In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Summary

Denne protokollen gir eksperimentelle in vitro verktøy for å evaluere transformasjonen av menneskelige brystceller. Detaljerte trinn for oppfølging av cellespredningshastighet, forankringsuavhengig vekstkapasitet og distribusjon av cellelinje i 3D-kulturer med kjellermembranmatrise er beskrevet.

Abstract

Tumorigenesis er en flertrinnsprosess der celler får evner som tillater vekst, overlevelse og spredning under fiendtlige forhold. Ulike tester søker å identifisere og kvantifisere disse kjennetegnene på kreftceller; Imidlertid fokuserer de ofte på et enkelt aspekt av cellulær transformasjon, og faktisk kreves flere tester for riktig karakterisering. Formålet med dette arbeidet er å gi forskerne et sett med verktøy for å vurdere cellulær transformasjon in vitro fra et bredt perspektiv, og dermed gjøre det mulig å trekke gode konklusjoner.

En vedvarende proliferativ signalaktivering er det viktigste trekk ved tumorvev og kan lett overvåkes under in vitro forhold ved å beregne antall befolkningsdoblinger oppnådd over tid. Dessuten tillater veksten av celler i 3D-kulturer deres interaksjon med omkringliggende celler, som ligner hva som skjer in vivo. Dette gjør det mulig å evaluering av cellulær aggregering og, sammen med immunofluorescent merking av karakteristiske cellulære markører, å få informasjon om et annet relevant trekk ved tumortransformasjon: tap av riktig organisering. En annen bemerkelsesverdig egenskap ved forvandlede celler er deres evne til å vokse uten tilknytning til andre celler og til den ekstracellulære matrisen, som kan evalueres med forankringsanalysen.

Detaljerte eksperimentelle prosedyrer for å evaluere cellevekst, for å utføre immunofluorescent merking av cellelinjemarkører i 3D-kulturer, og for å teste anchorage-uavhengig cellevekst i myk agar er gitt. Disse metodene er optimalisert for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) på grunn av sin relevans i brystkreft; Prosedyrer kan imidlertid brukes på andre celletyper etter noen justeringer.

Introduction

Flere påfølgende hendelser er nødvendig for neoplasmautvikling. I 2011 beskrev Hanahan og Weinberg 10 evner som muliggjør transformerte cellers vekst, overlevelse og formidling: den såkalte "Hallmarks of Cancer"¹. Metodikken som er beskrevet her, utarbeider tre forskjellige verktøy for å evaluere in vitro cellulær transformasjon ved å fokusere på noen av tumorcellenes særegne egenskaper. Disse teknikkene vurderer cellespredningsraten, oppførselen til celler når de dyrkes i 3D og deres evne til å danne kolonier med forankringsuavhengighet.

Cellemodeller er avgjørende for å teste hypotese in vitro. Ulike tilnærminger er utviklet for å generere eksperimentelle modeller av cellulær transformasjon for studiet av^{kreft 2,3,4}. Siden brystkreft er den vanligste kreften blant kvinner over hele verden og er ansvarlig for ca 15% av kreftdødsfall blant^{kvinner 5}, gir egnede cellulære modeller av pattedyr epitelceller er av største betydning for videre undersøkelse. I denne artikkelen har vi illustrert potensialet i tre teknikker for å evaluere cellulær transformasjon ved hjelp av en eksperimentell modell av Breast Primary Epithelial Cells (BPECs) transformasjon opprinnelig beskrevet av Ince og kolleger i 2007⁶ og senere implementert i vårt^{laboratorium 7}. Denne eksperimentelle modellen er basert på sekvensiell endring av tre målrettede gener (SV40 Large T og små t antigener heri referert til som Ttag, hTERTog HRAS)til genomet av ikke-transformerte BPECer. Videre favoriserer metoden som brukes for BPECs avledning vedlikehold av pattedyr epitelceller med luminal eller myoepithelial markører, noe som resulterer i en heterogen cellekultur som beholder noen av brystkjertelen fysiologiske egenskaper.

I brystkjertelen er luminalpattedyrepitelceller, som er ansvarlige for melkeproduksjon, plassert i nærheten av lumen, mens myoepithelialceller kastes rundt luminalceller og tar vare på sammentrekningsbevegelser som fører melken til brystvorten. Tapet av riktig organisering mellom disse cellelinjene er et trekk ved tumortransformasjon⁸ som kan vurderes in vitro etter immunofluorescent påvisning av karakteristiske avstamning markører i 3D cellekulturer. En annen viktig egenskap ved tumorceller er deres evne til å vokse uten vedlegg til andre celler og til den ekstracellulære^{matrisen 1}. Når friske celler er tvunget til å vokse i suspensjon, mekanismer som anoikis \u2012 en type celledød indusert som svar på løsrivelse fra den ekstracellulære matrisen \u2012 er aktivert⁹. Unndragelse av celledød er et av de karakteristiske kjennetegnene på kreft, og dermed er forvandlede celler i stand til å inaktivere anoikier og overleve på en ankeruavhengig måte. Denne kapasiteten kan evalueres in vitro med den forankringsuavhengige analysen ved hjelp av myk agar. Videre er et iboende trekk ved tumorvev deres vedvarende proliferative signalkapasitet, som lett kan overvåkes under in vitro-forhold ved å måle økningen av cellenummer langs tiden, ikke bare i suspensjonsanalyser, men også ved å overvåke veksten av monolayer-tilhengerkulturer.

