICL ، قمنا بتطوير النهج الموصوف هنا. لقد استغللنا علامة Dig كشريك في مقايسات ربط القرب (PLA) 19 لاستجواب الارتباط الوثيق ل ICL ببروتينات20 المجيبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. اليوم 1
    1. قم بمعالجة أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم مسبقا بمحلول لاصق خلوي.
    2. خلايا لوحة في الأطباق المعالجة مسبقا قبل يوم واحد من العلاج. يجب أن تنقسم الخلية بنشاط و 50-70 ٪ متقاربة في يوم التجربة.
      ملاحظة: تم استخدام خلايا هيلا في هذه التجربة مع Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM ، مع استكمال 10٪ مصل بقري جنيني ، 1x بنسلين / ستربتومايسين. لا توجد قيود على خطوط الخلايا الملتصقة. ومع ذلك ، يجب طرد الخلايا غير الملتصقة بالطرد المركزي على شرائح وتثبيتها قبل التحليل بواسطة PLA.
  2. اليوم 2
    1. قم بإعداد محلول مخزون من Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) عن طريق تعليق الحصة المجمدة من Dig-TMP المركب مسبقا في 1: 1 EtOH:H2 O. حدد التركيز عن طريق قياس OD عند 250 نانومتر من تخفيف 100x (في H2O) من Dig-TMP المذاب. معامل انقراض Dig-TMP هو 25000. تحقق من التركيز عن طريق قياس OD عند 250 نانومتر قبل كل استخدام وحساب تركيز المخزون: Abs x 100 x 106/25,000 = التركيز (بالميكرومتر). بشكل عام ، يبلغ محلول المخزون حوالي 3 مللي مول. يمكن تخزين المحلول في -20 درجة مئوية لمدة شهر تقريبا.
      ملاحظة: يجب تصنيع Dig-TMP كيميائيا مسبقا ، باتباع الإجراء الموضح هنا. الارتجاع 4'-كلوروميثيل-4،5'،8-ثلاثي ميثيل سورالين مع 4،7،10-ثلاثي أوكسا-1،13-تريديكانيدي-أمين في التولوين تحت النيتروجين لمدة 12 ساعة. قم بإزالة المذيب واستعادة 4'- [N- (13-أمينو-4،7،10-ثلاثي أوكساتريديكا)] منتج أمينوميثيل -4،5 '،8-ثلاثي ميثيل سورالين بواسطة كروماتوغرافيا هلام السيليكا. اقترن المنتج بإستر ديجوكسيجينين NHS في ثنائي ميثيل فورماميد وثلاثي إيثيل أمين عند 50 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. قم بإزالة المذيب وتنقية البقايا عن طريق تحضير كروماتوغرافيا هلام السيليكا ذات الطبقة الرقيقة. قم بسحب كلوروفورم شريط المنتج: الميثانول: 28٪ هيدروكسيد الأمونيوم (8: 1: 0.1) خليط. تتبخر المذيبات وتذوب الحبيبات في 50٪ EtOH:H 2O.
    2. أضف مخزون Dig-TMP في 50٪ EtOH:H 2O إلى وسط زراعة الخلايا إلى تركيز نهائي يبلغ 5 ميكرومتر. اجعل الوسط يصل إلى 37 درجة مئوية. قم بشفط الوسط من الألواح ، وأضف الوسائط التي تحتوي على Dig-TMP التي تم تسخينها مسبقا ، وضع الألواح في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة للسماح ل Dig-TMP بالتوازن.
    3. أثناء حضانة الخلايا ، قم بتسخين صندوق الأشعة فوق البنفسجية مسبقا (انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
    4. ضع الألواح في صندوق الأشعة فوق البنفسجية الذي تم تسخينه مسبقا وعرض الخلايا لجرعة 3 J / cm2 من ضوء UVA لمدة 5 دقائق لهذه التجربة. تم وضع الألواح فوق كتلة حرارية يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية ، أثناء التشعيع. احسب الوقت باستخدام الصيغة:
      Equation 1
    5. نضح الوسط باستخدام ماصة ، أضف وسطا جديدا تم تسخينه مسبقا وضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
    6. قم بإزالة الوسائط واغسل الأطباق مرة واحدة برفق باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    7. قم بإزالة PBS وأضف 0.1٪ فورمالديهايد (FA) في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). هذا يمنع انفصال الخلايا أثناء CSK-R (المخزن المؤقت لاستخراج الهيكل الخلوي الذي يحتوي على RNase ، الموصوف في 1.2.9.) المعالجة المسبقة المطلوبة لاستخراج العناصر السيتوبلازمية وتقليل خلفية PLA.
    8. نضح قبالة FA وغسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
    9. أضف المخزن المؤقت CSK-R واحتضانه لمدة 5 دقائق في RT لإزالة السيتوبلازم [المخزن المؤقت CSK-R: أنابيب 10 mM ، درجة الحموضة 7.0 ، 100 mM NaCl ، 300 mM السكروز ، 3 mM MgCl2 ، 0.5٪ Triton X-100 ، 300 μg / mL RNase A]. نضح المخزن المؤقت ، أضف CSK-R جديدا ، واحتضن لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن تخزين مخزون من المخزن المؤقت CSK عند 4 درجات مئوية ، وإضافة Triton X و RNaseA قبل الاستخدام مباشرة.
    10. يغسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    11. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ الفورمالديهايد في PBS لمدة 10 دقائق في RT.
    12. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. نفذ هذه الخطوة ثلاث مرات.
    13. يضاف الميثانول البارد 100٪ ويحتضن لمدة 20 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
    14. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. عند هذه النقطة ، يمكن تخزين الخلايا في برنامج تلفزيوني في غرفة رطبة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
    15. احتضان الخلايا في 80 ميكرولتر من 5 مللي متر TritonX-100 لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    16. احتضان الخلايا مع 100 ميكرولتر من 5 mM EDTA في PBS تستكمل مع 1 ميكرولتر من 100 ملغ / مل RNase A لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    17. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    18. قم بتخزين الخلايا في مخزن مؤقت مانع (5٪ BSA و 10٪ مصل الماعز في PBS) في غرفة رطبة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

