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Biology

एंटीजन टैग किए गए ब्लॉकिंग घाव के साथ रिप्लिसोम मुठभेड़ों का विज़ुअलाइज़ेशन

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

जबकि डीएनए जोड़ों के साथ प्रतिकृति कांटे टकराव डबल स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित कर सकते हैं, रिप्लिसोम और अवरुद्ध घावों के बीच बातचीत के बारे में कम जाना जाता है। हमने इन मुठभेड़ों की कल्पना करने और प्रतिकृति रचना के परिणामों को चिह्नित करने के लिए निकटता बंधाव परख को नियोजित किया है।

Abstract

न्यूक्लियस, विकिरण और अन्य डीएनए ब्रेकर द्वारा प्रेरित डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में काफी अंतर्दृष्टि मौजूद है। भाग में, यह ब्रेक साइटों की पहचान के लिए तरीकों की उपलब्धता को दर्शाता है, और उन अनुक्रमों में डीएसबी में भर्ती कारकों के लक्षण वर्णन को दर्शाता है। हालांकि, डीएसबी यौगिकों द्वारा गठित डीएनए जोड़ों के प्रसंस्करण के दौरान मध्यवर्ती के रूप में भी दिखाई देते हैं जो सीधे ब्रेक का कारण नहीं बनते हैं, और विशिष्ट अनुक्रम साइटों पर प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। नतीजतन, इनमें से अधिकांश एजेंटों के लिए, प्रौद्योगिकियां जो प्रतिक्रिया कारकों और मरम्मत प्रोटीन के साथ बाध्यकारी बातचीत के विश्लेषण की अनुमति देती हैं, अज्ञात हैं। उदाहरण के लिए, डीएनए इंटरस्ट्रैंड क्रॉसलिंक्स (आईसीएल) प्रतिकृति फोर्क मुठभेड़ों के बाद ब्रेक को उकसा सकते हैं। हालांकि कैंसर केमोथेरेपीटिक्स के रूप में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली दवाओं द्वारा गठित, प्रतिकृति प्रोटीन के साथ उनकी बातचीत की निगरानी के लिए कोई पद्धति नहीं है।

यहां, हम इन चुनौतीपूर्ण जोड़ों के साथ कांटे टकराव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए हमारी रणनीति का वर्णन करते हैं। हमने एक स्टेरॉयड एंटीजन को सोरालेन से जोड़ा, जो जीवित कोशिकाओं के नाभिक में फोटोएक्टिवेशन निर्भर आईसीएल बनाता है। एंटीजन टैग के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा आईसीएल की कल्पना की गई थी। टैग प्रॉक्सिमिटी लिगेशन परख (पीएलए) में एक भागीदार भी हो सकता है जो दो एंटीजन के घनिष्ठ संबंध की रिपोर्ट करता है। पीएलए का उपयोग उन प्रोटीनों को अलग करने के लिए किया गया था जो टैग किए गए आईसीएल के साथ निकटता से जुड़े थे। आईसीएल के साथ मुठभेड़ के बाद बनाए रखे गए रिप्लिसोम प्रोटीन को परिभाषित करना और खोए हुए अन्य लोगों की पहचान करना संभव था। यह दृष्टिकोण किसी भी संरचना या डीएनए जोड़ पर लागू होता है जिसे प्रतिरक्षात्मक रूप से पता लगाया जा सकता है।

Introduction

डबल स्ट्रैंड ब्रेक के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया अच्छी तरह से प्रलेखित है क्योंकि विशिष्ट जीनोमिक साइटों 1,2,3 पर ब्रेक निर्देशित करने के लिए तेजी से शक्तिशाली तरीकों का उत्तराधिकार है। स्थान की निश्चितता प्रोटीन और अन्य कारकों के स्पष्ट लक्षण वर्णन को सक्षम करती है जो साइट पर जमा होते हैं और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) में भाग लेते हैं, जिससे गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) और होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन (एचआर) मार्ग होते हैं जो टूटते हैं। बेशक, कई ब्रेक विकिरण और रासायनिक प्रजातियों जैसे एजेंटों द्वारा पेश किए जाते हैं जो विशिष्टअनुक्रमों पर हमला नहीं करते हैं। हालांकि, इनके लिए ऐसी प्रक्रियाएं उपलब्ध हैं जो सिरों को टैगिंग और स्थानीयकरण 5,6 के लिए उत्तरदायी संरचनाओं में परिवर्तित कर सकती हैं। ब्रेक जैविक प्रक्रियाओं द्वारा भी पेश किए जाते हैं, जैसे कि इम्युनोग्लोबुलिन पुनर्व्यवस्था, और हाल की तकनीक उनके स्थानीयकरण की अनुमति देती है, साथ हीसाथ 7। प्रतिक्रिया कारकों और उन साइटों के बीच संबंध तब निर्धारित किया जा सकता है।