Til tross for den beste modellen for å teste tumorogent potensial er inokulasjon av tumorceller i murine modeller og evaluering av tumorutvikling in situ, er det viktig å minimere antall dyr som brukes i eksperimentelle prosedyrer så mye som mulig. Derfor, å ha egnede tester for å vurdere transformasjon in vitro er en topp prioritet. Her gir vi et sett med verktøy for å evaluere det tumorogene potensialet til delvis og fullstendig forvandlede brystepitelceller som enkelt kan implementeres i de fleste laboratoriene som fungerer med cellulære transformasjonsmodeller.

Protocol

Menneskelige prøver som ble brukt i følgende eksperimenter ble hentet fra reduksjon mammoplasties utført på Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) under standard prosedyre samtykke. Alle prosedyrer utføres i et biologisk sikkerhetskabinett i klasse II med mindre annet er oppgitt.

1. In vitro kultur av menneskelige pattedyr epitelceller og vekst kurve plot oppbygging

1. In vitro kultur av bryst primære epitelceller (BPECs): celle passaging
   MERK: For BPEC avledning og cellekultur følger du instruksjonene beskrevet av Ince et al., 2007⁶.
   1. Middels forberedelse.
      1. Supplement WIT basal definert medium med P eller T kosttilskudd, levert av produsenten, avhengig av om primære eller transformerte BPECs er kultivert.
      2. Tilsett koleratoksin til det supplerte WIT-mediet til en endelig konsentrasjon på 100 ng/ml for primær- eller 25 ng/ml for transformerte BPECer.
         FORSIKTIG: Koleratoksin er dødelig ved svelging. Bruk personlig verneutstyr. Unngå utgivelsen til miljøet.
   2. Vedlikehold og passaging av cellekultur.
      MERK: For følgende trinn må du huske på at cellene vokser i en T25-kolbe. Likevel kan volumer tilpasses andre cellekulturformater som opprettholder proporsjonaliteten når det gjelder overflateareal.
      1. Sjekk cellekonfluens hver dag. Når kulturen er 90% samløpet, utfør cellepassaging.
      2. Skaff deg 1x PBS, 3x trypsin, medium og et konisk rør på 15 ml som inneholder 2 ml føtal bovineserum (FBS) for hver kolbe.
      3. Fjern mediet fra kolben og hold det i det koniske røret på 15 ml som inneholder FBS.
      4. Skyll celler med 1x PBS.
      5. Løsne celler fra overflaten ved å legge til 1 ml 3x trypsin. Inkuber i 5 min ved 37 °C.
      6. Sjekk om cellene er koblet fra. Påfør kraftig risting hvis cellene ikke er helt løsrevet.
      7. Inaktiver trypsin ved å legge til det reserverte mediet supplert med FBS.
      8. Høst cellulær suspensjon og legg den i det koniske røret på 15 ml.
      9. Sentrifuge på 500 x g i 5 min, eliminere supernatant, og resuspend pelleted cellene ved å knipse bunnen av røret med en finger.
      10. Tilsett 1–2 ml friske medier i pelleten og mål cellekonsentrasjonen ved hjelp av en automatisk celleteller eller et hemocytometer. Disse dataene vil senere bli brukt til å beregne befolkningsdoblingene og trekke vekstkurven. Frø 12 000 celler/cm² (f.eks. 300 000 celler for en T25 kolbe) i modifiserte cellekulturoverflateflasker (se Materialtabell).
          MERK: Fortynn cellefjæringsoppløsningen hvis konsentrasjonen er for høy til å sikre riktig kvantifisering.
      11. Tilsett medium til et endelig volum på 5 ml og inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO_{2-atmosfære.}
      12. Erstatt cellekulturmediet hver 48.
2. Beregning av befolkningsdobling og datavisualisering
   1. Bruk av data for celleantallet som er oppnådd i trinn 1.1.2.10, og bruk følgende formel for å få de akkumulerte populasjonsdoblingsverdiene (PD):
      
      Hvor, PD_jeg betegner antall befolkningsdoblinger oppnådd av cellene til forrige subkultur (det refererer til PD akkumulert på forrige subkultur), N_h er antall høstede celler, og N_s er antall seedede celler.
   2. Representere data for et bestemt tidsintervall ved hjelp av en XY-graf der antall dager i kultur (x-akse) og den akkumulerte PD(y-aksen)er representert.
   3. Få den beste passformen og tilpasningsligningen:
      
      MERK: Økt helling (b) betyr økt spredningshastighet.

