Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация ответных встреч с поражением, помеченным антигеном, блокирующим поражение

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

В то время как репликационные вилочные столкновения с аддуктами ДНК могут вызывать разрывы двойной цепи, меньше известно о взаимодействии между реплисомами и блокирующими поражениями. Мы использовали анализ лигирования близости, чтобы визуализировать эти встречи и охарактеризовать последствия для состава реплисом.

Abstract

Значительное понимание клеточного ответа на двухцепочечные разрывы (DSB), индуцированные нуклеазами, радиацией и другими разрушителями ДНК. Отчасти это отражает наличие методов идентификации участков разрыва и характеристику факторов, привлекаемых в ОРС в этих последовательностях. Однако DSB также появляются в качестве промежуточных продуктов при обработке аддуктов ДНК, образованных соединениями, которые непосредственно не вызывают разрывов и не реагируют на определенные участки последовательности. Следовательно, для большинства из этих агентов технологии, позволяющие анализировать связывающие взаимодействия с факторами ответа и белками репарации, неизвестны. Например, межцепочечные сшивки ДНК (ICL) могут провоцировать разрывы после встреч репликационной вилки. Несмотря на то, что они формируются препаратами, широко используемыми в качестве химиотерапии рака, не было методологии мониторинга их взаимодействия с репликационными белками.

Здесь мы описываем нашу стратегию отслеживания клеточного ответа на столкновения вилок с этими сложными аддуктами. Мы связали стероидный антиген с псораленом, который образует фотоактивационно-зависимые ICL в ядрах живых клеток. ICL визуализировали с помощью иммунофлуоресценции против метки антигена. Метка также может быть партнером в анализе бесконтактного лигирования (PLA), который сообщает о тесной связи двух антигенов. PLA использовали, чтобы отличить белки, которые были тесно связаны с мечеными ICL, от тех, которые не были связаны. Удалось определить реплисомные белки, которые были сохранены после встреч с ICL, и идентифицировать другие, которые были потеряны. Этот подход применим к любой структуре или аддукту ДНК, которые могут быть обнаружены иммунологически.

Introduction

Клеточная реакция на двухцепочечные разрывы хорошо задокументирована благодаря последовательности все более мощных методов направления разрывов к определенным участкам генома 1,2,3. Определенность местоположения позволяет однозначно охарактеризовать белки и другие факторы, которые накапливаются на участке и участвуют в реакции на повреждение ДНК (DDR), тем самым управляя путями негомологичного концевого соединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR), которые восстанавливают разрывы. Конечно, многие разрывы вводятся такими агентами, как радиация и химические вещества, которые не атакуют определенные последовательности4. Однако для них существуют процедуры, которые могут преобразовать концы в структуры, поддающиеся маркировке и локализации 5,6. Разрывы также вносятся биологическими процессами, такими как перестройка иммуноглобулинов, и последние технологии позволяют их локализовать, а также7. Затем можно определить взаимосвязь между реагирующими факторами и этими сайтами.

Разрывы также появляются как косвенное следствие аддуктов, образованных соединениями, которые не являются врожденными разрушителями, но нарушают транзакции ДНК, такие как транскрипция и репликация. Они могут быть сформированы как особенность клеточного ответа на эти препятствия, возможно, во время восстановления или потому, что они провоцируют структуру, которая уязвима для атаки нуклеаз. Как правило, физическая связь между аддуктом, разрывом и ассоциацией с реагирующими факторами является выводной. Например, ICL образуются химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин и митомицинС8, и в качестве продукта реакции основных сайтов9. ICL хорошо известны как мощные блоки репликационных вилок10, тем самым останавливая вилки, которые могут быть расщеплены нуклеазами11. Ковалентная связь между цепями часто облегчается путями, которые имеют облигатные разрывы в качестве промежуточныхпродуктов 12,13, что требует гомологичной рекомбинации для восстановления репликационной вилки14. В большинстве экспериментов исследователь следит за реакцией интересующих факторов на разрывы, которые образуются ниже по течению от столкновения репликационной вилки с ICL. Однако, поскольку не было никакой технологии локализации провокационного поражения, можно только предположить близость реплизомы и ее составных частей к ICL.