ब्रेक उन यौगिकों द्वारा गठित जोड़ों के अप्रत्यक्ष परिणाम के रूप में भी दिखाई देते हैं जो अंतर्निहित ब्रेकर नहीं हैं लेकिन प्रतिलेखन और प्रतिकृति जैसे डीएनए लेनदेन को बाधित करते हैं। वे इन अवरोधों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की एक विशेषता के रूप में बन सकते हैं, शायद मरम्मत के दौरान या क्योंकि वे एक संरचना को उकसाते हैं जो न्यूक्लियस हमले के लिए कमजोर है। आमतौर पर, जोड़, ब्रेक और प्रतिक्रिया कारकों के साथ संबंध के बीच शारीरिक संबंध विचारशील है। उदाहरण के लिए, आईसीएल सिस्प्लैटिन और मिटोमाइसिन सी8 जैसे कीमोथेरेपी द्वारा और एबेसिक साइटों9 के प्रतिक्रिया उत्पाद के रूप में बनते हैं। आईसीएल को फोर्क10 को प्रतिकृति करने के लिए शक्तिशाली ब्लॉक के रूप में जाना जाता है, जिससे कांटे को रोक दिया जाता है जिसे न्यूक्लियस11 द्वारा काटा जा सकता है। किस्में के बीच सहसंयोजक संबंध अक्सर उन मार्गों से राहत मिलती है जिनमें मध्यवर्ती12,13 के रूप में विराम होते हैं, प्रतिकृति फोर्क14 के पुनर्निर्माण के लिए समरूप पुनर्संयोजन की आवश्यकता होती है। अधिकांश प्रयोगों में अन्वेषक ब्रेक के लिए रुचि के कारकों की प्रतिक्रिया का पालन करता है जो आईसीएल के साथ प्रतिकृति कांटे के टकराव के नीचे की ओर बनते हैं। हालांकि, क्योंकि उत्तेजक घाव के स्थानीयकरण के लिए कोई तकनीक नहीं है, आईसीएल के लिए रिप्लिसोम और इसके घटक भागों की निकटता केवल मानी जा सकती है।

हमने गैर-अनुक्रम विशिष्ट सहसंयोजक जोड़ों के साथ प्रोटीन संघों के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक रणनीति विकसित की है, जिसे यहां आईसीएल द्वारा चित्रित किया गया है। हमारी प्रणाली में इन्हें सोरालेन द्वारा पेश किया जाता है, एक फोटोएक्टिव प्राकृतिक उत्पाद जो त्वचा विकारों के लिए चिकित्सीय के रूप में हजारों वर्षों से उपयोग कियाजाता है। हमारा दृष्टिकोण सोरालेंस की दो महत्वपूर्ण विशेषताओं पर आधारित है। पहला क्रॉसलिंक गठन की उनकी उच्च आवृत्ति है, जो सिस्प्लैटिन या मिटोमाइसिन सी 8,16 जैसे लोकप्रिय यौगिकों द्वारा गठित 10% से कम के विपरीत, 90% से अधिक जोड़ों से अधिक हो सकता है। दूसरा क्रॉसलिंकिंग क्षमता के नुकसान के बिना संयुग्मन के लिए यौगिक की पहुंच है। हमने सहसंयोजक रूप से ट्राइमेथिल सोरालेन को डिगोक्सीजेनिन (डिग) से जोड़ा है, जो एक लंबे समय से स्थापित इम्यूनोटैग है। यह डिग टैग के इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा जीनोमिक डीएनए में सोरालेन जोड़ों का पता लगाने और पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस17 द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।

इस अभिकर्मक को हमारे पिछले काम में, डीएनए फाइबर-आधारित परख16 का उपयोग करके आईसीएल के साथ प्रतिकृति कांटे मुठभेड़ों के विश्लेषण के लिए लागू किया गया था। उस काम में हमने पाया कि प्रतिकृति एक बरकरार आईसीएल से आगे जारी रह सकती है। यह एटीआर किनेज पर निर्भर था, जो प्रतिकृति तनाव द्वारा सक्रिय होता है। सीएमजी प्रतिकृति हेलिकेस की संरचना को देखते हुए प्रतिकृति पुनरारंभ अप्रत्याशित था। इसमें एमसीएम हेटेरो-हेक्सामर (एम) होता है जो अग्रणी स्ट्रैंड संश्लेषण के लिए टेम्पलेट स्ट्रैंड के चारों ओर एक ऑफसेट गैप्ड रिंग बनाता है जो जीआईएनएस कॉम्प्लेक्स (जी, पीएसएफ 1, 2, 3, और एसएलडी 5 से मिलकर) और सीडीसी 45 (सी) 18 के प्रोटीन द्वारा लॉक किया जाता है। प्रस्ताव कि प्रतिकृति आईसीएल डिस्टल के किनारे पर प्रतिकृति को फिर से शुरू कर सकती है, रिप्लिसोम की संरचना में बदलाव के लिए तर्क दिया। आईसीएल के साथ मुठभेड़ के समय कौन से घटक उत्तर में थे, इस सवाल को हल करने के लिए हमने यहां वर्णित दृष्टिकोण विकसित किया। हमने डिग टैग को प्रॉक्सिमिटी लिगेशन एसेस (पीएलए) 19 में एक भागीदार के रूप में इस्तेमाल किया ताकि रिप्लिसोम20 के प्रोटीन के साथ आईसीएल के घनिष्ठ संबंध पर पूछताछ की जा सके।

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Protocol

1. सेल की तैयारी

  1. दिन 1
    1. सेल चिपकने वाले समाधान के साथ 35 मिमी ग्लास-बॉटम कल्चर व्यंजनों का पूर्व-उपचार करें।
    2. उपचार से एक दिन पहले पूर्व-उपचारित व्यंजनों में प्लेट कोशिकाएं। प्रयोग के दिन सेल को सक्रिय रूप से विभाजित और 50-70% कॉन्फ्लुएंट होना चाहिए।
      नोट: हेला कोशिकाओं का उपयोग इस प्रयोग में डलबेको मॉडिफाइड ईगल मीडियम डीएमईएम के साथ किया गया था, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक था। अनुयायी सेल लाइनों के लिए कोई प्रतिबंध नहीं है। हालांकि, गैर-अनुयायी कोशिकाओं को स्लाइड पर सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए और पीएलए द्वारा विश्लेषण से पहले तय किया जाना चाहिए।
  2. दिन 2
    1. 1:1 EtOH:H2O में पहले संश्लेषित Dig-TMP के जमे हुए एलिकोट को पुन: व्यवस्थित करके Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) का स्टॉक समाधान तैयार करें। विघटित Dig-TMP के 100x कमजोर पड़ने (H 2 O में) के 250 nm परODको मापकर एकाग्रता का निर्धारण करें। डिग-टीएमपी का विलोपन गुणांक 25,000 है। प्रत्येक उपयोग से पहले 250 एनएम पर ओडी को मापकर एकाग्रता को सत्यापित करें और स्टॉक एकाग्रता की गणना करें: Abs x 100 x 106/25,000 = एकाग्रता (μM में)। आम तौर पर, स्टॉक समाधान लगभग 3 mM है। समाधान को लगभग एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: यहां वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए, डिग-टीएमपी को पहले से रासायनिक रूप से संश्लेषित किया जाना चाहिए। रिफ्लक्स 4'-क्लोरोमेथिल-4,5', 8-ट्राइमिथाइलपसोरलेन के साथ 4,7,10-ट्राइओक्सा-1,13-ट्राइडेकेनेडी-अमाइन 12 घंटे के लिए नाइट्रोजन के तहत टोल्यूनि में। विलायक को हटा दें और सिलिका जेल क्रोमैटोग्राफी द्वारा 4'-[एन-(13-एमिनो-4,7,10-ट्राइओक्साट्राइडका)] एमिनोमिथाइल-4,5', 8-ट्राइमिथाइलप्सोरालेन उत्पाद को पुनर्प्राप्त करें। 18 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर डाइमिथाइल फॉर्मामाइड और ट्राइथिलमाइन में डिगॉक्सिगेनिन एनएचएस एस्टर के लिए उत्पाद को संयुग्मित करें। विलायक को हटा दें और प्रीपेरेटिव पतली परत सिलिका जेल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों को शुद्ध करें। उत्पाद बैंड क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: 28% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (8: 1: 0.1) मिश्रण। सॉल्वैंट्स को वाष्पित करें और गोली को 50% ईटीओएच: एच2ओ में घोलें।