2. Tredimensjonal (3D) kultur i kjeller membran matrise og immunofluorescent protein deteksjon

1. 3D-kultur i kjellermembranmatrise
   MERK: Denne protokollen er tilpasset fra Debnath et al., 2003¹⁰ og er optimalisert for 24 brønnplater (se Materials tabell).
   1. Forbered materialet en dag før eksperimentet: pre-chill kjeller membran matrise over natten ved 4 ° C og la pipette tips, mikrocentrifuge rør, og godt plater avkjøles i fryseren.
      MERK: Matrisen må oppbevares ved -20 °C for langtidslagring. Lag aliquots for å unngå flere fryse-tine sykluser.
   2. På dagen for eksperimentet plasserer du forhåndskjølt materiale på is.
   3. Skyll brønner med kaldsteril 1x PBS for å redusere overflatespenningen.
   4. Dekk bunnen av hver brønn med 100 μL kjellermembranmatrise.
      MERK: Dispenser matrisen sakte og spre den gjennom brønnen; det er avgjørende å unngå bobledannelse i det nederste laget for å avverge monolayer cellekulturvekst.
   5. Plasser platen i inkubatoren, ved 37 °C, for å la matriselaget stivne.
      MERK: Det tar vanligvis ca. 20 min å stivne.
   6. I mellomtiden, trypsinize celler som forklart tidligere i trinn 1.1. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min og resuspend i medium. Forbered en 400 000 celler /ml suspensjon og forsiktig demontere en celle klump ved pipettering.
   7. Forbered mediet med 8% kjellermembranmatrise og bland 1:1 (v / v) med cellulær suspensjon for å få en 200.000 celler / ml løsning i 4% matrise.
      MERK: Beregn mengden medium som trengs for å unngå unødvendig avfall.
   8. Plasser 500 μL cellefjæring i matriseløsning på toppen av det allerede størknede matriselaget for å så totalt 100 000 celler i medium med 4% kjellermembranmatrise.
   9. Inkuber celler ved 37 °C i noen minutter, og tilsett deretter 500 μL av mediet med 4% kjellermembranmatrise. Inkuber cellene ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO₂ i 14 dager. Seedede celler vil gruppere og spre seg for å stamme fra de acini-lignendestrukturer.
      MERK: Cellemotilitet og aggregering kan overvåkes av tidsforløp under 3D-formasjonsprosessen. Bruk programvare for bildeanalyse (f.eks. Fiji/ImageJ eller Imaris) til å evaluere disse hendelsene. Antallet og størrelsen på acini avhenger av aggregeringsprosessen og spredningshastigheten og kan variere mellom celletyper. Juster kjelleren membran matrise konsentrasjon og seeded celler for å oppnå ønskede 3D strukturer.
   10. Tilsett 500 μL av mediet med 4% kjellermembranmatrise 2-3 ganger per uke.
       MERK: Unngå forstyrrelser i lagene som bærer platen forsiktig under manipulering.
   11. Om ønskelig kan antall og størrelse på acini måles i kulturperioden. For å gjøre dette, ta tilfeldige bilder til forskjellige tider etter såing ved hjelp av en fasekontrast eller DIC invertert mikroskop. Bruk bildeanalyseprogramvare til å måle diameteren på 100–200 3D-strukturer.
2. Immunstaining
   MERK: Sterile forhold er ikke nødvendig under denne delen av protokollen.
   1. Fjern kulturmediet.
   2. Riv kjellermembranmatrisen ved hjelp av en p200 pipettespiss med enden avskåret. Plasser ~50 μL med udelt matrise på toppen av et glasssklie og smør den i et område på 1–2 cm².
