Summary
Presenteras här är ett protokoll för kryogen överföring av frysta prover till den dynamiska nukleära polarisering (DNP) magiska vinkel spinning (MAS) kärnmagnetisk resonans (NMR) sond. Protokollet innehåller anvisningar för rotorlagring före experimentet och anvisningar för lönsamhetsmätningar före och efter försöket.
Abstract
Dynamisk nukleär polarisering (DNP) kan dramatiskt öka känsligheten hos magisk vinkelspinnande (MAS) kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR). Dessa känslighetsvinster ökar när temperaturerna minskar och är tillräckligt stora för att möjliggöra studier av molekyler vid mycket låga koncentrationer vid driftstemperaturerna (~ 100 K) hos de flesta kommersiella DNP-utrustade NMR-spektrometrar. Detta leder till möjligheten till in-cell strukturbiologi på cryopreserved celler för makromolekyler på deras endogena nivåer i sina inhemska miljöer. De fryshastigheter som krävs för cellulär kryopreservation överskrids dock under typisk provhantering för DNP MAS NMR och detta resulterar i förlust av cellulär integritet och livskraft. Denna artikel beskriver ett detaljerat protokoll för beredning och kryogen överföring av ett fryst prov av däggdjur celler till en MAS NMR spektrometer.
Introduction
Införandet av dynamisk nukleär polarisering för magisk vinkelspinnande kärnmagnetisk resonansspektroskopi kan öka MAS NMR:s känslighet med flera storleksordningar. Detta har gjort det möjligt att upptäcka biomolekyler vid eller nära deras fysiologiska koncentrationer. DNP kan och ger den känslighet som krävs för att detektera ett isotopiskt märkt protein vid endogena (~ 1 μM) koncentrationer i komplex biologisk miljö1. Eftersom det finns väletablerade protokoll för att introducera isotopiskt märkta molekyler i omärkta däggdjursceller utan att påverka deras livskraft, öppnar detta möjligheten att studera isotopiskt berikade biomolekyler på deras endogena nivåer i sin ursprungliga miljö. Dessutom, eftersom DNP-förbättringar är effektivare vid lägretemperaturer 2,3,4, överensstämmer de experimentella temperaturerna för DNP MAS NMR snyggt med de som krävs för långsiktig lagring av livskraftiga däggdjursceller5. Den konventionella metoden att överföra ett prov till en DNP MAS NMR-spektrometer utsätter den dock för temperaturfluktuationer som bryter däggdjursceller.
MAS NMR-experiment kräver att provet roteras om den magiska vinkeln vid frekvenser som är lika med eller större än storleken på anisotrop interaktionen för att det ska vara genomsnittligt till noll, vanligtvis minst 4 kHz och ofta myckethögre 6,7,8,9. Proverna är därför förpackade i rotorer som har en finnspets som används för att driva rotorns rotation genom en gasström och har ett märke i andra änden så att rotationsfrekvensen kan övervakas med en varvräknare. Provöverföring för de flesta MAS NMR-instrument sker genom att rotorn injiceras från instrumentets utsida i statorn i slutet av NMR-sonden med en ström av torr luft eller kvävegas. När rotorn når statorn, som håller rotorn i den magiska vinkeln, drivs provrotationen av en luftturbinmekanism. Separata strömmar av gasstöd, framdrita och kontrollera rotorns temperatur. Att föra in en rotor i NMR-spektrometern och uppnå stabil MAS-spinning kräver finbearbetade drivspetsar och noggrann kontroll av temperaturen och trycket hos de separata gasströmmarna. Trots dessa tekniska krav är införandet och uppnåendet av stabil MAS till stor del automatiserat för kommersiella MAS NMR-sonder för rumstemperaturapplikationer.
Situationen är dock mer komplicerad för applikationer med låg temperatur. Prover för applikationer med låg temperatur sätts vanligtvis in i spektrometern vid rumstemperatur och fryses i statorn. Under den första minuten sjunker provtemperaturen snabbt (> −100 °C/min) och systemtemperaturen kräver flera minuter för att balansera. På grund av samspelet mellan temperatur och tryck hanteras insättning och närmande av önskad MAS ofta manuellt för applikationer med låg temperatur. Trots kravet på manuell intervention är det fördelaktigt att frysa rotorn inuti instrumentet eftersom det minimerar införandet av vatten och kondens i sonden, vilket är avgörande för framgångsrik spinning. Kondens och isuppbyggnad från omgivande fuktblocksgasledningar, kondens eller frost på själva rotorn kan inte bara mekaniskt förhindra MAS. Prover för MAS NMR vid låg temperatur fryses således vanligtvis inuti instrumentet med hastigheter som överstiger -100 °C/min.
Däggdjursceller kan behålla sin integritet genom en frys-tina cykel om kylningen är långsam5,10,11,12, med en hastighet som är lika med eller långsammare än 1 °C/ min. Alternativt behåller cellerna också sin integritet om kylhastigheten är ultrasnabb13,14,15, med en hastighet snabbare än 104 °C/min. Priser mellan dessa två ytterligheter bristning och döda däggdjur celler på grund av att is kristall bildas både inuti och utanför cellerna, även i närvaro av cryoprotective agenter16. Provkylningshastigheterna för en rumstemperaturrotor inuti en förkyld sond faller mellan dessa två ytterligheter, vilket innebär att man studerar kryogeniskt bevarade intakta livskraftiga däggdjursceller, proverna måste frysas innan de överförs till instrumentet och överföras till instrumentet utan temperaturfluktuationer som kan skada provet eller ackumuleringen av frost på rotorn som kan förhindra att rotorn snurrar. Protokollet beskriver en metod för frostfri, förkyld rotor införande i ett kryogena MAS NMR system för studier av kryogeniskt bevarade intakt livskraftiga däggdjur cellprover. Cryogenic prov överföring beskrivs här utvecklades för NMR karakterisering av livskraftiga intakta celler. Det är dock tillämpligt på alla system där temperaturfluktuationer kan äventyra provintegriteten. Detta inkluderar alla olika komplexa system, såsom frys släckta reaktioner för kemisk och strukturell karakterisering av fångade reaktionsmediärer17,18,enzymologi19,20 eller proteinvikning21,22.
Protocol
1. Odling och kryoprotection av däggdjursceller
- Odling och skörd av däggdjursceller
- Tina upp en alikvot av frysta mänskliga embryonala njurceller (HEK 293).
- Kultur HEK 293 celler i tillväxtmedier (t.ex. DMEM med 10% fetala nötkreatursserum och 1% Pen-Strep) vid 37 °C med 5% CO2 i 100 mm plattor i två till tre passager (7-10 dagar).
- Dela cellerna och kulturen i en 150 mm platta tills cellerna uppnår 90-95% sammanflöde.
OBS: En 150 mm platta vid > 90% sammanflöde kommer att vara tillräcklig för att fylla två safirrotorer med en diameter på 3,2 mm. - Skörda celler med 4 ml trypsin (se Materialförteckning)och 10 ml media. Överför suspensionen till en steril konisk 15 ml och centrifugera vid 673 x g (1 000 varv/min) i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernaten.
- Tvätta cellpelleten med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2).
- Cryoprotection av celler
- Samla en 50 μL cellpellet i ett mikrocentrifugrör. Förbered en blandning av 50 μL PBS och 18 μL glycerol i ett separat rör.
- Blanda försiktigt 50 μL-cellpelleten med 68 μL glykol-PBS-blandning genom att tillsätta glykol-PBS-blandningen till toppen av pelleten och återanvänd pelleten genom att försiktigt knacka på sidan av röret tills inga klumpar återstår.
OBS: Skonsam pipetting kan också användas för att återanvända cellen, men se till att cellintegriteten inte äventyras.
2. Kryopreservation av däggdjursceller i en NMR-rotor
- Överföring av celler till en 3,2 mm safirrotor.
- För att göra en tratt, skär en 200 μL pipettspets och sätt in den smala änden av den skurna pipettspetsen i 3,2 mm rotorn.
- Överför cellerna till tratten som sitter på rotorn. Placera rotorn tillsammans med tratten i ett mikrocentrifugrör och pelleta cellerna i botten av rotorn genom centrifugering vid 673 x g i 2-3 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och eventuellt överflödigt prov från rotorn. Upprepa dessa två steg tills rotorn är helt packad med cellerna.
OBS: Bestäm eventuellt provet cellulära livskraft innan du fryser. Återanvänd 10 μL av överskottscellpelletsen i 100 μL FBS-fri DMEM. Blanda 10 μL av suspensionen med 0,4% trypanblå lösning och utvärdera omedelbart livskraften med hjälp av en automatiserad cellräknare. Använd endast FBS-fria medier för att späda ut celler eftersom serum stör trypanblå färgning. - Försegla rotorn med en silikonplugg med kommersiellt tillgängligt förpackningsverktyg.
- Stäng rotorn med en keramisk drivspets genom att trycka den vertikalt nedåt. Undvik att vidröra de känsliga fenorna på sidan av drivspetsen.
- Markera hälften av safirrotorns nederkant med en permanent silvermarkör och den andra halvan av rotorns nederkant med en svart permanent markör för att möjliggöra noggrann övervakning av rotorns spinn inuti spektrometern.
OBS: Brister i rotorns märkning förhindrar noggrann räkning av spinnfrekvensen, vilket resulterar i att stabil spinning inte lyckas. Eftersom markörer inte kommer att skriva på en frusen rotor och rotoruppvärmning äventyrar provintegriteten, är märkning av rotorn före frysning ett kritiskt steg.
- Cryopreservation av celler inuti en 3,2 mm safirrotor.
- Placera en kudde gjord av en bit vävnad eller pappershandduk under locket och längst ner på den kryogena injektionsflaskan (se Materialförteckning ).
OBS: Vävnadspapperet skyddar rotorns märkning från skador som uppstår vid stötar mot sidorna av kryogena injektionsflaska. - Placera 3,2 mm safirrotorn i den kryogena injektionsflaskan vadderad med vävnadspapperet med markerad ände vänd mot botten av den kryogena injektionsflaskan.
- Frys rotorn långsamt genom att placera den kryogena injektionsflaskan i kylbehållaren (-1 °C/min) och placera behållaren i -80 °C-frys i minst 3 timmar.
- Överför den kryogena injektionsflaskan som innehåller den frusna rotorn till vätskekvävelagring.
- Placera en kudde gjord av en bit vävnad eller pappershandduk under locket och längst ner på den kryogena injektionsflaskan (se Materialförteckning ).
3. Kryogen överföring av ett fruset prov till NMR-spektrometern
- Transportera det frysta provet till NMR-anläggningen.
- Överför den kryogena injektionsflaskan som innehåller den frusna rotorn till en liten dewar fylld med flytande kväve för transport till NMR-anläggningen.
- Överföring av frusen rotor till det flytande kvävebadet.
- Fyll en torr, termiskt isolerad bred munskum dewar med 500 ml – 1 L flytande kväve.
- Överför rotorn från den kryogena injektionsflaskan till den breda munskumdewar fylld med flytande kväve.
- Ta den kryogena injektionsflaskan från överföringsdewar i handen och håll den strax ovanför ytan av det flytande kvävet för att skydda den från atmosfären.
- Medan du håller den kryogena injektionsflaskan med munnen riktad något nedåt, skruva av locket och låt rotorn glida in i det flytande kvävebadet.
OBS: När locket har skruvats av måste rotorn falla från den kryogena injektionsflaskan till det flytande kvävebadet snabbt (under 1 sekund) för att förhindra kondens på rotorn. Avdunstning av flytande kväve bildar ett "kvävemoln" i det breda munskumdewaret och förhindrar kondens på rotorn innan det sänks ner i det flytande kvävet. Längre exponering av rotorn för luft kan leda till kondensering av fukt på rotorväggar som återkondenseras till is.
- Kryogen överföring av rotor till NMR provfångare.
- Prechill ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på 1,5 ml genom att dränka det i det flytande kvävebadet. Stäng inte röret.
OBS: Inspektera rotorn innan du överför den till mikrocentrifugröret. Håll rotorn precis under ytan av det flytande kvävet med pincett och kontrollera att rotormarkeringarna är intakta, att inga isavlagringar har bildats på väggarna och att drivspetsen är intakt. Iskristallavlagringar på rotorväggarna visas som vitt pulver. Var noga med att alltid hålla rotorn i kroppen och inte vid drivspetsen. Skrapa inte av markeringen från rotorn med pincettspetsarna. - Under ytan av det flytande kvävebadet, använd pincett för att överföra rotorn till mikrocentrifugröret med drivspetsen vänd mot botten av mikrocentrifugröret och markeringarna mot rörets öppning.
OBS: Torka alltid pincett innan du dränker i flytande kväve eller vidrör rotorn. - Håll röret som innehåller rotorn under flytande kväve i nacken med pincett.
- Med ett andra par pincett i handen, var beredd att nedsänka NMR-provfångaren i det flytande kvävebadet och håll det så att det lutar i en skarp vinkel med avseende på mikrocentrifugröret.
OBS: Minimera den tid som provfångaren kommer i kontakt med det flytande kvävet för att undvika att O-ringen fryses. Om O-ringen fryser blir det mycket svårt att föra in fångaren i spektrometern.
- Prechill ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på 1,5 ml genom att dränka det i det flytande kvävebadet. Stäng inte röret.
- Kryogen rotoröverföring från NMR-provfångaren till NMR-spektrometern
OBS: Detta steg kräver två personer, en för att använda kryocabinet och en för att överföra provet från det flytande kvävet till sonden.- Placera kryocabinetet i utmatningsläge genom att trycka på "EJECT" på skåpet.
OBS: Utmatningsläget rensar det torra och kalla kvävegasflödet vid högt tryck från sonden till atmosfären för att förhindra att atmosfärisk fukt kommer in. - Överför rotorn till NMR-provfångaren.
- För in nmr-provfångarens öppna ände i mikrocentrifugröret medan du fortfarande är under ytan av det flytande kvävet.
- Lyft upp både mikrocentrifugröret och NMR-provfångaren så att rotorn kan falla i provfångaren. Skaka NMR-provfångaren och mikrocentrifugröret om rotorn fastnar på provfångarens kant.
- Lämna det tomma mikrocentrifugröret ovanpå NMR-provfångaren för att skydda rotorn från luft.
- Ta bort den andra tomma NMR-provfångaren från sonden och lägg den på golvet.
- Överför NMR-provfångaren som innehåller rotorn till din fria hand, ta bort mikrocentrifugröret och sätt omedelbart in det i sonden.
OBS: Om O-ringen fryser blir det svårt att dra åt provfångaren. Fortsätt att använda våld tills den glider på plats. - Signalera till den person som använder kryocabinet att "STOPPA UTMATNING" och "INSERT".
OBS: Införingsläget leder rotorn från provfångaren in i sonden. - Snurra upp provet till önskad spinnhastighet (t.ex. 12 kHz) genom att justera lager- och drivflödestrycket som styrs av kryocabinet. (t.ex. Öka omedelbart lagergasen till ~200 mBar och drivgasen till 10 mBar. När provet har snurrat, öka lagergasen till 1000 mBar och drivgas till 200 mBar. När spinningen stabiliseras, öka lagret till 2400 mBar och öka sedan drivgasen från 200 mBar till 1700 mBar under flera minuter. VT kylgas är konstant vid ~1070 L/h.)
OBS: När du lyfter mikrocentrifugröret och NMR-provfångaren ur det flytande kvävebadet, se till att mikrocentrifugröret har tillräckligt med flytande kväve inuti det för att omge rotorn. Minimera tiden mellan överföringen av rotorn i NMR-provfångaren och för in NMR-provfångaren i spektrometern. Alla steg i 3.4 bör slutföras inom 30 s.
- Placera kryocabinetet i utmatningsläge genom att trycka på "EJECT" på skåpet.
4. Kryogent avlägsnande av provet från NMR-spektrometern
- Beredning av det flytande kvävebadet och den kryogena injektionsflaskan
- Häll 500 ml - 1 L flytande kväve i det breda munskumdewaret och placera badet under spektrometern.
- Förkyl den kryogena injektionsflaskan. Sänk ner den tomma kryogena injektionsflaskan som innehåller ett vävnadspapper i det flytande kvävebadet.
- Kryogen överföring av rotor från sond till kryogen injektionsflaska
- Minska spinnhastigheten till 0 kHz genom att rampa ner drivande och lagergasflödet och mata ut rotorn genom att växla till utmatningsläget.
- Håll utmatningsläget på, ta bort provfångaren från sonden, släpp rotorn direkt i den breda munskumdewar som innehåller flytande kväve.
- Använd förkylda pincett, överför rotorn till förkyld kryogen injektionsflaska under ytan av det flytande kvävet.
- Keps den kryogena flaskan. Förshilla det kryogena injektionsflaskan genom att doppa den i flytande kväve. Ta bort den kryogena injektionsflaskan som innehåller rotorn och flytande kväve från badet och kapa röret med förkhillat lock. Dra inte åt locket så att förångande kväve kan släppas ut på ett säkert sätt.
- Sänk ned den kryogena injektionsflaskan i flytande kväve. Provet kan överföras till långtidslagring av flytande kväve eller omedelbart packas upp för vidare analys.
5. Uppackning av rotor- och lönsamhetsmätningar
- Packa upp rotor och mäta livskraft
- Förvärmt serumfritt medium (DMEM) eller PBS till 37 °C.
- Ta bort rotorn från flytande kväve. Ta bort drivspetsen och silikonkontakten.
OBS: Safir är en utmärkt värmeledare. Undvik att vidröra rotorn med fingrarna eftersom värmeöverföring kan orsaka lokala frys-tina-händelser som äventyrar cellulär livskraft.
- Mäta livskraft
- Tillsätt 20 μL varmt medium till den frusna cellpelleten i rotor- och återanvändbara celler. Ta bort fjädringen med en pipett och blanda suspensionen med 100 μL media.
- Ta bort 10 μL cellfjädring och blanda med samma volym på 0,4% trypanblå lösning (v/v). Inkubera i rumstemperatur i 30 s till 1 min.
- Mät livskraften med hjälp av en automatiserad cellräknare.
Representative Results
Kryogen införing av förfrysta prover av däggdjursceller i NMR-spektrometern stöder livskraft under hela NMR-experimentet. Schemat för kryogen överföring av ett fruset prov till en förkyld NMR-sond visas i figur 1. Cellulär livskraft och intakthet kan bedömas med hjälp av en mängd olika metoder. Här använde vi ett standardfärgbaserat mått på membranintegritet, vilket stämmer bra överens med andra metoder23. Intakta celler är ogenomträngliga för trypanblått medan celler med nedsatt membranintegritet är genomsläppliga. Antalet trypanblå genomträngliga och ogenomträngliga celler kan snabbt bedömas med hjälp av en automatiserad cellräknare. Med hjälp av det protokoll som beskrivs här liknar trypanblå permeabilitet hos däggdjursceller efter MAS NMR (dvs. vid punkt 5.2.3) däggdjurscellernas trypanblå permeabilitet före någon temperaturförändring (dvs. punkt 2.1.3). Men om cellerna fryses långsamt, värms sedan upp till rumstemperatur före införing (dvs. enligt protokollet till punkt 3 innan rotorn värms upp till rumstemperatur innan den sätts in i den kylda sonden), minskar cellulär livskraft enligt trypanblått till mindre än 10 % av cellerna (figur 2). Således resulterar frysning av celler inuti spektrometern i förlusten av cellmembranintegritet medan kryogen införing av frysta prover av däggdjursceller stöder cellens livskraft under hela NMR-experimentet.
Figur 1: Schematisk kryogen överföring av ett fruset prov till en förkyld NMR-sond. a)Närma dig ytan på det flytande kvävet och skruva av toppen av den kryogena injektionsflaskan. B)Skjut rotorn i det flytande kvävebadet. C)Sänk ner ett mikrocentrifugrör med pincett och håll det på plats tills det svalnar helt. (D) Sätt in rotorn i mikrocentrifugen med drivspetsen vänd mot rörets botten. Tryck, snarare än ta tag, med pincetten. e)Håll mikrocentrifugröret precis under ytan på det flytande kvävebadet och inspektera rotorn visuellt för att säkerställa att den är frostfri och väl märkt. f)Håll provfångaren i en vinkel ovanför ytan. g)Lyft upp provfångaren och röret ur det flytande kvävet så snart provfångaren är inne i mikrocentrifugröret. H)Skaka provfångaren om rotorn fastnar på fälgen. (I) Ta bort den tomma provfångaren från sonden och lägg den på marken. (J) Ta bort mikrocentrifugröret från provfångaren med rotorn inuti, sätt i, dra åt provfångaren i sonden och tryck på "INSERT" på kontrollkonsolen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Kryogen införing av ett förfryst prov av däggdjursceller resulterar i mätningar av cellulär intakthet som liknar däggdjurscellsprover som aldrig har frysts. Andelen trypanblå ogenomträngliga celler för prover som aldrig har frysts (t.ex. steg 2.1.3) liknar andelen celler för prover efter MAS NMR (t.ex. steg 5.2.3 med 12 kHz MAS). Långsamma frusna celler (t.ex. steg 3) som värmdes upp till rumstemperatur innan de förs in i NMR-instrumentet som hade förkylts till 100 K hade mycket lägre procentandelar intakta celler efter MAS NMR med 12 kHz MAS. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Den kryogena överföringen av frysta prover till en NMR-spektrometer lyckas bevara livskraften hos frysta däggdjursceller genom NMR-datainsamlingen. Framgången för denna metod visas i mas NMR lönsamhetsmätningar före och efter MAS. Denna metod är framgångsrik och generaliserbar för alla system där temperaturfluktuationer kan äventyra provintegriteten. Det för närvarande presenterade protokollet utförs med HEK 293-cellinjen. Eftersom kryopreservationsförhållandena för många däggdjurscelllinjer är mycket lika, är det troligt att de tillstånd som rapporteras här kan översättas till andra cellulära system; De kan dock kräva ytterligare optimering av kryoprotekter, provvolymer och fryshastigheter för att uppnå samma resultat.
Denna metodik kan förbättras genom att uppacka rotorn snabbare efter NMR-experimentet. Det här steget är för närvarande suboptimalt och dess körning påverkar cellernas livskraft. Innan cellerna kan återanvändas i media måste drivspetsen och kiselkontakten tas bort från rotorn. Provet tinar ojämnt när rotorn hålls under borttagning av drivspetsen och silikonkontakten så kortare rotorhanteringstider resulterar i högre viabiliteter. Utvecklingen av rotorhållare eller andra verktyg för att underlätta enhetlig upptining och snabb borttagning av drivspetsen och silikonpluggen skulle bidra till att göra bedömningen efter NMR av livskraften mer exakt.
Metoden för kryogen provbelastning som beskrivs i denna artikel är begränsad till NMR-sonder som stöder provtagning och utmatning med sonden på plats i NMR-magnetens borrhål. Även om extern provinsättning och utmatning är standard för kommersiella DNP-system, har anpassade avsökningar inte alltid det här alternativet. Detta tillvägagångssätt för kryogen provbelastning kan också kräva viss modifiering för NMR-sonder byggda för att vara kompatibla med rotorer av olika storlek. Detta protokoll har optimerats för 3,2 mm rotorer och kan kräva modifiering om provfångarens ytterdiameter överstiger den inre diametern på ett mikrocentrifugrör (t.ex. steg 3.4.2).
Med tillämpning av DNP på MAS NMR är det nu möjligt att upptäcka proteiner och andra biomolekyler vid endogena fysiologiska koncentrationer24,25,26. Detta öppnar möjligheten att studera biomolekyler i sina inhemska miljöer. Upprätthållande av cellulär integritet och livskraft under hela experimentet är sannolikt avgörande för att koppla de experimentella resultaten av spektroskopin till biologiska fenomen. Okontrollerad frysning av prover som innehåller renade proteiner eller cellprover äventyrar vanligtvis inteprovkvaliteten 7,27, även om det finns vissa indikationer på att frysningshastigheten kan vara en viktig variabel även i renade system28. Prover av däggdjursceller måste dock frysas i kontrollerad hastighet om det är viktigt för tolkningen att bevara cellulär intakthet och livskraft. Här presenterar vi ett protokoll för frysning och överföring av frysta prover av däggdjursceller till ett förkylt DNP MAS NMR-instrument som undviker potentiellt skadliga temperaturfluktuationer och stöder mätning på livskraftiga celler.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], National Science Foundation [1751174]; De nationella hälsoinstituten [NS-111236], Welch Foundation [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Foundation, Ted Nash Long Life Foundation och Kinship Foundation (Searle Scholars Program) till K.K.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
| 100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
| 3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
| 45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
| Black and Silver marker | Sharpie | ||
| Cap removal tool | Bruker | HZ16913 | |
| Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
| Ceramic cap | Cortecnet | HZ12372 | |
| CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
| d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
| Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| DNP NMR system with frequency-matched gyrotron | Bruker | ||
| Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
| Kimwipes | Kimwipes | ||
| Packing tool | Bruker | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
| Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Silicon plug | Bruker | B7089 | |
| Standard Vessel forceps | |||
| Tryp-L | Gibco | 12605010 |
References
- Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
- Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
- Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
- Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
- Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
- Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
- Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
- Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
- Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
- Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
- Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
- Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
- Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).
- Pegg, D. E.
- Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
- Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).
- Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
- Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
- Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
- Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
- Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D.
- Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
- Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
- Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
- Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
- Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).
