Summary
Denne protokol beskriver transilluminationsassisteret mikrodissection af segmenter af voksne mus seminiferous tubules, der repræsenterer specifikke stadier af seminiferous epitelcyklus, og celletyper deri, og efterfølgende immunfarvning af squashpræparater og intakte tubule segmenter.
Abstract
Spermatogenese er en unik differentieringsproces, der i sidste ende giver anledning til en af de mest forskellige celletyper i kroppen, sæden. Differentiering af kimceller finder sted i de cytoplasmiske lommer af somatiske Sertoli-celler, der er vært for 4 til 5 generationer af kimceller samtidigt og koordinerer og synkroniserer deres udvikling. Derfor er sammensætningen af kimcelletyper i et tværsnit konstant, og disse celleforeninger er også kendt som stadier (I-XII) af den seminiferøse epitelcyklus. Det er vigtigt, at stadier også kan identificeres fra intakte seminiferous tubules baseret på deres differentiale lysabsorption / scatter-egenskaber afsløret ved transillumination, og det faktum, at stadierne følger hinanden langs tubule i numerisk rækkefølge. I denne artikel beskrives en transilluminationsassisteret mikrodissectionmetode til isolering af seminiferøse tubulesegmenter, der repræsenterer specifikke stadier af musens seminiferøse epitelcyklus. Lysabsorptionsmønsteret for seminiferøse rør inspiceres først under et dissektionsmikroskop, og derefter skæres tubulesegmenter, der repræsenterer specifikke stadier, og anvendes til downstream-applikationer. Her beskriver vi immunostaining protokoller for fase-specifikke squash præparater og for intakt tubule segmenter. Denne metode gør det muligt for en forsker at fokusere på biologiske begivenheder, der finder sted i bestemte faser af spermatogenese, hvilket giver et unikt værktøj til udviklingsmæssige, toksikologiske og cytologiske undersøgelser af spermatogenese og underliggende molekylære mekanismer.
Introduction
Differentiering af mandlige kønsceller fra diploid spermatogonia til moden haploid spermatozoa, dvs.spermatogenese, er en kompleks proces, der finder sted i epitelet af seminiferous tubules i testiklerne på et seksuelt modent individ1. Mitotiske efterkommere af A1 spermatogonia deler sig først fem gange for at udvide den differentierings-engagerede befolkning og derefter indtaste meiose som spermatocytter, der i sidste ende giver anledning til haploid spermatids. Differentiering af runde spermatids i spermatozoer, dvs.spermiogenese, indebærer komplekse ændringer i cellulær morfologi, herunder nuklear komprimering og konstruktion af sædspecifikke strukturer som acrosome og flagellum. I mus tager hele processen med spermatogenese 35 dage at gennemføre2,3.
Ved en given lokalitet er det seminiferøse epitel vært for op til fem kohorter af differentierende kimceller plus kønscellerne og de somatiske Sertoli-celler1. Differentiering af kimceller danner koncentriske lag, hvis sammensætning er forudsigelig, og haploide celler på et givet udviklingstrin forbinder altid med visse typer spermatocytter og spermatogonia4,5. Derfor er ethvert tværsnit af en tubule vært for kohorter af kimceller med en konstant sammensætning. Disse specifikke celleforeninger defineres som stadierne i det seminiferøse epitel. Faser i sig selv ikke præsenterer stagnerende check-point-lignende stater , men løbende udvikle sig som differentieringen af kimcelle kohorter skrider frem i synkronisering1,2,6. Hos mus er der 12 faser (I-XII)2, der er arrangeret på en segmental måde langs den seminiferøse tubules langs langsgående akse, og de følger hinanden i en logisk rækkefølge og danner således bølgen af seminiferous epitel eller spermatogenisk bølge7,8,9 ( Figur1). Færdiggørelsen af spermatogenese tager fire cyklusser, og hierarkiske lag eller kohorter af differentierende kimceller i enhver seminiferous tubule tværsnit er tidsmæssigt en seminiferous cyklus bortset fra hinanden. Længden af cyklussen er artsafhængig, og i musen tager hver cyklus 8,6 dage10.
Stadierne kan identificeres på grundlag af den cellulære sammensætning og tilrettelæggelse af det seminiferøse epitel på histologiske testis afsnit5 (Figur 1 og figur 2). Men histologiske analyser er besværlige, tidskrævende og kræver fastsættelse og farvning, og kan derfor ikke anvendes til levende væv. Det er vigtigt, at iscenesættelse også kan udføres på levende væv under et dissektionsmikroskop ved at drage fordel af tydelige lysabsorptions-/scattermønstre, der er udstillet af forskellige stadier af cyklussen (Figur 2). Hver fases evne til at absorbere og sprede lys er i forhold til niveauet for kromatinkondensation af sene postmeiotiske spermatids, som en given faseværter og pakningen af disse celler i bundter7,11. Spermatid differentiering, dvsspermiogenese, er yderligere opdelt i 16 udviklingsmæssige trin, herunder 8 trin af runde spermatid (trin 1-8) og 8 trin af aflange spermatid (trin 9-16) differentiering(Figur 1). Trin 9-11 aflange spermatids (fase IX-XI) viser kun et lavt niveau af kromatin kondens resulterer i lav mængde lys, der absorberes. Kromatinkondensation begynder i trin 11 spermatids (fase XI), og trin 15-16 aflange spermatids (fase IV-VIII) indeholder fuldt kondenseret kromatin og udviser derfor maksimal lysabsorption (Figur 3). Chromatin skal kondenseres for at være tæt pakket ind i sædhovedet. Yderligere faktorer, der bidrager til lysabsorptionsmønsteret, er placeringen af aflange spermatids i epitel (basal vs. apical) og bundling af aflange spermatids (udtales i fase II-V)11 (Figur 3). Bundter ses som pletter i midten af tubules og som striber på kanterne under en dissektion mikroskop og jo mere kondenseret kromatin, jo mørkere stedet / stribe11.
I denne artikel beskrives anvendelsen af transilluminationsassisteret mikrodissectionmetode til isolering af seminiferøse tubulesegmenter, der repræsenterer specifikke stadier af den seminiferøse epitelcyklus. Når segmenterne for faseinddelt tubule er isoleret , kan de underkastes forskellige downstream-analyser, herunder biokemiske RNA- og proteinanalyser12,13,14,15, flowcytometri16, ex vivo tubulekultur17 og immunostaining18. Her leverer vi også detaljerede downstream-protokoller til at forberede squashed monolayers af iscenesatte tubule segmenter for levende celle morfologiske analyse og efterfølgende immunostaining, samt hele montere immunostainings af tubule segmenter. Arbejdsprocessen i en nøddeskal, der er beskrevet i figur 4.
Den transillumination-assisteret microdissection metode giver mulighed for nøjagtig identifikation og isolering af kimceller på bestemte trin af differentiering takket være den synkroniserede cellulære sammensætning af faserne. Det er vigtigt, at det også gør det muligt at studere faseafhængige hændelser under spermatogenese på levende væv. I betragtning af manglen på skalerbare in vitro-modeller til spermatogenese har denne metode også en unik fordel ved at tillade målrettede kortsigtede udviklingsmæssige og toksikologiske undersøgelser af scenespecifikke tubulesegmenter ex vivo12,17. Mens vi beskriver metoden her for musen, kan den samme procedure anvendes på alle pattedyrarter med langsgående og segmentisk arrangement af seminiferøse epitelstadier, såsom rotten4,7,15,19,20.
Protocol
Vedligeholdelse af laboratoriemus og alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og regler for pleje og brug af forsøgsdyr på Universitetet i Turku.
1. Tilberedning af seminiferøse rør til mikrodissection
- Ofre en voksen mandlig mus (≥8 uger gammel, testis 80-120 mg afhængigt af stamme og alder) via CO2 kvælning efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation.
BEMÆRK: Musen skal være seksuelt moden og helst mindst 8 uger gammel. Transillumination mønster af unge mus adskiller sig fra voksne, fordi bølgen af det seminiferøse epitel endnu ikke er fuldt etableret, og timingen af den første bølge af spermatogenese er forskellig21,22. Mangel på aflange spermatids i <4 uger gamle hanmus udelukker deres brug for transillumination-assisteret mikrodissection. Alle musestammer, der har normal spermatogenese, kan bruges. - Spray ventral maven med 70% ethanol. Åbn abdominopelvic hulrummet ved hjælp af steril saks, hvilket gør en V-formet åbning.
- Træk på den epididymale fedtpude med sterile pincet, find testiklerne, disseker dem ved hjælp af en saks og læg dem på en steril 100 mm petriskål indeholdende PBS.
BEMÆRK: For at opretholde steriliteten skal du sørge for, at alt laboratorieudstyr og kirurgisk værktøj er sterilt. - Ved hjælp af finspidset saks decapsulate testiklerne ved at skære en slids i tunica albuginea, den tykke fiber ark indkapsle testis. Derefter rive tunica åbne ved hjælp af et par pincet. Tving tubules ud ved at trykke med pincet og kassér tunikaen.
BEMÆRK: Mens kassere tunica, kan det være gavnligt for nogle downstream applikationer, arterien testikelis fjernes sammen med tunika. Undgå at beskadige de seminiferous tubules. - Flyt seminiferous tubules til en ny Petri parabol og hæld nok steril PBS til at dække bunden af Petri parabol. Træk derefter forsigtigt tubules fra hinanden, men undgå at beskadige tubules.
BEMÆRK: For meget mekanisk stress vil påvirke transilluminationsmønsteret og påvirke vævets levedygtighed og dets cellulære arkitektur. Tubules kan også behandles for fuldmonterede immunostainings fra dette punkt uden iscenesættelse (3B). Nogle gange er det tilstrækkeligt at definere stadiet med tilbagevirkende kraft ved at inkludere antistoffer mod proteiner udtrykt i differentiering af spermatogonia, såsom SALL4, c-KIT og DNMT3A18,23. Tætheden af spermatogonia er en relativt pålidelig faseindikator (figur 2).
2. Transillumination-assisteret mikrodissection
- Placer petriskålen under et dissektionsmikroskop fast ved at tape den til scenen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at tape petriskålen godt for at forhindre dens bevægelse, som kan forårsage blanding af de indsamlede iscenesatte seminiferous tubule segmenter. - For at afsløre lysabsorptionsmønsteret for seminiferøse rør, der er under fokus, skal du sørge for, at prøven belyses nedefra, og at lyset passerer gennem prøven, dvs.
BEMÆRK: Mængden af absorberet/spredt lys er i forhold til niveauet af kromatinkondensation i aflange spermatids og deres bundling inde i den seminiferous tubule: jo mere kondenseret, jo mere lys absorberes, dvs . - Stifte bekendtskab med lysabsorptionsmønsteret i forskellige stadier som beskrevet i figur 2, figur 5A og figur S1 ved omhyggeligt at flytte bundter af tubules ved hjælp af fine pincet.
BEMÆRK: Stadierne følger altid hinanden i en logisk rækkefølge og danner bølgen af seminiferous epitel. Det er dog vigtigt at vide, at retningen af den spermatogene bølge lejlighedsvis vender tilbage og derefter vender tilbage igen (også kendt som modulationer4,9), nogle gange komplicerer proceduren. Også længden af hvert trin, med hensyn til hvor mange mm tubule, varierer betydeligt. - Løft forsigtigt den tubeule af interesse ved hjælp af pincet med en hooked spids, og skær derefter et segment af passende længde ved hjælp af microdissection saks (se Supplerende Video 1). En krog på spidsen af tang gør løft og holde en tubule lettere og hjælper med at undgå at klemme det.
BEMÆRK: Længden af de segmenter, der skal skæres, afhænger af downstream-applikationer. Til indsamling af sammenkædede tubulestykker af et bestemt stadium til protein- eller RNA-analyse12,13 (II-V, VII-VIII og IX-XI, figur 5B) er længden typisk 2-5 mm. Når der anvendes standard phenol-chloroformekstraktion, kan ca. 200 ng RNA udledes af 1 mm tubule. Ved helmontering af segmenter med faseinddelt rør skal segmenternes længde være >5 mm. Ved squashpræparater bør segmenternes længde ikke overstige 1-2 mm, da cellerne midt i segmentet ikke kan komme ud, hvis de er for lange. Brug en mm skala under Petri skålen for en nøjagtig måling af tubule længde.
3. Immunostaining af forskellige præparater
- Squashforberedelse: etapekontrol og immunosang
BEMÆRK: Scenespecifikke rørstykker kan mases på et mikroskopdias med et dækglas for at udføre morfologisk analyse af levende celler ved fasekontrastmikroskopi og efterfølgende immunostaining. En nybegynder anbefales at bruge denne tilgang til at kontrollere stadierne, når man stifter bekendtskab med den transilluminationsassisterede mikrodissection-metode.- Segmentet opsamles i et volumen på 10 μL ved hjælp af en pipette, og det flyttes over på et mikroskopsjebane.
- Squash tubule ved at placere et dækglas (20 mm x 20 mm) omhyggeligt på tubule. Som et resultat, celler vil flyde ud tubule og danne en levende-celle monolayer. Placer et filterpapir på kanten af dækglasset for at lette spredningen af celler. Undgå squashing cellerne for meget til at holde dem i live.
- Overvåg cellespredning under et mikroskop. Brug et fasekontrastmikroskop ved 40x-målet til at verificere fasegenkendelse ved at undersøge de tilstedeværende celletyper (Figur 2, Figur S2).
- Når cellerne har spredt sig til et rundt monolag fra begge ender af tubule, dyppe diaset i en beholder, der indeholder flydende nitrogen, mens du holder det med pincet. Hold det nedsænket i 10 s. Alternativt placeres rutsjebanen på en tørisplade til frysning.
- Fjern dækslet glas ved at vende det ud ved hjælp af en skalpel.
- Fortsæt straks med fikseringen, og placer hurtigt diaset i en beholder med 90% ethanol i 2-5 minutter.
BEMÆRK: Sørg for, at squashpræparatet ikke optøs, før det placeres på 90% ethanol. Andre fikseringsmidler kan også bruges, såsom acetone, i 10 min. - Lufttørres og opbevares ved stuetemperatur (RT) (op til nogle dage) eller ved -80 °C (lang sigt).
- For immunostaining, post-fix prøverne i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min på RT.
- Skyl i PBS og permeabilize med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
- Skyl i PBS og tegn en fedtring omkring hver squashprøve.
- Der tilsættes 50-100 μL 10% BSA (kvægserumalbumin) i 0,1% Tween i PBS (PBST) inde i fedtringen og blokprøver i 30 minutter ved RT.
- BSA-opløsningen fjernes, og der inkuberes med et primært antistof fortyndet i 10% BSA i PBST i 1 time ved RT.
- Vask 3x i 5 min med PBST.
- Inkuber med et sekundært antistof fortyndet i 10% BSA i PBST.
BEMÆRK: For at plette acrosomerne kan prøverne inkuberes med Rhodamin-mærket Peanut agglutininantistof (PNA, 1:1000) i 10% BSA i PBST i 1 time ved RT (Figur S3) i stedet for specifikke primære og sekundære antistoffer. - Vask 3x i 5 min hver med PBST, skyl med PBS og monter med et mountant, der indeholder DAPI.
- Immunfarvning af seminiferous tubules hele monteret
BEMÆRK: Protokollen nedenfor beskriver helmonteringsfarvning for faseinddelte (fra trin 2.4) tubulesegmenter. Hvis en forsker ønsker at udføre helmonteret farvning uden iscenesættelse (fra trin 1.5), skal du være opmærksom på noter i 3.2.1 og 3.2.7.- Ved hjælp af en pipette overføres tubulesegmenterne (fra trin 2.4) i iskold PBS til et 15 mL konisk rør og lad dem sedimentere på is.
BEMÆRK: Hvis du bruger ikke-mærkede rør fra 1.5., skal du adskille tubules i en petriskål ved at pipettere op og tilbage på en vippet skål flere gange. Brug en 1-mL pipette med en skåret spids. Dette trin er beregnet til at åbne strukturen af vævet. Undgå dog for meget pipetter, da det kan beskadige tubules. Sedimentering af tubules vil tage nogle snese sekunder. Små tubulefragmenter, interstitielle celler og cellerester forbliver i supernatanten. - Fjern forsigtigt supernatanten (SN) ved pipettering eller med en aspirator. Tilsæt 10 mL iskold PBS og bland ved inversion.
- Lad sediment og derefter fjerne SN som før.
- Der tilsættes 5 mL på 4% PFA og fastgøres i 5 timer på et roterende bord (20-30 omdrejninger i minuttet) ved +4 °C.
BEMÆRK: Fikseringstiden afhænger af de proteiner, der er af interesse, og deres subcellulære lokalisering. For nukleare og cytoplasmiske proteiner er en fiksering på 2 timer typisk tilstrækkelig, men membranmarkører, såsom GFRα1 (GDNF-familiereceptor alpha 1; Figur 6A,B) nyder godt af en længere fiksering på op til 6 timer. - Lad det sedimentere, fjern SN (PFA) som før, og skyl kort ved at tilføje 10 mL PBS og vende røret.
- Lad det sedimentere, fjern SN som før, og gentag PBS-vasketrinnet tre gange i mindst 10 minutter hver på et roterende bord ved +4 °C og fortsæt med farvning eller opbevaring ved +4 °C.
BEMÆRK: Hvis arbejdsforholdene er sterile og rene, kan prøverne opbevares og anvendes i mindst nogle uger. Alternativt tilsættes Natrium Azide til en endelig koncentration på 0,02% (w/v) fra en 2% bestandsopløsning for at hjælpe med at bevare tubules før opbevaring ved +4 °C. - Brug en 1-mL pipette til at flytte 10-20 faste rørsegmenter til et 2 mL rundt nederste rør. Lad sediment og fjerne SN.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med lange tubules, der ikke er blevet iscenesat, hæld tubules på en petriskål og ved hjælp af microdissection saks og pincet skåret segmenter på omkring 5-20 mm. For lange segmenter vil vikle sig ind under farvningsproceduren, mens for korte segmenter let går tabt. - Tilsæt 1 mL på 2% BSA + 10% FBS (føtal kvæg serum) i 0,3% Triton X-100 i PBS (PBSX). Bloker i mindst 1 time på et roterende bord (20-30 omdrejninger) ved RT.
- Skyl med 1 mL PBSX, fjern SN ved pipetter, og tilsæt 250 μL primært antistof fortyndet i 1% BSA i PBSX (1:100-1:2000 fortynding). Inkuberes i 2 timer ved RT eller natten over ved +4 °C på et roterende bord (20-30 omdrejninger i minuttet).
- Antistofopløsningen fjernes ved pipettering, og tublerne skylles med 1 ml PBSX som ovenfor. Vask tre gange i 1 time i PBSX på et roterende bord (20-30 omdrejninger) ved RT.
BEMÆRK: Efter denne første vask kan prøven efterlades natten over ved +4 °C, hvis det er nødvendigt. - SN fjernes, og der tilsættes 250 μL sekundært antistof fortyndet i 1% BSA i PBSX (typisk 1:500 fortynding af et fluorescerende antistof). Dæk i folie og inkuber på et roterende bord (20-30 omdrejninger) ved RT i 1 time.
- Gentag 3.2.10.
- Endelig fjerne SN og hæld tubules til et mikroskop dias. Adskil og arranger forsigtigt rør i lineære strimler ved hjælp af gel-loading tips. Afløb overskydende buffer og tilføje montering medium og en coverslip.
BEMÆRK: Undgå tørring af tubules, mens du arrangerer dem. Modbehuling af kernerne med DAPI er ikke nødvendig i de fleste tilfælde. Forsegl kanten af dækslet med neglelak for at forhindre tørring og forringelse af prøverne. Dias kan opbevares i 1-2 uger ved +4 °C før billedbehandling.
- Ved hjælp af en pipette overføres tubulesegmenterne (fra trin 2.4) i iskold PBS til et 15 mL konisk rør og lad dem sedimentere på is.
Representative Results
En vellykket transillumination-assisteret iscenesættelse og mikrodissection af mus seminiferous tubules afhænger primært af at finde de rette lysforhold og en passende dissektion mikroskop, og evnen til at genkende specifikke funktioner, der karakteriserer hvert trin. Trin VII-VIII fremstår homogent mørke, fordi de indeholder et stort antal fuldt kondenserede aflange spermatids, der er justeret på epitelets apikale overflade (Figur 5A og Figur S1). Efter at modne spermatozoer frigives i lumen i sædceller, fremstår tubulen meget bleg i trin IX-XI på grund af fraværet af kondenserede aflange spermatids i epitelet. Den nemmeste funktion at identificere på transilluminated tubules er det punkt, spermiation (stjerne i figur 5A og figur S1), det vil sige den pludselige overgang fra den mørke zone (VII-VIII) til den blege zone (IX-XI). Den blege zone efterfølges af den svage punktzone (XII-I). Det plettede udseende stammer fra organiseringen af aflange spermatids med kondenseret kromatin i bundter. Bundtene bliver meget fremtrædende i følgende stærke spotzone (II-V). Desuden migrerer spermatidbundter mod Sertoli-cellekerner, der er placeret tæt på det basale lamina, hvilket afspejles som stribet udseende af fase II-V-rør, når det transillumineres (Figur 2, Figur 5A, B og Figur S1). Bundter spredes endelig på trin VI, og kondenserende aflange spermatids bevæger sig tæt på de lumen, der skal frigives fra epitelet på trin VIII.
Den nøjagtige fase af tubulesegmentet kan verificeres nøjagtigt ved fasekontrastmikroskopi af squashpræparater(figur 2 og figur S2). De specifikke stadier i squashpræparater genkendes på grundlag af den akrosomale udvikling af trin 1-8 runde spermatids, status for kromatinkondensation i aflange spermatids og tilstedeværelsen af spermatidbundter16 (Figur 3 og Figur S2). Desuden kan tilstedeværelsen af tidligere celletyper, såsom type B spermatogonia og leptotene eller zygotene spermatocytter, der kan genkendes på grundlag af deres morfologiske træk, bruges til at understøtte fasegenkendelse. Størrelsen af pachytene spermatocytkerner stiger i størrelse omkring trin VI, hvilket også kan give yderligere hjælp til iscenesættelse.
Iscenesatte squashpræparater kan bruges til at studere ekspression og lokalisering af proteiner af interesse i det seminiferøse epitel ved hjælp af immunostaining. Dette giver mulighed for meget præcis analyse af celletypespecifikt udtryk på grund af den veldefinerede cellulære sammensætning på hvert trin. Stage-specifikke udtryk kan yderligere forstærkes ved co-farvning af acrosome(f.eksmed PNA), der muliggør visualisering af forskellige trin i runde spermatid differentiering. I figur S3findes repræsentative billeder af PNA-farvede acrosomer på forskellige stadier . Akrosomal farvning kan også bruges til at definere scenen med tilbagevirkende kraft. Den transilluminationsassisterede iscenesættelse er imidlertid en betydeligt lettere og hurtigere metode til at finde den ønskede fase end at bruge umærkede fragmenter på en tilfældig måde.
Seminiferous tubule helmontering farvning bruges typisk til at studere de celletyper, der er i kontakt med kælderen membranen af seminiferous epitel, enten på den rørformede side (spermatogonia, preleptotene spermatocytter og Sertoli celler; Figur 6A,B) eller den interstitielle side (peritubylære myoidceller og periubulære makrofager; Figur 6C og figur S4A)24. Metoden kan dog også bruges til at studere celler eller strukturer, der er placeret dybere i epitelet, såsom blod-testis-barrieren (Espin, Figur S4B) eller postmeiotiske kimceller (acrosomemarkør PNA, Figur S4C). Hvis der ved hjælp af ikke-stagnerede tubulesegmenter er det muligt at estimere et givet stadium med tilbagevirkende kraft ved hjælp af et antistof mod et protein, der udtrykkes i differentiering af spermatogonia (A1, A2, A3, A4, In og B; kollektivt Adiff) (Figur 2). Iscenesættelsen er derefter afhængig af tætheden af syncytial Adiff, der gennemgår seks mitotiske divisioner på en faseafhængig måde i den første cyklus af spermatogen differentiering1, hvilket fordobler antallet af Adiff spermatogonia i syncytia efter hver division1,25. Retrospektiv iscenesættelse er imidlertid mindre nøjagtig end transilluminationsassisteret iscenesættelse, fordi der ikke er nogen specifikke markører for forskellige generationer af Adiff, og vurdering af Adiff-tæthed kan være tilbøjelig til fejl.
Figur 1: Seminiferous epitelcykluskort til iscenesættelse af muse spermatogenese. Lodrette kolonner viser celletilknytninger på forskellige stadier af den seminiferøse epitelcyklus (markeret med romertal I-XII). De mest umodne kimceller er i bunden, mens de mest differentierede er øverst. For at følge udviklingen i kimcelledifferentiering skal man flytte fra venstre mod højre og fra bund til top. En cyklus af seminiferous epitel er en komplet serie af faser, der følger hinanden i en numerisk rækkefølge. Enudifferentieret spermatogonia; A1-4, type A1-A4 spermatogonia; I mellemliggende spermatogonia; B, type B spermatogonia; Pl, præleptoten spermatocytter; L, leptotene spermatocytter; Z, zygotene spermatocytter; P, pachytene spermatocytter; D, diploten spermatocytter; 2°, sekundære spermatocytter plus meiotiske divisioner. Arabertal 1-16 henviser til trin af post-meiotisk spermatid modning (spermiogenese). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Celleforeninger i faser af musens seminiferøse epitelcyklus. Stadier af den seminiferous epitelcyklus følger hinanden i en logisk rækkefølge og danner således den spermatogene bølge langs langs langsgående akse af en seminiferous tubule. Det øverste panel illustrerer kimcelleforeningerne på forskellige stadier og placeringen af celletyper i sertolicellernes cytoplasmiske lommer (lysegrå) i det seminiferøse epitel. Illustrationen af den seminiferous tubule visualiserer den spermatogene bølge og specifikke transilluminationsmønstre i det blege, svage punkt, stærke plet og mørke zoner. Fra hvert af de angivne stadier vises repræsentative levende cellefasekontrastbilleder af squashpræparater og periodiske syre-Schiff (PAS)-farvede testis tværsnit. Nederste to paneler viser segmenter af seminiferous tubule efter transillumination (top) eller farvning med antistoffer (nederst) mod SALL4 (rød, en pan-spermatogonial markør) og DNMT3A (grøn, en Adiff markør). Transilluminationsmønstrene for trin IX-XI, XII og VI fremhæves med boksede områder. Både lysabsorptionsmønster (øverst) og tæthed af DNMT3A-positiv differentierende spermatogonia (nederst) kan bruges til at definere det (omtrentlige) stadium af den seminiferøse cyklus. Efterfølgende generationer af Adiff kaldes type A1-A4, mellemliggende (In) og type B spermatogonia. Opdeling af hver resulterer i en fordobling af spermatogonial celletæthed. Den højeste celletæthed på kældermembranen i det seminiferøse epitel ses i trin VI-VIII, når meiotiske preleptotene spermatocytter (Pl) observeres. Skalastænger: squash prep. 10 μm, andre 50μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Trin af spermiogenese. Karakteristiske træk ved spermatids på forskellige trin af spermiogenese. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Arbejdsprocessen i denne undersøgelse. Transillumination mønster er blevet fuldt etableret i en voksen (>8 uger gammel) mus. Ofre musen og gå videre med testis dissektion og dekapsulation uden forsinkelse. Træk forsigtigt tubules fra hinanden på en petriskål. Fastgør rør til helmonterede pletter, eller fortsæt med transillumination. Under transillumination 1) skæres korte tubule segmenter af specifikke trin (r) for squash præparater (kvalitetskontrol eller immunostaining) eller 2) skære længere segmenter til at indsamle fase puljer til RNA og proteomics analyser, vævskultur eller for hele mount pletter. Korte rørsegmenter overføres til et mikroskopdias i 10 μL pbs-volumen. Placer en dækslet slip på segmentet for at tvinge ud cellerne og til at danne en levende celle monolayer. Overhold celletyperne under et mikroskop, og fastgør og pletter derefter. WMS, helmontering farvning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Seminiferous tubule af en voksen mus set under transillumination mikroskopi. (A)Et langt segment af seminiferous tubule set under transillumination viser bølge af seminiferous epitel. Der kan identificeres fire forskellige zoner baseret på kromatinkomprimering i spermatids og deres lokalisering i epitelet: mørk zone (trin VII-VIII), bleg zone (trin IX-XI), svagt punktzone (trin XII-I) og stærk spotzone (fase II-VI). Stjerne, sædkvalitet. Pile angiver to korte segmenter inden for den svage punktzone, der har et blegt udseende på grund af mekanisk stress på tubule. Skalastang: 500 μm. Indsat 1-5 er højere forstørrelser fra udvalgte tubule segmenter. (B) Sammenlagte segmenter af seminiferous tubule, der repræsenterer trin II-V (stærk pletzone), VII-VIII (mørk zone) og IX-XI (bleg zone). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fuldmonterede immunostainings ved hjælp af spermatogonial, Sertoli celle og peritubulære makrofag markører. (A) Helmonteringsfarvning for et segment, der repræsenterer fase XI-II med antistoffer mod GFRα1 (rød), SALL4 (grøn) og DNMT3B (blå). Farvningen afslører tre forskellige populationer af spermatogonia: enkeltstående (As)eller parret (Apr)udifferentieret stamceller spermatogonia (GFRα1+/ SALL4+/ DNMT3B-; hvide punkterede områder), korte syncytial (her 4 justerede celler; Aal4) stamfader spermatogonia (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B-; gule prikkede områder) og differentiering af spermatogonia (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B+). SALL4+/DNMT3B+ celler er type A3-A4 spermatogonia. (B) Helmonteret seminiferous tubule farvning med antistoffer mod GFRα1 (rød), USF1 (grøn) og SOX9 (blå). GFRα1 pletter stilken delmængde af spermatogonia. USF1 udtrykkes af både spermatogonia og SOX9+ Sertoli celler. (C) Peritubulære makrofager hos voksne mus er positive for både F4/80 (rød) og MHCII (blå). DAPI pletter DNA (grøn). Lyse store kerner er peritubulære myoid cellekerner. Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Et langt segment af seminiferous tubule set under transillumination viser bølge af seminiferous epitel. Der kan identificeres fire forskellige zoner baseret på kromatinkomprimering i spermatids og deres lokalisering i epitelet: svagt punktzone (trin XII-I), stærk pletzone (fase II-VI), mørk zone (fase VII-VIII) og bleg zone (trin IX-XI). Spermiation point (stjerne) kan genkendes som den mørke zone pludselig transitter ind i den blege zone. Skalastang: 500 μm. Indsat 1-4 er højere forstørrelser fra udvalgte tubule segmenter. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S2: Fasekontrastmikroskopi af levende cellemonomerer fra forskellige stadier af den seminiferøse epitelcyklus. (A) Trin I. Trin 1 runde spermatids mangler stadig acrosomal struktur. De er kendetegnet ved en lille rund kerne (røde cirkler) med et karakteristisk enkelt kromocenter (hvide pile). Kromatidkroppen er synlig i cytoplasmaet som et mørkt granulat i tæt kontakt med atommembranen (blå pile). Sertoli cellekerne (hvid cirkel) indeholder tre mørke foci: en stor nucleolus med to satellit kromcentre. Sertoli celler er unoften set i squash præparater, men de lejlighedsvis flyde ud fra tubule sammen med kimceller. (B) Fase II-IV. I trin 4 runde spermatids (røde cirkler) vises akrosomalstrukturen (røde pile) som en hvid lidt fladt vesikel fastgjort til den nukleare kuvert. Aflange spermatids danner bundter og har allerede et tykt flagellum (hvide pile), der angiver tilstedeværelsen af mitokondrieskeden i midten af sædhalen. Kernerne i pachytene spermatocytter (PSpc) er omtrent dobbelt så store som de runde spermatids og er kendetegnet ved mørke chromatin regioner fordelt over hele kernen. (C) Fase V-VI. I trin 5-6 runde spermatids (rød cirkel) er acrosomet yderligere fladt og spredes over kernen (røde pile). Arealet af den nukleare kuvert, der vender mod acrosome, vises mørkt på grund af tilstedeværelsen af acroplaxomet, en proteinrig plade mellem acrosomalmembranen og atommembranen. Aflange spermatids frigives fra bundter (hvide pile). Pachytene spermatocytter (PSpc) observeres ofte i epitelet. D) Fase VII-VIII. Acrosome (røde pile), en mørk foring på den nukleare kuvert med hvide skygger, er fuldt udvidet og dækker næsten hele den apikale side af trin 7-8 runde spermatids (røde cirkler). Denne fase er kendetegnet ved modne spermatids (hvide pile), der kan være rigelige på mange dele af squashpræparatet. Kernen i pachytene spermatocytter (PSpc) vokser i størrelse under udviklingen og synes større i fase VII-VIII end i tidligere faser. De mørke chromatin områder inde i kernen af pachytene spermatocytter (PSpc) synes fuzzy på grund af høj transskriptionel aktivitet og meiotiske begivenheder. (E) Trin X. Trin 10 spermatid nuclei (hvide pile) har indledt forlængelse, men kromatin er ikke kondenseret endnu. Acrosomes begynder at danne en krog på den nukleare spids (rød pil). Kernerne i pachytene spermatocytter (PSpc) synes meget store, da de forbereder sig på meiotiske divisioner. F) Fase XII. Stage XII er kendetegnet ved tilstedeværelsen af meiotiske metafaseplader (hvide stiplede cirkler). Små runde celler med typisk kondenseret chromatin mønster er zygotene spermatocytter (ZSpc), hvor søster kromosomer er på linje til at indlede synaptonemal kompleks dannelse. Skalastænger: 10 μm. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S3: Identifikation af stadiumet af seminiferous epitelcyklus på grundlag af akrosomal og nuklear farvning. Acetone-faste squashpræparater blev plettet med Rhodaminkonjugeret PNA og DAPI. Fase I: Selvom der ikke findes noget acrosome i trin 1 runde spermatids, kan et fuldt udviklet acrosome detekteres i aflange spermatids. Trin II-IV: Akrosomal udvikling begynder med udseendet af proacrosomal / acrosomal granulat i runde spermatids. Acrosomal vesikel på den nukleare overflade vises rundt indtil trin 3 spermatids, og derefter flader i trin 4 spermatids. Trin V: Den vinkel, som acrosomet har subtended, strækker sig fra 40 grader til maksimalt 95°. Etape VI-VII: Den vinkel, som acrosome subtended af acrosome strækker sig fra 95 grader til 120 grader. Trin VIII-IX: Acrosomet er fuldt udvidet i trin 8 spermatids (fase VIII), og nuclei polariserer på den apikale side af cellen, der kommer i kontakt med plasmamembranen (ikke vist). Ved fase IX bliver spermatidskernen deformeret; dorsale og ventrale overflader ses først. Trin X-XI: Spermatids viser den dorsale vinkel. Stage XII: Denne fase er bedst karakteriseret ved udseendet af meiotiske divisioner; metafaseplader er angivet med hvide pile. Aflange spermatids med deres acrosomes ses også. Skalastænger: 10μm. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S4: Helmonteret farvning til ukonventionelle markører. (A) Alpha glat muskel actin (aSMA) udtrykkes ved peritubular myoid celler. (B) Espin lokaliserer til Sertoli celle stramme vejkryds og bidrager til blod-testis barriere. (C) PNA lokaliserer til acrosomes af spermatids. Skalastænger: 50μm. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende video 1: Skæring af et kort segment af seminiferous tubule, der repræsenterer fase VII-VIII. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Den transilluminationsassisterede mikrodissection-metode, som vi har beskrevet ovenfor, muliggør en faseorienteret tilgang til studiet af spermatogenese. Spermatogenese er en stærkt synkroniseret proces, og alle vigtige trin under spermatogen differentiering reguleres og udføres på en faseafhængig måde, såsom differentieringsforpligtelse (i fase VII-VIII), starten af meiose (VII-VIII), meiotiske divisioner (XII), debut af spermatid-forlængelse (VIII) og sædafledning (VIII)1,26,27. Den faseorienterede analyse giver et effektivt værktøj til at studere disse særlige begivenheder, der er begrænset til specifikke trin af spermatogenese og derfor kun findes på definerede stadier af den seminiferøse epitelcyklus. Mastering metoden tager nogle praksis og brug af en god kvalitet dissektion mikroskop og ordentlige lysende forhold er nøglen til succes. Implementering af denne metode som en del af den daglige værktøjskasse har en kapacitet til i høj grad at forbedre virkningen og den biologiske relevans af forskning i mandlige reproduktive funktioner ved at tillade mere præcis dissektion af molekylære hændelser under spermatogenese.
Alle WT-musestammer, som vi har studeret, viser et lignende transilluminationsmønster og udviser bevarede celleforeninger på stadier af den seminiferøse epitelcyklus. På betingelse af, at spermiogen differentiering af kimceller ikke er groft forskellig fra WT-mus, gælder det samme også for alle de knock-out musemodeller, som vi har studeret. Desuden kan det anvendes på andre arter, der udviser langsgående segmentarrangement af stadier af den seminiferøse epitelcyklus7. Arter med ikke-segmentale stadier (f.eks. mennesker) kan dog ikke anvendes. I betragtning af den væsentlige rolle, som kromatinkondensation spiller i aflange spermatids i definitionen af transilluminationsmønsteret, er det klart, at enhver forkert regulering af denne proces uundgåeligt vil påvirke gennemførelsen af denne metode. Hos unge mus og unge voksne (5-6 uger) er transilluminationsmønsteret endnu ikke fuldt etableret, og derfor bør der kun anvendes mus, der er ældre end 8 uger. Det er også vigtigt at huske på, at klemme og trække tubules uundgåeligt vil gribe ind i transillumination mønster, fordi det fordrejer den cellulære arkitektur inden for seminiferous epitel.
De isolerede seminiferous tubule segmenter kan også dyrkes muliggør ex vivo observation og manipulation af spermatogenesis-koblede processer, herunder meiose. For at sikre vævets levedygtighed og forhindre RNA- og proteinforringelse skal prøverne indsamles og behandles senest 2 timer efter, at musen er gået på kompromis. For ex vivo kultur af seminiferous tubules, bør tiden fra offer til debut af kultur ikke overstige 1 time. Integriteten af tubulefragmenter kan typisk opretholdes op til 72 timer in vitro, hvis de høstes korrekt.
Fasen af den seminiferøse epitelcyklus kan verificeres og defineres endnu mere præcist ved hjælp af fasekontrastmikroskopi af squashpræparater16. Mikroskopi udføres på levende celler, som giver en ekstra dimension i analysen og tillader observation af organelle eller cellebevægelser i specifikke stadier af spermatogenese28,29,30. Fasekontrastmikroskopi giver nøjagtig iscenesættelse til efterfølgende immunostaining, hvilket muliggør meget detaljeret analyse af proteinudtryk og lokaliseringsdynamik under spermatogenese, herunder fasespecifikke ændringer.
Mens celler frigives fra epitelkonteksten i squashpræparater, gør fuldmonteringsimfreimationer af tubulesegmenter det muligt at studere spermatogene celler i deres fysiologiske miljø. Derfor kan hele monteringspræparater give en bedre visualisering af seminiferous tubule arkitektur og dens intercellulære kontakter end immunostaining på tværsnit. Det er vigtigt, at transillumination-assisteret iscenesættelse af tubulesegmenterne forud for immunostaining gør tilgangen endnu mere kraftfuld ved at inkludere oplysninger om den specifikke fase af et givet segment. Helmonteringsfarvning er et særligt nyttigt værktøj til undersøgelse af celler i periferien af seminiferøse tubules, såsom peritubulære myoidceller, peritubulære makrofager og spermatogonia, men kan også åbne ny indsigt i forskning i meiotiske og postmeiotiske kimceller.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af stipendier fra Finlands Akademi [315948, 314387 til N.K.]; Sigrid Jusélius Fonden [til N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [til J.-A.M., T.L.]; Turku Ph.d.-program for molekylær medicin [S.C.-M., O.O.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| cover glass 20x20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
| Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
| microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
| Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
| rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).
- Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).
- de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. , ELseiver. (2018).
- Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).
- Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154 (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).
- Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. Histological and histopathological evaluation of the testis. , Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).
- Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).
- Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30 (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).
- Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).
- Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).
- Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).
- Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).
- Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142 (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).
- La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).
- Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).
- Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).
- Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).
- Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).
- Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).
- Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).