2. مقايسة ربط القرب

ملاحظة: قم بإجراء مقايسة ربط القرب في اليوم 3.

  1. تلطيخ الأجسام المضادة
    1. تحضير 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل لوحة: أضف الحجم المناسب من الأجسام المضادة الأولية لتحقيق التخفيف المطلوب (مضاد للفأر Digoxigenin والجسم المضاد للأرانب ضد مكون رد مثل MCM5 أو CDC45 أو PSF1 أو pMCM2 ، التخفيفات المحددة في جدول المواد) في المخزن المؤقت المانع (للوصول إلى الحجم النهائي 24 ميكرولتر). امزج عن طريق النقر واتركه لمدة 20 دقيقة في RT. قم بإعداد مزيج رئيسي لعينات متعددة واخلطه عن طريق النقر قبل التقديم على الآبار.
    2. أضف 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى مركز البئر واحتضانها في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. أثناء التلوين ، اترك مجسات PLA وحاجز الحجب يسخن إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل الخلايا باستخدام PBS-T [PBS-T: 0.05٪ Tween-20 in 1X PBS] في RT. نفذ هذه الخطوة ثلاث مرات.
    4. أثناء الغسيل ، قم بإعداد 40 ميكرولتر من محلول مسبار PLA لكل طبق (تتكون مجسات PLA من جسم مضاد ثانوي يتعرف إما على الأرنب أو الفأر IgG ، مرتبطا تساهميا بقليل النوكليوتيد PLUS أو MINUS): 8 ميكرولتر من مسبار PLA المضاد للفأر PLUS + 8 ميكرولتر من مسبار PLA الأجسام المضادة للأرانب ناقص + 24 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. امزجه واتركه لمدة 20 دقيقة في RT. قم بإعداد مزيج رئيسي لعينات متعددة واخلطه جيدا قبل تطبيقه على الآبار. ضع المحلول في منتصف البئر في اللوحة.
    5. قم بإزالة الغسيل الأخير ، وأضف 40 ميكرولتر من محلول مسبار PLA إلى وسط البئر ، واحتضانه في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    6. يغسل في المخزن المؤقت A ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق لكل منهما ، على منصة مائلة في RT. أثناء الغسيل ، أحضر مزيج الربط إلى RT.
  2. الربط والتضخيم
    1. تحضير 40 ميكرولتر من مزيج الربط لكل لوحة: 8 ميكرولتر (5x) من مخزون الربط + 31 ميكرولتر من الماء المقطر + 1 ميكرولتر من الليجاز. تحضير المزيج الرئيسي لألواح متعددة واخلطه جيدا قبل وضعه على الآبار.
    2. أضف 40 ميكرولتر من محلول الربط إلى كل طبق واحتضنه في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. اغسل الخلايا 3x باستخدام المخزن المؤقت A ، كل منها لمدة 2 دقيقة ، على منصة مائلة في RT.
    4. تحضير 40 ميكرولتر من محلول التضخيم لكل طبق: 8 ميكرولتر (5x) من مخزون التضخيم + 31.5 ميكرولتر من الماء المقطر + 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي. قم بإعداد مزيج رئيسي لعينات متعددة واخلطه جيدا قبل تطبيقه على الآبار.
