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Cancer Research

सेल और ऊतक नमूने से मानव स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और कार्यात्मक मूल्यांकन

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्तन कैंसर कोशिका और ऊतक के नमूनों के साथ-साथ इन विट्रो और विवो परख से बीसीएससी के अलगाव का वर्णन करता है जिसका उपयोग बीसीएससी फेनोटाइप और फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

स्तन कैंसर स्टेम सेल (बीसीएससी) विरासत में मिली या अधिग्रहित स्टेम सेल जैसी विशेषताओं के साथ कैंसर कोशिकाएं हैं। उनकी कम आवृत्ति के बावजूद, वे स्तन कैंसर की शुरुआत, रिलैप्स, मेटास्टेसिस और थेरेपी प्रतिरोध में प्रमुख योगदानकर्ता हैं। स्तन कैंसर के इलाज के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझना अनिवार्य है। स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं को सीडी 44, सीडी 24 जैसे अद्वितीय सेल सतह मार्करों और एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच) की एंजाइमेटिक गतिविधि की अभिव्यक्ति के आधार पर अलग और विशेषता दी जाती है। ये एएलडीएचउच्चसीडी 44 + सीडी 24- कोशिकाएं बीसीएससी आबादी का गठन करती हैं और डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक अध्ययन के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा अलग की जा सकती हैं। वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर, बीसीएससी की कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन करने के लिए विभिन्न इन विट्रो और विवो विधियों का उपयोग किया जा सकता है। यहां, हम स्तन कैंसर कोशिकाओं की विषम आबादी के साथ-साथ स्तन कैंसर के रोगियों से प्राप्त प्राथमिक ट्यूमर ऊतक दोनों से मानव बीसीएससी के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हम डाउनस्ट्रीम इन विट्रो और विवो कार्यात्मक परखों पर प्रकाश डालते हैं, जिसमें कॉलोनी बनाने वाले परख, मैमोस्फीयर परख, 3 डी कल्चर मॉडल और ट्यूमर जेनोग्राफ्ट परख शामिल हैं जिनका उपयोग बीसीएससी फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मानव स्तन कैंसर स्टेम सेल (बीसीएससी) के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना स्तन कैंसर के उपचार में आने वाली चुनौतियों को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। बीसीएससी अवधारणा का उद्भव 21वीं शताब्दी की शुरुआत में हुआ, जहां सीडी 44 + सीडी 24- / कम स्तन कैंसर कोशिकाओं की एक छोटी आबादी चूहों 1,2 में हेटरोजेनस ट्यूमर पैदा करने में सक्षम पाई गई। इसके बाद, यह देखा गया कि एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच उच्च) कीउच्च एंजाइमेटिक गतिविधि के साथ मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं ने भी इसी तरह के स्टेम सेलजैसे गुण प्रदर्शित किए। ये बीसीएससी कोशिकाओं की एक छोटी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं जो आत्म-नवीकरण और भेदभाव में सक्षम हैं, जो थोक ट्यूमर 1,2,3 की विषम प्रकृति में योगदान देते हैं। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि विकासवादी रूप से संरक्षित सिग्नलिंग मार्गों में परिवर्तन बीसीएससी अस्तित्व और रखरखाव को चलाते हैं 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . इसके अलावा, सेल बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट को विभिन्न बीसीएससी कार्यों15,16,17 को निर्देशित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। ये आणविक मार्ग और बीसीएससी फ़ंक्शन को विनियमित करने वाले बाहरी कारक स्तन कैंसर रिलैप्स, मेटास्टेसिस18 और उपचारों के प्रतिरोध के विकास में योगदान करते हैं19,20,21, जिसमें बीसीएससी का अवशिष्ट अस्तित्व उपचार के बाद स्तन कैंसर रोगियों के समग्र अस्तित्व के लिए एक बड़ी चुनौती पेश करता है। . इसलिए इन कारकों का पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन बीसीएससी-लक्ष्यीकरण उपचारों की पहचान करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है जो बेहतर उपचार परिणामों को प्राप्त करने और स्तन कैंसर के रोगियों में बेहतर समग्र अस्तित्व के लिए फायदेमंद हो सकते हैं।

कई इन विट्रो मानव स्तन कैंसर सेल लाइन मॉडल और विवो मानव जेनोग्राफ्ट मॉडल का उपयोग बीसीएससी24,25,26,27,28,29 को चिह्नित करने के लिए किया गया है। प्रत्येक क्रमिक मार्ग के बाद सेल लाइनों की लगातार पुन: आबादी की क्षमता इन्हें ओमिक्स-आधारित और फार्माकोजेनोमिक अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाती है। हालांकि, सेल लाइनें अक्सर रोगी के नमूनों में देखी गई विषमता को पुन: परिभाषित करने में विफल रहती हैं। इसलिए, रोगी-व्युत्पन्न नमूनों के साथ सेल लाइन डेटा को पूरक करना महत्वपूर्ण है। BCSCs के विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए BCSCs का उनके शुद्धतम रूप में अलगाव महत्वपूर्ण है। इस शुद्धता को प्राप्त करना BCSCs के लिए विशिष्ट फेनोटाइपिक मार्करों के चयन पर निर्भर करता है। वर्तमान में, ALDHउच्चCD44 + CD24- सेल फेनोटाइप का उपयोग आमतौर परअधिकतम शुद्धता के लिए फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके थोक स्तन कैंसर सेल आबादी से मानव BCSCs को अलग करने और अलग करने के लिए किया जाता है। 3,26. इसके अलावा, पृथक बीसीएससी के गुणों जैसे स्व-नवीकरण, प्रसार और भेदभाव का मूल्यांकन इन विट्रो और विवो तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है।

उदाहरण के लिए, इन विट्रो कॉलोनी बनाने वाले परख का उपयोग विभिन्न उपचार स्थितियों की उपस्थिति में 50 कोशिकाओं या उससे अधिक की कॉलोनी बनाने के लिए एक एकल कोशिका की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकताहै। मैमोस्फीयर परख का उपयोग एंकरेज-स्वतंत्र स्थितियों के तहत स्तन कैंसर कोशिकाओं की आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। यह परख सीरम-मुक्त गैर-अनुयायी संस्कृति स्थितियों में प्रत्येक क्रमिक मार्ग पर गोले (बीसीएससी और गैर-बीसीएससी के मिश्रण) के रूप में उत्पन्न करने और बढ़ने के लिए एकल कोशिकाओं की क्षमता को मापताहै। इसके अतिरिक्त, 3-आयामी (3 डी) संस्कृति मॉडल का उपयोग बीसीएससी फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन शामिल हैं जो विवो माइक्रोएन्वायरमेंट में बारीकी से पुन: उत्पन्न करते हैं और संभावित बीसीएससी-लक्षितउपचारों की गतिविधि की जांच की अनुमति देते हैं। इन विट्रो मॉडल के विविध अनुप्रयोगों के बावजूद, केवल इन विट्रो परखों का उपयोग करके विवो स्थितियों की जटिलता को मॉडल करना मुश्किल है। विवो में बीसीएससी व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए माउस जेनोग्राफ्ट मॉडल के उपयोग से इस चुनौती को दूर किया जा सकता है। विशेष रूप से, ऐसे मॉडल स्तन कैंसर मेटास्टेसिस33 का आकलन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली के रूप में काम करते हैं, विवो इमेजिंग35 में रोग की प्रगति34 के दौरान माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ बातचीत की जांच करते हैं, और रोगी-विशिष्ट विषाक्तता और एंटीट्यूमरएजेंटों की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करते हैं।

यह प्रोटोकॉल हेटरोजेनस स्तन कैंसर कोशिकाओं की थोक आबादी से अधिकतम शुद्धता पर मानव एएलडीएचउच्चसीडी 44 + सीडी 24- बीसीएससी के अलगाव के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है। हम तीन इन विट्रो तकनीकों (कॉलोनी बनाने की परख, मैमोस्फीयर परख और 3 डी संस्कृति मॉडल) और एक इनविवो ट्यूमर जेनोग्राफ्ट परख का विस्तृत विवरण भी प्रदान करते हैं जिसका उपयोग बीसीएससी के विभिन्न कार्यों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। ये विधियां बीसीएससी जीव विज्ञान को समझने और / या नए बीसीएससी-लक्ष्यीकरण उपचारों की जांच के प्रयोजनों के लिए मानव स्तन कैंसर सेल लाइनों या प्राथमिक-रोगी व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिकाओं और ट्यूमर ऊतक से बीसीएससी को अलग करने और चिह्नित करने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं द्वारा उपयोग के लिए उपयुक्त होंगी।

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Protocol

सहमति से स्तन कैंसर के रोगियों से सीधे रोगी-व्युत्पन्न सर्जिकल या बायोप्सी नमूनों का संग्रह संस्थागत नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित अनुमोदित मानव नैतिकता प्रोटोकॉल के तहत किया गया था। रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी चूहों को बनाए रखा गया और एक संस्थान द्वारा अनुमोदित पशु सुविधा में रखा गया। चूहों का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल से ट्यूमर ऊतक संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित अनुमोदित नैतिकता प्रोटोकॉल के अनुसार उत्पन्न किए गए थे।

1. सेल लाइनों की तैयारी

  1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों के तहत सभी सेल संस्कृति और धुंधला प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें। बाँझ सेल कल्चर व्यंजन / फ्लास्क और अभिकर्मकों का उपयोग करें।
  2. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और प्रत्येक सेल लाइन के लिए विशिष्ट आवश्यक विकास कारकों के साथ पूरक परिभाषित मीडिया में 5% सीओ2 के साथ मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  3. 10% एफबीएस के साथ पूरक डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर माउस एनआईएच 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट सेल कल्चर (कॉलोनी बनाने में उपयोग के लिए) बनाए रखें।
  4. सभी संस्कृतियों के लिए, हर 2-3 दिनों में पुराने मीडिया को ताजा मीडिया के साथ फिर से भरें। एक बार जब संस्कृतियां 75-80% सामंजस्य तक पहुंच जाती हैं, तो उपसंस्कृति कई बाँझ सेल कल्चर फ्लास्क में बदल जाती है।

2. स्तन कैंसर ट्यूमर ऊतक की तैयारी

  1. संस्थागत नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित मानव नैतिकता प्रोटोकॉल के तहत सहमति वाले स्तन कैंसर के रोगियों से सीधे रोगी-व्युत्पन्न सर्जिकल या बायोप्सी नमूने एकत्र करें।
  2. इसके बाद, संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित पशु नैतिकता प्रोटोकॉल के तहत चूहों का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल से ट्यूमर ऊतक एकत्र और उत्पन्न करें।
  3. बाँझ परिस्थितियों में सभी ट्यूमर ऊतकों को 50 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें 30 एमएल डीएमईएम: एफ 12 मीडिया होता है, बर्फ पर रखें, और संग्रह के 2 घंटे के भीतर नीचे वर्णित नमूनों को संसाधित करें।

3. स्तन कैंसर कोशिकाओं के एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी

  1. फ्लास्क से एस्पिरेटेड मीडिया जिसमें स्तन कैंसर कोशिकाओं का एक मोनोलेयर होता है जो 60-80% कंफ्लुएंट (पसंद की सेल लाइनें) होता है। कोशिकाओं को 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धोएं। एस्पिरेटेड पीबीएस और उपयुक्त सेल पृथक्करण समाधान जोड़ें (उदाहरण के लिए, ट्रिप्सिन: ईडीटीए; कोशिकाओं के मोनोलेयर को कवर करने के लिए पर्याप्त) और कमरे के तापमान (अनुशंसित) या 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. सेल पृथक्करण समाधान की गतिविधि को बेअसर करने के लिए कल्चर मीडिया के 5 एमएल जोड़ें।
  3. परिणामी विघटित सेल समाधान को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सुपरनैटेंट को छोड़ दें और सेल पेलेट को 1x PBS के 5 एमएल में पुन: निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: हेमोसाइटोमीटर में सेल क्लंपिंग के लिए निरीक्षण करें। यदि एकल सेल निलंबन नहीं बना है तो सेल पृथक्करण चरण दोहराएं।
  5. सेल गिनती के बाद, 5 मिनट के लिए 1000 x g पर सेल निलंबन को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर एएलडीएच सब्सट्रेट बफर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।

4. ऊतक के नमूनों से एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी

  1. आकार में लगभग 1 मिमी के छोटे टुकड़े प्राप्त करने के लिए क्रिसक्रॉस तकनीक का उपयोग करके सर्जिकल ब्लेड के साथ ट्यूमर ऊतक कीमा करें। ऊतक के टुकड़ों को एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल पृथक्करण बफर (डीएमईएम: एफ 12 में 1 एक्स कोलेजनेज) होता है। शंक्वाकार ट्यूब को पैराफिल्म के साथ सील करें और 40 मिनट के लिए शेकर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि एक शेकर इनक्यूबेटर नहीं है, तो ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें और हर 5-10 मिनट में भंवर करके ट्यूब को मिलाएं।
  2. 5 मिनट के लिए 530 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करके पचे हुए ऊतक को गोली मार दें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और 5 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें। पैलेट को बाधित करने के लिए 1 एमएल पिपेट (750 μL निशान पर सेट) का उपयोग करके पिपेट को ऊपर और नीचे करें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, एकल कोशिकाओं को छोड़ने के लिए जोर से ऊपर और नीचे करें।
  3. ट्यूब में कुल मात्रा को डीएमईएम: एफ 12 मीडिया के साथ 25 एमएल तक बढ़ाएं और 5 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और पेलेट को डिस्पेज़-डीनेस समाधान के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
  4. ट्यूब में कुल मात्रा को पीबीएस के साथ 10 एमएल तक बढ़ाएं। ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, परिणामस्वरूप सेल निलंबन को एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से जुड़े 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से पारित करें। 5 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  5. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और सेल पेलेट को 1x PBS के 5 mL में पुन: निलंबित करें। चरण 3.4 और 3.5 में वर्णित कोशिकाओं की गणना करें और सेल निलंबन की पूरी तैयारी करें।

5. स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं (बीसीएससी) का अलगाव

  1. बिना दाग वाले नियंत्रण के लिए लेबल प्रवाह ट्यूब, एकल सेल धुंधला नियंत्रण (डीईएबी नियंत्रण, एएलडीएच, सीडी 44-पीई, सीडी 24-पीई 7, 7एएएडी), नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब (डीईएबी, सीडी 44-पीई, सीडी 24-पीई 7 और 7 एएडी से सना हुआ), फ्लोरोसेंट माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण और 'सॉर्ट' ट्यूब (एएलडीएच, सीडी 44, सीडी 24 और 7एडी से सना हुआ)।
  2. चरण 3.5 या चरण 4.5 से सेल सस्पेंशन के 500 μL (0.5 x 106 कोशिकाओं) को प्रत्येक ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसे केवल लेबल किए गए सेल, CD44, CD24 और 7AAD कहा जाता है। उपयोग होने तक ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  3. नमूना के 2 एमएल (2 x 106 कोशिकाओं) को संबंधित 'एएलडीएच' ट्यूब में स्थानांतरित करें। 'डीईएबी नियंत्रण' और 'नकारात्मक नियंत्रण' ट्यूबों में डीईएबी के 5 μL जोड़ें और इसे कसकर कैप करें। 'एएलडीएच' ट्यूब में 10 μL ALDH सब्सट्रेट जोड़ें, भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और तुरंत संबंधित 'DEAB नियंत्रण' और 'नकारात्मक नियंत्रण' ट्यूब में 500 μL स्थानांतरित करें। 'डीईएबी नियंत्रण', 'नकारात्मक नियंत्रण' और 'एएलडीएच ट्यूबों' को पुन: व्यवस्थित करें और 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (60 मिनट से अधिक न हों)।
    नोट: इष्टतम इनक्यूबेशन समय को सेल लाइन के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हमेशा एएलडीएच सब्सट्रेट और दाग वाली कोशिकाओं वाले ट्यूबों को प्रकाश से बचाएं।
  4. इनक्यूबेशन बाद, सेंट्रीफ्यूज सभी नमूने 5 मिनट के लिए 250 x g पर । एएलडीएच सब्सट्रेट बफर के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। एंटी-सीडी 44-पीई और एंटी-सीडी 24-पीई-साइ 7 एंटीबॉडी कॉकटेल के निर्माता-अनुशंसित या उपयोगकर्ता-अनुकूलित एकाग्रता जोड़ें और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। संबंधित 'सीडी 44' और 'सीडी 24' लेबल वाले ट्यूबों में एंटी-सीडी 44-पीई और एंटी-सीडी 24-पीई-साइ 7 एंटीबॉडी जोड़ें।
  5. इनक्यूबेशन बाद, सेंट्रीफ्यूज सभी नमूने 5 मिनट के लिए 250 x g पर। एएलडीएच सब्सट्रेट बफर के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। बर्फ पर 10 मिनट के लिए 7AAD (सुझाई गई एकाग्रता: 0.25 μg/1 x 106 कोशिकाओं) के साथ 'नकारात्मक नियंत्रण' ट्यूब, 'सॉर्ट ट्यूब' और '7ADD' ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    नोट: एएलडीएच गतिविधि हरे फ्लोरोसेंट चैनल में पाई जाती है, इसलिए एक अलग संगत उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ एक फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाना चाहिए। जहां मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री के दौरान वर्णक्रमीय ओवरलैप देखा जाता है, एकल रंग नियंत्रण और एफएमओ नियंत्रण का उपयोग अन्य चैनलों में फ्लोरोसेंट सिग्नल के फैलाव को कम करने के लिए फ्लोरोक्रोम के बीच मुआवजे की अनुमति देने के लिए एक गाइड के रूप में किया जाना चाहिए।
  6. नमूना विश्लेषण की तैयारी में FACS उपकरण पर विश्लेषण प्रोटोकॉल सेट करें। स्कैटर प्लॉट बनाएं (फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर, फॉरवर्ड स्कैटर बनाम फ्लोरोसेंट चैनल)।
  7. बिना दाग वाले नियंत्रण का उपयोग करके, पूरे सेल आबादी से मलबे को अलग करने के लिए फोटोमल्टीप्लायर को समायोजित करें और पहले लॉग स्केल (101) के आसपास पूरी सेल आबादी को स्थानांतरित करने के लिए फ्लोरोसेंट वोल्टेज को समायोजित करें। डीईएबी नियंत्रण का उपयोग करके, हरे फ्लोरोसेंट वोल्टेज चैनल को समायोजित करके पूरे सेल आबादी को दूसरे लॉग स्केल (102) के भीतर स्थानांतरित करें।
  8. पहले सभी एकल धुंधला नियंत्रणों (एएलडीएच, सीडी 44-पीई, सीडी 24-पीई-साइ 7) और 7एएएडी और एफएमओ नियंत्रण का विश्लेषण करें, वोल्टेज को बिना दाग वाली कोशिकाओं से अलग करने के लिए समायोजित करें और अन्य चैनलों में फ्लोरोसेंट संकेतों के फैलाव को कम करें।
  9. प्रत्येक एकल दाग वाले सेल नमूने के लिए सकारात्मक आबादी पर गेट। नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब का उपयोग करते हुए, व्यवहार्यता के लिए गेट (7एएडी नकारात्मक), एएलडीएचकम और एएलडीएचउच्च सेल आबादी ( चित्रा 1 बी में दिखाए गए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति)।
  10. व्यवहार्य ALDHनिम्न और ALDHउच्च द्वारों का उपयोग करते हुए, क्रमशः CD44+ CD24- (BCSC) और CD44-CD24+ (गैर-BCSC) सेल आबादी का चयन करें (चित्र 1B)।
  11. बाँझ संग्रह ट्यूबों में संग्रह मीडिया में व्यवहार्य बीसीएससी और गैर-बीसीएससी एकत्र करें ( चित्रा 2ए एंड बी में दिखाए गए दो प्रतिनिधि सेल लाइनों से आबादी)। नीचे वर्णित अनुसार डाउनस्ट्रीम इन विट्रो और विवो परख में क्रमबद्ध कोशिकाओं का उपयोग करें।
    नोट: इन विट्रो और नीचे वर्णित विवो परखों के अलावा, बीसीएससी को मानक इम्यूनोब्लोटिंग तकनीकों के माध्यम से एसओएक्स 2, ओसीटी 4 और एनएएनओजी जैसे प्लुरिपोटेंट मार्करों की अभिव्यक्ति को मापकर मान्य किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्तन कैंसर सेल लाइनों और ऊतक के नमूनों से बीसीएससी के अलगाव के लिए एफएसीएस गेटिंग रणनीति। (ए) बीसीएससी अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करने वाला फ्लोचार्ट। (बी) प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट जो व्यवहार्य बीसीएससी और गैर-बीसीएससी को कोशिकाओं के एक विषम पूल से अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रकार की रणनीति को दर्शाते हैं। एमडीए-एमबी -231 मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं को समवर्ती रूप से 7-एएडी, सीडी 44-एपीसी, सीडी 24-पीई और एएलडीएच सब्सट्रेट के साथ लेबल किया जाता है। सेल उपसमुच्चय को एफएसीएस मशीन पर चार-रंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किया गया था। कोशिकाओं को अपेक्षित प्रकाश फैलाव के आधार पर चुना जाता है, फिर सिंगल्स के लिए, और व्यवहार्यता 7-एएडी बहिष्करण के आधार पर। कोशिकाओं को तब एएलडीएच गतिविधि के लिए विश्लेषण किया जाता है और शीर्ष 20% सबसे सकारात्मक को एएलडीएचउच्च आबादी के रूप में चुना जाता है, जबकि सबसे कम एएलडीएच गतिविधि वाले निचले 20% कोशिकाओं को एएलडीएचकम माना जाता था। अंत में, एएलडीएचकम कोशिकाओं के 50% को सीडी 44कम / -सीडी 24 + फेनोटाइप के आधार पर चुना जाता है, और 50% एएलडीएचउच्च कोशिकाओं को सीडी 44 + सीडी 24- फेनोटाइप के आधार पर चुना जाता है । इस आंकड़े को चू एट अल.17 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बीसीएससी अनुपात विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों में परिवर्तनशील हैं। (ए) एसयूएम 159 और (बी) एमडीए-एमडी -468 ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर सेल लाइनों में बीसीएससी और गैर-बीसीएससी के अंतर अनुपात को दर्शाने वाली प्रतिनिधि छवि जैसा कि चित्र 1 में वर्णित लेबलिंग और सॉर्टिंग के बाद है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. कॉलोनी बनाने की परख

  1. पूर्ण मीडिया में रुचि की कोशिकाओं (चरण 5.11 से क्रमबद्ध कोशिकाएं या चरण 3.5 या 4.5 से मिश्रित कोशिकाएं) को पुन: निलंबित करें।
  2. 1 x 102, 2 x 10 2 और 5 x 102 कोशिकाओं के लिए तीन प्रवाहट्यूबों को लेबल करें। पूर्ण मीडिया के 2 एमएल जोड़ें और संबंधित ट्यूबों में उपयुक्त सेल नंबर (चरण 5.11 से क्रमबद्ध या चरण 3.5 या 4.5 से मिश्रित कोशिकाओं) को स्थानांतरित करें। सेल समाधानों को 5 बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में प्लेट करें और कोशिकाओं के समान वितरण प्राप्त करने के लिए प्लेटों को धीरे-धीरे घुमाकर सेल निलंबन वितरित करें।
  4. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें जब तक कि कॉलोनियां दिखाई न दें (जहां कॉलोनियां = ≥50 कोशिकाएं प्रति कॉलोनी)। कॉलोनी गठन को परेशान किए बिना सप्ताह में दो बार मीडिया को सावधानीपूर्वक फिर से भरें।
  5. एस्पिरेट मीडिया और 1 एमएल पीबीएस के साथ एक बार धो लें। प्रत्येक कुएं में 0.05% क्रिस्टल बैंगनी घोल का 0.5 एमएल जोड़ें और प्लेट को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अतिरिक्त क्रिस्टल बैंगनी दाग को 2 एमएल पानी से धोकर हटा दें। वॉशिंग स्टेप को तब तक दोहराएं जब तक कि पृष्ठभूमि धुंधलापन दूर न हो जाए।
  6. 4x और 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, उत्पन्न कॉलोनियों की कुल संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें ( चित्रा 3 ए में दिखाए गए प्रतिनिधि चित्र)।
  7. कॉलोनी निर्माण की आवृत्ति की गणना निम्नानुसार करें: आवृत्ति (%) = (गठित कॉलोनियों का # / बीजित कोशिकाओं की संख्या) x 100। उदाहरण के लिए, यदि 1 x 10 2 कोशिकाओं से25 उपनिवेश उत्पन्न होते हैं, तो कॉलोनी गठन की आवृत्ति क्या है, आवृत्ति = (25/100) x100 = 25%।
  8. वैकल्पिक रूप से, चरण 6.1 से 6.4 को फाइब्रोब्लास्ट के साथ सह-संस्कृति से जुड़ी एक वैकल्पिक विधि के साथ बदलें, जो आवश्यक विकास और उत्तरजीविता कारकों के उत्पादन के माध्यम से बीसीएससी के लिए एक सूक्ष्म पर्यावरणीय समर्थन प्रदान करते हैं।
  9. प्री-कोट सेल 60 मिमी कल्चर व्यंजन टाइप 1 गोजातीय कोलेजन (3 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन के 30 कमजोर पड़ने में 1)। कोलेजन को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए पॉलीमराइज करने की अनुमति दें। अपोलीमराइज्ड कोलेजन को एस्पिरेट करें और प्लेट को 1x PBS के साथ दो बार धोएं। कोलेजन-लेपित प्लेट को 1 एमएल पीबीएस के साथ कवर करें और उपयोग होने तक इसे कमरे के तापमान पर अलग रखें।
  10. 1 x 10 3, 5 x 103 और 1 x 10 4 कोशिकाओं के लिए तीन प्रवाहट्यूबों को लेबल करें। 4 एमएल कॉलोनी बनाने वाले परख मीडिया जोड़ें और संबंधित ट्यूबों में उचित संख्या में कोशिकाओं (चरण 5.11 से क्रमबद्ध या चरण 3.5 या 4.5 से मिश्रित कोशिकाओं) को स्थानांतरित करें। विकिरणित माउस एनआईएच 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट (4 x 104 कोशिकाएं / एमएल मीडिया) जोड़ें। सेल समाधानों को 5 बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  11. चरण 6.1 से कोलेजन-लेपित संस्कृति डिश से पीबीएस को एस्पिरेट करें और चरण 6.3 में वर्णित प्रत्येक सेल कल्चर प्लेटों पर सेल मिश्रण को प्लेट करें।
  12. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और उन्हें 7-10 दिनों के लिए या जब तक उपनिवेश नहीं बन जाते, मीडिया को फिर से भरने के बिना छोड़ दें। चरण 6.6 और 6.7 में वर्णित के रूप में उत्पन्न कॉलोनियों की कुल संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें।

7. मैमोस्फीयर परख

  1. 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट सेल कल्चर प्लेट में 5 x 10 2 कोशिकाओं/सेमी 2 क्षेत्र के सीडिंग घनत्व पर पूर्ण मैमोस्फीयर मीडिया और प्लेट कोशिकाओं में रुचि की कोशिकाओं (चरण 5.11 से क्रमबद्ध कोशिकाएं या चरण 3.5 या 4.5 से मिश्रित कोशिकाएं) को पुन: निलंबित करें।
    नोट: सेल सीडिंग घनत्व को विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5-10 दिनों के लिए कल्चर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। मैमोस्फीयर गठन को परेशान किए बिना सप्ताह में दो बार मीडिया को सावधानीपूर्वक फिर से भरें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में उत्पन्न मैमोस्फीयर की संख्या की गणना करें; जहां मैमोस्फीयर को व्यास में 100 μm से अधिक स्तन कैंसर सेल क्लस्टर के रूप में परिभाषित किया गया है ( चित्र 3 बी में दिखाए गए प्रतिनिधि चित्र)।
  4. मैमोस्फीयर गठन दक्षता (MFE) की गणना निम्नानुसार करें: MFE (%) = (प्रति कुएं मैमोस्फीयर की संख्या)/ (प्रति कुएं बीजित कोशिकाओं की संख्या) x 100 (यानी, यदि किसी कुएं में 1 x 102 कोशिकाओं द्वारा 5 मैमोस्फीयर उत्पन्न होते हैं, तो MFE = (5/100) x 100 = 5%)।
  5. उपसंस्कृति मैमोस्फीयर के लिए, मैमोस्फीयर सामग्री वाले मीडिया को सावधानीपूर्वक 5 मिनट के लिए 1000 x g पर एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज मीडिया में स्थानांतरित करें। सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें, सेल पेलेट को 500 μL ट्रिप्सिन में पुन: निलंबित करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और गोली को पूर्ण मैमोस्फीयर मीडिया के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और चरण 7.1 में वर्णित अल्ट्रा-लो अटैचमेंट सेल कल्चर प्लेट में कोशिकाओं को फिर से प्लेट करें।
    नोट: उप-संवर्धन के अलावा, मैमोस्फीयर-व्युत्पन्न कोशिकाओं को बीसीएससी फेनोटाइप का आकलन करने और / या अन्य डाउनस्ट्रीम परखों के लिए बीसीएससी की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए एफएसीएस द्वारा आगे विश्लेषण भी किया जा सकता है।
  7. अपनी सेल आबादी के भीतर निहित मैमोस्फीयर-शुरू करने वाली कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, एक वैकल्पिक विधि का उपयोग करें जिसमें क्षेत्र सीमित कमजोर पड़ने का विश्लेषण (एसएलडीए) शामिल है। 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट सेल कल्चर प्लेट में उच्च से निम्न सेल संख्या के सीरियल कमजोर पड़ने में प्लेट कोशिकाएं, जिसमें उच्चतम कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप प्रति कुएं एक से कम सेल होता है।
  8. कल्चर प्लेट को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10-14 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें और सेल एकत्रीकरण से बचने के लिए उन्हें अबाधित छोड़ दें।
  9. इनक्यूबेशन के बाद, माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में उत्पन्न मैमोस्फीयर की संख्या की गणना करें; जहां मैमोस्फीयर को 100 μm व्यास से अधिक स्तन कैंसर सेल क्लस्टर के रूप में परिभाषित किया गया है। एक्सट्रीम लिमिटिंग डाइल्यूशन एनालिसिस (ईएलडीए) ऑनलाइन सॉफ्टवेयर (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) का उपयोग करके क्षेत्र-पहल आवृत्ति और महत्व की गणना करें।

8.3D संस्कृति मॉडल

  1. प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, विकास कारकों (कम) के साथ या बिना बेसमेंट झिल्ली निकालने (बीएमई) का उपयोग करें। कैंसर कोशिकाओं पर व्यक्तिगत विकास कारक के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विकास कारक का उपयोग करने से बीएमई कम हो गया। यह बीएमई में मौजूद अंतर्जात विकास कारकों के गैर-विशिष्ट प्रभावों को कम करने में भी मदद करता है।
    नोट: बीएमई 10 डिग्री सेल्सियस से ऊपर जम जाता है। पिघलने के चरण के दौरान भी हमेशा बर्फ पर बीएमई रखें।
  2. हवा के बुलबुले बनाए बिना 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 50 μL BME को सावधानीपूर्वक जोड़ें और इसे 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीमराइज़ करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, जेल परत के सूखने से बचने के लिए 100 μL पीबीएस जोड़ें।
  3. चरण 5.11 से क्रमबद्ध कोशिकाओं या चरण 3.5 या 4.5 से मिश्रित कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति मीडिया में 5 x 103 से 5 x 104/200 μL की एकाग्रता पर पुन: निलंबित करें।
  4. एक बार जब बीएमई पॉलीमराइज्ड हो जाता है, तो पीबीएस को हटा दें, प्रत्येक कुएं में 200 μL सेल सस्पेंशन जोड़ें और 5%CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। मीडिया के वाष्पीकरण से बचने के लिए आसपास के कुओं में पीबीएस जोड़ें।
    नोट: प्रयोग की स्थापना से पहले चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की इष्टतम संख्या निर्धारित की जानी चाहिए। प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, बीसीएससी को अकेले या अन्य कोशिकाओं के प्रकारों (फाइब्रोब्लास्ट / एंडोथेलियल / प्रतिरक्षा कोशिकाओं आदि) के साथ सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  5. संस्कृति प्लेटों में साप्ताहिक रूप से दो बार ताजा मीडिया जोड़ें। ऑर्गेनोइड्स के गठन का विश्लेषण करने से पहले 10-14 दिनों के लिए संस्कृतियों को बनाए रखें ( चित्रा 3 सी में दिखाए गए प्रतिनिधि चित्र)।
  6. उप-संवर्धन के लिए, सावधानीपूर्वक मीडिया को उत्तेजित करें और प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं में 200 μL डिस्पेज़ जोड़ें। प्लेट को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि (30 मिनट) के आधे रास्ते में, प्लेट को बाहर निकालें, धीरे से डिस्पेज़ घोल को 5 बार ऊपर और नीचे करें, और आगे 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  7. 1 घंटे के बाद, विघटित सेल समाधान को प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुएं को 2% एफबीएस (एफपीबीएस) युक्त 1x PBS से धोएं और इसे प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को 5 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानी से एस्पिरेट करें और 500 μL ट्रिप्सिन जोड़ें, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 1000 x g पर एफपीबीएस और सेंट्रीफ्यूज की समान मात्रा जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें।
  8. सुपरनैटेंट को छोड़ दें और 3 डी कल्चर मीडिया के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। चरण 8.2 से 8.4 में बीएमई में कोशिकाओं की संख्या की आवश्यकता होती है।
    नोट: रुचि की सेल आबादी का विश्लेषण या क्रमबद्ध करने के लिए कई कुओं को पूल किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: बीसीएससी सेल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए इन विट्रो परख। इन विट्रो परख प्रोटोकॉल अनुभाग 6.1 से 6.5 (ए), 7.1 से 7.4 (बी), या 81 में वर्णित के रूप में किए गए थे। 8.4 + 8.6 (सी) (ए) एमडीए-एमबी -231 मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न कॉलोनियों को दिखाने वाली प्रतिनिधि छवि; (बी) एमसीएफ 7, एसयूएम 159, या एमडीए-एमबी -468 मानव सेल लाइनों के साथ-साथ रोगी-व्युत्पन्न एलआरसीपी 17 स्तन कैंसर कोशिकाओं द्वारा मैमोस्फीयर गठन को दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। (सी) 3 डी संस्कृतियों के मॉडल में एमसीएफ 7 और एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर कोशिकाओं द्वारा गठित 3 डी संरचनाओं को दिखाने वाले प्रतिनिधि चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नोट: संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित पशु नैतिकता प्रोटोकॉल के तहत पशु प्रयोग करें।

9. वीवो जेनोग्राफ्ट मॉडल में

  1. स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं की ट्यूमर दीक्षा क्षमता निर्धारित करने के लिए, सीमित कमजोर पड़ने के दृष्टिकोण का उपयोग करके कोशिकाओं (चरण 5.7 से क्रमबद्ध आबादी या चरण 3.5 या 4.5 से मिश्रित आबादी) तैयार करें। पीबीएस में क्रमिक रूप से 1 और 5 अलग-अलग तनुकरण समूहों के बीच उपयोग करके कोशिकाओं को पतला करें, जिसमें 0.01-0.2 x 102 कोशिकाओं / 100 μL जितनी कम खुराक होती है और 1 x 106 कोशिकाओं / 100 μL जितनी अधिक होती है।
    नोट: मिश्रित / संपूर्ण जनसंख्या कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उपयोग किए गए कमजोर पड़ने वाले समूहों की संख्या वांछित वैज्ञानिक परिणाम पर निर्भर करेगी (उदाहरण के लिए यदि केवल ट्यूमरजेनिसिटी का परीक्षण किया जाता है तो उच्च सेल संख्या पर 1 समूह का उपयोग किया जा सकता है, जबकि ट्यूमर-शुरू करने की क्षमता की गणना करते समय, 5 सीमित कमजोर पड़ने की खुराक का परीक्षण करना इष्टतम है)।
  2. मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं से जेनोग्राफ्ट मॉडल उत्पन्न करने के लिए, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड मादा चूहों (एथिमिक न्यूड [एनयू / एनयू], नॉनओबेसिटी डायबिटिक / गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंट [NOD / SCID] या NOD / SCID IL2s [एनजीएस] उपभेदों) का उपयोग करें।
    नोट: हालांकि प्रति समूह न्यूनतम 4 जानवरों का उपयोग किया जा सकता है, प्रति समूह 8-12 जानवरों को विशेष रूप से कमजोर पड़ने के विश्लेषण को सीमित करने के लिए मजबूत परिणाम प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में प्रत्येक सेल तैयारी के 100 μL / माउस का उपयोग करके मानक स्तन वसा पैड (एमएफपी) इंजेक्शन निष्पादित करें।
    नोट: इष्टतम स्तन ट्यूमर के विकास और दूर के अंगों के लिए सहज मेटास्टेसिस के लिए, थोरैसिक एमएफपी की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, इंगुइनल एमएफपी का भी उपयोग किया जा सकता है।
  4. इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन की साइट पर सामान्य स्वास्थ्य और ट्यूमर के विकास के लिए दैनिक आधार पर चूहों की निगरानी करें। एक स्पष्ट ट्यूमर का पता लगाने पर, कैलिपर्स द्वारा ट्यूमर के आकार को दो लंबवत आयामों में मापना शुरू करें और समापन बिंदु तक साप्ताहिक रिकॉर्ड करें।
    नोट: प्रयोगात्मक अंत बिंदु संस्थागत पशु नैतिकता प्रोटोकॉल निर्धारित नियमों के आधार पर निर्धारित किया जाता है; आमतौर पर, ट्यूमर की मात्रा 1500 मिमी3 तक पहुंचने के बाद इच्छामृत्यु द्वारा समापन बिंदु की आवश्यकता होती है। बीसीएससी आबादी और / या उच्च सेल खुराक (जैसे >1 x 104 कोशिकाओं) के लिए, यह समापन बिंदु एमएफपी इंजेक्शन के 4-8 सप्ताह के भीतर पहुंच जाएगा। बहुत कम सेल खुराक और / या गैर-बीसीएससी सेल आबादी के लिए, ट्यूमर के विकास को इंजेक्शन के बाद 8 महीने तक प्रगति करने की अनुमति दी जानी चाहिए।
  5. इन मापों से, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा की गणना करें: मिमी3 में मात्रा = 0.52 x (चौड़ाई)2 x लंबाई। यदि एक सीमित कमजोर पड़ने के दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं, तो ईएलडीए ऑनलाइन सॉफ्टवेयर (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) का उपयोग करके ट्यूमर शुरू करने की क्षमता और महत्व की गणना करें।
  6. वैकल्पिक रूप से, समापन बिंदु का मानवीय विस्तार करने के लिए, शल्य चिकित्सा से प्राथमिक ट्यूमर को हटा दें और दूर के अंगों में स्वास्थ्य और / या सहज मेटास्टेसिस के विकास के लिए चूहों की निगरानी जारी रखें। सीरियल क्सीनट्रांसप्लांट की पीढ़ी के लिए कटे हुए ट्यूमर ऊतक का उपयोग करें।
  7. समापन बिंदु पर, प्राथमिक ट्यूमर और दूर के अंगों (लिम्फ नोड्स, फेफड़े, यकृत, मस्तिष्क, हड्डी) से ऊतक की कटाई करें और हिस्टोपैथोलॉजिकल और / या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण करें या ट्यूमर ऊतक को अलग करें और अनुभाग 6-8 में वर्णित इन विट्रो परख में उपयोग करें।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल स्तन कैंसर कोशिकाओं की एक विषम आबादी से मानव बीसीएससी के अलगाव की अनुमति देता है, या तो सेल लाइनों से या अलग ट्यूमर ऊतक से। किसी भी सेल लाइन या ऊतक के नमूने के लिए, अधिकतम शुद्धता पर BCSCs को अलग करने के लिए एक समान एकल सेल निलंबन उत्पन्न करना महत्वपूर्ण है क्योंकि गैर-BCSC आबादी को दूषित करने से परिवर्तनीय सेलुलर प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं, खासकर यदि अध्ययन का उद्देश्य BCSCs को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना है। एक कठोर छंटाई रणनीति का उपयोग गैर-BCSCs को दूषित करने की उपस्थिति को कम करेगा और इसके परिणामस्वरूप स्तन कैंसर कोशिकाओं के अनुपात को एकत्र करने की क्षमता होगी। स्टेम सेल जैसी विशेषताओं के साथ जो एक सेलुलर फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं जो उन्हें कैंसर कोशिकाओं की थोक आबादी से अलग करता है। मानव स्तन कैंसर कोशिकाएं जो बढ़ी हुई एएलडीएच एंजाइमेटिक गतिविधि प्रदर्शित करती हैं, सेल सतह मार्कर सीडी 44 के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं, और सीडी 24 की कम / नकारात्मक अभिव्यक्ति में एएलडीएचउच्चसीडी 44 + सीडी 24- फेनोटाइप होता है और इसे बीसीएससी के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। थोक आबादी के भीतर बीसीएससी का अनुपात सेल लाइनों या रोगियों (चित्रा 2) के बीच भिन्न हो सकता है, और अक्सर रोग के चरण पर निर्भर करता है, जिसमें अधिक आक्रामक स्तन कैंसर आमतौर पर बीसीएससी26,36,37 का उच्च अनुपात प्रदर्शित करता है।

पृथक बीसीएससी का उपयोग विट्रो और विवो परख में अलग-अलग प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है जहां उनके व्यवहार और कार्य की तुलना थोक और / या गैर-बीसीएससी आबादी से की जा सकती है। उदाहरण के लिए, एकल स्तन कैंसर कोशिका की 50 कोशिकाओं की कॉलोनियों को स्व-नवीनीकृत करने और उत्पन्न करने की क्षमता का आकलन कॉलोनी बनाने वाले परख (चित्रा 3 ए) द्वारा किया जा सकता है। एंकरेज-स्वतंत्र प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत बीसीएससी की आत्म-नवीनीकरण की क्षमता का मूल्यांकन मैमोस्फीयर परख द्वारा किया जा सकता है, जहां चर क्षेत्र संख्या, आकार और क्षेत्र-शुरू करने की क्षमता का विश्लेषण किया जा सकता है और बीसीएससी की उपस्थिति और कार्य के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है (चित्रा 3 बी)। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों या स्तन ट्यूमर के नमूनों के लिए सीडिंग सेल घनत्व निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। एसएलडीए करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि उच्च सेल घनत्व सेल एकत्रीकरण का कारण बन सकता है जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर गतिविधि की गलत व्याख्या हो सकती है।

बीएमई में स्तन कैंसर कोशिकाओं की खेती बीसीएससी को 3 डी संरचनाओं को बनाने की अनुमति देती है जो विवो स्थितियों (चित्रा 3 सी) में पुन: उत्पन्न होती हैं। फाइब्रोब्लास्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और / या प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे अन्य माइक्रोएन्वायरमेंटल सेल प्रकारों की उपस्थिति में स्तन कैंसर कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति में बीसीएससी38,39 के 3 डी विकास में माइक्रोएन्वायरमेंट की भूमिका की जांच करने की अतिरिक्त क्षमता है। 3 डी ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए आवश्यक विशिष्ट सेल नंबर सेल लाइन या रोगी ट्यूमर स्रोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, और इस प्रकार किसी भी बड़े पैमाने पर प्रयोगों से पहले संस्कृति स्थितियों और सेल संख्याओं को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।

अंत में, विवो माउस जेनोग्राफ्ट मॉडल में गैर-बीसीएससी या थोक सेल आबादी की तुलना में विवो में बीसीएससी की वृद्धि (चित्रा 4) आत्म-नवीकरण, भेदभाव और / या ट्यूमर-प्रारंभिक क्षमता में अंतर को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अक्सर, बहिर्जात कारकों या चिकित्सीय एजेंटों की उपस्थिति में देखी गई इन विट्रो सेलुलर प्रतिक्रियाएं विवो सेटिंग में प्रतिनिधि नहीं होती हैं, यह सुझाव देते हुए कि जब भी संभव हो विवो अध्ययनों में इन विट्रो अवलोकन की सराहना की जानी चाहिए। विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल में उपयोग करते हुए, सेलुलर विषमता और ट्यूमर आर्किटेक्चर संरक्षित है और इस प्रकार ये मॉडल एक प्रणाली के रूप में काम कर सकते हैं जो मानव रोगियों में माइक्रोएन्वायरमेंट की बारीकी से नकल करता है। विवो में एलडीए कैंसर कोशिकाओं (बीसीएससी या गैर-बीसीएससी) 40,41 की किसी दी गई मिश्रित आबादी में ट्यूमर-शुरू करने वाली कोशिकाओं के अनुपात को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। उपयोग किए जाने वाले सेल कमजोर पड़ने की सीमा को अनुकूलित किया जाना चाहिए और रुचि की सेल आबादी में कोशिकाओं को शुरू करने की आवृत्ति पर निर्भर करेगा। आदर्श रूप से इन कमजोर पड़ने में ऐसी खुराक शामिल होनी चाहिए जिसके परिणामस्वरूप 100% ट्यूमर का गठन होता है, बिना ट्यूमर गठन और बीच में एक उचित सीमा के साथ सेल खुराक तक। प्राथमिक नमूनों में ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं की आवृत्ति परिवर्तनशील हो सकती है, और ऐसे उदाहरणों में जहां स्तन ट्यूमर में ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं की बहुत कम संख्या या विषम आबादी होती है, एलडीए प्रदर्शन करना विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकताहै। इन मामलों में, स्तन कैंसर जीव विज्ञान को समझने के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं को इंजेक्ट करना अधिक उपयुक्त होगा।

Figure 4
चित्रा 4: बीसीएससी फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए विवो जेनोग्राफ्ट परख में । एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को एफएसीएस द्वारा अलग किया गया था जैसा कि चित्रा 1 में वर्णित है और प्रोटोकॉल अनुभाग 9.1 से 9.8 (5 x 10 5 कोशिकाओं / माउस; 4 चूहों / सेल आबादी) में वर्णित महिला एनएसजी चूहों केदाहिने वक्ष स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया गया था। प्राथमिक स्तन ट्यूमर विकास कैनेटीक्स एएलडीएचहायसीडी 44 + सीडी 24- (■) बनाम एएलडीएचकमसीडी 44कम / -सीडी 24 + (□) आबादी के लिए दिखाए गए हैं। डेटा को औसत ± एसईएम * के रूप में दर्शाया गया है = एक ही समय-बिंदु पर संबंधित एएलडीएचकमसीडी 44कम / - उपसमुच्चय की तुलना में काफी अलग ट्यूमर आकार (पी < 0.05)। इस आंकड़े को क्रोकर एट अल.26 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्तन कैंसर मेटास्टेसिस और चिकित्सा के लिए प्रतिरोध दुनिया भर में महिलाओं में मृत्यु दर का प्रमुख कारण बन गया है। स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं (बीसीएससी) की एक उप-आबादी का अस्तित्व मेटास्टेसिस 26,43,44,45,46 और चिकित्सा प्रतिरोध 21,47,48 में योगदान देता है। इसलिए, भविष्य के उपचारों का ध्यान बेहतर उपचार परिणामों को प्राप्त करने के लिए बीसीएससी को खत्म करने का लक्ष्य होना चाहिए, और इसके लिए इन विट्रो और विवो दोनों तरीकों का उपयोग करके बीसीएससी की कार्यात्मक विशेषताओं को अलग करने और चिह्नित करने के लिए सटीक तरीकों की आवश्यकता होती है।

स्तन कैंसर के विभिन्न उपप्रकारों से प्राप्त अमर सेल लाइनें बीसीएससी 26,49,50 के अलगाव और लक्षण वर्णन सहित स्तन कैंसर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए व्यवहार्य मॉडल साबित हुई हैं। सेल लाइनों की उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमता और असीमित विस्तार क्षमता उन अध्ययनों के प्रदर्शन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली प्रदान करती है जो अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और तकनीकी रूप से सरल हैं। हालांकि, सेल लाइनों की क्लोनल उत्पत्ति के कारण, वे ट्यूमर ऊतक के भीतर विभिन्न रोगियों और / या कैंसर कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित विषमता को पुन: उत्पन्न करने में विफल हो सकते हैं। इसके अलावा, सेल लाइनों के सीरियल पासिंग के दौरान आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त किए जा सकते हैं और जीनोटाइपिक या फेनोटाइपिक परिवर्तनों को प्रेरित कर सकते हैं जो प्रयोगात्मक परिणामों को भ्रमित करसकते हैं। इसके विपरीत, प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाएं, उनकी सीमित प्रोलिफेरेटिव और विस्तार क्षमता के बावजूद, विवो में देखे गए के लिए अधिक सटीक मॉडल प्रदान कर सकती हैं। हालांकि, ऐसे नमूने प्राप्त करना अधिक कठिन हो सकता है और काम करने के लिए अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। बीसीएससी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए एक प्रारंभिक मॉडल प्रणाली चुनते समय इन सभी कारकों पर विचार किया जाना चाहिए।

एफएसीएस सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति52,53 के आधार पर रुचि की कोशिकाओं को अलग करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। सेल सतह एंटीजन (सीडी 44 और सीडी 24) और एएलडीएच एंजाइमेटिक गतिविधि के आधार पर, मानव बीसीएससी को स्तन कैंसर सेल लाइनों और ट्यूमर ऊतकों 1,2 दोनों से उच्च शुद्धता पर अलग किया जा सकता है। सॉर्टिंग दक्षता क्रमबद्ध नमूने की शुद्धता निर्धारित करती है, और यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता53,54 को छांटने की दक्षता की जांच करने के लिए व्यवहार्यता डाई के साथ क्रमबद्ध नमूने के एक छोटे से हिस्से का विश्लेषण करें। सॉर्टिंग दक्षता को कई कारकों से भ्रमित किया जा सकता है जिसमें सेल क्लंप की उपस्थिति, मृत या मरने वाली कोशिकाओं की एक उच्च संख्या, फ्लोरोक्रोम का अनुचित मुआवजा और / या प्री-सॉर्टिंग पृथक्करण चरण53,54,55,56 के दौरान ट्रिप्सिन या कोलेजनेज की संवेदनशीलता के कारण सेल सतह एंटीजन को नुकसान शामिल है। . इसलिए, एक उचित एकल सेल निलंबन की पीढ़ी और उचित सेल पृथक्करण तकनीकों का उपयोग छंटाई दक्षता में वृद्धि करेगा। मल्टीपैरामीटर सेल सॉर्टिंग करते समय, फ्लोरोक्रोम चुनना महत्वपूर्ण है जो वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करता है। कुछ मामलों में, जहां वर्णक्रमीय ओवरलैप से बचा नहीं जा सकता है, एक नियंत्रण जिसमें एक (फ्लोरेसेंस माइनस वन, एफएमओ) को छोड़कर सभी फ्लोरोक्रोम शामिल हैं, का उपयोग फ्लोरोसेंट संकेतों के स्पिलओवर को अन्यचैनलों में कम करने के लिए किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, वर्णक्रमीय ओवरलैप को इम्यूनोमैग्नेटिक रूप से अलग सेल आबादी द्वारा कम किया जा सकता है,इससे पहले कि ब्याज की कोशिकाओं के अंतिम एफएसीएस अलगाव से पहले।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित कॉलोनी बनाने और मैमोस्फीयर परख जैसे इन विट्रो परखों का बड़े पैमाने पर बीसीएससी 57,58,59,60,61,62 की आत्म-नवीकरण और प्रोलिफेरेटिव क्षमता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इसके अतिरिक्त, इन परखों का उपयोग बीसीएससी फ़ंक्शन पर विभिन्न चिकित्सीय दवाओं की गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। बीसीएससी रखरखाव63 में कई विकासवादी संरक्षित सिग्नलिंग मार्गों को लागू किया गया है, और कॉलोनी बनाने वाले 64,65,66 और मैमोस्फीयर परख64,67 दोनों का उपयोग बीसीएससी आंतरिक सिग्नलिंग को अवरुद्ध करने और बीसीएससी गतिविधि और रोग की प्रगति को कम करने के लिए हस्तक्षेप के रूप में इन मार्गों के चिकित्सीय व्यवधान के मूल्य का आकलन करने के लिए किया गया है। प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करके कॉलोनी बनाने की परख कम सेल घनत्व, नमूनों के बीच भिन्नता और पृथक इन विट्रो स्थितियों के लिए इसकी अनुकूलन क्षमता की कमी के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इन चुनौतियों को एक नरम आगर परत पर बीसीएससी की खेती करके या कोलेजन-लेपित सेल कल्चर डिश 68,69,70 पर फाइब्रोब्लास्टके साथ उन्हें जोड़कर दूर किया जा सकता है। इसके अलावा, संस्कृति मीडिया (जैसे एफजीएफ 771) में विकास कारकों को पूरक करने से ऊतक के नमूनों से अलग कोशिकाओं की कॉलोनी बनाने की क्षमता में भी सुधार हो सकता है। इसके अलावा, एकल सेल निलंबन पीढ़ी चरण के दौरान कोलेजनेज या ट्रिप्सिन का उपयोग करके ऊतक के अति-पाचन के परिणामस्वरूप कम से शून्य कॉलोनी बनाने की क्षमता हो सकती है और मैमोस्फीयर बनाने की दक्षता कम हो सकतीहै। दोनों परखों में, कॉलोनी या क्षेत्र संरचनाओं के विघटन से बचने के लिए परख प्लेटों को अविचलित रूप से इनक्यूबेट करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए क्योंकि वे बन रहे हैं। यह भी अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता प्राथमिक कोशिकाओं (सेल लाइनों के सापेक्ष) के लिए इनक्यूबेशन अवधि का विस्तार करें क्योंकि इन कोशिकाओं को उपनिवेश या गोले बनाने में अधिक समय लग सकता है।

साक्ष्य की कई पंक्तियों ने बीसीएससीकार्यों को प्रभावित करने में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 15,17,72 और स्ट्रोमल घटकों, जैसे फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में हम जिस 3 डी कल्चर मॉडल का वर्णन करते हैं, वह इन विट्रो सेटिंग में विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने में मदद करने के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान कर सकता है। यद्यपि 3 डी संस्कृति प्रणाली कैंसर रोगियों में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से निकटता से मिलती-जुलती है, ऑर्गेनोइड के रूप में कोशिकाओं का दीर्घकालिक रखरखाव मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, 3 डी संस्कृति स्थितियों का अनुकूलन और बीसीएससी की आत्म-नवीकरण और भेदभाव क्षमता की सटीक जांच करने कीक्षमता चुनौतीपूर्ण है। 3 डी संस्कृति प्रणाली में गठित ऑर्गेनोइड्स की दक्षता संस्कृति मीडिया74 में पूरक विकास कारकों पर निर्भर करती है। प्रमुख घटकों (उदाहरण के लिए, रॉक अवरोधक) की अनुपस्थिति से ऑर्गेनोइड गठन कम या कोई ऑर्गेनोइड गठन नहीं होसकता है। इष्टतम सेलुलर फ़ंक्शन और संस्कृति की स्थिरता को बनाए रखने के लिए मीडिया को हर 3-4 दिनों में फिर से भरना चाहिए। विवो स्थितियों और प्रतिक्रिया में पुनरावृत्ति करने के लिए,कोशिकाओं को किसी भी प्रकार के बहिर्जात उपचार से पहले ऑर्गेनोइड बनाने की अनुमति देना हमेशा महत्वपूर्ण होता है। रोगी के नमूनों से प्राप्त कोशिकाओं को ऑर्गेनोइडबनाने के लिए पर्याप्त समय देना चाहिए, खासकर यदि उद्देश्य दवा प्रतिक्रिया का मूल्यांकनकरना है।

जबकि ये इन विट्रो विधियां बीसीएससी फ़ंक्शन को चिह्नित करने के लिए आकर्षक और सुलभ प्रयोगात्मक उपकरण हैं, ट्यूमर विषमता और बीसीएससी व्यवहार पर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव का अध्ययन पूर्ण प्रभावशीलता के साथ नहीं किया जा सकता है। इसलिए बीएससीएस जीव विज्ञान और / या नए चिकित्सीय के प्रति प्रतिक्रिया से संबंधित प्रयोगात्मक निष्कर्षों को और अधिक मान्य करने के लिए जब भी संभव हो, इन इन विट्रो परखों को विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल के साथ पूरक किया जाना चाहिए। विवो मॉडल में विभिन्न का उपयोग बीसीएससी ट्यूमरजेनिसिटी और मेटास्टेसिस का अध्ययन किया गया है। एक्टोपिक (चमड़े के नीचे एनग्राफमेंट) और ऑर्थोटोपिक (एमएफपी एनग्राफमेंट) माउस मॉडल का उपयोग स्तन ट्यूमर उत्पन्न करने और समय के साथ ट्यूमर के विकास में अनुदैर्ध्यपरिवर्तनों का आकलन करने के लिए किया गया है। यद्यपि विवो इंजेक्शन दृष्टिकोण दोनों का उपयोग बीसीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, एमएफपी के देशी स्ट्रोमल और वास्कुलचर-संबंधित घटक प्राथमिक स्तन ट्यूमर की प्रगति के अधिक सटीक पुन: समर्पण की अनुमति देते हैं, जैसा कि रोगियों में देखा गया है, और इस प्रकार एमएफपी इंजेक्शनको 76,77,78 पसंद किया जाता है। अंत में, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों का उपयोग मानव बीसीएससी और ट्यूमर के विकास के लिए आवश्यक है, और यह ट्यूमरजेनिसिस और मेटास्टेसिस अध्ययन में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका को शामिल करने से रोकताहै। हाल ही में, इस सीमा को मानवकृत चूहों के उपयोग के माध्यम से संबोधित किया गया है जिसमें एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को80,81,82 के जेनोग्राफ्ट अध्ययन की शुरुआत से पहले अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के माध्यम से पुनर्गठित किया जाता है। हालांकि, ये मॉडल महंगे और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, और इस प्रकार अभी भी आमतौर परउपयोग नहीं किए जाते हैं।

सारांश में, यहां हमने स्तन कैंसर सेल लाइनों और रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऊतक नमूनों दोनों से मानव बीसीएससी के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया है। हमने डाउनस्ट्रीम परख के लिए इन विट्रो और विवो प्रोटोकॉल में भी वर्णन किया है जिसका उपयोग बीसीएससी फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें विभिन्न स्तन कैंसर सेल स्रोतों के लिए अनुकूलित होने की क्षमता और विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में किए जाने वाले लचीलेपन के साथ किया जा सकता है। ये प्रोटोकॉल कैंसर स्टेम कोशिकाओं, स्तन कैंसर जीव विज्ञान और चिकित्सीय विकास में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होंगे, भविष्य में रोगी के परिणामों में सुधार के अंतिम लक्ष्य के साथ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम अपनी प्रयोगशाला के सदस्यों को उनकी उपयोगी चर्चा और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट पर हमारा शोध कनाडाई कैंसर रिसर्च सोसाइटी रिसर्च इंस्टीट्यूट और अमेरिकी सेना रक्षा विभाग स्तन कैंसर कार्यक्रम (ग्रांट # बीसी 160912) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित है। वी.बी. को वेस्टर्न पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (वेस्टर्न यूनिवर्सिटी) द्वारा समर्थित किया जाता है, और एएलए और वीबी दोनों कनाडा के स्तन कैंसर सोसायटी द्वारा समर्थित हैं। सीएल कनाडा सरकार से वैनियर कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

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Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

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