从细胞和组织样本中分离和功能评估人类乳腺癌干细胞

Summary

该实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样品中分离BCSC以及可用于评估BCSC表型和功能的 体外 和 体内 测定。

Abstract

乳腺癌干细胞（BCSC）是具有遗传或获得性干细胞样特征的癌细胞。尽管它们的频率很低，但它们是乳腺癌发生、复发、转移和治疗耐药性的主要贡献者。了解乳腺癌干细胞的生物学必须确定治疗乳腺癌的新治疗靶点。乳腺癌干细胞是根据独特的细胞表面标志物（如CD44、CD24）和醛脱氢酶（ALDH）的酶活性）的表达进行分离和表征的。这些 ALDH^高CD44⁺CD24^- 细胞构成了 BCSC 群体，可通过荧光激活细胞分选 （FACS） 进行下游功能研究。根据科学问题，可以使用不同的 体外 和 体内 方法来评估BCSC的功能特征。在这里，我们提供了一个详细的实验方案，用于从乳腺癌细胞的异质群体以及从乳腺癌患者获得的原发性肿瘤组织中分离人类BCSC。此外，我们还重点介绍了下游体 外 和 体内 功能测定，包括集落形成测定、乳腺球测定、3D 培养模型和可用于评估 BCSC 功能的肿瘤异种移植测定。

Introduction

了解人类乳腺癌干细胞（BCSC）的细胞和分子机制对于解决乳腺癌治疗中遇到的挑战至关重要。BCSC概念的出现可以追溯到21^世纪初，当时发现少量CD44 ⁺ CD24^-/低乳腺癌细胞能够在小鼠中产生异质肿瘤^1，2。随后，观察到具有高酶活性的醛脱氢酶（ALDH^高）的人乳腺癌细胞也表现出类似的干细胞样性质³。这些BCSC代表能够自我更新和分化的细胞群，有助于本体肿瘤的异质性1，^2，3。越来越多的证据表明，进化保守信号通路的改变推动了BCSC的存活和维持⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，¹²，

Protocol

直接从同意的乳腺癌患者那里收集患者来源的手术或活检样本是根据机构伦理委员会批准的批准的人类伦理协议进行的。所有用于生成患者来源的异种移植模型的小鼠均被维持并饲养在机构批准的动物设施中。使用小鼠的患者来源的异种移植模型的肿瘤组织是根据机构动物护理委员会批准的批准的伦理方案生成的。

1. 细胞系的制备

1. 在生物安全柜的无菌条件下执行所有细胞培养和染色程序。使用无菌细胞培养皿/烧瓶和试剂。
2. 在补充有胎牛血清（FBS）和每个细胞系特异性的必要生长因子的定义培养基中用5%CO₂ 将人乳腺癌细胞维持在37°C。

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1. 
   

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Results

所描述的方案允许从异质的乳腺癌细胞群中分离人BCSC，无论是来自细胞系还是从解离的肿瘤组织中。对于任何给定的细胞系或组织样品，产生均匀的单细胞悬液以最大纯度分离BCSC至关重要，因为污染的非BCSC群体可能导致不同的细胞反应，特别是如果研究目的是评估靶向BCSC的治疗剂的功效。 应用严格的分选策略将最大限度地减少污染非BCSC的存在，并导致收集乳腺癌细胞比例的能力具有干细胞样特征，显示出将它们与大量癌细胞区分开来的细胞表型。表现出增强的 ALDH 酶活性、表达高水平的细胞表面标志物 CD44 和低/阴性表达的 CD24 的人乳腺癌细胞具有 ALDH^高CD44⁺CD24^- 表型，可归类为 BCSC。散装群体中BCSC的比例可能因细胞系或患者而异（图2），并且通常取决于疾病阶段，更具侵袭性的乳腺癌通常显示更高比例的BCSCs26^，36，37

Discussion

乳腺癌转移和对治疗的抵抗已成为全世界妇女死亡的主要原因。乳腺癌干细胞（BCSC）亚群的存在有助于增强转移26，43，44，45，⁴⁶和治疗耐药^性21，^47，48。因此，未来治疗的重点应旨在根除BCSC以达到更好的治疗效果，这需要使用体外和体内方法分离和表征BCSC功能特征的准确方法。

源自不同亚型乳腺癌的永生化细胞系已被证明是研究乳腺癌生物学的可行模型，包括BCSCs的分离和表征^26.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-氨基放线菌素 D （7AAD）	BD	51-68981E	建议：0.25 &微量;g/1x106 细胞
丙酮	Fisher	A18-1
醛脱氢酶 （ALDH） 底物	Stemcell Technologies	1700	作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的一部分进行商业销售;按照制造商的说明进行 ALDH 底物制备
基底膜提取物 （BME）	康宁	354234	以商业名称 Matrigel 出售
细胞培养板：6 孔	康宁	877218
细胞培养板：60 mm	康宁	353002
细胞培养板：96 孔超低吸附	康宁	3474
细胞过滤器：40 微米	BD	352340
胶原蛋白	技术	7001	制备 3 mg/mL 胶原蛋白的 PBS
胶原酶	Sigma	11088807001	1x
锥形管：50 mL	Fisher scientific	05-539-7
结晶紫	Sigma	C6158	使用 0.05% 结晶紫水溶液进行染色
Dispase	Stemcell Technologies	7913	5U/mL
DMEM：F12	Gibco	11330-032	1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
DNAse	Sigma	D5052	0.1 mg/mL 终浓度
FBS	Avantor Seradigm Lifescience	97068-085
流管：5ml	BD	352063	聚丙烯圆底管
甲醇	Fisher	84124
小鼠抗人 CD24 抗体	BD	561646	R-藻红蛋白和花青染料偶联 克隆：ML5
小鼠抗人 CD44 抗体	BD	555479	R-藻红蛋白偶联，克隆：G44-26
N，N-二乙氨基苯甲醛 （DEAB）	Stemcell Technologies	1700	作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的一部分进行商业销售;遵循制造商的说明 DEAB 制备
PBS	Wisent Inc	311-425-CL	1x，不含钙和镁
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
乳腺球 培养基成分
B27	Gibco	17504-44	1x
bFGF	Sigma	F2006	10 ng/mL
BSA		Bioshop ALB003	04%
DMEM：F12	Gibco	11330-032	1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	20 ng/mL
胰岛素	Sigma	16634	5 & 微型;g/mL
3D 类器官培养基组成
A8301	Tocris	2939	500 nM
B27	Gibco	17504-44	1x
DMEM：F12	Gibco	11330-032	1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	5 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMax	Invitrogen	35050-061	1x
HEPES	Gibco	15630-080	10 mM
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165	1.25 mM
神经调节蛋白和 β;1	Peprotech	100-03	5 nM
烟酰胺	Sigma	N0636	5 mM
Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
R-spondin3	R&D	3500	250 ng/mL
SB202190	Sigma	S7067	500 nM
Y-27632	Tocris	1254	5 µ米