    5. أضف 40 ميكرولتر من محلول التضخيم إلى كل طبق واحتضنه في غرفة رطبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة.
    6. نضح محلول التضخيم واغسله باستخدام المخزن المؤقت B. قم بإجراء 6 غسلات لكل منها لمدة 10 دقائق ، على منصة مائلة في RT.
    7. اغسل مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت B 0.01x لمدة 1 دقيقة في RT.
    8. نضح المخزن المؤقت B واحتضان الألواح ذات الأجسام المضادة الثانوية ، Alexa Fluor 488 المضاد للفأر IgG و Alexa Fluor 568 المضاد للأرانب IgG في محلول مانع عند التخفيفات المناسبة في العازلة المانعة ، في غرفة رطبة ، لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    9. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS-T ، لمدة 10 دقائق لكل منها على منصة مائلة في RT.
    10. نضح PBS-T وقم بالتركيب في وسط التركيب باستخدام DAPI. يمكن تصوير الألواح المركبة على الفور أو تخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة لا تزيد عن 4 أيام قبل التصوير.

3. التصوير والقياس الكمي

  1. قم بإجراء التصوير في مجهر فوق فلوري أو متحد البؤر (إذا كان التصوير ثلاثي الأبعاد مرغوبا فيه ، فقم بتغطية 3 ميكرومتر على الأقل في 15 مكدسا). قم بإجراء تجارب في ثلاث نسخ وصورة عدد كاف من الحقول لعمل 100 ملاحظة على الأقل لكل عينة أو حالة. قم بتصوير جميع الحقول والعينات، بما في ذلك عناصر التحكم، باستخدام نفس إعدادات التعريض الضوئي.
  2. قم بالقياس الكمي باستخدام برنامج مناسب لتحليل الصور (انظر جدول المواد للبرامج مفتوحة المصدر والتجارية القادرة على إجراء هذا التحليل في صور مستوية مفردة أو متعددة).
    1. شريحة نوى الخلية على أساس تلطيخ DAPI. إجراء الكشف عن نقاط جيش التحرير الشعبى الصينى النووية. قم بتعيين نقاط PLA إلى النواة المقابلة لها. تصدير نقاط PLA لكل نواة كملف csv (انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2).
  3. التحليل الإحصائي (انظر جدول المواد للبرامج مفتوحة المصدر والتجارية المقترحة).
    1. تحقق مما إذا كانت العينات تتبع التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار Shapiro-Wilk.
    2. حدد ما إذا كان هناك فرق كبير بين عينتين باستخدام اختبار Student-t (إذا تم استيفاء افتراض التوزيع الطبيعي) أو اختبار Wilcoxon-Rank Sum (إذا تم انتهاك افتراض التوزيع الطبيعي للعينة).
  4. تصور البيانات: قم بإنشاء مخططات نقطية مدمجة مع مخططات مربعة لتصور توزيع البيانات ، الوسيط (Q2) ، 25 th (Q1) و 75th بالمائة للعينات المختلفة (انظر جدول المواد للبرامج مفتوحة المصدر والتجارية المقترحة).

