Summary
Hier wird ein Protokoll für den kryogenen Transfer von gefrorenen Proben in die dynamische Kernpolarisation (DNP) Magic Angle Spinning (MAS) Kernspinresonanzsonde (NMR) vorgestellt. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Rotorspeicherung vor dem Experiment und Anweisungen für Lebensfähigkeitsmessungen vor und nach dem Experiment.
Abstract
Die dynamische Kernpolarisation (DNP) kann die Empfindlichkeit der NMR-Spektroskopie (Magic Angle Spinning) dramatisch erhöhen. Diese Empfindlichkeitsgewinne nehmen mit abnehmenden Temperaturen zu und sind groß genug, um die Untersuchung von Molekülen in sehr niedrigen Konzentrationen bei den Betriebstemperaturen (~ 100 K) der meisten kommerziellen DNP-ausgestatteten NMR-Spektrometer zu ermöglichen. Dies führt zu der Möglichkeit der zellinzelligen Strukturbiologie an kryokonservierten Zellen für Makromoleküle auf ihren endogenen Ebenen in ihrer nativen Umgebung. Die für die zelluläre Kryokonservierung erforderlichen Gefrierraten werden jedoch während der typischen Probenhandhabung für DNP MAS NMR überschritten, was zu einem Verlust der zellulären Integrität und Lebensfähigkeit führt. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und den kryogenen Transfer einer gefrorenen Probe von Säugetierzellen in ein MAS-NMR-Spektrometer.
Introduction
Die Einführung der dynamischen Kernpolarisation für die magische Winkeldrehung der Kernspinresonanzspektroskopie kann die Empfindlichkeit der MAS-NMR um mehrere Größenordnungen erhöhen. Dies ermöglichte den Nachweis von Biomolekülen in oder in der Nähe ihrer physiologischen Konzentrationen. DNP kann und wird die erforderliche Empfindlichkeit bieten, um ein isotopisch markiertes Protein bei endogenen (~1 μM) Konzentrationen in komplexer biologischer Umgebung nachzuweisen1. Da es gut etablierte Protokolle gibt, um isotopisch markierte Moleküle in nicht markierte Säugetierzellen einzuführen, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen, eröffnet dies die Möglichkeit, isotopisch angereicherte Biomoleküle auf ihren endogenen Ebenen in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Da DNP-Verbesserungen bei niedrigeren Temperaturen 2 , 3 ,4effizientersind,stimmen die experimentellen Temperaturen für DNP MAS NMR genau mit denen überein, die für die langfristige Lagerung lebensfähiger Säugetierzellen erforderlich sind5. Die herkömmliche Methode, eine Probe in ein DNP MAS NMR-Spektrometer zu übertragen, unterwirft sie jedoch Temperaturschwankungsraten, die Säugetierzellen zerreißen.
MAS-NMR-Experimente erfordern, dass die Probe um den magischen Winkel mit Frequenzen gedreht wird, die gleich oder größer als die Größe der anisotropen Wechselwirkung sind, damit sie auf Null gemittelt werden kann, typischerweise mindestens 4 kHz und oft viel höher6,7,8,9. Die Proben werden daher in Rotoren verpackt, die eine Rippenspitze haben, die verwendet wird, um die Rotation des Rotors durch einen Gasstrom anzutreiben, und am anderen Ende eine Markierung haben, so dass die Rotationsfrequenz von einem Drehzahlmesser überwacht werden kann. Der Probentransfer für die meisten MAS-NMR-Instrumente erfolgt durch Einspritzen des Rotors von der Außenseite des Instruments in den Stator am Ende der NMR-Sonde mit einem Strom trockener Luft oder Stickstoffgas. Nachdem der Rotor den Stator erreicht hat, der den Rotor im magischen Winkel hält, wird die Probenrotation durch einen Luftturbinenmechanismus angetrieben. Separate Gasströme stützen, treiben und steuern die Temperatur des Rotors. Das Einsetzen eines Rotors in das NMR-Spektrometer und das Erreichen eines stabilen MAS-Spinnens erfordert fein bearbeitete Antriebsspitzen und eine strenge Kontrolle der Temperatur und des Drucks der einzelnen Gasströme. Trotz dieser technischen Anforderungen sind das Einsetzen und Erreichen stabiler MAS für kommerzielle MAS-NMR-Sonden für Raumtemperaturanwendungen weitgehend automatisiert.
Komplizierter ist die Situation jedoch bei Niedertemperaturanwendungen. Proben für Niedertemperaturanwendungen werden typischerweise bei Raumtemperatur in das Spektrometer eingeführt und im Stator eingefroren. In der ersten Minute sinkt die Probentemperatur schnell (> −100 °C/min) und die Systemtemperatur benötigt mehrere Minuten, um sich auszugleichen. Aufgrund des Zusammenspiels von Temperatur und Druck werden das Einsetzen und Annähern des gewünschten MAS bei Niedertemperaturanwendungen häufig manuell gehandhabt. Trotz der Notwendigkeit eines manuellen Eingriffs ist das Einfrieren des Rotors im Inneren des Instruments von Vorteil, da es das Einbringen von Wasser und Kondensation in die Sonde minimiert, was für ein erfolgreiches Spinnen entscheidend ist. Kondensation und Eisbildung durch Umgebungsfeuchtigkeit können nicht nur Gasleitungen blockieren, Kondensation oder Frost am Rotor selbst können MAS mechanisch verhindern. Daher werden Proben für DIE MAS-NMR bei niedrigen Temperaturen typischerweise im Inneren des Instruments mit Raten von mehr als -100 °C/min eingefroren.
Säugetierzellen können ihre Integrität durch einen Frost-Tau-Zyklus behalten, wenn die Abkühlung langsamist 5,10,11,12, mit einer Geschwindigkeit gleich oder langsamer als 1 ° C / min. Alternativ behalten Zellen ihre Integrität auch, wenn die Abkühlrate ultraschnell13,14,15, mit einer Geschwindigkeit schneller als 104 ° C / min ist. Raten, die zwischen diesen beiden Extremen liegen, reißen und töten Säugetierzellen aufgrund von Eiskristallbildung sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zellen, selbst in Gegenwart von Kryoprotektoren16. Die Probenkühlraten für einen Raumtemperaturrotor in einer vorgekühlten Sonde liegen zwischen diesen beiden Extremen, so dass zur Untersuchung kryogen konservierbarer intakter lebensfähiger Säugetierzellen Proben vor dem Transfer in das Instrument eingefroren und ohne Temperaturschwankungen, die die Probe beschädigen könnten, oder ansammlung von Frost auf dem Rotor, der das Drehen des Rotors verhindern könnte, in das Instrument übertragen werden. Das Protokoll beschreibt ein Verfahren zum frostfreien, vorgekühlten Rotoreinführung in ein kryogenes MAS-NMR-System zur Untersuchung von kryogen konservierten intakten lebensfähigen Säugetierzellproben. Der hier beschriebene kryogene Probentransfer wurde zur NMR-Charakterisierung lebensfähiger intakter Zellen entwickelt. Es ist jedoch auf jedes System anwendbar, bei dem Temperaturschwankungen die Probenintegrität beeinträchtigen können. Dazu gehören beliebig viele komplexe Systeme, wie z.B. gefriervergütete Reaktionen zur chemischen und strukturellen Charakterisierung der eingeschlossenen Reaktionszwischenprodukte17,18, Enzymologie19,20 oder Proteinfaltung21,22.
Protocol
1. Kultur und Kryoschutz von Säugetierzellen
- Kultur und Ernte von Säugetierzellen
- Auftauen eines Aliquots von gefrorenen menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK 293).
- Kultur HEK 293 Zellen in Wachstumsmedien (z.B. DMEM mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Pen-Strep) bei 37 °C mit 5% CO2 in 100 mm Platten für zwei bis drei Passagen (7-10 Tage).
- Teilen Sie die Zellen und kulturieren Sie sie in einer 150-mm-Platte, bis die Zellen eine Konfluenz von 90-95% erreichen.
HINWEIS: Eine 150-mm-Platte mit > 90% Konfluenz reicht aus, um zwei Saphirrotoren mit einem Durchmesser von 3,2 mm zu füllen. - Erntezellen mit 4 ml Trypsin (siehe Materialtabelle)und 10 ml Medien. Die Suspension für 5 min bei Raumtemperatur auf eine sterile 15 mL Konikale und Zentrifuge bei 673 x g (1000 U/min) geben. Entfernen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das Zellpellet mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4, −CaCl2, −MgCl2).
- Kryoprotektion von Zellen
- Sammeln Sie ein 50 μL Zellpellet in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine Mischung aus 50 μL PBS und 18 μL Glycerin in einem separaten Röhrchen vor.
- Mischen Sie das 50 μL-Zellpellet vorsichtig mit 68 μL Glycerin-PBS-Mischung, indem Sie die Glycerin-PBS-Mischung an die Oberseite des Pellets geben und das Pellet durch vorsichtiges Klopfen der Seite des Röhrchens wieder aufwenden, bis keine Klumpen mehr übrig bleiben.
HINWEIS: Sanftes Pipettieren kann auch verwendet werden, um die Zelle wieder aufzubereiten, stellen Sie jedoch sicher, dass die zelluläre Integrität nicht beeinträchtigt wird.
2. Kryokonservierung von Säugetierzellen in einem NMR-Rotor
- Transfer der Zellen in einen 3,2 mm Saphirrotor.
- Um einen Trichter herzustellen, schneiden Sie eine 200 μL Pipettenspitze und führen Sie das schmale Ende der geschnittenen Pipettenspitze in den 3,2 mm Rotor ein.
- Übertragen Sie die Zellen in den Trichter, der auf dem Rotor sitzt. Legen Sie den Rotor zusammen mit dem Trichter in ein Mikrozentrifugenrohr und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 673 x g für 2-3 min bei Raumtemperatur in den Boden des Rotors.
- Entfernen Sie den Überstand und die überschüssige Probe aus dem Rotor. Wiederholen Sie diese beiden Schritte, bis der Rotor vollständig mit den Zellen gefüllt ist.
HINWEIS: Bestimmen Sie optional die zelluläre Lebensfähigkeit der Probe vor dem Einfrieren. 10 μL des überschüssigen Zellpellets in 100 μL FBS-freiem DMEM wiedergeben. Mischen Sie 10 μL der Suspension mit 0,4% iger trypanblauer Lösung und beurteilen Sie sofort die Lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler. Verwenden Sie nur FBS-freie Medien, um Zellen zu verdünnen, da Serum die Trypanblaufärbung stört. - Versiegeln Sie den Rotor mit einem Silikonstopfen mit handelsüblichem Verpackungswerkzeug.
- Schließen Sie den Rotor mit einer keramischen Antriebsspitze, indem Sie ihn vertikal nach unten drücken. Vermeiden Sie es, die empfindlichen Flossen an der Seite der Antriebsspitze zu berühren.
- Markieren Sie die Hälfte der Unterkante des Saphirrotors mit einem silbernen Permanentmarker und die andere Hälfte der Unterkante des Rotors mit einem schwarzen Permanentmarker, um eine genaue Überwachung der Drehung des Rotors im Inneren des Spektrometers zu ermöglichen.
HINWEIS: Unvollkommenheiten in der Markierung des Rotors verhindern eine genaue Zählung der Spinnfrequenz, was dazu führt, dass ein stabiles Spinnen nicht erreicht werden kann. Da Marker nicht auf einen gefrorenen Rotor schreiben und die Rotorerwärmung die Probenintegrität beeinträchtigt, ist das Markieren des Rotors vor dem Einfrieren ein kritischer Schritt.
- Kryokonservierung von Zellen in einem 3,2 mm Saphirrotor.
- Legen Sie ein Kissen aus einem Stück Taschentuch oder Papiertuch unter den Deckel und an den Boden der kryogenen Durchstechflasche(siehe Materialtabelle ).
HINWEIS: Das Seidenpapier schützt die Rotormarkierung vor Beschädigungen, die durch Stöße an den Seiten kryogener Fläschchen entstehen. - Legen Sie den 3,2-mm-Saphirrotor in die kryogene Durchstechflasche, die mit dem Seidenpapier gepolstert ist, mit einem markierten Ende am Boden der kryogenen Durchstechflasche.
- Kühlen Sie den Rotor langsam ein, indem Sie die kryogene Durchstechflasche in den Kühlbehälter mit kontrollierter Rate (-1 °C/ min) legen und den Behälter für mindestens 3 h in einen Gefrierschrank mit einer Temperatur von -80 °C stellen.
- Die kryogene Durchstechflasche mit dem gefrorenen Rotor wird in den Flüssigstickstoffspeicher überführen.
- Legen Sie ein Kissen aus einem Stück Taschentuch oder Papiertuch unter den Deckel und an den Boden der kryogenen Durchstechflasche(siehe Materialtabelle ).
3. Kryogener Transfer einer gefrorenen Probe in das NMR-Spektrometer
- Transportieren Sie die gefrorene Probe zur NMR-Anlage.
- Die kryogene Durchstechflasche, die den gefrorenen Rotor enthält, wird in einen kleinen, mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dewar für den Transport zur NMR-Anlage überführen.
- Übergabe des gefrorenen Rotors an das Flüssigstickstoffbad.
- Füllen Sie einen trockenen, wärmeisolierten Breitmaulschaumtau mit 500 ml – 1 l flüssigem Stickstoff.
- Den Rotor aus der kryogenen Durchstechflasche in den mit flüssigem Stickstoff gefüllten Breitmaulschaumentwar überführen.
- Nehmen Sie die kryogene Durchstechflasche aus dem Transfer-Dewar in die Hand und halten Sie sie knapp über die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs, um sie vor der Atmosphäre zu schützen.
- Während Sie das kryogene Fläschchen mit leicht nach unten zeigendem Mund halten, schrauben Sie die Kappe ab und lassen Sie den Rotor in das Flüssigstickstoffbad gleiten.
HINWEIS: Sobald die Kappe abschrauben ist, muss der Rotor schnell (unter 1 Sekunde) aus der kryogenen Durchstechflasche in das Flüssigstickstoffbad fallen, um zu verhindern, dass sich Kondenswasser auf dem Rotor sammelt. Die Verdunstung von flüssigem Stickstoff bildet im Wide Mouth-Schaumtau eine "Stickstoffwolke" und verhindert Kondensation am Rotor, bevor er in den flüssigen Stickstoff getaunken wird. Eine längere Exposition des Rotors gegenüber Luft kann zu einer Kondensation von Feuchtigkeit an Rotorwänden führen, die wieder zu Eis kondensiert.
- Kryogene Übertragung des Rotors auf den NMR-Probenfänger.
- Prechillieren Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, indem Sie es in das Flüssigstickstoffbad tauchen. Schließen Sie das Rohr nicht.
HINWEIS: Überprüfen Sie den Rotor vor dem Transfer in das Mikrozentrifugenrohr. Halten Sie den Rotor mit einer Pinzette knapp unter die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs und überprüfen Sie, ob die Rotormarkierungen intakt sind, dass sich keine Eisablagerungen an den Wänden gebildet haben und dass die Antriebsspitze intakt ist. Eiskristallablagerungen an den Rotorwänden erscheinen als weißes Pulver. Achten Sie darauf, den Rotor immer an seinem Körper und nicht an der Antriebsspitze zu halten. Kratzen Sie die Markierung nicht mit den Pinzettenspitzen vom Rotor ab. - Verwenden Sie unter der Oberfläche des Flüssigstickstoffbades eine Pinzette, um den Rotor in das Mikrozentrifugenrohr zu übertragen, wobei die Antriebsspitze dem Boden des Mikrozentrifugenrohrs zugewandt ist und die Markierungen der Öffnung des Rohrs zugewandt sind.
HINWEIS: Trocknen Sie immer die Pinzette, bevor Sie in flüssigen Stickstoff eintauchen oder den Rotor berühren. - Halten Sie mit einer Pinzette das Rohr mit dem Rotor unter flüssigem Stickstoff am Hals.
- Bereiten Sie sich mit einer zweiten Pinzette in der Hand darauf vor, den NMR-Probenfänger in das Flüssigstickstoffbad zu tauchen und so zu halten, dass er in einem spitzen Winkel zum Mikrozentrifugenröhrchen geneigt ist.
HINWEIS: Minimieren Sie die Zeit, in der der Probenfänger mit dem flüssigen Stickstoff in Kontakt kommt, um ein Einfrieren des O-Rings zu vermeiden. Wenn der O-Ring einfriert, wird es sehr schwierig sein, den Fänger in das Spektrometer einzuführen.
- Prechillieren Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, indem Sie es in das Flüssigstickstoffbad tauchen. Schließen Sie das Rohr nicht.
- Kryogener Rotortransfer vom NMR-Probenfänger zum NMR-Spektrometer
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert zwei Personen, eine für die Bedienung des Kryokabinetts und eine für die Übertragung der Probe vom flüssigen Stickstoff in die Sonde.- Stellen Sie das Kryokabinett in den Auswurfmodus, indem Sie "EJECT" auf dem Gehäuse drücken.
HINWEIS: Der Auswurfmodus spült den trockenen und kalten Stickstoffgasstrom mit hohem Druck von der Sonde in die Atmosphäre, um das Eindringen von Luftfeuchtigkeit zu verhindern. - Übertragen Sie den Rotor in den NMR-Probenfänger.
- Setzen Sie das offene Ende des NMR-Probenfängers noch unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs in das Mikrozentrifugenröhrchen ein.
- Heben Sie sowohl das Mikrozentrifugenröhrchen als auch den NMR-Probenfänger an, damit der Rotor in den Probenfänger fallen kann. Schütteln Sie den NMR-Probenfänger und das Mikrozentrifugenrohr, falls der Rotor am Rand des Probenfängers klebt.
- Lassen Sie das leere Mikrozentrifugenrohr auf dem NMR-Probenfänger, um den Rotor vor Luft zu schützen.
- Entfernen Sie den anderen leeren NMR-Probenfänger von der Sonde und legen Sie ihn auf den Boden.
- Übertragen Sie den NMR-Probenfänger mit dem Rotor in Ihre freie Hand, entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr und führen Sie es sofort in die Sonde ein.
HINWEIS: Wenn der O-Ring einfriert, wird es schwierig sein, den Probenfänger festzuziehen. Wenden Sie die Kraft so lange an, bis sie an ihren Platz gleitet. - Signalisieren Sie der Person, die das Kryokäbinet bedient, "STOP EJECT" und "INSERT".
HINWEIS: Der Einführmodus führt den Rotor vom Probenfänger in die Sonde. - Drehen Sie die Probe auf die gewünschte Spinnrate (z. B. 12 kHz), indem Sie den Lager- und Antriebsdurchflussdruck einstellen, der vom Kryokäbinet gesteuert wird. (z.B. Sofort das Lagergas auf ~200 mBar und das Antriebsgas auf 10 mBar erhöhen. Sobald sich die Probe dreht, erhöhen Sie das Lagergas auf 1000 mBar und fahren Sie gas auf 200 mBar. Wenn sich das Spinnen stabilisiert, erhöhen Sie das Lager auf 2400 mBar und erhöhen Sie dann das Antriebsgas von 200 mBar auf 1700 mBar über mehrere Minuten. VT-Kühlgas ist konstant bei ~1070 L/h.)
HINWEIS: Wenn Sie das Mikrozentrifugenrohr und den NMR-Probenfänger aus dem Flüssigstickstoffbad heben, stellen Sie sicher, dass das Mikrozentrifugenrohr genügend flüssigen Stickstoff enthält, um den Rotor zu umgeben. Minimieren Sie die Zeit zwischen dem Einbringen des Rotors in den NMR-Probenfänger und dem Einsetzen des NMR-Probenfängers in das Spektrometer. Alle Schritte in 3.4 sollten innerhalb von 30 s abgeschlossen sein.
- Stellen Sie das Kryokabinett in den Auswurfmodus, indem Sie "EJECT" auf dem Gehäuse drücken.
4. Kryogene Entnahme der Probe aus dem NMR-Spektrometer
- Herstellung des Flüssigstickstoffbades und der kryogenen Durchstechflasche
- Gießen Sie 500 ml - 1 L flüssigen Stickstoff in den breitmauligen Schaum-Dewar und legen Sie das Bad unter das Spektrometer.
- Kühlen Sie die kryogene Durchstechflasche vor. Tauchen Sie die leere kryogene Durchstechflasche mit einem Stück Seidenpapier in das Flüssigstickstoffbad.
- Kryogene Übertragung des Rotors von der Sonde auf die kryogene Durchstechflasche
- Reduzieren Sie die Spinnrate auf 0 kHz, indem Sie den Antriebs- und Lagergasstrom herunterfahren und den Rotor auswerfen, indem Sie in den Auswurfmodus wechseln.
- Halten Sie den Auswurfmodus eingeschaltet, entfernen Sie den Probenfänger von der Sonde, lassen Sie den Rotor direkt in den breitmauligen Schaumtau fallen, der flüssigen Stickstoff enthält.
- Mit einer vorgekühlten Pinzette den Rotor in eine vorgekühlte kryogene Durchstechflasche unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs überführen.
- Die kryogene Durchstechflasche verschließen. Die kryogene Fläschchenkappe vorbeenden, indem Sie sie in flüssigen Stickstoff tauchen. Entfernen Sie die kryogene Durchstechflasche mit dem Rotor und flüssigem Stickstoff aus dem Bad und verschließen Sie das Röhrchen mit vorgewälzter Kappe. Ziehen Sie die Kappe nicht fest, damit verdampfender Stickstoff sicher freigesetzt werden kann.
- Tauchen Sie die kryogene Durchstechflasche wieder in flüssigen Stickstoff. Die Probe kann in ein längerfristiges Flüssigstickstofflager überführt oder sofort zur weiteren Analyse ausgepackt werden.
5. Auspacken von Rotor und Lebensfähigkeitsmessungen
- Rotor auspacken und Lebensfähigkeit messen
- Vorwarmen serumfreie Medien (DMEM) oder PBS auf 37 °C.
- Rotor aus flüssigem Stickstoff entfernen. Entfernen Sie die Laufwerksspitze und den Silikonstecker.
HINWEIS: Saphir ist ein ausgezeichneter Wärmeleiter. Vermeiden Sie es, den Rotor mit den Fingern zu berühren, da die Wärmeübertragung lokale Frost-Tau-Ereignisse verursachen kann, die die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen.
- Messung der Lebensfähigkeit
- 20 μL warme Medien in das gefrorene Zellpellet im Rotor geben und die Zellen wiederverwenden. Suspension mit einer Pipette entfernen und die Suspension mit 100 μL Medium mischen.
- 10 μL Zellsuspension entfernen und mit gleichem Volumen von 0,4% trypanblauer Lösung (v/v) mischen. Bei Raumtemperatur für 30 s bis 1 min inkubieren.
- Messen Sie die Lebensfähigkeit mit dem automatisierten Zellzähler.
Representative Results
Die kryogene Insertion von vorgefrorenen Proben von Säugetierzellen in das NMR-Spektrometer unterstützt die Lebensfähigkeit während des gesamten NMR-Experiments. Schematische Darstellungen des kryogenen Transfers einer gefrorenen Probe in eine vorgekühlte NMR-Sonde sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Zelllebensfähigkeit und Intaktheit kann mit einer Vielzahl von Methoden beurteilt werden. Hier haben wir ein standardfarbstoffbasiertes Maß für die Membranintegrität verwendet, das gut mit anderen Methoden übereinstimmt23. Intakte Zellen sind undurchlässig für Trypanblau, während Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität durchlässig sind. Die Anzahl der trypanblau durchlässigen und undurchlässigen Zellen kann mit einem automatisierten Zellzähler schnell beurteilt werden. Unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls ähnelt die Trypanblau-Permeabilität von Säugetierzellen nach MAS-NMR (d. h. bei Punkt 5.2.3) der Trypanblau-Permeabilität von Säugetierzellen vor jeder Temperaturänderung (d. h. Punkt 2.1.3). Wenn Zellen jedoch langsam eingefroren und dann vor dem Einsetzen auf Raumtemperatur erwärmt werden (d. h. gemäß dem Protokoll zu Punkt 3, bevor der Rotor vor dem Einsetzen in die gekühlte Sonde auf Raumtemperatur erwärmt wird), nimmt die zelluläre Lebensfähigkeit, wie sie durch Trypanblau beurteilt wird, auf weniger als 10% der Zellen ab (Abbildung 2). So führt das Einfrieren von Zellen im Spektrometer zum Verlust der Integrität der Zellmembran, während das kryogene Einfügen von gefrorenen Proben von Säugetierzellen die Zelllebensfähigkeit während des gesamten NMR-Experiments unterstützt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des kryogenen Transfers einer gefrorenen Probe in eine vorgekühlte NMR-Sonde. (A) Nähern Sie sich der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs und schrauben Sie die Oberseite der kryogenen Durchstechflasche ab. (B) Schieben Sie den Rotor in das Flüssigstickstoffbad. (C) Tauchen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pinzette ein und halten Sie es an Ort und Stelle, bis es vollständig abgekühlt ist. (D) Setzen Sie den Rotor in die Mikrozentrifuge ein, wobei die Antriebsspitze dem Boden des Rohrs zugewandt ist. Drücken Sie mit der Pinzette, anstatt zu greifen. (E) Halten Sie das Mikrozentrifugenrohr direkt unter die Oberfläche des Flüssigstickstoffbades und inspizieren Sie den Rotor visuell, um sicherzustellen, dass er frostfrei und gut markiert ist. (F) Halten Sie den Probenfänger in einem Winkel über der Oberfläche. (G) Heben Sie den Probenfänger und das Röhrchen aus dem flüssigen Stickstoff heraus, sobald sich der Probenfänger im Mikrozentrifugenröhrchen befindet. (H) Schütteln Sie den Probenfänger, wenn sich der Rotor auf der Felge verfängt. (I) Entfernen Sie den leeren Probenfänger aus der Sonde und legen Sie ihn auf den Boden. (J) Entfernen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Rotor im Inneren aus dem Probenfänger, setzen Sie den Probenfänger in die Sonde ein, und drücken Sie "INSERT" auf der Steuerkonsole. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das kryogene Einfügen einer vorgefrorenen Probe von Säugetierzellen führt zu Messungen der Zellintaktheit, die Säugetierzellenproben ähneln, die nie eingefroren wurden. Der Prozentsatz der trypanblauen undurchlässigen Zellen für Proben, die nie eingefroren wurden (z. B. Schritt 2.1.3), ist ähnlich wie der von Zellen für Proben nach MAS-NMR (z. B. Schritt 5.2.3 mit 12 kHz MAS). Langsam gefrorene Zellen (z. B. Schritt 3), die vor dem Einsetzen in das nmR-Instrument, das auf 100 K vorgekühlt worden war, auf Raumtemperatur erwärmt wurden, hatten nach MAS NMR mit 12 kHz MAS viel geringere Prozentsätze intakter Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Der kryogene Transfer von gefrorenen Proben in ein NMR-Spektrometer ist erfolgreich, um die Lebensfähigkeit gefrorener Säugetierzellen durch die NMR-Datenerfassung zu erhalten. Der Erfolg dieser Methodik wird in Messungen der NMR-Lebensfähigkeit vor und nach MAS nachgewiesen. Dieser Ansatz ist erfolgreich und verallgemeinerbar für jedes System, bei dem Temperaturschwankungen die Probenintegrität beeinträchtigen können. Das aktuell vorgestellte Protokoll wird mit der Zelllinie HEK 293 durchgeführt. Da die Kryokonservierungsbedingungen für viele Säugetierzelllinien sehr ähnlich sind, ist es wahrscheinlich, dass die hier berichteten Bedingungen auf andere zelluläre Systeme übertragbar sind; Sie können jedoch eine weitere Optimierung von Kryoprotektoren, Probenvolumina und Gefrierraten erfordern, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen.
Diese Methodik kann verbessert werden, indem der Rotor nach dem NMR-Experiment schneller ausgepackt wird. Dieser Schritt ist derzeit suboptimal und seine Ausführung beeinflusst die Lebensfähigkeit der Zellen. Bevor die Zellen in Medien wieder aufgewendet werden können, müssen die Antriebsspitze und der Silikonstecker vom Rotor entfernt werden. Die Probe taut ungleichmäßig auf, wenn der Rotor beim Entfernen der Antriebsspitze und des Silikonstopfens gehalten wird, so dass kürzere Rotorhandhabungszeiten zu höheren Fläschchen führen. Die Entwicklung von Rotorhaltern oder anderen Werkzeugen, um ein gleichmäßiges Auftauen und schnelles Entfernen der Antriebsspitze und des Silikonsteckers zu ermöglichen, würde dazu beitragen, die Post-NMR-Bewertung der Lebensfähigkeit genauer zu machen.
Der in diesem Artikel beschriebene Ansatz zur kryogenen Probenbeladung beschränkt sich auf NMR-Sonden, die das Einsetzen und Auswerfen der Probe mit der Sonde in der Bohrung des NMR-Magneten unterstützen. Während das Einsetzen und Auswerfen externer Proben bei kommerziellen DNP-Systemen Standard ist, haben kundenspezifische Sonden diese Option nicht immer. Auch dieser Ansatz zur kryogenen Probenbeladung kann einige Modifikationen für NMR-Sonden erfordern, die so gebaut sind, dass sie mit Rotoren unterschiedlicher Größe kompatibel sind. Dieses Protokoll wurde für 3,2-mm-Rotoren optimiert und kann geändert werden müssen, wenn der Außendurchmesser des Probenfängers den Innendurchmesser eines Mikrozentrifugenrohrs überschreitet (z. B. Schritt 3.4.2).
Mit der Anwendung von DNP auf MAS NMR ist es nun möglich, Proteine und andere Biomoleküle in endogenen physiologischen Konzentrationen24,25,26nachzuweisen. Dies eröffnet die Möglichkeit, Biomoleküle in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Die Aufrechterhaltung der zellulären Integrität und Lebensfähigkeit während des gesamten Experiments ist wahrscheinlich entscheidend, um die experimentellen Ergebnisse der Spektroskopie mit biologischen Phänomenen zu verbinden. Das unkontrollierte Einfrieren von Proben, die gereinigte Proteine oder Zelllysateenthalten,beeinträchtigt in der Regel nicht die Probenqualität7,27, obwohl es einige Hinweise darauf gibt, dass die Gefrierrate auch in gereinigten Systemen eine wichtige Variable sein kann28. Proben von Säugetierzellen müssen jedoch mit kontrollierter Geschwindigkeit eingefroren werden, wenn die Erhaltung der zellulären Unversehrtheit und Lebensfähigkeit für die Interpretation wichtig ist. Hier stellen wir ein Protokoll zum Einfrieren und Übertragen gefrorener Proben von Säugetierzellen in ein vorgekühltes DNP MAS NMR-Instrument vor, das potenziell schädliche Temperaturschwankungen vermeidet und Messungen an lebensfähigen Zellen unterstützt.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], der National Science Foundation [1751174] unterstützt; die National Institutes of Health [NS-111236], die Welch Foundation [1-1923-20170325]; Die Lupe Murchison Foundation, die Ted Nash Long Life Foundation und die Kinship Foundation (Searle Scholars Program) an K.K.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
| 100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
| 3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
| 45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
| Black and Silver marker | Sharpie | ||
| Cap removal tool | Bruker | HZ16913 | |
| Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
| Ceramic cap | Cortecnet | HZ12372 | |
| CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
| d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
| Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| DNP NMR system with frequency-matched gyrotron | Bruker | ||
| Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
| Kimwipes | Kimwipes | ||
| Packing tool | Bruker | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
| Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Silicon plug | Bruker | B7089 | |
| Standard Vessel forceps | |||
| Tryp-L | Gibco | 12605010 |
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