Мы разработали стратегию, позволяющую анализировать белковые ассоциации с непоследовательными специфическими ковалентными аддуктами, проиллюстрированными здесь ICL. В нашу систему они введены псораленом, фотоактивным натуральным продуктом, используемым на протяжении тысячелетий в качестве терапевтического средства для лечения кожных заболеваний15. Наш подход основан на двух важных особенностях псораленов. Во-первых, это их высокая частота образования сшивки, которая может превышать 90% аддуктов, в отличие от менее 10%, образованных популярными соединениями, такими как цисплатин или митомицин С 8,16. Во-вторых, доступность соединения к сопряжению без потери сшивающей способности. Мы ковалентно связываем триметилпсорален с дигоксигенином (Dig), давно установленной иммунометкой. Это позволяет обнаруживать аддукты псоралена в геномной ДНК с помощью иммуноокрашивания метки Dig и визуализации с помощью обычной иммунофлуоресценции17.

Этот реагент был применен в нашей предыдущей работе для анализа встреч репликационной вилки с ICL с использованием анализа на основе ДНК-волокна16. В этой работе мы обнаружили, что репликация может продолжаться после неповрежденного ICL. Это зависело от ATR-киназы, которая активируется репликационным стрессом. Перезапуск репликации был неожиданным, учитывая структуру репликативной геликазы CMG. Он состоит из гетерогексамера MCM (M), который образует кольцо со смещенным зазором вокруг матричной цепи для синтеза ведущей цепи, которая заблокирована белками комплекса GINS (G, состоящего из PSF1, 2, 3 и SLD5) и CDC45 (C) 18. Предположение о том, что репликация может быть возобновлена на стороне ICL дистальнее стороны столкновения реплисом, приводило доводы в пользу изменения структуры реплисомы. Чтобы ответить на вопрос о том, какие компоненты были в ответе во время встречи с ICL, мы разработали подход, описанный здесь. Мы использовали тег Dig в качестве партнера в анализах бесконтактного лигирования (PLA)19 для изучения тесной связи ICL с белками реплиомы20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клеток