4.3D عرض pMCM2: تفاعلات ICL

  1. صورة لوحات جيش التحرير الشعبى الصينى على المجهر متحد البؤر القرص الغزل، وذلك باستخدام خطة فلور 60x / 1.25 الفتحة العددية النفط الهدف. احصل على 16 مكدسا تغطي 1.6 مم وقم بإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

جيش التحرير الشعبى الصينى من Dig-TMP مع البروتينات replisome
يظهر هيكل Dig-TMP في الشكل 1. تمت مناقشة تفاصيل التوليف ، الذي تم فيه اقتران ثلاثي ميثيل السورالين من خلال رابط جليكول إلى ديجوكسيجينين ، سابقا17,21. حضانة الخلايا بالمركب متبوعا بالتعرض لضوء 365 نانومتر (UVA) ينشط المركب ضوئيا ويدفع تفاعل التشابك. أكثر بقليل من 90٪ من المواد المقربة هيICLs 16. يمكن تصور علامة الحفر عن طريق التألق المناعي الذي يكشف عن وجود ICLs في جميع أنحاء النواة (الشكل 2). يشير التألق المناعي لبروتين replisome مثل MCM2 أيضا إلى التوزيع في جميع أنحاء النواة ، وهو توزيع لا يتأثر بإدخال ICLs. أظهرت هذه النتائج أن المظهر البؤري للبروتينات المستجيبة ، مثل ما يظهر في استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ل DSBs ، ليس سمة من سمات الرد: تفاعلات ICL.

من أجل تصور تفاعل الردود مع ICLs في التجربة الموضحة في الشكل 2 ، قمنا بتطبيق PLA ، الذي يبلغ عن قرب مستضدين (الشكل 3 أ). قمنا بقياس تواتر ارتباط MCM5 وعلامة الحفر 1 h بعد إدخال ICLs (الشكل 3 ب). أظهرت إشارات جيش التحرير الشعبي قرب الردود من ICLs.

يعمل إجهاد النسخ المتماثل ، بما في ذلك الضغط الذي تقدمه ICLs ، على تنشيط ATR kinase22. من بين العديد من ركائز ATR هي بروتينات MCM ، بما في ذلك MCM2 في سيرين 10823. من المتوقع أن يؤدي اللقاء التفاعلي مع ICL إلى فسفرة MCM2 ، من بين العديد من الركائز الأخرى. وفقا لهذا التوقع ، كان جيش التحرير الشعبى الصينى بين pMCM2Ser108 وعلامة Dig موجبا (الشكل 3 ج). في تجارب أخرى وجدنا أن تردد الهضبة تم الوصول إليه عند 1 ساعة20. لقد فسرنا هذه النتائج على أنها تشير إلى أن الردود الموجودة بشكل مختلف في جميع أنحاء الجينوم ، وبعيدة بشكل متغير عن ICL ، تواجه في النهاية الكتلة ، مما يؤدي إلى تنشيط ATR ، وفسفرة MCM2.

يتم تقديم نتائج PLA في الأشكال السابقة كمجموع مضغوط لمستويات بصرية متعددة. ومع ذلك ، يمكن أيضا تقديم النتائج من النوى الفردية في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد ، كما هو موضح في pMCM2: Dig-TMP PLA في الفيديو 1. أشار هذا التحليل إلى أنه يمكن ملاحظة لقاءات متجاوبة مع ICLs في جميع أنحاء النواة.