   3. La prøven tørke helt ved romtemperatur eller bruk en varmeplate ved 37 °C for å akselerere prosessen. Fiks prøver med metanol:aceton (1:1, v/v) ved -20 °C i 30 min.
      MERK: Fluorescerende signal fra tidligere markører, for eksempel fluorescerende proteiner uttrykt av cellene, vil bli slettet.
      FORSIKTIG: Metanol er brannfarlig, giftig ved innånding, svelging eller i tilfelle det kommer i kontakt med huden. Bruk personlig verneutstyr og arbeid inne i en røykhette.
   4. Kast fikseringsløsningen og fjern oms ekstra, hvis noen, ved å liggende lysbildet på filterpapir.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her. Når de er tørre, kan lysbildene oppbevares ved -20 °C i flere måneder.
   5. Blokker prøver epitoper med 5% normal geit serum og 0,1% triton-X-100 i 1x PBS (blokkerende løsning) for 2 timer ved romtemperatur.
   6. I mellomtiden forberede antistoffer arbeidsløsninger ved å fortynne primære eller sekundære antistoffer ved ønsket konsentrasjon i blokkering løsning.
      MERK: Antistoffkonsentrasjonen må justeres nøyaktig avhengig av celletypen og antistoffreferansen. Som en veiledning, for å identifisere celler fra luminal og myoepitheliale avstamninger i BPEC, kan primære anti-Cytokeratin 14 og anti-Claudin-IV antistoffer (se Materialtabell) brukes. Den anbefalte konsentrasjonen av arbeidsløsning er 1:100 for disse primære antistoffene og 1:500 for anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer (se Materialtabell).
   7. Tilsett 30 μL primære antistoffer som arbeider løsning og dekke den med en stripe av laboratorieinnpakning film for å unngå fordampning. Inkuber over natten ved 4 °C i et fuktig kammer.
   8. Vask tre ganger med 1x PBS i 1 time hver.
   9. Gjenta trinn 2.2.7 for sekundære antistoffer. Inkubasjon bør utføres i mørket.
   10. Vask med 1x PBS i 2 timer.
       MERK: Juster antistoffkonsentrasjon, inkubasjonstid og vasking av hardhet for å forbedre signal-/støyforholdet for bestemte prøver.
   11. Fjern gjenværende PBS og, når den er tørr, konstain med DAPI ved 0,25 μg/ml fortynnet i antifadmonteringsmedium. Dekk lysbilder med en dekkslips ved å la den avgjøre uten å legge press. Forsegle med neglelakk.
       MERK: Prøvene kan oppbevares ved 4 °C i flere uker. For langtidslagring, hold dem ved -20 °C.
   12. Analyser fluorescerende signalfordeling for hver acinus ved hjelp av et konfokalt mikroskop.
       MERK: Konfokal mikroskopkonfigurasjon må bestemmes nøyaktig avhengig av utstyret som brukes og antistoffene som brukes på prøven. Som en veiledning, med utstyr og reagenser som er beskrevet i materialstederen,bruker du et 40x mål og følgende laser- og detektorinnstillinger: for DAPI bruk eksitasjon med en 405 laser (3%-5%), deteksjon med en PMT-detektor (800V, Offset: -9) og et spektralt bånd fra 410 nm til 500 nm; for A488 (Claudin-IV) bruk eksitasjon med en 488 laser (7%-10%), deteksjon med en PMT-detektor (800V, Offset: -20) og et spektralt bånd fra 490 nm til 550 nm; og for Cy3 (Cytokeratin 14) bruk eksitasjon med en 555 laser (2%-10%), deteksjon med en PMT detektor (800V, Offset: -35) og et spektralt bånd fra 560 nm til 600 nm.

3. Anchorage-uavhengig analyse, MTT-farging og automatisk kolonikvantifisering

1. Anchorage-uavhengig analyse: agar og cellulær suspensjon plating
   MERK: Protokollen er tilpasset fra Borowicz et al., 2014^{11 for} å utføre eksperimenter i BPECer.
   1. Forbered en 1,2% agarløsning fortynnet i ultrarent vann i en steril flaske. Autoklav oppløsningen og vedlikehold den ved 42 °C under forsøket. Agarløsningen kan lagres ved 4 °C; når det er nødvendig, varm agaroppløsningen til den er flytende igjen.
      FORSIKTIG: Bruk varmebestandige hansker for å unngå brenning etter autoklav.
      MERK: Fra nå av må sterile forhold opprettholdes.
   2. Forbered en 0,6% agarløsning ved å blande 1:1 (v / v) komplett forhåndsoppvarmet medium med 1,2% agarløsning. Opprettholde ved 42 °C for å unngå for tidlig størkning.
      MERK: Medium kan tidligere dobles for å få en fullt supplert 0,6% agar + medium løsning når blandet.
   3. Dekk bunnen av en 35 mm brønn med 1,5 ml 0,6% agar i middels løsning og la den stivne ved romtemperatur. Pass på at bunnen av platen er helt dekket før agar størkning, ellers kan cellene holde seg til platen og vokse i monolayer.
      MERK: Tilhenger- og ikke-tilhengeroverflateplater kan brukes.
   4. I mellomtiden, trypsinize celler og, når sentrifugert og resuspended i medium, forberede en 50,000 celler / ml løsning og forsiktig disaggregate noen celle klump ved pipettering gjentatte ganger.
   5. Forbered en 0,3% agar + celle suspensjon i mediet ved en endelig konsentrasjon på 25.000 celler / ml.
      MERK: Optimal cellekonsentrasjon kan variere mellom celletyper. Prøv forskjellige konsentrasjoner til individualiserte kolonier dannes.
      1. Plasser et 40 μm silfilter på toppen av et 50 ml sterilt rør og filtrer 50 000 celler/ml-løsningen slik at det faller ned i bunnen av røret.
      2. Fjern filteret fra det 50 ml sterile røret, vipp celleholderrøret til en 45° vinkel og slipp det samme volumet på 0,6% agar + medium løsning som helles gjennom den indre veggen av røret. Dette vil tillate agarløsningen å kjøle seg ned akkurat nok til å ikke skade cellene og unngå for tidlig størkning.
   6. Homogenisere blandingen og deponere 1 ml 0,3% agar + celle suspensjon i mediet (som inneholder 25.000 celler) på toppen av det tidligere størknet bunn agar lag.
   7. Visualiser seedede celler ved hjelp av et omvendt mikroskop for å sikre at cellene er individualisert. Ellers bør eksperimentet gjentas.
   8. Vent til agarlaget er helt størknet, og tilsett deretter forsiktig 1 ml av det friske mediet på toppen uten å forstyrre de delikate agarlagene under.
   9. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO₂ i en inkubator i 3 uker.
      MERK: Tiden som kreves for kolonidannelse kan variere mellom ulike celletyper, men vanligvis er 3 uker tilstrekkelig.
   10. Bytt medium to ganger i uken. For å gjøre dette, forsiktig vippe platen mot deg, aspirere medium i nedre hjørne, og legge til 1 ml friskt medium.
       MERK: Unngå å berøre agarlagene, da de enkelt løsner fra platen.
2. MTT farging
   1. Klargjøre Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) lageroppløsning ved 6 mg/ml i ultrapure vann i en steril flaske og filterløsning ved hjelp av 0,2 μm filtre. Denne MTT-oppløsningen kan oppbevares i opptil 6 måneder ved -20 °C.
      FORSIKTIG: MTT kan forårsake irritasjon og mistenkes for å forårsake genetiske defekter. Bruk vernebriller, hansker og åndedrettsfilter.
      MERK: Unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
   2. Forbered en arbeidsløsning av MTT ved 1 mg/ml ved å fortynne lageroppløsningen med sterilt ultrarent vann.
   3. Når koloniformasjonsperioden er avsluttet, fjern mediet fra platen og tilsett 1 ml 1 mg / ml MTT til hver brønn.
   4. Inkuber i 24 timer i inkubatoren. Fjern MTT-oppløsningen ved å aspirere den forsiktig. Plater kan oppbevares ved 4 °C i flere uker.
      MERK: Unngå lyseksponering for å unngå ikke-spesifikk krystalldannelse.
3. Koloni kvantifisering
   1. Få bilder av hver plate ved hjelp av et omvendt mikroskop. Juster forstørrelsen for å oppnå det maksimale synsfeltet med færre bilder og fortsatt kunne oppdage små kolonier (vanligvis 4x eller 10x mål).
      MERK: Kontroller at bildene har en homogen bakgrunn. Verken fasekontrast eller differensial interferenskontrast er nødvendig, siden ikke-beisede kolonier ikke vil kvantifiseres.
   2. Last opp bilder til ImageJ / Fiji^{programvare 12} for å telle antall kolonier og området for hver MTT-positiv koloni.
      MERK: Et skript for automatisk kvantifisering er angitt som en tilleggsfil. Hvis du vil kjøre koden, limer du den inn i makroredigeringsprogrammet (Plugins | Ny | makro) og følg instruksjonene.
      1. Få en binær maske ved å terskele det opprinneligebildet ( | Juster | Terskel) for å få godt avgrensede kolonier (figur 1).
         MERK: 8- eller 16-biters bilder er vanligvis nødvendig for å utføre dette trinnet. Metoden "Minimum terskel" anbefales.
      2. Kjør Extended Particle Analyzer fra Biovoxxel plugin¹³ (Plugins | BioVoxxel | Utvidet partikkelanalysator) for å identifisere MTT-positive kolonier (figur 2). Innledende styrebetingelser: Størrelse (μm²) = 250–Infinity; Soliditet = 0,75–1,00.
   3. Anslå gjennomsnittlig diameter (D) fra hver koloniområdeverdi (A) i henhold til formelen:
      
   4. Filtrer resultatene ved å ekskludere lave proliferative kolonier (f.eks. lav diameter).
      1. Velg et minimum antall divisjoner per uke(m) som skal vurderes (f.eks. 1).
      2. Anslå radiusen til en koloni (R) med n celler i henhold til følgende formel:
         
         Hvor, r er den gjennomsnittlige radius av individuelle celler i suspensjon, n er antall celler som danner en koloni som led m divisjoner hver uke i løpet av w uker i kultur. I eksponentiell vekst: n = 2^(m*w). ρ er emballasjeeffektiviteten. Vær oppmerksom på at i tilfeldig bevegelse er emballasjeeffektivitet ~0,64 og den tetteste mulige pakkefraksjonen for identiske kuler er 0,74¹⁴.
      3. Kast alle kolonier som presenterer en diameter lavere enn 2R som deres celler ikke har oppnådd minimum antall divisjoner vurdert i trinn 3.3.4.1.