  1. День 1
    1. Предварительно обработайте 35-миллиметровые чашки для культур со стеклянным дном клеевым раствором.
    2. Пластинчатые клетки в предварительно обработанной посуде за сутки до обработки. Клетка должна быть активно делящейся и на 50–70% сливаться в день эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HeLa использовались в этом эксперименте с Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой, 1x пенициллином / стрептомицином. Нет ограничений для адгезивных клеточных линий. Тем не менее, неадгезивные клетки должны быть центрифугированы на предметных стеклах и зафиксированы перед анализом с помощью PLA.
  2. День 2
    1. Приготовьте исходный раствор дигоксигенина триметилпсоралена (Dig-TMP) путем ресуспендирования замороженной аликвоты ранее синтезированного Dig-TMP в 1:1 EtOH:H 2 O. Определите концентрацию,измерив OD при 250 нм 100-кратного разбавления (в H2O) растворенного Dig-TMP. Коэффициент вымирания Dig-TMP составляет 25 000. Проверяйте концентрацию, измеряя OD на длине волны 250 нм перед каждым использованием, и рассчитывайте концентрацию запасов: Abs x 100 x 106/25 000 = концентрация (в мкМ). Как правило, исходный раствор составляет около 3 мМ. Раствор можно хранить при температуре –20 °C около месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Dig-TMP должен быть химически синтезирован заранее, следуя процедуре, описанной здесь. Рефлюкс 4'-хлорметил-4,5',8-триметилпсорален с 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамином в толуоле под азотом в течение 12 ч. Удалите растворитель и восстановите продукт 4'-[N-(13-амино-4,7,10-триоксатридека)] аминометил-4,5',8-триметилпсорален с помощью силикагелевой хроматографии. Конъюгируют продукт с дигоксигениновым эфиром NHS в диметилформамиде и триэтиламине при 50 °C в течение 18 ч. Удалите растворитель и очистите остаток препаративной тонкослойной силикагелевой хроматографией. Разбавление полосы продукта хлороформ: метанол: смесь 28% гидроксида аммония (8:1:0,1). Выпарить растворители и растворить гранулу в 50% EtOH:H2O.
    2. Добавьте сырье Dig-TMP в 50% EtOH:H2O в среду для культивирования клеток до конечной концентрации 5 мкМ. Доведите среду до 37 °C. Аспирируйте среду из пластин, добавьте предварительно подогретую среду, содержащую Dig-TMP, и поместите пластины в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 30 минут, чтобы дать Dig-TMP уравновеситься.
    3. Во время инкубации клеток предварительно прогрейте УФ-бокс (см. Таблицу материалов) до 37 °C.
    4. Поместите планшеты в предварительно разогретый УФ-бокс и подвергните клетки дозе 3 Дж/см2 ультрафиолетового света в течение 5 минут для этого эксперимента. Пластины были помещены поверх термоблока, поддерживаемого при 37 ° C во время облучения. Рассчитайте время по формуле:
      Equation 1
    5. Аспирируйте среду с помощью пипетки, добавьте свежую предварительно подогретую среду и поместите пластины обратно в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 на 1 час.
    6. Удалите носитель и аккуратно вымойте посуду один раз фосфатным солевым раствором (PBS).
    7. Удалите PBS и добавьте 0,1% формальдегида (FA) в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Это предотвращает отслоение клеток во время предварительной обработки CSK-R (буфер экстракции цитоскелета, содержащий РНКазу, описанный в 1.2.9.), необходимой для извлечения цитоплазматических элементов и снижения фона PLA.
    8. Аспирируйте FA и один раз вымойте посуду с помощью PBS.
    9. Добавьте буфер CSK-R и инкубируйте в течение 5 мин при RT для удаления цитоплазмы [буфер CSK-R: 10 мМ PIPES, pH 7,0, 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2, 0,5% Triton X-100, 300 мкг/мл РНКазы A]. Аспирируйте буфер, добавьте свежий CSK-R и выдерживайте в течение 5 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запас буфера CSK можно хранить при температуре 4 °C, а Triton X и RNaseA добавлять непосредственно перед использованием.
    10. Трижды вымойте PBS.
    11. Зафиксируйте ячейки с 4% формальдегидом в PBS в течение 10 мин при ЛТ.
    12. Вымойте клетки с помощью PBS. Выполните этот шаг три раза.
    13. Добавьте холодный 100% метанол и выдерживайте в течение 20 мин при -20 °C.
    14. Трижды промойте клетки PBS. На этом этапе клетки можно хранить в PBS во влажной камере при 4 ° C до недели.
    15. Инкубировать клетки в 80 мкл 5 мМ TritonX-100 в течение 10 мин при 4 °C.
    16. Инкубируйте клетки со 100 мкл 5 мМ ЭДТА в PBS с добавлением 1 мкл 100 мг / мл РНКазы А в течение 30 мин при 37 ° C.
    17. Трижды промойте клетки PBS.
    18. Храните клетки в блокирующем буфере (5% BSA и 10% козьей сыворотки в PBS) во влажной камере в течение ночи при 4 ° C.

2. Анализ бесконтактного лигирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ бесконтактного лигирования на 3-й день.

  1. Окрашивание антителами
    1. Приготовьте 40 мкл раствора первичного антитела на планшет: добавьте соответствующий объем первичных антител для достижения желаемого разведения (мышиный антидигоксигенин и кроличье антитело против реплисомного компонента, такого как MCM5, CDC45, PSF1 или pMCM2, разведения, указанные в таблице материалов) в блокирующий буфер (для достижения конечного объема 24 мкл). Перемешайте, постукивая, и дайте ему постоять 20 минут при RT. Приготовьте мастер-смесь для нескольких образцов и перемешайте постукиванием перед нанесением в скважины.
    2. Добавьте 40 мкл раствора первичного антитела в центр лунки и инкубируйте во влажной камере в течение 1 ч при 37 °C. Во время окрашивания дайте зондам PLA и блокирующему буферу нагреться до комнатной температуры.
    3. Промывайте ячейки с помощью PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 в 1X PBS] при RT. Выполните этот шаг три раза.
    4. Во время мытья приготовьте 40 мкл раствора зонда PLA на чашку (зонды PLA состоят из вторичного антитела, распознающего IgG кролика или мыши, ковалентно связанного с олигонуклеотидом PLUS или MINUS): 8 мкл зонда PLA против мыши-PLUS + 8 мкл зонда PLA против антитела кролика-МИНУС + 24 мкл блокирующего буфера. Перемешайте и дайте постоять 20 минут при RT. Приготовьте мастер-смесь для нескольких образцов и хорошо перемешайте перед нанесением в лунки. Поместите раствор в середину лунки в тарелку.
    5. Удалите последнюю промывку, добавьте 40 мкл раствора зонда PLA в центр лунки и инкубируйте во влажной камере в течение 1 ч при 37 ° C.
    6. Промываем в буфере А трижды по 10 мин на опрокидывающейся платформе при РТ. Во время промывания доведите смесь для перевязки до RT.
  2. Лигирование и амплификация
    1. Приготовьте 40 мкл смеси для лигирования на пластину: 8 мкл (5x) лигационного сырья + 31 мкл дистиллированной воды + 1 мкл лигазы. Приготовьте мастер-микс для нескольких пластин и хорошо перемешайте перед нанесением в лунки.
    2. Добавьте 40 мкл раствора лигирования в каждую пластину и инкубируйте во влажной камере в течение 30 мин. при 37 ° C.
    3. Промойте ячейки 3x с буфером А, каждая в течение 2 минут, на наклонной платформе при RT.
    4. Приготовьте 40 мкл амплификационного раствора на чашку: 8 мкл (5x) амплификационного сырья + 31,5 мкл дистиллированной воды + 0,5 мкл ДНК-полимеразы. Подготовьте мастер-смесь для нескольких образцов и хорошо перемешайте перед нанесением в скважины.
    5. Добавьте 40 мкл амплификационного раствора в каждую пластину и инкубируйте во влажной камере при 37 ° C в течение 100 мин.
    6. Аспирируйте амплификационный раствор и промойте буфером B. Выполните 6 стирок каждый в течение 10 минут на наклонной платформе при RT.
    7. Промойте один раз с 0,01x буфером B в течение 1 мин при RT.
    8. Аспирировать буфер B и инкубировать планшеты с вторичными антителами, Alexa Fluor 488 анти-мышиный IgG и Alexa Fluor 568 анти-кроличий IgG в блокирующем растворе при соответствующих разведениях в блокирующем буфере, во влажной камере, в течение 30 мин при 37 ° C или ночью при 4 ° C.
    9. Трижды промойте ячейки с помощью PBS-T в течение 10 минут каждый на наклонной платформе при RT.
    10. Присощите PBS-T и установите в монтажную среду с помощью DAPI. Установленные пластины можно сразу же получить изображение или хранить при температуре 4 °C в темноте не более 4 дней перед визуализацией.

3. Визуализация и количественная оценка

  1. Выполняйте визуализацию в эпифлуоресцентном или конфокальном микроскопе (если желательна 3D-визуализация, охватывайте не менее 3 мкм в 15 стеках). Проведите эксперименты в трех экземплярах и сфотографируйте достаточное количество полей, чтобы сделать не менее 100 наблюдений на образец или условие. Изображение всех полей и образцов, включая элементы управления, с одинаковыми настройками экспозиции.
  2. Количественная оценка с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов для программного обеспечения с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения, способного выполнять этот анализ на одном или нескольких плоских изображениях).
    1. Ядра сегментных клеток основаны на окрашивании DAPI. Выполняйте обнаружение ядерных точек PLA. Назначьте точки PLA соответствующему ядру. Экспортируйте результаты PLA точек на ядро в виде CSV-файла (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2).
  3. Статистический анализ (см. Таблицу материалов для предлагаемого программного обеспечения с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения).
    1. Проверьте, соответствуют ли образцы нормальному распределению, с помощью теста Шапиро-Уилка.
    2. Определите, есть ли значимая разница между двумя выборками, используя критерий Стьюдента-t (если выполнено предположение о нормальном распределении) или критерий суммы рангов Уилкоксона (если допущение нормального распределения нарушено для выборки).
  4. Визуализация данных: Создание точечных диаграмм в сочетании с блочными диаграммами для визуализации распределения данных, медианы (Q2), 25-го (Q1) и75-го процентиля для различных выборок (см. Таблицу материалов для предлагаемого программного обеспечения с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения).

4.3D отображение pMCM2: взаимодействия ICL

  1. Изображение пластин PLA на конфокальном микроскопе с вращающимся диском с использованием масляного объектива Plan Fluor 60x/1.25 с числовой апертурой. Приобретите 16 стеков размером 1,6 мм и создайте 3D-реконструкцию с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PLA Dig-TMP с белками-реплисомами
Структура Dig-TMP показана на рисунке 1. Детали синтеза, в котором триметилпсорален был конъюгирован через гликолевый линкер с дигоксигенином, обсуждались ранее17,21. Инкубация клеток с соединением с последующим воздействием света 365 нм (UVA) фотоактивирует соединение и запускает реакцию сшивания. Чуть более 90% аддуктов составляют ICL16. Тег Dig можно визуализировать с помощью иммунофлуоресценции, которая выявляет присутствие ICL по всему ядру (рис. 2). Иммунофлуоресценция реплисомного белка, такого как MCM2, также указывает на распределение по всему ядру, распределение, на которое не влияет введение ICL. Эти результаты продемонстрировали, что фокальное появление реагирующих белков, например, наблюдаемое в ответе на повреждение ДНК (DDR) на DSB, не является особенностью взаимодействий между реплисомами: ICL.

Чтобы визуализировать взаимодействие реплисом с ICL в эксперименте, показанном на рисунке 2, мы применили PLA, который сообщает о близости двух антигенов (рис. 3a). Мы измерили частоту ассоциации MCM5 и метки Dig через 1 ч после введения ICL (рис. 3b). Сигналы PLA продемонстрировали близость ответов к ICL.

Репликационный стресс, в том числе проявляемый ICL, активирует ATR-киназу22. Среди многих субстратов ATR есть белки MCM, включая MCM2 в серине 10823. Ожидается, что ответная встреча с ICL приведет к фосфорилированию MCM2 среди многих других субстратов. В соответствии с этим ожиданием, PLA между pMCM2Ser108 и тегом Dig был положительным (рис. 3c). В других экспериментах мы обнаружили, что частота плато была достигнута в 1 час20 минут. Мы интерпретировали эти результаты как указывающие на то, что реплизомы, по-разному расположенные по всему геному и различно удаленные от ICL, в конечном итоге сталкиваются с блоком, вызывая активацию ATR и фосфорилирование MCM2.

Результаты PLA на предыдущих рисунках представлены в виде сжатого суммирования нескольких оптических плоскостей. Тем не менее, результаты по отдельным ядрам также могут быть представлены в трехмерной реконструкции, как показано для pMCM2: Dig-TMP PLA на видео 1. Этот анализ показал, что ответные встречи с ICL можно наблюдать по всему ядру.

Наше исследование репликационной вилки показало, что встречи ICL выявили неожиданное явление перезапуска репликации16. Рассматривая запертую кольцевую структуру функциональной реплисомы, представлял значительный интерес вопрос о том, изменяется ли состав репликационного аппарата при столкновении с ICL. Поскольку менее 10% репликационных вилок контактируют с ICL, простой анализ белкового состава всех реплисом не был бы продуктивным. Однако НОАК между Dig и различными компонентами позволила решить этот вопрос. В отличие от положительных результатов с pMCM2, мы обнаружили, что белки комплекса GINS не давали сигнал PLA с ICL. С другой стороны, анализ с CDC45 был положительным, что указывает на то, что другой блокирующий белок был сохранен (рис. 4a, b). Когда клетки инкубировали с ингибитором ATR, перезапуск был полностью подавлен, и GINS: Dig PLA был сильно положительным (рис. 4c). Наша интерпретация этих результатов заключалась в том, что при отсутствии активности ATR белки GINS были сохранены, геликаз CMG оставалась в заблокированной конфигурации, и не было перезапуска репликации после ICL20.

Figure 1
Рисунок 1: Структура триметилпсоралена, связанного с меткой антигена дигоксигенина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Иммунофлуоресценция реплисомного белка MCM5 и DIG TMP не показывает дискретных очагов. Клетки обрабатывали препаратами Dig-TMP и UVA, а через 1 ч иммуноокрашивали на MCM5 и Dig. Белая полоса представляет собой 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: PLA между Dig-TMP и MCM5. (a) Схема анализа бесконтактного лигирования, применяемого к взаимодействию между реплисомным белком MCM5 и меткой Dig на ICL. Схема упрощена. На практике первичные антитела были связаны вторичными антителами, ковалентно связанными с олигонуклеотидами. (b) PLA между MCM5 и Dig-TMP. Обратите внимание на дискретные сигналы, указывающие места взаимодействия. Точечные и прямоугольные диаграммы, показывающие распределение сигнала (точечный график), а также медиану (прямоугольная диаграмма, красная полоса), 25-й и75-й процентили (концы прямоугольника), а также самые высокие и самые низкие значения, исключая выбросы (крайние линии). Тест Wilcoxon-Rank Sum подтвердил существенную разницу между этими двумя условиями (p<0,001). Белые полосы обозначают 5 мкм. (c) PLA между pMCM2 и Dig-TMP. Эти сигналы представляют собой встречу реплиомы с ICL, которая запускает ATR-зависимое фосфорилирование MCM2. PLA сообщает об изменчивости частоты встреч в разных клетках. Белая полоса представляет собой 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: PLA между Dig-TMP и белками, блокирующими реплизомы. а) CDC45: Dig-TMP. Белая полоса обозначает 5 мкм. (b) PSF1: Dig-TMP. Минимальная частота сигнала значительно увеличивается за счет лечения ингибитором ATR, который блокирует траверсный путь и высвобождение комплекса GINS, включающего PSF1. Белые полосы представляют 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Трехмерная реконструкция сигналов pMCM2: Dig PLA демонстрирует распределение по всему ядру. PCNA окрашивается в зеленый цвет, PLA — в красный, DAPI — в синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: Конвейер Cellprofiler для количественной оценки PLA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Пакетные параметры модуля ячейки IMARIS для количественного определения PLA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя НОАК является очень мощным методом, существуют технические проблемы, которые необходимо решить, чтобы получить четкие и воспроизводимые результаты. Антитела должны обладать высоким сродством и специфичностью. Кроме того, важно максимально уменьшить количество неспецифических фоновых сигналов. Мы обнаружили, что мембраны и клеточный мусор вносят свой вклад в фон, и мы удалили их настолько, насколько это было возможно. Стирка моющим средством, содержащим буферы, перед фиксацией и стирка метанолом после фиксации помогают уменьшить неспецифическое связывание. Предостережение заключается в том, что обработка детергентом перед фиксацией может привести к отслоению клеток. Мы обнаружили, что обработка пластин клеточным клеем и префиксация 0,1% FA перед обработкой CSK облегчает эту проблему.

Также полезно идентифицировать ячейки, не относящиеся к S-фазе, при мониторинге событий, специфичных для S-фазы. Это можно сделать путем окрашивания после PLA маркерами клеточного цикла, такими как PCNA или NPAT24,25. Эти маркеры не только подтверждают явления S-фазы, но и обеспечивают внутренний биологический контроль неспецифических взаимодействий. Положительные сигналы в ячейках фазы G1 в анализах, которые измеряют события, которые должны быть эксклюзивными для S-фазы, указывают на то, что требуются дополнительные усилия для уменьшения неспецифических взаимодействий.

Стратегии визуализации отдельных клеток имеют преимущества, недоступные при других подходах к мониторингу молекулярных взаимодействий. Методы гомогенизации, такие как используемые в экспериментах по иммунопреципитации, устраняют любую связь с событиями в отдельных клетках. Следовательно, понимание влияния состояния клеточного цикла или изменчивости в популяции клеток теряется. Однако, поскольку PLA сообщает о частоте событий в отдельных ячейках, эти данные могут быть восстановлены.

Частым ограничением PLA является отсутствие иммунологических реагентов для обнаружения интересующих целей. Это вызывает беспокойство при решении вопросов, касающихся клеточного ответа на возмущения ДНК, вносимые агентами, отличными от прямых разрушителей. Мы преодолели это ограничение, используя реактивный реагент ДНК с иммунометкой. Хотя мы сосредоточили наши исследования на межцепочечных сшивках, существует множество генотоксичных соединений, включая химиотерапевтические препараты, которые подходят для этого подхода. Кроме того, с помощью этой стратегии можно изучить взаимодействия между белками и структурами ДНК, такими как G-квадруплексы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национального института старения, США (Z01-AG000746–08). J.H. поддерживается Национальными фондами естественных наук Китая (21708007 и 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

Биология выпуск 173 реплисома блокирующее поражение PLA анализ лигирования неблизости межцепочечные сшивки ДНК кросс-шлинки меченные антигенами

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Визуализация ответных встреч с поражением, помеченным антигеном, блокирующим поражение
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter