Summary
Nel contesto clinico, i pazienti con cancro al pancreas localizzato saranno sottoposti a pancreatectomia seguita da un trattamento adiuvante. Questo protocollo qui riportato mira a stabilire un metodo sicuro ed efficace per modellare questo scenario clinico nei topi nudi, attraverso l'impianto ortotopico del cancro al pancreas seguito da pancreatectomia distale e splenectomia.
Abstract
Mancano modelli animali soddisfacenti per studiare la terapia adiuvante e/o neoadiuvante nei pazienti presi in considerazione per la chirurgia del cancro al pancreas (PC). Per affrontare questa carenza, descriviamo un modello di topo che prevede l'impianto ortotopico del PC seguito da pancreatectomia distale e splenectomia. Il modello ha dimostrato di essere sicuro e adeguatamente flessibile per lo studio di vari approcci terapeutici in contesti adiuvanti e neoadiuvanti.
In questo modello, un tumore al pancreas viene generato per la prima volta impiantando una miscela di cellule tumorali pancreatiche umane (AsPC-1 taggate con luciferasi) e cellule stellate pancreatiche associate al cancro umano nel pancreas distale dei topi nudi atimici Balb / c. Dopo tre settimane, il cancro viene reinsediato da re-laparotomia, pancreatectomia distale e splenectomia. In questo modello, l'imaging a bioluminescenza può essere utilizzato per seguire i progressi dello sviluppo del cancro e gli effetti della resezione / trattamenti. Dopo la resezione, può essere somministrata una terapia adiuvante. In alternativa, il trattamento neoadiuvante può essere somministrato prima della resezione.
Vengono presentati i dati rappresentativi di 45 topi. Tutti i topi hanno subito una pancreatectomia/splenectomia distale di successo senza problemi di emostasi. Un margine pancreatico prossimale macroscopico superiore a 5 mm è stato raggiunto in 43 (96%) topi. Il tasso di successo tecnico della resezione pancreatica è stato del 100%, con una mortalità precoce e una morbilità dello 0%. Nessuno degli animali è morto durante la settimana successiva alla resezione.
In sintesi, descriviamo una tecnica robusta e riproducibile per un modello di resezione chirurgica del cancro al pancreas nei topi che imita lo scenario clinico. Il modello può essere utile per il test di trattamenti sia adiuvanti che neoadiuvanti.
Introduction
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (tumore al pancreas [PC]) è associato a una prognosi infausta1. La resezione chirurgica rimane l'unico trattamento potenzialmente curativo per PC e deve essere presa in considerazione per i pazienti che presentano una malattia in fase iniziale. Sfortunatamente, anche con la resezione R0 (cioè margini di resezione liberi da tumore), il tasso di recidiva (locale o da malattia metastatica non rilevata) èalto 2,3. Pertanto, la terapia adiuvante sistemica è indicata in quasi tutti i pazienti sottoposti a resezione4. Inoltre, mentre la terapia neoadiuvante è ora raccomandata solo per i tumori resectabili al limite, le sue indicazioni si stanno espandendo in modo tale che il suo uso di routine sia al centro di moltericerche cliniche 5,6,7,8. Al fine di sviluppare nuovi approcci terapeutici per PC che coinvolgono la resezione, questi approcci devono essere prima valutati in modelli preclitici che riascindono accuratamente le impostazioni cliniche.
I modelli di mouse ortotopici di PC sono stati frequentemente utilizzati in passato per testare i trattamentifarmacologici 9,10. Molti di questi sono stati prodotti per iniezione di cellule tumorali da sole nel pancreas del topo, con conseguente tumori che mancavano dell'importante stroma che è caratteristico del PC. Più recentemente, i modelli ortotopici a co-iniezione, come quello che abbiamo sviluppato per la prima volta iniettando una miscela di PC umano e cellule stellate pancreatiche umane (PSC, i produttori primari dello stroma collagenoso nel PC), sono venuti in usoregolare 11,12. I tumori prodotti da tale co-iniezione di cancro e cellule stromali mostrano (i) sia gli elementi tumorali che la componente stromale caratteristica (desmoplastica) del PC, e (ii) maggiore proliferazione e metastasi delle cellule tumorali11. Pertanto, questo modello assomiglia molto al PC umano. Mentre un certo numero di modelli resezionali di PC ortotopico sono statidescritti 13,14,15,16, nessuno ha riflesso le realtà cliniche della resezione pancreatica nell'uomo accurato come questo modello, e quindi sono stati non ottimale per testare trattamenti adiuvanti o neoadiuvanti.