أظهرت دراستنا لشوكة النسخ المتماثل أن لقاءات ICL كشفت عن ظاهرة إعادة تشغيل النسخ المتماثل غير المتوقعة16. بالنظر إلى بنية الحلقة المقفلة للرد الوظيفي ، كان من المهم للغاية التساؤل عما إذا كان تكوين جهاز النسخ المتماثل يتغير عند الاصطدام ب ICL. نظرا لأن أقل من 10٪ من شوكات النسخ المتماثل تتلامس مع ICL ، فإن مجرد فحص تكوين البروتين لجميع الردود لن يكون منتجا. ومع ذلك ، سمح لنا جيش التحرير الشعبي بين Dig والمكونات المختلفة بمعالجة هذا السؤال. على عكس النتائج الإيجابية مع pMCM2 ، وجدنا أن بروتينات مركب GINS فشلت في إعطاء إشارة PLA مع ICLs. من ناحية أخرى ، كان الفحص مع CDC45 إيجابيا ، مما يشير إلى أنه تم الاحتفاظ ببروتين القفل الآخر (الشكل 4أ ، ب). عندما تم تحضين الخلايا بمثبط ATR ، تم قمع إعادة التشغيل تماما وكان GINS: Dig PLA إيجابيا بقوة (الشكل 4 ج). كان تفسيرنا لهذه النتائج هو أنه في غياب نشاط ATR ، تم الاحتفاظ ببروتينات GINS ، وظلت مروحية CMG في تكوين مغلق ، ولم يكن هناك إعادة تشغيل للنسخ المتماثل بعد ICL20.

Figure 1
الشكل 1: تركيب ثلاثي ميثيل السورالين المرتبط بعلامة مستضد الديجوكسيجينين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: لا يظهر التألق المناعي للبروتين المضاد MCM5 و DIG TMP بؤرا منفصلة. تمت معالجة الخلايا باستخدام Dig-TMP و UVA وبعد 1 ساعة مناعية ل MCM5 و Dig. يمثل الشريط الأبيض 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: جيش التحرير الشعبى الصينى بين Dig-TMP و MCM5. (أ) رسم تخطيطي لمقايسة ربط القرب المطبق على التفاعل بين البروتين المجيب MCM5 وعلامة الحفر على ICL. المخطط مبسط. في الممارسة العملية ، كانت الأجسام المضادة الأولية مرتبطة بأجسام مضادة ثانوية مقترنة تساهميا بقليل النيوكليوتيدات. (ب) جيش التحرير الشعبى الصينى بين MCM5 و Dig-TMP. لاحظ الإشارات المنفصلة التي تشير إلى مواقع التفاعل. تظهر المخططات النقطية والمربعة توزيع الإشارة (مخطط النقطة) بالإضافة إلى الوسيط (الشريط الأحمر لمخطط المربع) ،والنسب المئوية 25و 75 (نهايات المربع) والقيم الأعلى والأدنى باستثناء القيم المتطرفة (الخطوط المتطرفة). أكد اختبار Wilcoxon-Rank Sum وجود فرق كبير بين الشرطين (p<0.001). تمثل الأشرطة البيضاء 5 ميكرومتر. (ج) PLA بين pMCM2 و Dig-TMP. تمثل هذه الإشارات لقاء الرد مع ICL ، مما يؤدي إلى فسفرة تعتمد على ATR ل MCM2. يبلغ جيش التحرير الشعبي عن تباين تردد المواجهة في الخلايا المختلفة. يمثل الشريط الأبيض 5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: PLA بين Dig-TMP وبروتينات القفل الرد. (أ) CDC45: Dig-TMP. يمثل الشريط الأبيض 5 ميكرومتر. (ب) PSF1: Dig-TMP. يتم زيادة الحد الأدنى من تردد الإشارة بشكل كبير عن طريق العلاج بمثبط ATR ، والذي يمنع مسار الاجتياز وإطلاق مجمع GINS الذي يتضمن PSF1. تمثل الأشرطة البيضاء 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد ل pMCM2: توضح إشارات Dig PLA التوزيع في جميع أنحاء النواة. PCNA ملطخة باللون الأخضر ، جيش التحرير الشعبى الصينى باللون الأحمر ، DAPI باللون الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الملف التكميلي 1: خط أنابيب Cellprofiler للقياس الكمي ل PLA. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: معلمات دفعة وحدة خلية IMARIS للقياس الكمي PLA. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن جيش التحرير الشعبي هو تقنية قوية للغاية ، إلا أن هناك مخاوف فنية يجب حلها من أجل الحصول على نتائج واضحة وقابلة للتكرار. يجب أن تكون الأجسام المضادة ذات تقارب وخصوصية عالية. علاوة على ذلك ، من المهم تقليل إشارات الخلفية غير المحددة قدر الإمكان. لقد وجدنا أن الأغشية والحطام الخلوي تساهم في الخلفية ، وقمنا بإزالتها قدر الإمكان. تساعد الغسالات التي تحتوي على منظفات تحتوي على مخازن مؤقتة قبل التثبيت ، والغسيل بالميثانول بعد التثبيت على تقليل الارتباط غير المحدد. التحذير هو أن معالجة المنظفات قبل التثبيت يمكن أن تؤدي إلى انفصال الخلايا. نجد أن معالجة الألواح بمادة لاصقة للخلايا والبادئة بنسبة 0.1٪ FA قبل علاج CSK يخفف من هذه المشكلة.

من المفيد أيضا تحديد خلايا الطور غير S عند مراقبة الأحداث الخاصة بالطور S. يمكن القيام بذلك عن طريق تلطيخ PLA بعد علامات دورة الخلية مثل PCNA أو NPAT24,25. لا تؤكد هذه العلامات ظواهر الطور S فحسب ، بل توفر أيضا تحكما بيولوجيا داخليا للتفاعلات غير المحددة. الإشارات الإيجابية في خلايا الطور G1 ، في المقايسات التي تقيس الأحداث التي يجب أن تكون حصرية للمرحلة S ، هي مؤشر على أن هناك حاجة إلى بذل جهد إضافي لتقليل التفاعلات غير المحددة.

تتمتع استراتيجيات التصوير أحادية الخلية بمزايا غير متوفرة مع الأساليب الأخرى لمراقبة التفاعلات الجزيئية. تقنيات التجانس ، مثل المستخدمة في تجارب الترسيب المناعي تقضي على أي اتصال بالأحداث في الخلايا الفردية. وبالتالي ، يتم فقدان نظرة ثاقبة لتأثير حالة دورة الخلية ، أو التباين عبر مجموعة الخلايا. ومع ذلك ، نظرا لأن PLA يبلغ عن ترددات الأحداث في الخلايا الفردية ، يمكن استرداد هذه الرؤى.

من القيود المتكررة لجيش التحرير الشعبي هو عدم وجود كواشف الكشف المناعي للأهداف ذات الأهمية. هذا مصدر قلق عند معالجة الأسئلة المتعلقة بالاستجابة الخلوية لاضطرابات الحمض النووي التي تسببها عوامل أخرى غير القواطع المباشرة. لقد تغلبنا على هذا القيد باستخدام كاشف تفاعلي للحمض النووي الموسوم بالمناعة. على الرغم من أننا ركزنا دراساتنا على الروابط المتقاطعة ، إلا أن هناك العديد من المركبات السامة للجينات ، بما في ذلك أدوية العلاج الكيميائي ، التي من شأنها أن تفسح المجال لهذا النهج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا فحص التفاعلات بين البروتينات وهياكل الحمض النووي ، مثل G quadruplexes ، باستخدام هذه الاستراتيجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث ، جزئيا ، من قبل برنامج الأبحاث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني للشيخوخة ، الولايات المتحدة (Z01-AG000746-08). يتم دعم J.H. من قبل المؤسسات الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21708007 و 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

علم الأحياء ، العدد 173 ، الرد ، منع الآفة ، PLA ، مقايسة ربط القرب ، الروابط المتقاطعة بين الحمض النووي ، الروابط المتقاطعة الموسومة بالمستضد

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

تصور اللقاءات المجيبة مع آفة حجب مستضد موسومة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter