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Cancer Research

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Published: October 02, 2020
doi:
10.3791/61775
, , , ,
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology,Western University, 3Department of Oncology,Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Questo protocollo sperimentale descrive l’isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

Abstract

Le cellule staminali del cancro al seno (BCSC) sono cellule tumorali con caratteristiche simili alle cellule staminali ereditarie o acquisite. Nonostante la loro bassa frequenza, sono i principali contributori all’inizio del cancro al seno, alla recidiva, alle metastasi e alla resistenza alla terapia. È imperativo comprendere la biologia delle cellule staminali del cancro al seno al fine di identificare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento del cancro al seno. Le cellule staminali del cancro al seno sono isolate e caratterizzate sulla base dell’espressione di marcatori di superficie cellulare unici come CD44, CD24 e dell’attività enzimatica dell’aldeide deidrogenasi (ALDH). Queste celluleALDH ad altocontenuto di CD44+CD24– costituiscono la popolazione BCSC e possono essere isolate mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per studi funzionali a valle. A seconda della domanda scientifica, possono essere utilizzati diversi metodi in vitro e in vivo per valutare le caratteristiche funzionali dei BCSC. Qui, forniamo un protocollo sperimentale dettagliato per l’isolamento di BCSC umani sia da popolazioni eterogenee di cellule di cancro al seno che da tessuto tumorale primario ottenuto da pazienti con cancro al seno. Inoltre, evidenziamo saggi funzionali a valle in vitro e in vivo , tra cui saggi di formazione di colonie, saggi di mammosfera, modelli di coltura 3D e saggi di xenotrapianto tumorale che possono essere utilizzati per valutare la funzione BCSC.

Introduction

Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari delle cellule staminali del cancro al seno umano (BCSC) è fondamentale per affrontare le sfide incontrate nel trattamento del cancro al seno. L’emergere del concetto BCSC risale all’inizio del 21° secolo, dove una piccola popolazione di cellule CD44 + CD24-/basso cancro al seno sono state trovate in grado di generare tumori eterogenei nei topi 1,2. Successivamente, è stato osservato che le cellule di cancro al seno umano con elevata attività enzimatica dell’aldeide deidrogenasi (ALDHalto) mostravano anche proprietà simili alle cellule staminali3. Questi BCSCs rappresentano una piccola popolazione di cellule capaci di auto-rinnovamento e differenziazione, contribuendo alla natura eterogenea dei tumori bulk 1,2,3. Prove crescenti suggeriscono che alterazioni nelle vie di segnalazione evolutivamente conservate guidano la sopravvivenza e il mantenimento del BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Inoltre, il microambiente estrinseco cellulare ha dimostrato di svolgere un ruolo fondamentale nel dettare diverse funzioni BCSC15,16,17. Queste vie molecolari e i fattori esterni che regolano la funzione del BCSC contribuiscono alla recidiva del cancro al seno, alle metastasi18 e allo sviluppo di resistenza alle terapie 19,20,21, con l’esistenza residua di BCSC post-trattamento che rappresenta una sfida importante per la sopravvivenza globale delle pazienti con carcinoma mammario22,23 . La valutazione pre-clinica di questi fattori è quindi molto importante per identificare le terapie mirate al BCSC che potrebbero essere utili per ottenere migliori risultati di trattamento e una migliore sopravvivenza globale nei pazienti con cancro al seno.

Diversi modelli in vitro di linee cellulari di carcinoma mammario umano e modelli di xenotrapianto umano in vivo sono stati utilizzati per caratterizzare BCSCs 24,25,26,27,28,29. La capacità delle linee cellulari di ripopolarsi continuamente dopo ogni passaggio successivo rende questi un sistema modello ideale per eseguire studi omici e farmacogenomici. Tuttavia, le linee cellulari spesso non riescono a ricapitolare l’eterogeneità osservata nei campioni di pazienti. Pertanto, è importante integrare i dati delle linee cellulari con campioni derivati dal paziente. L’isolamento dei BCSC nella loro forma più pura è importante per consentire una caratterizzazione dettagliata dei BCSC. Il raggiungimento di questa purezza dipende dalla selezione di marcatori fenotipici specifici per i BCSC. Attualmente, il fenotipo cellulareALDH ad altocontenuto di CD44 + CD24– è più comunemente usato per distinguere e isolare i BCSC umani da popolazioni di cellule di cancro al seno di massa utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per la massima purezza1, 3,26. Inoltre, le proprietà di BCSC isolati come l’auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione possono essere valutate utilizzando tecniche in vitro e in vivo.

Ad esempio, i saggi in vitro per la formazione di colonie possono essere utilizzati per valutare la capacità di una singola cellula di auto-rinnovarsi per formare una colonia di 50 cellule o più in presenza di diverse condizioni di trattamento30. I saggi della mammosfera possono anche essere utilizzati per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule del cancro al seno in condizioni indipendenti dall’ancoraggio. Questo test misura la capacità delle singole cellule di generare e crescere come sfere (miscela di BCSC e non BCSC) ad ogni passaggio successivo in condizioni di coltura non aderenti prive di siero31. Inoltre, i modelli di coltura tridimensionale (3D) possono essere utilizzati per valutare la funzione BCSC, comprese le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che ricapitolano da vicino il microambiente in vivo e consentono di studiare l’attività di potenziali terapie mirate al BCSC32. Nonostante le diverse applicazioni dei modelli in vitro, è difficile modellare la complessità delle condizioni in vivo utilizzando solo saggi in vitro. Questa sfida può essere superata utilizzando modelli di xenotrapianto murino per valutare il comportamento BCSC in vivo. In particolare, tali modelli servono come sistema ideale per valutare le metastasi del cancro al seno 33, studiare le interazioni con il microambiente durante la progressione della malattia 34, l’imaging in vivo 35 e per prevedere la tossicità e l’efficacia specifiche del paziente degli agenti antitumorali 34.

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata per l’isolamento di BCSC umani ALDHad altocontenuto di CD44+CD24– alla massima purezza da popolazioni massicce di cellule eterogenee di carcinoma mammario. Forniamo anche una descrizione dettagliata di tre tecniche in vitro (saggio di formazione di colonie, saggio della mammosfera e modello di coltura 3D) e un saggio di xenotrapianto tumorale in vivo che può essere utilizzato per valutare diverse funzioni dei BCSC. Questi metodi sarebbero appropriati per l’uso da parte di ricercatori interessati a isolare e caratterizzare i BCSC da linee cellulari di carcinoma mammario umano o cellule di cancro al seno derivate da pazienti primari e tessuto tumorale ai fini della comprensione della biologia BCSC e / o dello studio di nuove terapie mirate al BCSC.

Protocol

La raccolta di campioni chirurgici o bioptici derivati dai pazienti direttamente da pazienti con carcinoma mammario consenzienti è stata effettuata secondo il protocollo di etica umana approvato approvato dal comitato etico istituzionale. Tutti i topi utilizzati per generare modelli di xenotrapianto derivati dal paziente sono stati mantenuti e ospitati in una struttura per animali approvata dall’istituzione. Il tessuto tumorale da modelli di xenotrapianto derivati dal paziente utilizzando topi è stato generato secondo …

Representative Results

Il protocollo descritto consente l’isolamento di BCSC umani da una popolazione eterogenea di cellule di cancro al seno, sia da linee cellulari che da tessuto tumorale dissociato. Per ogni data linea cellulare o campione di tessuto, è fondamentale generare una sospensione monocellulare uniforme per isolare i BCSC alla massima purezza poiché la contaminazione delle popolazioni non-BCSC potrebbe comportare risposte cellulari variabili, specialmente se lo scopo dello studio è valutare l’efficacia degli agenti terapeutici …

Discussion

Le metastasi del cancro al seno e la resistenza alla terapia sono diventate la principale causa di mortalità nelle donne di tutto il mondo. L’esistenza di una sottopopolazione di cellule staminali del cancro al seno (BCSC) contribuisce all’aumento delle metastasi 26,43,44,45,46 e alla resistenza alla terapia21,47,48.<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per le loro utili discussioni e supporto. La nostra ricerca sulle cellule staminali del cancro al seno e sul microambiente tumorale è finanziata da sovvenzioni del Canadian Cancer Research Society Research Institute e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti Breast Cancer Program (Grant # BC160912). V.B. è supportato da una Western Postdoctoral Fellowship (Western University), e sia A.L.A. che V.B. sono supportati dalla Breast Cancer Society of Canada. C.L. è supportato da una borsa di studio Vanier Canada Graduate dal governo del Canada.

Materials

7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1×106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
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Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).
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