Gli obiettivi del modello di topo presentato erano di dimostrare come: i) impiantare con successo il cancro al pancreas ortotopico riducendo al minimo la diffusione peritoneale involontaria e (ii) successivamente resect completamente il cancro. Il documento evidenzia suggerimenti e potenziali insidie di questa tecnica.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali e l'etica dell'Università del Nuovo Galles del Sud (17/109A). Per questo protocollo sono stati utilizzati topi nudi atimici Balb/c femminili, di età compresa tra 8 e 10 settimane del peso di 16-19 g. I topi erano alloggiati in gabbie micro-isolanti e alimentati commercialmente disponibili con cibo e acqua a pellet ad libitum.
1. Impianto di cancro al pancreas ortotopico
- Preparare le cellule per l'impianto. In primo luogo, calcolare il numero di cellule necessarie per la procedura (sono necessarie 1 x10 6 cellule AsPC-1 taggate alla luciferasi e 1 x 106 cellule stellate pancreatiche umane associate al cancro [CAhPSC] per ogni animale).
- Mantenere queste cellule in un incubatore di CO2 umidificato a temperatura controllata ed eseguire test di micoplasma di routine. I mezzi di coltura utilizzati per aspc-1 e CAhPSC sono RPMI 1640 (con 300 mg/L L-glutammina, 20% v/v siero bovino fetale, 1% v/v penicillina/streptomicina) e IMDM (con 4 mM L-glutammina, 10% v/v siero bovino fetale, 1% v/v penicillina/streptomicina).
- Utilizzare tecniche standard di coltura cellulare per tripinare le celle in una sospensione cellulare. Neutralizzare la tripina utilizzando il rispettivo supporto di coltura completo con un volume doppio rispetto alla soluzione di tripina utilizzata.
- Lavare queste cellule due volte con saline tamponate di fosfato (PBS) e resospersi in una miscela contenente 1 x 106 cellule AsPC-1 e 1 x 106 CAhPSC in una sospensione cellulare di 50 μL.
- Mantenere questa sospensione sul ghiaccio fino all'uso.
- Preparare un armadietto di biosicurezza di classe II per la procedura. Utilizzare un tappetino riscaldante sovrapposto da un drappo di plastica sterile. Per l'ingrandimento durante la procedura, utilizzare una coppia da 2,5x a 3,5 volte lopi chirurgici di ingrandimento.
- Preparare tamponi a corda di borsa tagliando un foro, di 1 cm di diametro, in un tampone di garza. Fissare questo buco con una sutura a corda di borsa. Qualsiasi sutura intrecciata fine può essere utilizzata per questo (ad esempio, sutura di acido poliglicolico 5/0). Si consiglia il materiale di sutura intrecciata in quanto consente al nodo sciolto di rimanere in posizione dopo il serraggio. Ciò è illustrato nella figura 1a.
- Anestetizzare il topo con 80 mg/kg di chetamina e 10 mg/kg di xiazina per iniezione intraperitoneale.
- Somministrare 5 mg/kg di profilassi antibiotica all'enrofloxacina, 2,5 mg/kg di analgesia di flunixina e 1 mL dello 0,9% di saline sottocutaneamente.
- Una volta anestetizzato, posizionare il topo sul campo sterile in posizione supina e applicare povidone-iodio seguito dal 70% di etanolo per la preparazione della pelle.
- Fare un'incisione longitudinale nella pelle del quadrante cranica sinistro dell'addome, quindi entrare nell'addome intasando lo strato muscolare tra le pinza.
- Caricare una siringa per insulina da 29 G con 50 μL di sospensione cellulare, pari a 1 x 106 CAhPSC e 1 x 106 cellule AsPC-1 contrassegnate con luciferasi per iniettato. Montarlo sul dispositivo di iniezione. Il design e la funzione di questo dispositivo di iniezione sono spiegati in dettaglio nella figura 1b e nella sua legenda.
- Posizionare il tampone a corda della borsa sopra l'incisione della laparotomia e quindi esternalizzare la milza e la coda pancreatica attraverso l'apertura di questo tampone. Stringere la corda della borsa per circondare delicatamente il corpo del pancreas, esponendo la coda pancreatica per iniezione. È importante essere abbastanza stretti che la garza contatti il pancreas circonferenzialmente e allo stesso tempo non lo costrizioni.
- Usando un paio di forcep, afferrare la coda del pancreas e posizionare delicatamente la tensione laterale su di esso. Forare la superficie peritoneale ventrale con l'ago ad un angolo poco profondo e quindi iniettare la sospensione cellulare nel pancreas in modo lento e controllato (oltre 10−15 s) con il dispositivo di iniezione.
- Durante il processo di iniezione, osservare attentamente la perdita, sia intorno al sito di iniezione (dal reflusso) che dall'altro lato del lobulo pancreatico (in caso di penetrazione through-and-through). Se si verifica una perdita visibile, interrompere l'iniezione e notare il volume di perdite controllando il volume di iniettato rimanente nella siringa. Se la perdita è di piccolo volume (<10 μL), quindi assorbire eventuali perdite con garza e riposizionare l'ago in un diverso lobulo pancreatico per completare l'iniezione.
- Sostituire la milza e il pancreas e chiudere la parete addominale con una sutura di acido poliglicolico 5/0 in modo continuo. Chiudere la pelle con le clip.
- Monitorare il mouse in una gabbia riscaldata fino a quando non viene recuperato dall'anestetico. Una volta sveglio e vigile, riporta il mouse nella sua gabbia.
2. Chirurgia della resezione del cancro: pancreatectomia distale e splenectomia
- La tempistica della resezione in relazione all'impianto può variare a seconda del protocollo sperimentale. In generale, consentire ai tumori di crescere almeno per 3 settimane prima della resezione, ma ottimizzarlo empiricamente per la particolare linea cellulare tumorale impiantata.
- Il giorno prima dell'intervento di resezione, eseguire l'imaging della bioluminescenza sugli animali per confermare la presenza di un tumore primario localizzato. Si noti che questo studio di imaging viene semplicemente utilizzato per escludere dalla resezione topi con ovvia malattia extra-pancreatica. Né le dimensioni né il flusso radiante dovrebbero essere utilizzati come soglie per determinare l'ammissibilità alla resezione.
- Pesare i topi e iniettare con D-luciferina per via intraperitoneale (150 mg/kg).
- Determinare la tempistica della fase di imaging in relazione all'iniezione di luciferina per ogni esperimento mediante le prestazioni di una curva cinetica luciferina. Il periodo di tempo in cui il flusso radiante è superiore al 90% del suo massimo rappresenta il tempo ottimale per l'imaging a bioluminescenza (in questo esperimento, da 18 a 26 minuti dopo l'iniezione)
- Indurre l'anestesia e mantenere utilizzando isoflurane (rispettivamente 4% e 3% con ossigeno) ed eseguire immagini utilizzando un dispositivo di imaging bioluminescente (ad esempio, IVIS Lumina II). Utilizzare impostazioni di esposizione e binning automatiche (questo può tuttavia essere ottimizzato per il flusso radiante previsto).
- Preparare l'armadio di biosicurezza di classe II per la procedura. Utilizzare un tappetino riscaldante sovrapposto da un drappo di plastica sterile. Per l'ingrandimento durante la dissezione, utilizzare una coppia da 2,5x a 3,5 volte lochie chirurgiche di ingrandimento.
- Anestetizzare il topo con 80 mg/kg di chetamina e 10 mg/kg di xiazina per iniezione intraperitoneale.
- Somministrare 5 mg/kg di profilassi antibiotica all'enrofloxacina, 2,5 mg/kg di analgesia di flunixina e 1 mL dello 0,9% di saline sottocutaneamente.
- Posizionare il topo sul campo sterile in posizione supina e applicare povidone-iodio seguito dal 70% di etanolo per la preparazione della pelle.
- Effettuare un'incisione longitudinale nella pelle del quadrante cranica sinistro dell'addome, preferibilmente attraverso il precedente sito di incisione.
- Sezionare senza mezzi termini la pelle dalla parete addominale muscolare sottostante, quindi posizionare un riavvolgitore autocontenente Alm per tenere aperta la ferita della pelle.
- Incidere lo strato muscolare tra le forcep solo su un lato della linea di sutura dell'operazione precedente, quindi estendere l'incisione per asportare l'intera linea di sutura precedente.
- Esternalizza la milza e il pancreas distale e ritrailo cranialmente. All'aspetto caudale del pancreas, il colon può essere trovato attaccato da aderenze filmate. Se questo viene trovato, sezionare senza mezzi termini i due punti.
- Passare con cura un paio di forcep dorsali al corpo del pancreas e dei vasi splenici e aprire questo spazio. Questo libera un segmento di pancreas per la successiva legatura.
- Legare il corpo del pancreas prossimale al tumore con una clip di legatura di titanio, quindi trascriire il pancreas distale a questo con cautery. Un modo alternativo per controllare il ceppo pancreatico è quello di legarlo in continuità con la sutura di acido poliglicolico 5/0 prima della trasezione.
- Ritrarre il pancreas caudally e cauterizzare i vasi gastrosplenici tra il palo cranico della milza e lo stomaco.
- Rimuovere il campione e confermare l'emostasi.
- Chiudere la parete addominale con sutura di acido poliglicolico 5/0 in modo continuo. Chiudere la pelle con le clip.
3. Gestione postoperatoria
- Nell'immediato periodo post anestetico (per entrambe le procedure di cui sopra), monitorare il topo in una gabbia riscaldata fino a quando non viene recuperato dall'anestetico. Una volta sveglio e vigile, riporta il mouse nella sua gabbia. Nel periodo postoperatorio, monitorare gli animali alla ricerca di dolore e segni di angoscia. Somministrare 0,05 mg/kg di buprenorfina per iniezione sottocutanea e osservare attentamente gli animali per 12 ore.
- Successivamente, monitorare quotidianamente i topi per peso, assunzione di cibo e attività. Esaminare i siti di incisione e palpato per la dimensione del tumore. Rimuovere le clip della pelle il settimo giorno postoperatorio.
- Eutanasia del mouse se vengono raggiunti endpoint umani. Questi endpoint umani includono: perdita di peso corporeo >20%, caratteristiche di disagio non curabile (tra cui postura curva, mancanza di movimento o toelettatura) e dimensioni tumorali superiori a 1 cm3 come stimato dalla palpazione esterna.
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Representative Results
Cinquantanove topi consecutivi sono stati sottoposti a un intervento chirurgico di impianto. Perdite lorde si sono verificate in otto (14%) topi. Il grado di perdita al momento dell'iniezione è stimato come descritto sopra nella sezione del protocollo. Dopo tre settimane per consentire la crescita di questi tumori impiantati, è stata eseguita l'imaging a bioluminescenza pre-resezione per escludere i topi con malattia metastatica grave prima della resezione. Quarantacinque (76%) topi sono stati sottoposti a resezione chirurgica.
Tutti i 45 (100%) i topi hanno subito una pancreatectomia/splenectomia distale di successo senza problemi di emostasi. Un margine pancreatico prossimale macroscopico superiore a 5 mm è stato raggiunto in 43 (96%) topi.
Al momento della resezione, la metastasi locale è stata trovata in 9/45 (20%) topi - per lo più nella linea di sutura (discontinua con il tumore primario) con tre dei nove che mostrano noduli isolati aggiuntivi sulla curva maggiore dello stomaco e uno che mostra un nodulo sottocapsulare sul fegato. Il tumore pancreatico primario è stato aderente alla linea di sutura in cinque (11%) topi e al fegato in uno (2%) topo. Queste strutture aderenti sono state asportate in blocco.
Il tempo medio (SEM) di intervento chirurgico (induzione alla chiusura) è stato di 22 (0,9) minuti. Nessuno degli animali è morto entro 1 settimana dalla resezione.
Una settimana dopo la resezione, i topi sono stati sottoposti a imaging a bioluminescenza per rilevare la malattia residua. Il rapporto della massima luminosità sulla superficie ventrale del mouse è stato confrontato con quello dello sfondo. Trentadue (71%) i topi avevano un rapporto di luminosità massimo (topo:sfondo) di <10, indicando una malattia minima o nessuna residua.
Figura 1: Dispositivi su misura per facilitare l'impianto tumorale. ( a ) Tampone di garzaacorda di borsa: i) foro centrale, di circa 1 cm di diametro, attraverso il quale la coda pancreatica sarà posizionata al momento dell'iniezione; — sutura a corda di borsa attorno al foro; — garza a doppio strato; — nodo a lancio singolo; — un arto del materiale di sutura è fissato alla garza con nastro adesivo sterilizzante; — una maniglia, realizzata con nastro adesivo, è modellata sull'altra estremità del materiale di sutura. b)Dispositivo di iniezione: (I) Siringa attuatore. Le fessure tagliate attraverso il corpo di questa siringa consentono di montare la siringa per iniezione (con l'iniettare la sospensione cellulare; non mostrata) su questo corpo della siringa; (II) Siringa controller. Questo è pieno d'acqua. La depressione dello stantuffo sulla siringa del controller più piccola da parte dell'assistente chirurgico provoca lo spostamento dello stantuffo della siringa attuatore più grande. Lo spostamento dello stantuffo attuatore è più piccolo, ma con un vantaggio meccanico che consente all'iniezione di superare la resistenza associata al meccanismo della siringa a iniezione e la resistenza del tessuto all'espansione da parte dell'iniettato. Ciò consente un'iniezione precisa e fluida di 50 μL in 10-15 secondi; (III) Tubi di collegamento in politetrafluoroetilene (PTFE) con diametro interno di 0,5 mm.
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Discussion
Un modello di topo ortotopico resezionale del cancro al pancreas è importante perché consente il test dei trattamenti adiuvanti e neoadiuvanti. Ciò è particolarmente importante nel cancro al pancreas, dove la chirurgia rimane il trattamento più efficace ma è associata ad un alto rischio di recidiva. Questo documento descrive un metodo che produrrà in modo affidabile un cancro al pancreas potenzialmente curabile con resezione, replicando lo scenario clinico in cui è richiesta una terapia neoadiuvante / adiuvante.
Importanza rispetto ai metodi esistenti
Nonostante l'importanza delle terapie adiuvanti e neoadiuvanti nel cancro al pancreas, ci sono pochi modelli di topo resezionale ortotopico ben descritti in letteratura. Questi modelli resezionali descritti variavano nella loro fedeltà di replicazione della situazione clinica nell'uomo. Questi modelli precedenti possono essere ampiamente classificati in: (i) solo escissione tumorale, con guida alla fluorescenza; — resezione pancreatica subtotale senza splenectomia; — pancreatectomia/splenectomia distale.
L'escissione tumorale con guida alla fluorescenza è stata descritta nel maggior numero di rapporti15,17,18,19,20,21. Molti di questi documenti provenivano dallo stesso gruppo di ricerca. Sfortunatamente, nell'uomo, l'escissione locale del solo tumore (enucleazione) non viene eseguita per l'adenocarcinoma pancreatico (PC) a causa dell'alta probabilità di recidiva locale, nonché dell'incapacità di valutare lo stato dei linfonodi22,23. Pertanto, l'uso di un gruppo di comparatori non clinicamente rilevante (enucleazione guidata da non fluorescenza) offusca la segnalazione dei risultati oncologici in articoli che descrivono questa tecnica. Non sorprende che i gruppi di enucleazione non fluorescenza avessero invariabilmente tassi eccessivi di recidivalocale 15,20,21. Al contrario, Torgenson et al. Nel complesso, questi studi sembrano dimostrare l'utilità della guida alla fluorescenza per la visualizzazione della malattia residua durante l'intervento chirurgico. Tuttavia, questo non è ancora lo standard di cura nell'uomo, che è una limitazione in termini di utilizzo in un modello di topo che mira a replicare lo scenario clinico. Naturalmente, questo può cambiare se la chirurgia guidata dalla fluorescenza dovesse essere ampiamente adottata nella pratica clinica.
Un altro modello di resezione era basato sulla pancreatectomia subtotale senza splenectomia per un tumore impiantato nel corpo del pancreas13,24. La rilevanza clinica di questo è anche messa in discussione in quanto l'operazione descritta non era né una pancreaticoduodenectomia né una pancreatectomia distale eseguita nell'uomo. Non sorprende che questi topi soffrivano anche di alti tassi di recidiva tumorale, sia lontana che locale. Di particolare nota è che la recidiva splenica era comune, suggerendo sia una resezione inadeguata o una possibile semina tumorale peritoneale all'impianto24.
Ni et al. Deludentemente, nonostante l'uso di un'operazione clinicamente rilevante (con guida alla fluorescenza), la sopravvivenza è stata molto breve (sopravvivenza media di 18 giorni), anche nel gruppo di pancreatectomia distale. Questo grado di malattia progressiva sembra essere ancora peggiore dei modelli di trattamento palliativo25,26,27, suggerendo la possibile presenza di malattia residua lorda dopo la resezione. Più recentemente, Giri etal. Questo studio è degno di nota in quanto rappresenta un modello di topo immunocompetente del cancro. Tuttavia, questo studio ha riportato una recidiva tumorale locale e di altro tipo quasi universale, probabilmente indicando metastasi iatrogenica occulta all'impianto.
L'uso di modelli di topi in cui vi è una malattia residua lorda dopo la resezione per testare i trattamenti adiuvanti può essere inappropriato. Il problema è che il trattamento per la malattia residua lorda non può essere realmente classificato come trattamento adiuvante, ma piuttosto dovrebbe essere considerato un trattamento con intento palliativo. In tal caso, tali modelli di topi non offrono alcun vantaggio rispetto ai modelli non resezionali con malattia a basso volume.
Suggerimenti e insidie dei passaggi critici
Procedura di impianto tumorale
Al fine di replicare lo scenario clinico, ci sono sfide distinte in questo modello che riguardano le procedure di impianto e resezione. Per la procedura di impianto, le principali sfide che devono essere superate sono il successo dell'impianto e la prevenzione delle perdite. Questi due problemi sono correlati in quanto il fallimento dell'iniezione comporterebbe una grave perdita della sospensione delle cellule tumorali nella cavità addominale. Questo produrrebbe un modello di topo con metastasi peritoneale, che progredirà indipendentemente dalla resezione pancreatica. Ciò riflette il noto scenario clinico negli esseri umani in cui la resezione pancreatica nel PC metastatico non influisce sull'esito del paziente. Questa è la base della laparoscopia di staging nell'uomo29.
Il successo dell'impianto del tumore può essere visto intraoperatoriamente come la generazione di successo di una "bolla" di sospensione cellulare senza evidenti perdite. Di grande importanza per ottenere un buon risultato è il posizionamento accurato dell'ago all'interno del parenchima pancreatico. Questo potrebbe essere ottenuto solo "allungando" il pancreas in modo che la superficie peritoneale sia tesa. La puntura dovrebbe verificarsi con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto (ventralmente). Una volta che l'ago fora la superficie peritoneale, dovrebbe essere avanzato mentre la punta dell'ago è leggermente sollevata in modo che la superficie smussata scivoli appena sotto il peritoneo. Ciò impedirà una puntura involontaria attraverso e attraverso il pancreas, un'insidia comune a causa delle piccole dimensioni dei lobuli pancreatici del topo. Una volta che l'intera smussatura è all'interno della sostanza del pancreas, la sospensione cellulare viene iniettata. L'ingrandimento della vista con loupes chirurgiche è altamente desiderabile per visualizzare con precisione la profondità della penetrazione dell'ago.
Una serie di tecniche può essere utilizzata per ridurre ulteriormente il rischio di perdite involontarie.
Selezione di un grande lobulo per iniezione. Piccoli lobuli richiedono pressioni più elevate per gonfiarsi (seguendo la legge di Laplace), aumentando così il rischio di perdite intorno all'ago nel sito di puntura.
Ottimizzazione della velocità di iniezione. L'uso di un dispositivo di iniezione (Figura 1b) che consente di iniettare la sospensione cellulare per 10-15 secondi serve a tre scopi. In primo luogo, diminuisce il tasso di cambiamento di pressione nel pancreas, dando ai tessuti il tempo di deformarsi e riduce il rischio di reflusso della sospensione. In secondo luogo, consente di monitorare il processo di iniezione e, se necessario, di fermarlo e riposizionare l'ago. Qualsiasi perdita può essere mopped da una garza imbevuta di povidone-iodio. In terzo luogo, libera l'operatore dalla necessità di deprimere lo stantuffo, consentendo all'operatore di concentrarsi sul mantenimento della punta dell'ago all'interno del pancreas mentre l'assistente inietta la sospensione cellulare.
Uso di una garza a doppia corda a doppio strato. Questa garza forma un collare intorno alla coda pancreatica che assorbirà qualsiasi perdita della sospensione cellulare e quindi ridurrà al minimo la contaminazione nella cavità addominale.
Alcuni studi in letteratura hanno utilizzato una miscela di matrice extracellulare (Matrigel) che si solidifica con il tempodopo l'iniezione 13,15,24. Ciò può ridurre il rischio di perdite dopo l'iniezione. Tuttavia, un potenziale svantaggio di questa strategia è che Matrigel o altre soluzioni di matrice extracellulare simili possono esercitare effetti non fisiologici sulle PSC30. Ad esempio, è stato dimostrato che Matrigel rende quiescenti i PSC, negando potenzialmente gli effetti dei PSC nelmodello 31,32. Un'alternativa all'iniezione di cellule tumorali è l'impianto ortotopico del tessuto tumorale (direttamente dai pazienti o dai modelli di topo sottocutaneo). Tuttavia, questi approcci hanno i loro svantaggi. In primo luogo, l'eterogeneità può derivare da errori di campionamento o da variazioni nel volume dei tessuti impiantati. Tale eterogeneità può ridurre la potenza dei successivi confronti di trattamento. In secondo luogo, la passaging del tessuto tumorale con un modello di topo sottocutaneo può portare alla selezione di sotto-cloni che hanno comportamenti biologici diversi al tumore originale del paziente.
Procedura di resezione tumorale
In questo modello, abbiamo utilizzato una procedura di pancreatectomia/splenectomia distale simile a quella eseguita nell'uomo. Le sfide relative alla chirurgia resezionale dipendono da fattori patologici e anatomici.
Il fattore patologico chiave è la diffusione del tumore. La diffusione locale a basso volume può essere resettata al momento della resezione pancreatica, anche se può indicare la possibilità di peritoneali e altre metastasi più distanti. Asportiamo regolarmente la linea di sutura dalla prima operazione in quanto si tratta di una possibile area di ricorrenza locale. Se il tumore è attaccato alle strutture circostanti, come la parete addominale o il lobo sinistro del fegato, questi possono essere resected in blocco. Anatomicamente, il passo chiave è sezionare il piano dorsale al corpo del pancreas. La vena splenica può spesso essere visualizzato dietro il pancreas una volta esternati il pancreas. Questo è un punto di riferimento chiave, poiché il piano embriologico senza sangue è immediatamente dorsale a questo.
Ci sono altre due potenziali insidie anatomiche nel modello qui descritto. Il colon può essere aderente all'aspetto caudale del corpo pancreatico. La mancata mobilitazione di questa struttura potrebbe portare a lesioni coloniche involontarie al momento della divisione pancreatica o della legatura. I vasi gastrosplenici sono piccoli e possono facilmente sanguinare se avulsi o cauterizzati in modo inadeguato. Inoltre, una volta avvolto, il punto di sanguinamento si ritrae spesso in profondità nell'addome dietro la curva maggiore dello stomaco, rendendo più impegnativo il successivo controllo del sanguinamento. Pertanto, è necessaria un'attenta retrazione della milza e del cautery dei vasi gastrosplenici. Un approccio per un'emostasi di successo è quello di cauterizzare questi vasi sull'aspetto ilar della milza, il che riduce al minimo il rischio di lesioni termiche involontarie ai visceri cavi circostanti.
Abbiamo scoperto che l'utilizzo di una clip di legatura in titanio, ampiamente utilizzata nella chirurgia umana per la legatura dei vasi, è un modo rapido ed efficace per controllare il ceppo pancreatico, con conseguente riduzione del tempo operativo totale rispetto all'uso delle legature. Questo è stato usato anche da Giri etal.
Limitazioni della tecnica
Ci sono limitazioni a questo modello resezionale del pancreas. Una limitazione riguarda il tempo concesso per produrre recidiva/metastasi. Da un lato, è necessario massimizzare lo sviluppo della malattia metastatica, ma dall'altro è necessario resect il tumore prima che sia localmente avanzato. Potrebbe quindi essere necessario regolare il periodo tra impianto e resezione per lo scenario clinico specifico che si desidera replicare. Un'altra limitazione riguarda lo sversamento involontario e la successiva metastasi peritoneale delle cellule tumorali di cui si parla sopra.
Una grande sfida dei modelli di trattamento adiuvante è sezionare l'effetto di trattamento adiuvante dall'effetto del trattamento chirurgico. Chiaramente, è necessario uno studio ben progettato che sia randomizzato, con un gruppo di controllo sottoposto a chirurgia di resezione. Per migliorare ulteriormente la valutazione degli effetti relativi del trattamento, suggeriamo di valutare il carico tumorale in vivo (ad esempio, utilizzando cellule tumorali taggate alla luciferasi ed eseguendo l'imaging in vivo della bioluminescenza). Nonostante la natura semi-quantitativa di questa valutazione nei modelli ortotopici (poiché il segnale di bioluminescenza è attenuato dal passaggio attraverso i tessuti sovrascelti), questo approccio consente la valutazione longitudinale del carico tumorale, compresa la valutazione della malattia residua post-chirurgica.
Modifiche e applicazioni future
La linea cellulare impiantata e/o i numeri di cellulare con o senza cellule stellate pancreatiche potrebbero essere modificati per riflettere lo scenario clinico target12. La durata tra impianto e resezione potrebbe anche essere modificata per cambiare il rischio di formazione di metastasi. Altre varianti potrebbero includere l'impianto di xenoinnesti o organoidi derivati da pazienti o topi33.
La terapia neoadiuvante può anche essere testata all'interno delle caratteristiche di base del modello descritto qui. Richiederebbe semplicemente l'inizio del trattamento farmacologico prima della resezione chirurgica34. Allo stesso modo, sia la terapia neoadiuvante che la terapia adiuvante potrebbero essere studiate negli stessi topi.
Infine, mentre abbiamo descritto l'uso di topi nudi Balb / c atici che rappresenta un modello immunodifeso, un modello immunocompetente alternativo può coinvolgere cellule tumorali KPC impiantate nei topi C57B628. Questa può essere un'alternativa utile per il test di terapie immunitarie adiuvanti / neoadiuvanti.
In sintesi, descriviamo una tecnica robusta e riproducibile per un modello di resezione chirurgica del cancro al pancreas nei topi che imita lo scenario clinico e non richiede attrezzature specializzate. Questo modello può essere utile per il test di trattamenti sia adiuvanti che neoadiuvanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare in merito a questo progetto.
Acknowledgments
Gli autori hanno ricevuto il sostegno della Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
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