Summary
I denne artikkelen beskriver vi isolering av rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) ved hjelp av en enzymatisk vevsfordøyelsesprotokoll. Deretter beskriver vi ADSC-spredning som inkluderer celleløsning, telling og plating. Til slutt beskrives ADSC-differensiering ved bruk av spesifikke adipogene induserende midler. I tillegg beskriver vi fargeteknikker for å bekrefte differensiering.
Abstract
Fettvev gir en rik og tilgjengelig kilde til multipotente stamceller, som er i stand til å fornye seg selv. Disse fettavledede stamcellene (ADSC) gir et konsistent ex vivo cellulært system som er funksjonelt som for in vivo adipocytter. Bruk av ADSC-er i biomedisinsk forskning muliggjør cellulær undersøkelse av fettvevets metabolske regulering og funksjon. ADSC-differensiering er nødvendig for adekvat adipocyttekspansjon, og suboptimal differensiering er en viktig mekanisme for fettdysfunksjon. Å forstå endringer i ADSC-differensiering er avgjørende for å forstå utviklingen av metabolsk dysfunksjon og sykdom. Protokollene beskrevet i dette manuskriptet, når de følges, vil gi modne adipocytter som kan brukes til flere in vitro funksjonstester for å vurdere ADSC metabolsk funksjon, inkludert men ikke begrenset til analyser som måler glukoseopptak, lipolyse, lipogenese og sekresjon. Rhesus macaques (Macaca mulatta) er fysiologisk, anatomisk og evolusjonært lik mennesker, og som sådan har deres vev og celler blitt brukt mye i biomedisinsk forskning og for utvikling av behandlinger. Her beskriver vi ADSC-isolering ved bruk av ferskt subkutant og omentalt fettvev fra 4–9 år gamle rhesusmakaker. Fettvevsprøver fordøyes enzymatisk i kollagenase etterfulgt av filtrering og sentrifugering for å isolere ADSC fra stromal vaskulær fraksjon. Isolerte ADSC-er prolifereres i stromale medier etterfulgt av ca. 14–21 dagers differensiering ved bruk av en cocktail på 0,5 μg/ml deksametason, 0,5 mM isobutylmetylxanthin og 50 μM indometacin i stromale medier. Eldre adipocytter observeres ved ca. 14 dagers differensiering. I dette manuskriptet beskriver vi protokoller for ADSC-isolering, proliferasjon og differensiering in vitro. Selv om vi har fokusert på ADSC-er fra rhesus macaque fettvev, kan disse protokollene brukes til fettvev hentet fra andre dyr med minimale justeringer.
Introduction
Fettvev består av en heterogen blanding av celler, hovedsakelig modne adipocytter og en stromal vaskulær fraksjon inkludert fibroblaster, immunceller og fettavledede stamceller (ADSC)1,2,3. Primære ADSC-er kan isoleres direkte fra hvitt fettvev og stimuleres til å differensiere til adipocytter, brusk eller beinceller4. ADSC-er utviser klassiske stamcelleegenskaper som vedlikehold av multipotens in vitro og selvfornyelse; og er tilhenger av plast i kultur 5,6. ADSC er av viktig interesse for bruk i regenerativ medisin på grunn av deres multipotens og evne til lett å høstes i store mengder ved hjelp av ikke-invasive teknikker7. Adipogen differensiering av ADSC produserer celler som funksjonelt etterligner modne adipocytter, inkludert lipidakkumulering, insulinstimulert glukoseopptak, lipolyse og adipokinsekresjon8. Deres likhet med modne adipocytter har ført til utbredt bruk av ADSC for fysiologisk undersøkelse av cellulære egenskaper og metabolsk funksjon av adipocytter. Det er økende bevis som støtter ideen om at utviklingen av metabolsk dysfunksjon og lidelser stammer fra celle- eller vevsnivå 9,10,11,12. Optimal ADSC-differensiering er nødvendig for tilstrekkelig fettvevsutvidelse, riktig adipocyttfunksjon og effektiv metabolsk regulering13.
Protokoller beskrevet i dette manuskriptet er enkle teknikker som benytter standard laboratorieutstyr og grunnleggende reagenser. Manuskriptet beskriver først protokollen for isolering av primære ADSC-er fra ferskt fettvev ved bruk av mekanisk og enzymatisk fordøyelse. Deretter beskrives protokollen for spredning og passasjering av ADSC-er i stromalt medium. Til slutt beskrives protokollen for adipogen differensiering av ADSC. Etter differensiering kan disse cellene brukes til studier for bedre å forstå adipocytmetabolisme og mekanismer for dysfunksjon. Protokollene for bekreftelse av adipogen differensiering og påvisning av lipiddråper ved bruk av oljerød O og bor-dipyrrometen (BODIPY) farging er også beskrevet. Detaljene i disse protokollene fokuserte på primære ADSC-er isolert fra ferskt omentalt fettvev av rhesusmakaker. Vi og andre har brukt denne protokollen til å isolere ADSC-er fra rhesus macaque subkutane og omentale fettvevdepoter14,15. For samme mengde vev som brukes, har vi observert at subkutant fettvev er tettere, tøffere og gir mindre celler fra fordøyelsen sammenlignet med omentalt fettvev. Denne protokollen har også blitt brukt til å isolere ADSC-er fra humane fettprøver16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle oppnådde vev og prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Louisiana State University Health Sciences Center og ble utført i samsvar med retningslinjene fra National Institute of Health (NIH-publikasjon nr. 85-12, revidert 1996).
1. Fremstilling av buffere og løsninger
- Klargjør steril 5-fosfatbufret saltvannsvaskebuffer (5-PBS) løsning ved å tilsette 5% penicillin / streptomycin (penn / strep) og 0,25 μg / ml sopphemmer til 1x PBS. Klargjør steril 2-PBS vaskebuffer (2-PBS) løsning ved å tilsette 2% penn / streptokokker og 0,25 μg / ml sopphemmer i 1x PBS. Vaskebuffere kan oppbevares ved 4 °C for fremtidig bruk og må brukes innen 4 uker.
MERK: 5-PBS buffer brukes til fettvevsinnsamling og innledende vask for å minimere mulig forurensning ettersom vevsprøver oppnådd ved nekropsi samles inn i et ikke-sterilt miljø. - Forbered steril kollagenasebuffer (CB) ved å kombinere 0,075% kollagenase type I (125 enheter / mg aktivitet), 2% penn / streptokokker og 0,25 μg / ml sopphemmer i Hanks balansert saltløsning (HBSS) med 1% Bovine Serum Albumin. CB må brukes innen 1 time.
- Forbered sterilt ADSC-vekstmedium ved hjelp av α-MEM-buffer. Kombiner 100 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml 200 ml L-glutaminoppløsning, 500 μL 0,25 μg / ml sopphemmer og 10 ml penn / strepløsning i 394 ml α-MEM-buffer. ADSC vekstmedium kan oppbevares ved 4 °C og må brukes innen 4 uker.
MERK: Varmeinaktivering av FBS er ikke nødvendig. - Forbered sterilt ADSC-differensieringsmedium ved å kombinere ADSC-vekstmedium som fremstilt ovenfor og induksjonsmidler for å oppnå endelig konsentrasjon på 0,5 μg/ml deksametason, 0,5 mM isobutylmetylxanthin og 50 μM indometacin.
2. ADSC-isolasjon
- Vevspreparering og fordøyelse
- Pipette ~10 ml 5-PBS buffer i fire 100 mm cellekulturskåler.
- Overfør ~ 50 g fettprøve til en av 100 mm retter som inneholder 5-PBS. Vask den innsamlede fettvevsprøven fire ganger ved å overføre den sekvensielt over de fire kulturskålene som inneholder 5-PBS.
- Overfør fettprøve til en ren 100 mm kulturskål og hakk fettvev grundig ved hjelp av saks eller to sterile skalpeller. Hakking gjør det mulig å øke overflaten for effektiv og fullstendig enzymatisk fordøyelse.
- Overfør det hakkede fettvevet til 50 ml plastisk konisk rør som inneholder 13 ml CB (1-3 cm seksjon av vev per 15 ml CB).
- Skyll kulturskålen med 2 ml CB og overfør mediet til 50 ml plastisk konisk rør.
MERK: På dette tidspunktet skal det være totalt 15 ml CB med vev i et 50 ml plastisk konisk rør. - Pipette opp og ned flere ganger ved hjelp av 25 ml serologisk pipette for å lette mekanisk vevsfordøyelse.
- Inkuber det 50 ml plastiske koniske røret som inneholder vev i CB på en vippemaskin med middels hastighet ved 37 °C i 30–60 minutter.
- ADSC-plating for kultur
- Tilsett 10 ml ADSC-vekstmedium til det 50 ml rørholdige vevet for å nøytralisere enzymaktiviteten. Pipette opp og ned flere ganger ved bruk av 25 ml serologisk pipette for å separere eventuelle fettvevsaggregater.
- Overfør den flytende delen til et nytt sterilt 50 ml konisk rør som forlater faststoffene. Vask det originale 50 ml røret 3 ganger med ~ 7 ml 2-PBS buffer og overfør væskedelen til 50 ml røret.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter for å oppnå en cellepellets. Fjern forsiktig så mye supernatant som mulig ved hjelp av en serologisk pipette uten å forstyrre cellepelleten. Ikke dekanter.
- Resuspend cellepelleten i 1 ml 1x røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Tilsett 5 ml ADSC-vekstmedium til røret og sentrifuger ved 500 x g i 5 minutter, fjern og kast deretter supernatanten forsiktig.
- Tilsett 5 ml ADSC-vekstmedium og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter for å vaske cellepellet. Kast supernatanten.
- Resuspend pelleten i 2 ml ADSC vekstmedium og filtrer gjennom en 70 μm cellesil i et nytt sterilt 50 ml plast konisk rør.
- Skyll cellesilen med ytterligere 2 ml ADSC-vekstmedium. Overfør 4 ml av suspensjonen som inneholder ADSC-er fra 50 ml konisk rør til en steril 100 mm kulturskål.
- Vask det 50 ml koniske røret 2 ganger med 3 ml ADSC-vekstmedium og overfør væsken til 100 mm kulturskålen som inneholder ADSC-er for totalt 10 ml medium i kulturskålen.
- Vis celler under et omvendt mikroskop ved 10x forstørrelse for å se etter flytende celler i mediet som vist i figur 1A. Cellene skal oppbevares i en CO 2-inkubator ved 37 °C ved 5 % CO2 og 100 % relativ fuktighet.
- Etter 24 timer, se celler under et omvendt mikroskop for å se etter celleoverholdelse. Aspirer ADSC-vekstmedium fra platen og erstatt med 10 ml friske, varme (37 °C) medier. Fjern og erstatt medier hver 48. time til cellene er 80–90 % sammenflytende (figur 1B).
MERK: Minst 10–20 % av cellene vil være i samsvar innen 24 timer. Kontroller cellekulturen for tegn på forurensning som cellegranularitet, turbiditet i media eller vekst av sporer. Når celler er 80% sammenflytende, kan de høstes for spredning og kryopreservering eller induseres for å differensiere. ADSC-er kan utvides til 4-6 passasjer før de mister evnen til effektivt å spre seg eller differensiere.
3. ADSC-spredning
- Celle løsrivelse
- Fjern ADSC-vekstmediet ved hjelp av en aspirator/pipette. Skyll sammenflytende ADSC-er 2 ganger med 2 ml steril PBS i romtemperatur.
- Aspirer PBS og tilsett 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA per 100 mm kulturplate. Sørg for at hele overflaten er dekket med trypsin.
- Inkuber platen i ~7 min ved 37 °C i 5 % CO2 til ADSC-er er løsrevet. Fjern platen fra inkubatoren og fjern celler mekanisk ved å pipettere trypsinoppløsningen i platen.
- Tilsett 2 ml ADSC-vekstmedium til de løsnede cellene og forsiktig pipette for å blande. Overfør celler til sterilt 50 ml plast konisk rør. For å sikre maksimal cellegjenoppretting, skyll kulturskålen med ytterligere 2 ml ADSC-vekstmedium, og overfør mediet til det koniske røret som inneholder frittliggende celler.
- Sentrifuge det 50 ml koniske røret ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å oppnå en cellepellets. Dekanter supernatant forsiktig uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspend cellepellet i 5-6 ml ADSC vekstmedium per 1 x 106 celler.
- Celleantall og plating
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, fortynn 10 μL celleoppløsning ovenfra og 10 μL 0,04% trypanblå løsning (0,4% trypanblå fortynnet 1:10 i PBS) og telle celler ved hjelp av et hemocytometer.
- Resuspend ønsket antall ADSC-er i vekstmedium. For 100 mm kulturskål, plate ~ 3,0 x 105 celler i 10 ml ADSC-vekstmedier for å tillate 80% sammenløp i 72 timer eller 100% sammenløp i 96 timer.
- Se parabolen under et omvendt mikroskop ved 10x forstørrelse før inkubasjon for å sikre tilstedeværelse av suspenderte celler. Hold cellene ved 37 °C ved 5 % CO2 og 100 % relativ fuktighet.
- Hver 48. time aspirerer vekstmediet og erstattes med varmt (37 °C) medium til cellene er 80% til 90% sammenflytende som vist i figur 1B.
- Gjenta trinnene fra pkt. 3.1 og 3.2 for passende antall passeringer for å oppnå ønsket cellenummer.
MERK: Etter passasjer 5 til 6 ser det ut til at primære celler gjennomgår senescence; Ta derfor sikte på å oppnå ønskede celletall ved passering 4.
4. ADSC adipogen differensiering
- Aspirer ADSC-vekstmedium fra ADSC-er som har nådd 80% til 90% sammenløp.
- Skyll raskt ADSC-cellelaget med steril, romtemperatur PBS.
- Legg til ADSC-differensieringsmedium. For 100 mm kulturskål, tilsett 10 ml ADSC-differensieringsmedium.
- Bytt medium hver 3. dag i omtrent 14-21 dager. Eldre adipocytter observeres vanligvis etter 14 dagers differensiering.
- Undersøk celler under et omvendt lysmikroskop ved 40x forstørrelse for å bekrefte tilstedeværelsen av lipiddråper som vist i figur 2A.
5. Adipocyttdeteksjon
MERK: Denne delen vil beskrive fargeprotokoller som brukes til påvisning av lipiddråper i differensierte adipocytter, men immunfluorescerende farging for CD105, en mesenkymal stamcellemarkør, kan også brukes til ADSC-bekreftelse.
- Oljerød O-farging
- Forbered 0,5% Oil Red O lagerløsning i isopropanol. For 20 ml Oil Red O stamløsning, oppløs 100 mg Oil Red O i 20 ml isopropanol. Filtrer løsningen gjennom et sterilt sprøytefilter med 0,2 μm membran.
- Aspirer differensieringsmediet forsiktig og vask celler 2 ganger ved å legge PBS langs sidene av brønnen for ikke å forstyrre cellemonolaget.
- Aspirer PBS forsiktig fra celler og tilsett nok nøytralt bufret formalin (NBF, 10%) til å dekke cellelaget. Inkuber ved romtemperatur i 30-60 min.
- Under formalinfikseringstrinnet, klargjør Oil Red O-arbeidsløsningen ved å fortynne 3 deler Oil Red O-lagerløsning med 2 deler destillert vann. Bland løsningen og filtrer gjennom et sterilt sprøytefilter med 0,2 μm membran. Arbeidsløsningen er stabil i opptil 2 timer.
- Aspirer NBF forsiktig og vask raskt (~ 15 s) cellelaget med destillert vann. Tilsett nok 60% isopropanol til å dekke cellelaget etter å ha aspirert vann og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Aspirer isopropanol forsiktig etter 5 minutters inkubasjon og tilsett nok oljerød O-arbeidsløsning for å dekke cellelaget og inkubere ved romtemperatur i 10-15 minutter.
- Aspirer forsiktig av Oil Red O-arbeidsløsningen og vask cellelaget flere ganger med destillert vann til vannet blir klart.
- Legg PBS til cellekulturskålen og undersøk celler under et omvendt mikroskop for indikasjon på differensiering og tilstedeværelse av lipiddråper (figur 2B).
- BODIPY Farging
- Tilbered 5 mM BODIPY stamløsning ved å oppløse 1,3 g BODIPY i 1 ml DMSO. Tilbered 2 μg/ml BODIPY arbeidsløsning ved å fortynne stamløsningen 1:25 000 ganger i PBS.
- Aspirer differensieringsmediet forsiktig og vask celler 2 ganger ved å legge PBS langs sidene av brønnen for ikke å forstyrre cellemonolaget.
- Aspirer PBS forsiktig og tilsett nok BODIPY arbeidsløsning til å dekke cellelaget og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
NOTAT: Fra dette punktet, beskytt cellene mot lys ved å dekke platen med folie. - Aspirer BODIPY arbeidsløsning forsiktig og vask cellelaget 3 ganger med PBS.
- Fest celler ved å tilsette 4% paraformaldehyd og inkubere ved romtemperatur i 15 minutter.
- Aspirer fikseringsbufferen forsiktig og vask celler 2 ganger ved å legge PBS langs sidene av brønnen for ikke å forstyrre cellemonolaget.
- Legg PBS til cellekulturskål og undersøk celler under et omvendt fluorescerende mikroskop for bevis på differensiering og tilstedeværelse av lipiddråper (figur 2C). Bildeceller ved hjelp av et FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma-filtersett. Eksitasjonsbølgelengden er ved 480 nm med en båndbredde på 40 nm og emisjonsbølgelengden er ved 535 nm med en båndbredde på 50 nm. Et lignende eller passende filtersett, og mikroskop kan brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADSC-ene isolert fra rhesus macaque fettvevsprøver ble sådd på dyrkningsplater og er vist i figur 1. På pletteringsdagen er cellene ikke-klebende og flyter i kulturskålen som vist i figur 1A. Innen 72 timer vil ADSC-er bli 80% sammenflytende og er klare for adipocytdifferensiering (figur 1B). ADSC-er utviser sterke adipogene egenskaper etter kjemisk induksjon. Etter 14 dagers differensiering kan modne adipocytter observeres via lysmikroskopi (figur 2A). For å bekrefte ADSC adipogen differensiering kan forskjellige flekker brukes til å visualisere lipiddråper av de differensierte modne adipocytter. På dag 14 av differensiering ble celler farget og fiksert med oljerød O (figur 2B) og BODIPY (figur 2C) for lipiddråpevisualisering. Den svarte pilen representerer en differensiert adipocytt (figur 2B). Disse dataene indikerer at etter denne protokollen ble ADSC-er generert fra rhesus macaque fettvev og differensiert til modne adipocytter.
Figur 1: Lette mikrografer av ADSC-er på pletteringsdagen og ved 80% cellekonfluens. (A) Representativ lysmikrografi av stromale vaskulære celler på pletteringsdagen etter ADSC-isolasjon fra ferskt rhesus macaque fettvev (10x forstørrelse). (B) Representativ lysmikrografi av ADSC-er ved 80% sammenløp (20x forstørrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikrografer av ADSC-er på dag 14 av differensiering. (A) Representativ lysmikrografi oppnådd på dag 14 av ADSC-differensiering (40x forstørrelse). (B) Representativ mikrografi av oljerød O-farging ved dag 14 av ADSC-differensiering (20x forstørrelse). (C) Representativ mikrografi av bor-dipyrrometen (BODIPY) farging ved dag 14 av ADSC-differensiering (20x forstørrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC-isolasjons-, sprednings- og differensieringsprotokoller er rett frem og reproduserbare, men de krever nøye teknikk for å sikre tilstrekkelig isolasjon, sunn ekspansjon og effektiv differensiering. Et sterilt arbeidsmiljø er kritisk for alle cellekultureksperimenter. Bakterier eller sopp kan bli introdusert i cellekulturer gjennom forurensede verktøy, media eller arbeidsmiljø. Svampkontaminering indikeres av sporevekst i kulturen, mens bakteriell forurensning indikeres av tilstedeværelsen av turbiditet i media. Vi foreslår at biosikkerhetsskapet og alle pipetter, flasker og verktøy desinfiseres før bruk, slår på den laminære luftstrømmen minst 15 minutter før du bruker biosikkerhetsskapet og desinfiserer skapet og alle pipetter etter bruk for å redusere risikoen for forurensning. Vi foreslår også autoklavering av ikke-filterpipettespisser for vakuum aspirasjon og spyling av aspiratoren med sterilt vann etterfulgt av 70% etanol etter bruk. En kulturskål med kun medier kan plasseres i den fuktede inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i noen dager for å kontrollere steriliteten til mediet. Kontaminerte kulturer skal blekes i 30 minutter og kastes. Cellekulturinkubatoren bør også desinfiseres.
En stor forskjell mellom protokollene i dette manuskriptet og de som tidligere er publisert, er bruken av BSA i vår ADSC-kollagenasefordøyelsesbuffer som muliggjør isolering av modne adipocytter og ADSC. I tillegg bruker protokollen vår ADSC-vekstmedium supplert med 20% FBS sammenlignet med 10% FBS som foreslått av de fleste protokoller. Vi har lagt merke til at rhesus macaque primære ADSC-er sprer seg og skiller seg bedre med 20% FBS. ADSC-differensiering in vitro induseres av avstamningsspesifikke induksjonsmidler. Induksjonsmidlene som brukes i denne protokollen er allment akseptert for in vitro adipogen differensiering av ADSC. Imidlertid, i motsetning til mange tidligere publiserte protokoller, inkluderer den adipogene differensieringscocktailen ikke insulin eller PPARγ-agonister. Vi og andre har brukt denne protokollen til å skille både rhesus macaque og menneskelige ADSCs14,15,16.
I denne protokollen bekreftes ADSC-adipogen differensiering ved lipiddråpedeteksjon ved bruk av oljerød O- og BODIPY-fargeteknikker. Selv om disse flekkene er godt anerkjent i feltet, er det andre metoder som ofte brukes, inkludert flowcytometri for påvisning av CD105 for å identifisere ADSC, eller markører for endotel- og immunceller for å etablere renhet av ADSCs17.
Bruk av ADSCs gir et verdifullt verktøy for regenerativ medisin og metabolsk forskning. ADSC-isolering og proliferasjon produserer et stort antall stamceller som kan brukes til flere nedstrøms applikasjoner og eksperimentelle teknikker, inkludert men ikke begrenset til de som er beskrevet i denne protokollen. En viktig tiltenkt bruk for differensierte adipocytter i denne protokollen inkluderer bruk av metabolske analyser som insulinstimulert glukoseopptak, lipogenese og stimulert lipolyse18. I tillegg kan ADSC-er differensieres i osteogen og kondrogen avstamning og brukes til nedstrømsanalyse, inkludert for vevsteknikk7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Curtis Vande Stouwe for teknisk assistanse. Forskningen som ligger til grunn for utviklingen av protokollene ble støttet av tilskudd fra National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 og 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