    2. सेल कल्चर माध्यम में 50% EtOH: H2Oमें Dig-TMP स्टॉक को 5 μM की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। माध्यम को 37 °C तक लाएं। प्लेटों से माध्यम को एस्पिरेट करें, प्री-वार्मेड डिग-टीएमपी युक्त मीडिया जोड़ें, और डिग-टीएमपी को बराबर करने की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में प्लेटों को रखें।
    3. जबकि कोशिकाएं इनक्यूबेट हो रही हैं, यूवी बॉक्स ( सामग्री की तालिका देखें) को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    4. प्लेटों को पूर्व-गर्म यूवी बॉक्स में रखें और इस प्रयोग के लिए 5 मिनट के लिए यूवीए प्रकाश की 3 जे / सेमी2 की खुराक के लिए कोशिकाओं को उजागर करें। प्लेटों को विकिरण के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए थर्मो-ब्लॉक के शीर्ष पर रखा गया था। सूत्र का उपयोग करके समय की गणना करें:
      Equation 1
    5. पिपेट का उपयोग करके माध्यम को एस्पिरेट करें, ताजा पूर्व-गर्म माध्यम जोड़ें और प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    6. मीडिया को हटा दें और फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धीरे से बर्तन धो लें।
    7. पीबीएस को हटा दें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% फॉर्मलाडेहाइड (एफए) जोड़ें। यह सीएसके-आर (साइटोस्केलेटन निष्कर्षण बफर युक्त आरनेस युक्त साइटोस्केलेटन निष्कर्षण बफर, 1.2.9 में वर्णित) के दौरान सेल डिटेचमेंट को रोकता है, जो साइटोप्लाज्मिक तत्वों को निकालने और पीएलए पृष्ठभूमि को कम करने के लिए आवश्यक है।
    8. एफए को बंद करें और एक बार पीबीएस के साथ बर्तन धो लें।
    9. सीएसके-आर बफर जोड़ें और साइटोप्लाज्म को हटाने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें [सीएसके-आर बफर: 10 एमएम पाइप, पीएच 7.0, 100 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम सुक्रोज, 3 एमएम एमजीसीएल2, 0.5% ट्राइटन एक्स -100, 300 μg / बफर को एस्पायरेट करें, ताजा सीएसके-आर जोड़ें, और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: सीएसके बफर का एक स्टॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और ट्राइटन एक्स और आरएनएएसए को उपयोग से ठीक पहले जोड़ा जा सकता है।
    10. पीबीएस से तीन बार धोएं।
    11. आरटी में 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    12. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। इस चरण को तीन बार करें।
    13. ठंडा 100% मेथनॉल जोड़ें और -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    14. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। इस बिंदु पर कोशिकाओं को पीबीएस में एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में संग्रहीत किया जा सकता है।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5 mM TritonX-100 के 80 μL में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    16. पीबीएस में 5 एमएम ईडीटीए के 100 μL के साथ कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100 mg/mL RNase A के 1 μL के साथ पूरक किया जाता है।
    17. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    18. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आर्द्र कक्ष में ब्लॉकिंग बफर (पीबीएस में 5% बीएसए और 10% बकरी सीरम) में कोशिकाओं को स्टोर करें।

2. निकटता बंधाव परख

नोट: दिन 3 पर निकटता बंधाव परख करें।

  1. एंटीबॉडी धुंधला होना
    1. प्रति प्लेट प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 40 μL तैयार करें: ब्लॉकिंग बफर (24 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए) ब्लॉकिंग बफर में वांछित कमजोर पड़ने (MCM5, CDC45, PSF1 या pMCM2, सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट कमजोर पड़ने) के खिलाफ वांछित कमजोर पड़ने (माउस एंटी डिगॉक्सिगेनिन और खरगोश एंटीबॉडी) प्राप्त करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित मात्रा जोड़ें। टैप करके मिलाएं और इसे आरटी पर 20 मिनट के लिए खड़े रहने दें। कई नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और कुओं पर लागू करने से पहले टैप करके मिलाएं।
    2. कुएं के केंद्र में 40 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें। धुंधला होने के दौरान, पीएलए जांच और अवरुद्ध बफर को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें।
    3. RT पर PBS-T [PBS-T: 1X PBS में 0.05% ट्वीन-20] के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    4. धोते समय, प्रति डिश 40 μL PLA जांच समाधान तैयार करें (PLA जांच में खरगोश या माउस IgG को पहचानने वाला एक द्वितीयक एंटीबॉडी होता है, जो सहसंयोजक रूप से प्लस या MINUS ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड से जुड़ा होता है): PLA प्रोब एंटी माउस-प्लस का 8 μL + 8 μL का PLA प्रोब एंटी रैबिट-MINUS एंटीबॉडी + ब्लॉकिंग बफर का 24 μL। मिलाएं और इसे आरटी में 20 मिनट के लिए खड़े रहने दें। कई नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और कुओं पर लागू करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं। घोल को प्लेट में कुएं के बीच में रखें।
    5. अंतिम धोने को हटा दें, कुएं के केंद्र में 40 μL PLA जांच समाधान जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें।
    6. आरटी पर झुकाव वाले प्लेटफॉर्म पर बफर ए में 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं। धोने के दौरान, बंधाव मिश्रण को आरटी में लाएं।
  2. बंधाव और प्रवर्धन
    1. प्रति प्लेट 40 μL लिगेशन मिश्रण तैयार करें: 8 μL (5x) लिगेशन स्टॉक + आसुत जल का 31 μL + 1 μL लिगेज। कई प्लेटों के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें और कुओं पर लागू करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. प्रत्येक प्लेट में 40 μL बंधाव घोल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें।
    3. आरटी पर झुकाव मंच पर कोशिकाओं को बफर ए के साथ 3x धोएं, प्रत्येक 2 मिनट के लिए।
    4. प्रति डिश 40 μL प्रवर्धन समाधान तैयार करें: प्रवर्धन स्टॉक का 8 μL (5x) + आसुत जल का 31.5 μL + DNA पोलीमरेज़ का 0.5 μL। कई नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और कुओं पर आवेदन करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
    5. प्रत्येक प्लेट में 40 μL प्रवर्धन घोल जोड़ें और 100 मिनट के लिए 37 °C पर आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें।
    6. प्रवर्धन घोल को एस्पिरेट करें और बफर बी के साथ धो लें। आरटी पर एक झुकाव मंच पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक 6 वॉश करें।
    7. आरटी पर 1 मिनट के लिए 0.01 एक्स बफर बी के साथ एक बार धो लें।
    8. एस्पिरेट बफर बी और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट प्लेटें, एलेक्सा फ्लूर 488 एंटी-माउस आईजीजी और एलेक्सा फ्लूर 568 एंटी-खरगोश आईजीजी एक आर्द्र कक्ष में, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर को अवरुद्ध करने में उचित कमजोर पड़ने पर समाधान को अवरुद्ध करते हैं।
    9. कोशिकाओं को पीबीएस-टी के साथ तीन बार धोएं, आरटी पर झुकाव मंच पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए।
    10. एस्पिरेटेड पीबीएस-टी और डीएपीआई के साथ बढ़ते माध्यम में माउंट करें। माउंटेड प्लेटों को तुरंत चित्रित किया जा सकता है या इमेजिंग से पहले 4 दिनों से अधिक समय तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. इमेजिंग और परिमाणीकरण

  1. एपिफ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में इमेजिंग करें (यदि 3 डी इमेजिंग वांछनीय है, तो 15 ढेर में कम से कम 3 μm को कवर करें)। प्रति नमूना या स्थिति में कम से कम 100 अवलोकन करने के लिए तीन प्रतियों में प्रयोग करें और पर्याप्त संख्या में फ़ील्ड की छवि बनाएं। समान एक्सपोज़र सेटिंग्स का उपयोग करके नियंत्रण सहित सभी फ़ील्ड और नमूने छवि बनाएं।
  2. एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ मात्रा निर्धारित करें (एकल या एकाधिक विमान-छवियों में इस विश्लेषण को करने में सक्षम ओपन सोर्स और वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    1. डीएपीआई धुंधला होने पर आधारित सेगमेंट सेल नाभिक। परमाणु पीएलए डॉट्स का पता लगाना। पीएलए डॉट्स को उनके संबंधित नाभिक में असाइन करें। प्रति न्यूक्लियस परिणामों में पीएलए डॉट्स को सीएसवी फ़ाइल के रूप में निर्यात करें (पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 देखें)।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण (सुझाए गए खुले स्रोत और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    1. सत्यापित करें कि क्या नमूने शापिरो-विल्क परीक्षण के साथ सामान्य वितरण का पालन करते हैं।
    2. निर्धारित करें कि क्या छात्र-टी परीक्षण (यदि सामान्य वितरण धारणा पूरी हुई) या विलकॉक्सन-रैंक सम परीक्षण (यदि नमूने के लिए सामान्य वितरण धारणा का उल्लंघन किया जाता है) का उपयोग करके दो नमूनों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है।
  4. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन: विभिन्न नमूनों के लिए डेटा वितरण, औसत (क्यू2), 25 वें (क्यू1) और 75वें प्रतिशत की कल्पना करने के लिए बॉक्स प्लॉट के साथ संयुक्त डॉट प्लॉट उत्पन्न करें (सुझाए गए ओपन सोर्स और वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

4.3D pMCM2 का प्रदर्शन: आईसीएल इंटरैक्शन

  1. प्लान फ्लोर 60x/1.25 संख्यात्मक एपर्चर तेल उद्देश्य का उपयोग करते हुए, एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर पीएलए प्लेट्स की छवि। 1.6 मिमी को कवर करने वाले 16 ढेर प्राप्त करें और उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

रिप्लिसोम प्रोटीन के साथ डिग-टीएमपी की पीएलए
Dig-TMP की संरचना चित्र 1 में दिखाया गया है। संश्लेषण का विवरण, जिसमें ट्राइमिथाइल सोरालेन को ग्लाइकोल लिंकर के माध्यम से डिगॉक्सिगेनिन में संयुग्मित किया गया था, पर पहले17,21 पर चर्चा की गई है। यौगिक के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन के बाद 365 एनएम प्रकाश (यूवीए) फोटो के संपर्क में आने से यौगिक सक्रिय हो जाता है और क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया चलती है। 90% से थोड़ा अधिक जोड़ आईसीएल16 हैं। डिग टैग को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की जा सकती है जो पूरे नाभिक में आईसीएल की उपस्थिति को प्रकट करता है (चित्रा 2)। एमसीएम 2 जैसे एक रिप्लिसोम प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस भी पूरे नाभिक में वितरण को इंगित करता है, एक वितरण जो आईसीएल की शुरूआत से अप्रभावित है। इन परिणामों से पता चला कि प्रतिक्रिया देने वाले प्रोटीन की फोकल उपस्थिति, जैसे कि डीएसबी के लिए डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) में देखा गया है, प्रतिकृति की एक विशेषता नहीं है: आईसीएल इंटरैक्शन।

चित्र 2 में दिखाए गए प्रयोग में आईसीएल के साथ रिप्लिसोम की बातचीत की कल्पना करने के लिए हमने पीएलए को लागू किया, जो दो एंटीजन (चित्रा 3 ए) की निकटता की रिपोर्ट करता है। हमने आईसीएल (चित्रा 3 बी) की शुरूआत के बाद एमसीएम 5 और डिग टैग 1 घंटे के जुड़ाव की आवृत्ति को मापा। पीएलए संकेतों ने आईसीएल के लिए रिप्लिसोम की निकटता का प्रदर्शन किया।

प्रतिकृति तनाव, जिसमें आईसीएल द्वारा प्रस्तुत किया गया है, एटीआर किनेज22 को सक्रिय करता है। एटीआर के कई सब्सट्रेट्स में एमसीएम प्रोटीन हैं, जिसमें सेरीन 10823 पर एमसीएम 2 शामिल है। आईसीएल के साथ एक जवाबी मुठभेड़ के परिणामस्वरूप एमसीएम 2 के फॉस्फोराइलेशन के परिणामस्वरूप कई अन्य सब्सट्रेट्स के बीच होने की उम्मीद होगी। इस अपेक्षा के अनुरूप, pMCM2Ser108 और Dig टैग के बीच PLA सकारात्मक था (चित्रा 3c)। अन्य प्रयोगों में हमने पाया कि पठार आवृत्ति 1 घंटे20 तक पहुंच गई थी। हमने इन परिणामों की व्याख्या यह संकेत देने के रूप में की कि प्रतिकृति पूरे जीनोम में स्थित है, और आईसीएल से दूर है, अंततः ब्लॉक का सामना करती है, जिससे एटीआर सक्रियण और एमसीएम 2 फॉस्फोराइलेशन शुरू होता है।

पूर्ववर्ती आंकड़ों में पीएलए के परिणामों को कई ऑप्टिकल विमानों के संपीड़ित योग के रूप में प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, व्यक्तिगत नाभिक के परिणामों को तीन-आयामी पुनर्निर्माण में भी प्रस्तुत किया जा सकता है, जैसा कि पीएमसीएम 2 के लिए दिखाया गया है: वीडियो 1 में डिग-टीएमपी पीएलए। इस विश्लेषण ने संकेत दिया कि पूरे नाभिक में आईसीएल के साथ प्रतिकृति मुठभेड़ देखी जा सकती है।

प्रतिकृति फोर्क के हमारे अध्ययन से पता चला है कि आईसीएल मुठभेड़ों ने एक अप्रत्याशित प्रतिकृति पुनरारंभ घटनाका खुलासा किया। एक कार्यात्मक प्रतिकृति की लॉक रिंग संरचना को ध्यान में रखते हुए, यह पूछना काफी दिलचस्प था कि क्या आईसीएल से टकराने पर प्रतिकृति तंत्र की संरचना बदल गई है। चूंकि 10% से कम प्रतिकृति कांटे आईसीएल के साथ संपर्क करते हैं, इसलिए सभी रिप्लिसोम की प्रोटीन संरचना को समझना उत्पादक नहीं होता। हालांकि, डिग और विभिन्न घटकों के बीच पीएलए ने हमें इस प्रश्न को संबोधित करने की अनुमति दी। पीएमसीएम 2 के साथ सकारात्मक परिणामों के विपरीत, हमने पाया कि जीआईएनएस कॉम्प्लेक्स के प्रोटीन आईसीएल के साथ पीएलए सिग्नल देने में विफल रहे। दूसरी ओर, सीडीसी 45 के साथ परख सकारात्मक थी, यह दर्शाता है कि अन्य लॉकिंग प्रोटीन को बरकरार रखा गया था (चित्रा 4ए, बी)। जब कोशिकाओं को एटीआर के अवरोधक के साथ इनक्यूबेट किया गया था, तो पुनरारंभ पूरी तरह से दबा दिया गया था और जीआईएनएस: डिग पीएलए दृढ़ता से सकारात्मक था (चित्रा 4 सी)। इन परिणामों की हमारी व्याख्या यह थी कि एटीआर गतिविधि की अनुपस्थिति में जीआईएनएस प्रोटीन को बनाए रखा गया था, सीएमजी हेलिकेस एक लॉक कॉन्फ़िगरेशन में रहा, और आईसीएल20 से पहले कोई प्रतिकृति पुनरारंभ नहीं हुआ।

Figure 1
चित्रा 1: डाइगोक्सीजेनिन एंटीजन टैग से जुड़े ट्राइमिथाइल सोरालेन की संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: रिप्लिसोम प्रोटीन एमसीएम 5 और डीआईजी टीएमपी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस असतत फॉसी नहीं दिखाते हैं। कोशिकाओं को डिग-टीएमपी और यूवीए के साथ और एमसीएम 5 और डिग के लिए 1 एच इम्यूनोस्टेन्ड के बाद इलाज किया गया था। सफेद पट्टी 5 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डिग-टीएमपी और एमसीएम 5 के बीच पीएलए। (ए) आईसीएल पर एमसीएम 5 रिप्लिसोम प्रोटीन और डिग टैग के बीच बातचीत के लिए लागू प्रॉक्सिमिटी लिगेशन परख का योजनाबद्ध। इस योजना को सरल बनाया गया है। व्यवहार में प्राथमिक एंटीबॉडी द्वितीयक एंटीबॉडी से बंधे थे जो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ सहसंयोजक रूप से युग्मित थे। (ख) एमसीएम5 और डिग-टीएमपी के बीच पीएलए। इंटरैक्शन की साइटों को इंगित करने वाले असतत संकेतों पर ध्यान दें। डॉट और बॉक्स प्लॉट सिग्नल वितरण (डॉट प्लॉट) के साथ-साथ माध्य (बॉक्स प्लॉट रेड बार), 25वें और 75वें प्रतिशत (बॉक्स छोर) और आउटलायर्स (चरम रेखाओं) को छोड़कर उच्चतम और निम्नतम मान दिखाते हैं। विलकॉक्सन-रैंक सम परीक्षण ने पुष्टि की कि दो स्थितियों (पी <0.001) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है। (c) pMCM2 और Dig-TMP के बीच 5 μm. (c) PLA का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये संकेत आईसीएल के साथ रिप्लिसोम की मुठभेड़ का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो एमसीएम 2 के एटीआर निर्भर फॉस्फोराइलेशन को ट्रिगर करता है। पीएलए विभिन्न कोशिकाओं में मुठभेड़ आवृत्ति की परिवर्तनशीलता की रिपोर्ट करता है। सफेद पट्टी 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डिग-टीएमपी और रिप्लिसोम लॉकिंग प्रोटीन के बीच पीएलए। (ए) सीडीसी 45: डिग-टीएमपी। सफेद पट्टी 5 μm का प्रतिनिधित्व करती है। (b) PSF1: Dig-TMP. न्यूनतम सिग्नल आवृत्ति एटीआर अवरोधक के साथ उपचार द्वारा बहुत बढ़ जाती है, जो ट्रैवर्स मार्ग और जीआईएनएस कॉम्प्लेक्स की रिहाई को अवरुद्ध करती है जिसमें पीएसएफ 1 शामिल है। सफेद पट्टियाँ 5 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: पीएमसीएम 2 का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण: डिग पीएलए सिग्नल पूरे नाभिक में वितरण को दर्शाता है। पीसीएनए हरे रंग में सना हुआ है, पीएलए लाल रंग में, डीएपीआई नीले रंग में। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: पीएलए परिमाणीकरण के लिए सेलप्रोफाइलर पाइपलाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फाइल 2: पीएलए परिमाणीकरण के लिए आईएमएआरआईएस सेल मॉड्यूल बैच पैरामीटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यद्यपि पीएलए एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन तकनीकी चिंताएं हैं जिन्हें स्पष्ट और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए हल किया जाना चाहिए। एंटीबॉडी उच्च आत्मीयता और विशिष्टता का होना चाहिए। इसके अलावा, गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को यथासंभव कम करना महत्वपूर्ण है। हमने पाया है कि झिल्ली और सेलुलर मलबे पृष्ठभूमि में योगदान करते हैं, और हमने उन्हें यथासंभव हटा दिया है। फिक्सिंग से पहले बफर युक्त डिटर्जेंट के साथ धोया जाता है, और ठीक करने के बाद मेथनॉल के साथ धोने से गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने में मदद मिलती है। चेतावनी यह है कि निर्धारण से पहले डिटर्जेंट उपचार के परिणामस्वरूप सेल डिटेचमेंट हो सकता है। हम पाते हैं कि सीएसके उपचार से पहले प्लेटों को सेल चिपकने वाला और 0.1% एफए के साथ उपसर्ग के साथ इलाज करना इस समस्या को कम करता है।

एस चरण विशिष्ट घटनाओं की निगरानी करते समय गैर-एस चरण कोशिकाओं की पहचान करना भी सहायक होता है। यह पीसीएनए या एनपीएटी24,25 जैसे सेल चक्र मार्करों के साथ पोस्ट पीएलए धुंधला करके किया जा सकता है। न केवल ये मार्कर एस चरण घटना की पुष्टि करते हैं बल्कि वे गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन के लिए एक आंतरिक जैविक नियंत्रण भी प्रदान करते हैं। जी 1 चरण कोशिकाओं में सकारात्मक संकेत, परख में जो एस चरण के लिए अनन्य होने वाली घटनाओं को मापते हैं, एक संकेत है कि गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को कम करने के लिए अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता है।

एकल सेल इमेजिंग रणनीतियों के फायदे आणविक इंटरैक्शन की निगरानी के लिए अन्य दृष्टिकोणों के साथ उपलब्ध नहीं हैं। होमोजेनाइजेशन तकनीक, जैसे कि इम्यूनोप्रेसिपेशन प्रयोगों में नियोजित व्यक्तिगत कोशिकाओं में घटनाओं के किसी भी संबंध को समाप्त करती है। नतीजतन, सेल चक्र की स्थिति के प्रभाव, या सेल आबादी में परिवर्तनशीलता के बारे में अंतर्दृष्टि खो जाती है। हालांकि, चूंकि पीएलए अलग-अलग कोशिकाओं में घटना आवृत्तियों की रिपोर्ट करता है, इसलिए इन अंतर्दृष्टि को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।

पीएलए की एक लगातार सीमा रुचि के लक्ष्यों के लिए इम्यूनोलॉजिकल डिटेक्शन अभिकर्मकों की कमी है। प्रत्यक्ष ब्रेकर के अलावा अन्य एजेंटों द्वारा पेश किए गए डीएनए गड़बड़ी के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया के बारे में सवालों को संबोधित करते समय यह एक चिंता का विषय है। हमने एक इम्यूनोटैग्ड डीएनए प्रतिक्रियाशील अभिकर्मक के उपयोग से उस सीमा को दूर कर दिया है। यद्यपि हमने इंटरस्ट्रैंड क्रॉसलिंक पर अपने अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन कीमोथेरेपी दवाओं सहित कई जीनोटॉक्सिक यौगिक हैं, जो खुद को इस दृष्टिकोण के लिए उधार देंगे। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन और डीएनए संरचनाओं के बीच बातचीत, जैसे कि जी चौगुनी, इस रणनीति के साथ भी जांच की जा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग, संयुक्त राज्य अमेरिका (जेड01-एजी000746-08) द्वारा समर्थित किया गया था। जेएच चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21708007 और 31871365) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

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References

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जीव विज्ञान अंक 173 रिप्लिसोम ब्लॉकिंग घाव पीएलए प्रॉक्सिमिटी लिगेशन परख डीएनए इंटरस्ट्रैंड क्रॉसलिंक एंटीजन-टैग किए गए क्रॉसलिंक

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

एंटीजन टैग किए गए ब्लॉकिंग घाव के साथ रिप्लिसोम मुठभेड़ों का विज़ुअलाइज़ेशन
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Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

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