Representative Results

En eksperimentell modell for cellulær transformasjon med innføring av tre genetiske elementer i BPECs ble valgt for å generere representative resultater av onkogen transformasjon^6,7 (Figur 3). Ikke-transformerte BPECs (N) ble avledet fra sykdomsfritt brystvev som beskrevet av Ince og^{kolleger 6} og kultivert etter protokollen som er angitt her. Etter å ha overvunnet STASIS (stress eller avvikende signalisering indusert-senescence, et fenomen som vanligvis observeres i pattedyr epitelceller in vitro som er overvunnet rundt 4 uker etter cellekultur etablering), celler ble fortløpende transdusert med lentiviral partikler pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP og pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP for å oppnå delvis forvandlede celler (dobbelttransdusert; D). Uttrykk for den virale Ttag hemmer p53 og retinoblastomfunksjon, og ektopisk uttrykk for hTERT-genet kompenserer for spredningsavhengig telomerlengde attrisjon. Etter fluorescerende utvalg etter cellesortering ble celler transdusert med pLenti-CMV/TORasV12-Puro, som gir et vedvarende mitogent signal, og deretter vekst i nærvær av antibiotika for å velge transduserte celler (trippeltransdusert; T), som ble fullstendig forvandlet i henhold til Ince og kolleger⁶.

Som vist i figur 4observeres en økning i skråningen av regresjonslinjen (parameter b i ligningen 1.2.3) med det økende antallet genetiske modifikasjoner introdusert i BPEC (N: 0,47, D: 0,93, T: 1,13). For et bestemt tidsintervall oppnådde delvis (D) og fullstendig forvandlede (T) celler et høyere antall befolkningsdoblinger sammenlignet med de ikke-transformerte cellene (N), og dermed ble celledelingshastigheten økt med transformasjonsprosessen. Det samme resultatet kan også uttrykkes som tiden det tar å duplisere cellepopulasjonen (t_d), som kan oppnås etter å ha erstattet y med 1 (PD) i ligningen y = bx, og dermed t_d = 1/b. I motsetning til skråningen, t_d minker med transformasjon. Mens ikke-transformerte celler trengte mer enn 2 dager for å duplisere sin befolkning (N: t_d = 2,13 dager), gjorde delvis forvandlede celler det på halvparten av tiden (D: t_d = 1,08 dager). Tillegg av HRAS under regulering av en konstitutiv promotor førte til økt spredningsaktivitet og celler som trengtes mindre enn 1 dag for å duplisere (T: t_d = 0,89 dager) i samsvar med den mitogene aktiviteten til denne onkogene.

Mens monolayer cellekultur er et nyttig verktøy for å studere in vitro celle atferd, Det er en sterkt begrenset tilnærming fordi det ikke kan reprodusere de fleste av de fysiologiske forholdene. I stedet tillater den tredimensjonale cellekulturteknikken som er beskrevet her, at celler fra forskjellige avstamninger kan aggregere og bevege seg fritt i et 3D-miljø som danner acinarstrukturer takket være cellecelle- og cellematrisekryssopprettingen (figur 5A. Tidsforløp). I løpet av de neste 2 ukene distribuerer cellene i henhold til sin opprinnelige vevsfunksjon og sprer seg og øker acinistørrelsen (figur 5B). Riktig polarisering av hver acinus kan vurderes nøyaktig takket være kombinasjonen av immunofluorescent påvisning av luminal (Claudin-IV) og myoepithelial (Cytokeratin 14) avstamning markører med tredimensjonal signalplassering ved konfokal mikroskopi (figur 6A). Mens alle acini dannet av ikke-transformerte BPECs var riktig organisert (Claudin-IV positive celler omgitt av Cytokeratin 14 positive celler; Figur 6Ai), tap av polarisering (figur 6Aii) ble observert i acini dannet av delvis og fullstendig forvandlet BPECs (figur 6B).

En av de viktigste egenskapene til en forvandlet celle er dens evne til å vokse med uavhengighet av kontakt med basal lamina. Denne egenskapen ble evaluert ved å dyrke cellene innebygd på agar i 3 uker, unngå forankring til plateoverflate (figur 7A). I løpet av de følgende 3 ukene ga disse cellene med anchorage-uavhengig vekstkapasitet opphav til kolonier bestående av flere celler. Som vist i figur 8, 2 dager etter å ha blitt sådd i agar, noen celler allerede led 2-3 divisjoner. Etter 1 uke kan celler med dødslignende morfologi observeres som indikerer at cellene som ikke er i stand til å overleve under disse forholdene, til slutt døde, mest sannsynlig av anoikis. Likevel fortsetter noen celler å dele og danne små kolonier som vokser i løpet av andre og tredje uke med kultur.

Etter å ha lagt MTT til kulturen, bare disse cellene metabolsk aktiv, det vil si i live, er i stand til å holde tetrazolium ringen av MTT resulterer i lilla MTT formazan krystaller 24 timer senere ( Figur7B). Imidlertid er disse krystallene ikke bare dannet av kolonier med levende celler, men også av enkeltceller som fortsatt lever etter 3 uker i agar (figur 9). Siden formålet med denne teknikken er å bestemme cellenes evne til å spre seg på en substratuavhengig måte, må størrelsen på MTT-positive kolonier evalueres. Måling av kolonidiameter kan vurderes ved automatisk bildeanalyse (figur 7C) slik at små kolonier eller individualiserte celler kan filtreres. Som vist i figur 10,samsvarer grå prikker med de koloniene som har lidd mindre enn tre divisjoner i 3 uker og dermed måler mindre enn 65 μm diameter. Disse hendelsene ble inkludert i datavisualiseringen, men ekskludert fra den endelige kvantifiseringen.

Samlet sett indikerer disse resultatene at anchorage uavhengighet analyse tillater diskriminering mellom ulike grader av transformasjon (Figur 10). Antall kolonier dannet av ikke-transformerte BPECer var ubetydelig i forhold til de dannet av delvis og fullstendig forvandlet BPECs (koloninummer: N = 3; D = 278; T = 243). Også når kolonistørrelsen ble vurdert, ble forskjeller mellom delvis og fullstendig forvandlede tilstander tydelige (koloni medianstørrelse: N = 70 μm; D = 83 μm; T = 114 μm). Tar kolonistørrelsen i betraktning gir mer nøyaktig informasjon om det tumorogene potensialet til studerte cellelinjer, og dermed anbefales det sterkt å vurdere det.

Figur 1: Skjermbilde eksemplifiserende bildetersklering etter MTT-farging ved hjelp av Fiji-programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjermbilde av Extended Particle Analyzer fra Biovoxxel plugin forhold og utfall i Fiji programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Skjematisk representasjon av den eksperimentelle modellen for cellulær transformasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Spredningshastighet i ikke-transformerte, delvis og fullstendig transformerte BPECer. Best-fit linjer og 95% konfidensbånd (stiplede linjer) av lineær regresjon vises. ANCOVA for en lineær regresjonsmodell ble brukt for sammenligningen mellom forholdene; * p-verdi < 0,0001. Dette tallet er tilpasset fra Repullés et al. 2019⁷. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Acini dannelse og vekst etter seeding BPECs i kjelleren membran matrise. (A) Representative bilder av en time-lapse for de første gangene (fra 0 til 7 timer) etter seeding BPECs i kjelleren membran matrise. Skala bar = 100 μm. (B) Acini størrelse over 14 dager med kultur i kjelleren membran matrise for ikke-transformert, delvis, og fullt forvandlet BPEC. Feilfelt indikerer SEM. Ingen statistiske forskjeller mellom forholdene på dag 14 (enveis ANOVA og Tukey korreksjon; p-verdi > 0,05). Dette tallet er tilpasset fra Repullés et al. 2019⁷. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Acini polarisering i ikke-transformert, delvis (D), og fullt forvandlet (T) BPECs etter 3D-kultur i kjelleren membran matrise. (A) Representative bilder av en polarisert og en ikke-polarisert acinus etter Cytokeratin 14 (K14, rød) og Claudin-IV (Cl-IV, grønn) immunofluorescence. Polarisert acini (i) ble vurdert da Cytokeratin 14-positive celler omringet Claudin-IV positive celler; Ellers ble acini ansett som ikke-polarisert siden Cytokeratin 14 og Claudin-IV positive celler ble plassert både i midten og perifere steder (ii). Vektstangen = 25 μm. (B) Prosentandel av acini polarisert. Et minimum antall 10 acini ble analysert for hver tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Skjematisk representasjon av de ulike trinnene som brukes til den forankringsuavhengige vekstanalysen i BPECer. Cellene ble dyrket i 3 uker i myk agar (A) og deretter MTT farging ble påført (B). Skala bar = 5 mm. (C) MTT positive kolonier ble kvantifisert ved hjelp av Fiji programvare. Ulike trinn på bildebehandling er uthevet. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Utviklingen av cellevekst i 3 uker etter såing individualiserte celler i 0,3% agar. Bilder er hentet fra en delvis forvandlet BPEC kultur. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Representative bilder av MTT-farging og kvantifisering. Eksempler med en MTT-positiv koloni (rad 1), to MTT-negative kolonier (rad 2) og enkeltceller positive eller negative for MTT-farging (rad 3). A indikerer området av MTT positiv koloni eller celle. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10: Kolonikvantifisering etter forankringsuavhengig analyse i ikke-transformerte (N), delvis (D) og fullstendig forvandlede (T) BPECer. (A) Antall og diameter av koloniene oppnådd for de ulike forholdene. Hver prikk tilsvarer en koloni. Myke grå prikker representerer MTT positive kolonier, som ble utelukket i resultatene fordi diameteren var lavere enn 65 μm (minimumsstørrelse vurdert etter bruk av ligningsnummer 4 og tatt i betraktning minst en divisjon per uke). Den røde linjen indikerer median kolonidiameter for hver gruppe. To uavhengige replikaer ble utført for hver betingelse. Ulike bokstaver (a, b, c) indikerer statistisk signifikante forskjeller for antall kolonier (Fishers eksakte test; p-value < 0,05) og for deres median diameter (Kruskal-Wallis test med flere sammenligninger korreksjon; p-verdi < 0,05). Denne grafen er tilpasset fra Repullés et al. 2019⁷. (B) Representative bilder av hele brønner etter MTT-farging. Vekt bar = 5 mm; Innfelt skala bar = 2,5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. 

Discussion

De eksperimentelle protokollene som er beskrevet i dette papiret gir nyttige verktøy for å vurdere den onkogene transformasjonen av in vitro kultiverte celler. Hver teknikk evaluerer spesifikke aspekter ved transformasjonsprosessen, og dermed må spesiell oppmerksomhet rettes når man trekker konklusjoner fra en enkelt analyse. Vekstkurver oppbygging er en tilnærming som krever informasjon som allerede er tilgjengelig når du culturing celler til andre formål. Det gjør denne teknikken billigere og enklere å bruke i forhold til andre cellespredningsanalyser. Men for å oppnå gyldige resultater, må spesiell oppmerksomhet betales når du teller og såer celler hver gang de er subkulturert. En økt vekstrate er et tegn på cellulær^{transformasjon 1}, men det bør ikke brukes alene fordi andre eksogene faktorer, for eksempel tilsetning / fjerning av antibiotika og antifungale stoffer eller variasjonen i kulturforhold (f.eks temperatur, CO₂) også kan påvirke cellulær deling. Det er også viktig å vurdere at transduksjon eller behandling av celler med narkotika kan påvirke deres vekstrate i de kommende dagene eller ukene og dermed gi et forvrengt syn på langsiktig spredningskapasitet. I denne forbindelse må passende kontroller utføres.

3D-kulturen i kjellermembranmatrisen gjør det mulig å vurdering av cellefordeling i en hel funksjonell enhet, acinus. En endret organisasjon er et tegn på en intercellulær kommunikasjonsfunksjon som kan føre til tap av funksjon, et karakteristisk for tumorvev. Det faktum at noen acini presentere ikke-polarisert organisasjon indikerer at noen celler har initiert transformasjonsprosessen. Når det gjelder tekniske problemer, er det viktig å nøyaktig bestemme den optimale konsentrasjonen av seedede celler og konsentrasjonen av matrisen. Disse to parameterne kan påvirke antall og størrelse på den resulterende acini, og dette kan forstyrre deres organisatoriske kapasitet. Også manipulering av kjellermembranmatrise krever en viss grad av erfaring, da den må håndteres forsiktig. Til tross for å være en arbeidskrevende teknikk, ligner veksten av celler i tre dimensjoner den fysiologiske konteksten til disse cellene og tillater evalueringen ikke bare av fordelingen av brystlinjemarkører⁷,^15, men også av andre strukturer som gir informasjon om tumorfunksjoner, for eksempel forstyrrelsen av kjellermembranen¹⁶. 3D cellekulturer representerer fremtiden i cellekulturforskning. Faktisk kan 3D-vekster gi opphav til mer fysiologiske og interessante funn mens du tar hensyn til mikromiljøelementer og gir oss mange forskjellige studier, samt terapeutiske målidentifikasjon og evaluering, celle til celleinteraksjoner eller stamcelleundersøkelser.

Anchorage-uavhengig vekst av tilhengerceller er en utvetydig godbit av transformasjonsprosessen. Mens noen av de delvis og fullstendig forvandlede BPECs fortsatt var i stand til å gi opphav til en strukturert acinus, manifesterer de sin evne til å danne kolonier når de blir tvunget til å vokse individuelt i suspensjon. På teknisk nivå er forankringsanalysen også kompleks, siden små variasjoner under agarmanipulasjon (f.eks. høy temperatur) eller under disaggregation av celler etter trypsinisering kan notorisk påvirke cellekolonidannelse. Materialet som kreves er imidlertid billigere enn kjellermembranmatrise som brukes til 3D-cellekulturer som gjør vurderingen av den forankringsuavhengige veksten rimeligere. Også før MTT-tillegg kan enkeltkolonier plukkes og få lov til å vokse ut av agaren i plater med en tilhengeroverflate. Disse koloniene kan føre til klonale cellelinjer som kan fortsette å vokse i suspensjon eller følge igjen. DNA, RNA og/eller protein kan trekkes ut fra disse cellekulturene for videre analyser.

Det er en generell begrensning angående metodene som er beskrevet her: de er svært tidkrevende, og det tar flere uker å oppnå resultatene. Men siden hver test vurderer en bestemt tumorkarakteristikk, er konklusjoner gjort med tanke på hele settet med resultater veldig lyd. Derfor er alle de tre testene sammen kraftige indikatorer på cellulær transformasjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture