Summary
Detta protokoll beskriver transillumination-assisted microdissection av segment av vuxna mus seminiferous tubules representerar specifika stadier av seminiferous epitelial cykel och cell typer däri, och efterföljande immunostaining av squash preparat och intakt tubule segment.
Abstract
Spermatogenesis är en unik differentieringsprocess som i slutändan ger upphov till en av de mest distinkta celltyperna i kroppen, spermierna. Differentiering av könsceller sker i de cytoplasmiska fickorna i somatiska Sertoli-celler som är värd för 4 till 5 generationer av könsceller samtidigt och samordnar och synkroniserar deras utveckling. Därför är sammansättningen av könscellstyper inom ett tvärsnitt konstant, och dessa cellassociationer är också kända som stadier (I-XII) i den seminifera epitelcykeln. Viktigt är att steg också kan identifieras från intakta seminiferous tubules baserat på deras differentiella ljus absorption/scatter egenskaper som avslöjas av transillumination, och det faktum att stadierna följer varandra längs tubule i en numerisk ordning. Denna artikel beskriver en transillumination-assisted microdissection metod för isolering av seminiferous tubule segment som representerar specifika stadier av mus seminiferous epitelial cykel. Ljusabsorptionsmönstret för seminiferous tubules inspekteras först under ett dissekeringsmikroskop, och sedan skärs tubulesegment som representerar specifika steg och används för nedströmsapplikationer. Här beskriver vi immunostaining protokoll för stegspecifika squash preparat och för intakta tubule segment. Denna metod gör det möjligt för en forskare att fokusera på biologiska händelser som äger rum i specifika faser av spermatogenes, vilket ger ett unikt verktyg för utvecklingsmässiga, toxikologiska och cytologiska studier av spermatogenes och underliggande molekylära mekanismer.
Introduction
Differentiering av manliga könsceller från diploid spermatogonia till mogna haploid spermatozoa, dvs,spermatogenesis, är en komplex process som äger rum i epitel av seminiferous tubules i testikel av en sexuellt mogen individ1. Mitotiska ättlingar till A1 spermatogonia delar först fem gånger för att expandera den differentieringsbefäst populationen och ange sedan meios som spermatocyter som i slutändan ger upphov till haploid spermatider. Differentiering av runda spermatider till spermatozoa, dvs.spermiogenesis, innebär komplexa förändringar i cellulär morfologi, inklusive nukleär komprimering och konstruktion av spermiespecifika strukturer som acrosome och flagellum. I musen tar hela processen med spermatogenes 35 dagar att slutföra2,3.
På en given plats är det seminiferous epitel värd upp till fem kohorter av differentierande könsceller plus könsstammen /stamcellerna och de somatiska Sertoli cellerna1. Differentierande könsceller bildar koncentriska lager vars sammansättning är förutsägbar, och haploida celler i ett givet utvecklingssteg associerar alltid med vissa typer av spermatocyter och spermatogonia4,5. Därför är alla tvärsnitt av en tubule värdkohorter av könsceller med en konstant komposition. Dessa specifika cellassociationer definieras som stadierna i det seminifera epitelet. Steg i sig presenterar inte stillastående kontrollpunktsliknande tillstånd utan utvecklas kontinuerligt när differentiering av bakteriecellkohorter fortskrider i synkron1,2,6. Hos möss finns det 12 steg (I-XII)2 som är ordnade på ett segmentalt sätt längs den längsgående axeln i den seminifera tubuleen, och de följer varandra i en logisk ordning och bildar därmed vågen av seminiferous epitel, eller spermatogenic wave7,8,9 ( Figur1). Slutförandet av spermatogenesis tar fyra cykler, och hierarkiska skikt eller kohorter av differentierande könsceller inom någon seminiferous tubule tvärsnitt är temporalt en seminiferous cykel bortsett från varandra. Cykelns längd är artberoende och i musen tar varje cykel 8,6 dagar10.
Stadierna kan identifieras på grundval av den cellulära sammansättningen och organisationen av det seminifera epitelet på histologiska testisavsnitt5 (figur 1 och figur 2). Histologisk analys är dock mödosam, tidskrävande och kräver fixering och färgning, och kan därför inte tillämpas på levande vävnad. Viktigt är att iscensättning också kan utföras på levande vävnad under ett dissekeringsmikroskop genom att dra nytta av distinkta ljusabsorptions-/spridningsmönster som uppvisas av olika stadier av cykeln (figur 2). Varje stegs förmåga att absorbera och sprida ljus är i förhållande till kromatinkondensen hos sena postmetiotiska spermatider som varje givet stadium är värd och förpackningen av dessa celler ibuntar 7,11. Spermatid differentiering, dvs.spermiogenesis, är ytterligare uppdelad i 16 utvecklingssteg, inklusive 8 steg av rund spermatid (steg 1-8) och 8 steg av långsträckt spermatid (steg 9-16) differentiering (Figur 1). Steg 9-11 långsträckta spermatider (steg IX-XI) visar endast en låg nivå av kromatinkondens som resulterar i att låg mängd ljus absorberas. Kromatinkondensation börjar i steg 11 spermatider (steg XI) och steg 15-16 långsträckta spermatider (steg IV-VIII) innehåller helt kondenserad kromatin och uppvisar därför maximal ljusabsorption (figur 3). Kromatin måste kondenseras för att tätt packas i spermiehuvudet. Ytterligare faktorer som bidrar till ljusabsorptionsmönstret är placeringen av långsträckta spermatider i epitel (basal kontra apical) och buntning av långsträckta spermatider (uttalade i steg II-V)11 (Figur 3). Buntar ses som fläckar i mitten av tubulerna och som ränder på kanterna under ett dissekeringsmikroskop och desto mer kondenserad kromatin, desto mörkare spot / rand11.
Denna artikel beskriver användningen av transillumination-assisted microdissection metod för isolering av seminiferous tubule segment som representerar specifika stadier av seminiferous epitelial cykeln. När de har isolerats kan iscensatta tubulesegment bli föremål för olika nedströmsanalyser, inklusive biokemiska RNA- ochproteinanalyser 12,13,14,15, flödescytometri16, ex vivo-tubulekultur 17 och immunostaining18. Här tillhandahåller vi också detaljerade nedströms protokoll för att förbereda squashed monolayers av iscensatta tubule segment för levande cell morfologisk analys och efterföljande immunostaining, liksom hela mount immunostainings av tubule segment. Arbetsflödet i ett nötskal som beskrivs i figur 4.
Den transilluminationsassisterade mikrodissektionsmetoden möjliggör noggrann identifiering och isolering av könsceller vid specifika differentieringssteg tack vare den synkroniserade cellulära sammansättningen av stadierna. Viktigt är också att det möjliggör studier av scenberoende händelser under spermatogenes på levande vävnad. Med tanke på bristen på skalbara in vitro-modeller för spermatogenes har denna metod också en unik fördel med att tillåta riktade kortsiktiga utvecklingsstudier och toxikologiska studier på scenspecifika tubulesegment ex vivo12,17. Medan vi beskriver metoden här för musen, kan samma förfarande tillämpas på alla däggdjursarter med längsgående och segmental arrangemang av seminifera epitelstadier, såsom råtta4,7,15,19,20.
Protocol
Underhåll av laboratoriemöss och alla djurförsök gjordes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter för vård och användning av försöksdjur vid Åbo universitet.
1. Beredning av seminiferous tubules för mikrodissektion
- Offra en vuxen manlig mus (≥8 veckor gammal, testikel 80-120 mg beroende på stam och ålder) via CO2 kvävning följt av massundersökning förskjutning.
OBS: Musen ska vara sexuellt mogen, och helst minst 8 veckor gammal. Transillumination mönster av juvenil möss skiljer sig från vuxna eftersom vågen av seminiferous epitel ännu inte har fastställts fullt ut, och tidpunkten för den första vågen av spermatogenesis ärdistinkt 21,22. Brist på långsträckta spermatider i <4 veckor gamla hanmöss utesluter deras användning för transillumination-assisterad mikrodissektion. Alla musstammar som har normal spermatogenes kan användas. - Spraya ventral buken med 70% etanol. Öppna abdominopelvichålan med steril sax, vilket gör en V-formad öppning.
- Dra i den epididymala fettdynan med sterila tångar, lokalisera testikelerna, dissekera dem med sax och placera dem på en steril 100 mm Petri-skål som innehåller PBS.
OBS: För att bibehålla steriliteten, se till att alla labware och kirurgiska verktyg är sterila. - Med finspetsad sax halshugger testiklen genom att skära en slits i tunica albuginea, den tjocka fibrösa arket som kapslar in testiklar. Riv sedan upp tunikan med ett par tångar. Tvinga ut tubulerna genom att trycka med tång och kassera tunikan.
OBS: När tunika kasseras kan det vara fördelaktigt för vissa nedströmsapplikationer att arteri testikel avlägsnas tillsammans med tunika. Undvik att skada de seminiferous tubulesna. - Flytta de seminiferous tubulerna till en ny Petri-maträtt och häll tillräckligt med steril PBS för att täcka botten av Petri-skålen. Dra sedan försiktigt isär tubulerna men undvik att skada tubulerna.
OBS: För mycket mekanisk stress kommer att påverka transilluminationsmönstret och påverka vävnadens livskraft och dess cellulära arkitektur. Tubulerna kan också bearbetas för helmonterade immunostainings från denna punkt utan iscensättning (3B). Ibland är det tillräckligt att definiera scenen retroaktivt genom att inkludera antikroppar mot proteiner uttryckta i differentierande spermatogonia, såsom SALL4, c-KIT och DNMT3A18,23. Spermatogonias densitet är en relativt tillförlitlig stegindikator (figur 2).
2. Transilluminationsassisterad mikrodissektion
- Placera petriskålen under ett dissekeringsmikroskop ordentligt genom att tejpa fast den på scenen.
OBS: Det är viktigt att tejpa petriskålen väl för att förhindra dess rörelse som kan orsaka blandning av de uppsamlade iscensatta seminiferous tubule segmenten. - För att avslöja ljusabsorptionsmönstret för seminiferous tubules i fokus, se till att provet är upplyst underifrån och ljuset passerar genom provet, dvs.
OBS: Mängden ljus som absorberas/sprids är i förhållande till kromatinskondensnivån vid långsträckta spermatider och deras buntning inuti den seminiferous tubule: desto mer kondenserad absorberas, dvs. - Bekanta dig med ljusabsorptionsmönstret i olika steg enligt beskrivningen i figur 2, figur 5A och figur S1 genom att försiktigt flytta buntar av tubuler med fina tångar.
OBS: Stadierna följer alltid varandra i en logisk ordning och bildar vågen av seminiferous epitel. Det är dock viktigt att veta att riktningen på den spermatogena vågen ibland vänder och sedan återgår tillbaka igen (även känd sommodulering 4,9), ibland komplicera proceduren. Längden på varje steg, när det gäller hur många mm tubule, varierar också avsevärt. - Lyft försiktigt upp den tubule som är av intresse med hjälp av tång med en krokad spets och skär sedan ett segment med lämplig längd med hjälp av mikrodissektionssax (se kompletterande video 1). En krok vid tångspetsen gör det lättare att lyfta och hålla i en tubule och hjälper till att undvika att klämma på den.
OBS: Längden på de segment som ska skäras beror på nedströmsapplikationer. För insamling av poolade tubulebitar i ett visst stadium för protein- eller RNA-analys12,13 (II–V, VII–VIII och IX–XI, figur 5B)är längden vanligtvis 2–5 mm. När standard fenol-kloroform extraktion används, cirka 200 ng RNA kan härledas från 1 mm tubule. För helmonteringsfärgning av stegvisa tubulesegment bör segmentens längd vara >5 mm. För squashpreparat bör segmentens längd inte överstiga 1–2 mm eftersom cellerna i mitten av segmentet kan misslyckas med att gå ut om de är för långa. Använd en mm skala under Petri-skålen för en noggrann mätning av tubulelängden.
3. Immunostaining av olika preparat
- Squashpreparat: scenverifiering och immunostaining
OBS: Scenspecifika tubulebitar kan krossas på en mikroskopbild med ett täckglas för att utföra morfologisk analys av levande celler genom faskontrastmikroskopi och efterföljande immunostaining. En nybörjare rekommenderas att använda den här metoden för att verifiera stadierna när man bekantar sig med den transilluminationsassisterade mikrodissektionsmetoden.- Samla segmentet i en volym av 10 μL med en pipett och flytta det till en mikroskopbild.
- Krossa tubuleen genom att placera ett täckglas (20 mm x 20 mm) försiktigt på tubuleen. Som ett resultat kommer celler att strömma ut tubule och bilda en levande cell monoskikt. Placera ett filterpapper på kanten av täckglaset för att underlätta spridningen av celler. Undvik att krossa cellerna för mycket för att hålla dem vid liv.
- Övervaka cellspridning under ett mikroskop. Använd ett faskontrastmikroskop vid 40x-målet för att verifiera scenigenkänningen genom att undersöka de celltyper som finns (figur 2, figur S2).
- När cellerna har spridit sig till ett runt monoskikt från båda ändarna av tubuleen, doppa glidningen i en behållare som innehåller flytande kväve medan du håller den med tång. Håll den nedsänkt i 10 s. Alternativt placera rutschkanan på en torr isplatta för frysning.
- Ta bort täckglaset genom att vända av det med en skalpell.
- Utan dröjsmål, fortsätt med fixeringen och placera snabbt bilden i en behållare med 90% etanol i 2-5 min.
OBS: Se till att squashpreparatet inte tinar innan det placeras till 90% etanol. Andra fixativ kan också användas, såsom aceton, i 10 minuter. - Lufttorka och förvara i rumstemperatur (RT) (upp till vissa dagar) eller vid -80 °C (långsiktigt).
- För immunostaining, efterfixa proverna i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minuter på RT.
- Skölj i PBS och permeabilisera med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
- Skölj i PBS och dra en fettring runt varje squashprov.
- Tillsätt 50–100 μL 10 % BSA (bovint serumalbumin) i 0,1 % interpolering i PBS (PBST) inuti fettringen och blockera prover i 30 minuter vid RT.
- Ta bort BSA-lösningen och inkubera med en primär antikropp utspädd i 10% BSA i PBST i 1 timme vid RT.
- Tvätta 3x i 5 min med PBST.
- Inkubera med en sekundär antikropp utspädd i 10% BSA i PBST.
OBS: För att färga acrosomes kan proverna inkuberas med Rhodamine-märkt Jordnöts agglutininantikropp (PNA, 1:1000) i 10% BSA i PBST i 1 h vid RT (Figur S3) istället för specifika primära och sekundära antikroppar. - Tvätta 3x i 5 minuter vardera med PBST, skölj med PBS och montera med en monteringsanordning som innehåller DAPI.
- Fullmonterad immunostaining av seminiferous tubules
OBS: Protokollet nedan beskriver helmonterad färgning för steg 2.4-tubulesegment. Om en forskare vill utföra helmonteringsfärgning utan mellanlagring (från steg 1.5), var uppmärksam på anteckningar i 3.2.1 och 3.2.7.- Använd en pipett och överför tubulesegmenten (från steg 2.4) i iskallt PBS till ett koniskt rör på 15 ml och låt dem sedimentera på is.
OBS: Om du använder odemörda tubuler från 1.5, separera tubulerna i en Petri-skål genom att pipetting upp och tillbaka på en lutad maträtt flera gånger. Använd en 1 ml pipett med en snittspets. Detta steg är avsett att öppna vävnadens struktur. Undvik dock för mycket pipetting eftersom det kan skada tubulerna. Sedimentering av tubuler tar cirka tiotals sekunder. Små tubulefragment, interstitiella celler och cellskräp stannar i supernaten. - Ta försiktigt bort supernaten (SN) genom pipetting eller med en aspirator. Tillsätt 10 ml iskallt PBS och blanda genom inversion.
- Låt sedimentera och ta sedan bort SN som tidigare.
- Tillsätt 5 ml 4 % PFA och fixera i 5 timmar på ett roterande bord (20–30 varv/min) vid +4 °C.
OBS: Fixeringstiden beror på proteinerna av intresse och deras subcellulära lokalisering. För nukleära och cytoplasmaproteiner är en 2 h fixering vanligtvis tillräcklig, men membranmarkörer, såsom GFRα1 (GDNF familjereceptor alfa 1; Figur 6A,B), dra nytta av en längre fixering, upp till 6 timmar. - Låt sedimentera, ta bort SN (PFA) som tidigare och skölj kort genom att tillsätta 10 ml PBS och invertera röret.
- Låt sedimentera, ta bort SN som tidigare och upprepa PBS-tvättsteget tre gånger i minst 10 minuter vardera på ett roterande bord vid +4 °C och fortsätt med färgning eller förvara vid +4 °C.
OBS: Om arbetsförhållandena är sterila och rengör kan proverna förvaras och användas i minst några veckor. Alternativt kan du tillsätta natriumazid till en slutlig koncentration på 0,02% (w/v) från en 2% stamlösning för att hjälpa till att bevara tubulerna före lagring vid +4 °C. - Använd en 1-ml pipett och flytta 10–20 fasta tubulesegment till ett 2 ml rundbottnat rör. Låt sedimentera och ta bort SN.
OBS: Om du arbetar med långa tubuler som inte har iscensatts, häll tubulerna på en Petri-skål och använd mikrodissektionssax och tångskurna segment på cirka 5–20 mm. För långa segment kommer att trassla under färgningsproceduren, medan för korta segment lätt går förlorade. - Tillsätt 1 ml 2% BSA + 10% FBS (fetala nötkreatursserum) i 0,3% Triton X-100 i PBS (PBSX). Blockera i minst 1 timme på ett roterande bord (20–30 varv/min) på RT.
- Skölj med 1 ml PBSX, ta bort SN genom pipetting och tillsätt 250 μL primär antikropp utspädd i 1% BSA i PBSX (1:100–1:2000 utspädning). Inkubera i 2 timmar vid RT eller över natten vid +4 °C på ett roterande bord (20–30 varv/min).
- Ta bort antikroppslösningen genom att pipetera och skölj tubulerna med 1 ml VÄXEL ENLIGT ovan. Tvätta tre gånger i 1 timme i PBSX på ett roterande bord (20–30 varv/min) på RT.
OBS: Efter denna första tvätt kan provet lämnas över natten vid +4 °C vid behov. - Ta bort SN och tillsätt 250 μL sekundär antikropp utspädd i 1% BSA i PBSX (vanligtvis 1:500 utspädning av en fluorescerande märkt antikropp). Täck i folie och inkubera på ett roterande bord (20–30 varv/min) på RT i 1 timme.
- Upprepa 3.2.10.
- Ta slutligen bort SN och häll tubulerna i en mikroskopbild. Separera försiktigt och ordna tubuler i linjära remsor med gelbelastningsspetsar. Töm överflödig buffert och tillsätt monteringsmedium och ett täckskydd.
OBS: Undvik torkning av tubulerna när du ordnar dem. Motfärgning av kärnorna med DAPI är inte nödvändigt i de flesta fall. Täta av kanten på täcket med nagellack för att förhindra provtorkning och försämring. Diabilder kan förvaras i 1–2 veckor vid +4 °C före avbildning.
- Använd en pipett och överför tubulesegmenten (från steg 2.4) i iskallt PBS till ett koniskt rör på 15 ml och låt dem sedimentera på is.
Representative Results
En framgångsrik transillumination-assisterad iscensättning och mikroskop av mus seminiferous tubules beror främst på att hitta rätt ljusförhållanden och ett lämpligt dissekeringsmikroskop, och förmågan att känna igen specifika funktioner som kännetecknar varje steg. Steg VII-VIII verkar homogent mörka eftersom de innehåller ett stort antal helt kondenserade långsträckta spermatider som är i linje vid epitelens apatiska yta (figur 5A och figur S1). Efter mogna spermatozoa släpps ut i lumen i spermiation, tubule verkar mycket blek i steg IX-XI på grund av avsaknad av kondenserade långsträckta spermatider i epitel. Den enklaste funktionen att identifiera på transilluminerade tubuler är spermiationspunkten (asterisk i figur 5A och figur S1), det vill säga den plötsliga övergången från den mörka zonen (VII–VIII) till den bleka zonen (IX–XI). Den bleka zonen följs av svag punktzonen (XII–I). Det fläckiga utseendet härstammar från organisationen av långsträckta spermatider med kondenserad kromatin i buntar. Buntarna blir mycket framträdande i följande starka punktzon (II-V). Dessutom migrerar spermatidbuntar mot Sertoli-cellkärnor som ligger nära basal lamina, vilket återspeglas som randigt utseende av steg II–V-tubule när de transillumineras (figur 2, figur 5A,B och figur S1). Buntar skingras slutligen i steg VI och kondenserande långsträckta spermatider rör sig nära lumen som ska släppas ut från epitelet i steg VIII.
Det exakta stadiet av tubulesegmentet kan kontrolleras noggrant genom faskontrastmikroskopi av squashpreparat(figur 2 och figur S2). De specifika stadierna i squashpreparat erkänns på grundval av den acrosomala utvecklingen av steg 1-8 runda spermatider, statusen för kromatinkondens vid långsträckta spermatider och närvaron av spermatidpaket16 (figur 3 och figur S2). Dessutom kan närvaron av tidigare celltyper, såsom typ B-spermatogonia och leptotene eller zygoten spermatocyter, som kan kännas igen på grundval av deras morfologiska egenskaper, användas för att stödja scenigenkänning. Storleken på pachytene spermatocytekärnor ökar i storlek runt steg VI, vilket också kan ge ytterligare hjälp i iscensättning.
Iscensatta squashpreparat kan användas för att studera uttryck och lokalisering av proteiner av intresse i seminiferous epitel med hjälp av immunostaining. Detta möjliggör mycket noggrann analys av celltypspecifikt uttryck på grund av den väldefinierade cellsammansättningen i varje steg. Stegspecifika uttryck kan förstärkas ytterligare genom samfärgning av acrosome(t.ex.med PNA) som möjliggör visualisering av distinkta steg av rund spermatid differentiering. Representativa bilder av PNA-färgade akrosomer i olika skeden finns i figur S3. Den acrosomala färgningen kan också användas för att definiera scenen retroaktivt. Den transilluminationsassisterade iscensättningen är dock en betydligt enklare och snabbare metod för att hitta önskat stadium än att använda otaggade fragment på ett slumpartat sätt.
Seminifera tubule helmonterad färgning används vanligtvis för att studera de celltyper som är i kontakt med källarmembranet i seminiferous epitel, antingen på den rörformiga sidan (spermatogonia, preleptotene spermatocyter och Sertoli celler; Figur 6A,Beller den mellansidessidan (peritubulära myoidceller och peritubulära makrofager. Figur 6C och figur S4A)24. Metoden kan dock också användas för att studera celler eller strukturer som ligger djupare i epitel, såsom blodtestisbarriären (Espin, figur S4B)eller postmetiotiska könsceller (acrosome markör PNA, Figur S4C). Vid användning av odemälda tubulesegment är det möjligt att uppskatta ett givet stadium retroaktivt med hjälp av en antikropp mot ett protein som uttrycks i differentiering av spermatogonia (A1, A2, A3, A4, In och B; kollektivt Adiff) (Figur 2). Iscensättning förlitar sig sedan på densitet av syncytial Adiff som genomgår sex mitotiska uppdelningar på ett stegberoende sätt under den första cykeln av spermatogenic differentiering1, därför fördubblar antalet Adiff spermatogonia i syncytia efter varje division1,25. Retrospektiv iscensättning är dock mindre exakt än transillumination-assisterad iscensättning eftersom det inte finns några specifika markörer fördistinkta generationer av A diff och bedömning av Adiff densitet kan vara benägna att fel.
Figur 1: Seminifer epitelial cykel karta för iscensättning av musen spermatogenesis. Vertikala kolumner visar cellassociationer i olika stadier av den seminifera epitelcykeln (markerad med romerska siffror I–XII). De mest omogna könscellerna är längst ner, medan de mest differentierade är högst upp. För att följa utvecklingen av bakteriecells differentiering måste man flytta från vänster till höger och från botten till toppen. En cykel av det seminiferous epitel är en komplett serie steg som följer varandra i numerisk ordning. Enund, odifferentierad spermatogonia; A1–4, typ A1–A4 spermatogonia; I, mellanliggande spermatogonia; B, spermatogonia av typ B; Pl, preleptotene spermatocyter; L, leptotene spermatocyter; Z, zygoten spermatocyter; P, pachytene spermatocyter; D, diploten spermatocyter; 2°, sekundära spermatocyter plus meiotiska uppdelningar. Arabiska siffror 1-16 hänvisar till steg av post-meiotic spermatid mognad (spermiogenes). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Cellassociationer i stadier av musens seminifera epitelcykel. Stadier av den seminiferous epitelial cykeln följer varandra i en logisk ordning, och bildar därmed den spermatogenic vågen längsgående axeln av en seminiferous tubule. Den övre panelen illustrerar bakteriecellsassociationerna i olika stadier och placeringen av celltyper i de cytoplasmiska fickorna i Sertoli-celler (ljusgrå) i det seminifera epitelet. Illustrationen av den seminiferous tubule visualiserar den spermatogenic vågen och specifika transillumination mönster av den bleka, svaga punkten, stark punkt och mörka zoner. Från varje angiven steg visas representativa levande cell fas-kontrast bilder av squash preparat och periodiska syra-Schiff (PAS)-färgade testiklesk tvärsnitt. Botten två paneler visar segment av seminiferous tubule efter transillumination (överst) eller färgning med antikroppar (botten) mot SALL4 (röd, en pan-spermatogonial markör) och DNMT3A (grön, en Adiff markör). Transilluminationsmönstren för etapperna IX-XI, XII och VI markeras med boxade områden. Både ljus absorption mönster (överst) och densitet av DNMT3A-positiva differentiering spermatogonia (botten) kan användas för att definiera (ungefärliga) etappen av seminiferous cykeln. På varandra följande generationerav A-diff kallas typ A1–A4, mellanliggande (In) och typ B-spermatogonia. Uppdelning av varje resulterar i fördubbling av spermatogonial celltäthet. Den högsta celltätheten på källarmembranet i det seminifera epitelet ses i steg VI–VIII när meiotiska preleptotene spermatocyter (Pl) observeras. Skalstänger: squash prep. 10 μm, andra 50μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Steg av spermiogenes. Utmärkande egenskaper hos spermatider vid olika steg av spermiogenesis. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Arbetsflöde för denna studie. Transillumination mönster har helt fastställts i en vuxen (>8 veckor gammal) mus. Offra musen och fortsätt med testis dissekering och halshuggning utan dröjsmål. Dra försiktigt isär tubulerna på en petriskål. Fixera tubuler för helmonterade färgningar eller fortsätt med transillumination. Under transillumination 1) skära korta tubule segment av specifika steg (er) för squash preparat (kvalitetskontroll eller för immunostaining) eller 2) skära längre segment för att samla steg pooler för RNA och proteomics analyser, vävnad kultur eller för hela mount färgningar. Överför korta tubulesegment till en mikroskopbild i 10 μL volym PBS. Placera en täckglimt på segmentet för att tvinga ut cellerna och bilda ett levande cellmonoskikt. Observera celltyperna under ett mikroskop och fixa och fläcka sedan. WMS, helmonterad färgning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Seminiferous tubule av en vuxen mus sett under transillumination mikroskopi. a)Ett långt segment av seminiferous tubule sett under transillumination som visar vågen av seminiferous epitel. Fyra distinkta zoner kan identifieras baserat på kromatinkomprimering i spermatider och deras lokalisering inom epitel: mörk zon (steg VII–VIII), blek zon (steg IX-XI), svag punktzon (steg XII–I) och stark punktzon (steg II–VI). Asterisk, spermiationspunkt. Pilar indikerar två korta segment inom svag punktzonen som har ett blekt utseende på grund av mekanisk påfrestning på tubuleen. Skalstång: 500 μm. Insets 1–5 är högre förstoringar från utvalda tubulesegment. B) Poolade segment av seminiferous tubule som representerar steg II–V (stark dekorzon), VII–VIII (mörk zon) och IX–XI (blek zon). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Helmonterade immunostainings med spermatogoniala, Sertoli cell och peritubulära makrofag markörer. (A) Helmonteringsfärgning för ett segment som representerar steg XI–II med antikroppar mot GFRα1 (röd), SALL4 (grön) och DNMT3B (blå). Färgningen avslöjar tre distinkta populationer av spermatogonia: singly-isolerade (A)eller parade (Apr)odifferentierade stam spermatogonia (GFRα1+/SALL4+/DNMT3B-; vita prickade områden), kort synytial (här 4 anpassade celler; Aal4) stamceller spermatogonia (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B-; gula prickade områden) och differentiering av spermatogonia (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B+). SALL4+/DNMT3B+ celler är typ A3–A4 spermatogonia. (B) Helmonterad seminiferous tubule färgning med antikroppar mot GFRα1 (röd), USF1 (grön) och SOX9 (blå). GFRα1 fläckar stamundergruppen av spermatogonia. USF1 uttrycks av både spermatogonia och SOX9+ Sertoli celler. (C) Peritubulära makrofager hos vuxna möss är positiva för både F4/80 (röd) och MHCII (blå). DAPI fläckar DNA (grön). Ljusa stora kärnor är peritubulära myoidcellkärnor. Skalstänger: 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur S1: Ett långt segment av seminiferous tubule sett under genomskinlighet som visar vågen av seminiferous epitel. Fyra distinkta zoner kan identifieras baserat på kromatinkomprimering i spermatider och deras lokalisering inom epitel: svag punktzon (steg XII–I), stark punktzon (steg II–VI), mörk zon (steg VII–VIII) och blek zon (steg IX–XI). Spermiation punkt (asterisk) kan kännas igen som den mörka zonen plötsligt passerar in i den bleka zonen. Skalstång: 500 μm. Insets 1–4 är högre förstoringar från utvalda tubulesegment. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Figur S2: Faskontrastmikroskopi av levande cellmonoskikt i olika stadier av den seminifera epitelcykeln. StegI.Steg 1 runda spermatider saknar fortfarande acrosomalstrukturen. De kännetecknas av en liten rund kärna (röda cirklar) med ett distinkt enda kromocenter (vita pilar). Kromatoidkroppen är synlig i cytoplasman som en mörk granulat i nära kontakt med kärnmembranet (blå pilar). Sertoli cellkärna (vit cirkel) innehåller tre mörka högborgar: en stor kärna med två satellitkromocenter. Sertoliceller är ouppnåena sett i squashpreparat men de strömmar ibland ut från tubule tillsammans med könsceller. b)Steg II–IV. I steg 4 runda spermatider (röda cirklar) visas den acrosomala strukturen (röda pilar) som en vit något utplattad blåsor fäst vid kärnhöljet. Långsträckta spermatider bildar buntar och har redan ett tjockt flagellum (vita pilar) som indikerar närvaron av mitokondriell mantel i mitten av spermiernas svans. Atomkärnorna av pachytene spermatocyter (PSpc) är ungefär dubbelt så stora som de av runda spermatider och kännetecknas av mörka kromatinregioner fördelade över hela kärnan. C)Steg V–VI. I steg 5-6 runda spermatider (röd cirkel) plattas akrogen ytterligare och sprids över kärnan (röda pilar). Området i det nukleära kuvertet som vetter mot acrosome verkar mörkt på grund av närvaron av acroplaxome, en proteinrik platta mellan acrosomalmembranet och kärnmembranet. Långsträckta spermatider frigörs från buntar (vita pilar). Pachytene spermatocyter (PSpc) observeras ofta i epitel. d)Steg VII-VIII. Acrosome (röda pilar), ett mörkt foder på kärnhöljet med vita skuggor, är helt utsträckt och täcker nästan hela den apaiska sidan av steg 7-8 runda spermatider (röda cirklar). Detta stadium kännetecknas av mogna spermatider (vita pilar) som kan vara rikliga på många delar av squashberedningen. Kärnan av pachytene spermatocyter (PSpc) växer i storlek under utveckling och verkar större i steg VII-VIII än i tidigare steg. De mörka kromatinområdena inuti kärnan av pachytene spermatocyter (PSpc) verkar fuzzy på grund av hög transkriptionell aktivitet och meiotiska händelser. (E) Steg X. Steg 10 spermatidkärnor (vita pilar) har initierat förlängning men kromatin har inte kondenserat ännu. Akrosomer börjar bilda en krok vid kärnvapenspetsen (röd pil). Atomkärnorna av pachytene spermatocyter (PSpc) verkar mycket stora eftersom de förbereder sig för meiotiska uppdelningar. F)Steg XII. Steg XII kännetecknas av närvaron av meiotiska metafasplattor (vita streckade cirklar). Små runda celler med typiska kondenserade kromatinmönster är zygoten spermatocyter (ZSpc), där systerkromosomerna anpassar sig för att initiera synaptonemal komplexbildning. Skalstänger: 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Figur S3: Identifiering av stadiet av seminiferous epitelial cykel på grundval av acrosomal och nukleära färgning. Aceton-fasta squash preparat var färgas med Rhodamine-konjugerade PNA och DAPI. Steg I: Även om det inte finns någon akrosom i steg 1 runda spermatider kan en fullt utvecklad akrosom detekteras i långsträckta spermatider. Steg II–IV: Acrosomal utveckling börjar med utseendet på proacrosomal/acrosomal granulat i runda spermatider. Acrosomal vesikel på nukleära ytan visas runt till steg 3 spermatider, och sedan platta i steg 4 spermatider. Steg V: Akrosomens vinkel sträcker sig från 40 grader till högst 95°. Steg VI–VII: Vinkeln som subtended av acrosome sträcker sig från 95 grader till 120 grader. Steg VIII-IX: Acrosome är helt utsträckt i steg 8 spermatider (steg VIII) och atomkärnor polariseras på den apatiska sidan av cellen som kommer i kontakt med plasmamembranet (visas inte). Vid arrangera IX blir spermatidskärnan deformerad; dorsala och ventrala ytor ses först. Steg X-XI: Spermatider visar dorsala vinkeln. Steg XII: Detta stadium kännetecknas bäst av utseendet på meiotiska uppdelningar; metafasplattor indikeras med vita pilar. Långsträckta spermatider med sina akrosomer ses också. Skalstänger: 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Figur S4: Helmonterad färgning för okonventionella markörer. (A) Alfa glatt muskel aktin (aSMA) uttrycks av peritubular myoid celler. B) Espin lokaliserar till Sertoli cell snäva korsningar och bidrar till blod-testis barriären. C) PNA lokaliserar till akrosomer av spermatider. Skalstänger: 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande video 1: Skärning av ett kort segment av seminiferous tubule som representerar steg VII-VIII. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Den transilluminationsassisterade mikrodissektionsmetoden som vi har beskrivit ovan möjliggör ett stegorienterat tillvägagångssätt för studier av spermatogenes. Spermatogenesis är en mycket synkroniserad process, och alla viktiga steg under spermatogenic differentiering regleras och utförs på ett stegberoende sätt, såsom differentiering engagemang (i steg VII-VIII), uppkomsten av meios (VII-VIII), meiotiska uppdelningar (XII), uppkomsten av spermatid förlängning (VIII) och spermiation (VIII)1,26,27. Den stegorienterade analysen ger ett kraftfullt verktyg för att studera dessa särskilda händelser som är begränsade till specifika steg av spermatogenes och därför endast finns i definierade stadier av den seminiferous epitelial cykeln. Att behärska metoden kräver viss övning och användning av ett dissekeringsmikroskop av god kvalitet och korrekta lysande förhållanden är nyckeln till framgång. Att implementera denna metod som en del av den dagliga verktygslådan har en förmåga att avsevärt förbättra forskningens inverkan och biologiska relevans på manliga reproduktiva funktioner genom att möjliggöra mer exakt dissekering av molekylära händelser under spermatogenes.
Alla WT-musstammar som vi har studerat visar ett liknande transillumination mönster och uppvisar bevarade cell associationer i stadier av seminiferous epitelial cykeln. Under förutsättning att spermiogen differentiering av könsceller inte skiljer sig grovt från WT-möss gäller detsamma för alla knockout-musmodeller som vi har studerat. Dessutom kan det appliceras på andra arter som uppvisar längsgående segmentarrangemang av stadier i den seminifera epitelcykeln7. Arter med icke-segmentala stadier (t.ex. mänskliga) kan dock inte användas. Med tanke på kromatinkondensens viktiga roll vid förlängning av spermatider vid definitionen av transilluminationsmönstret är det uppenbart att varje felreglering av denna process oundvikligen kommer att ingrep på genomförandet av denna metod. Hos unga möss och unga vuxna (5-6 veckor) har transilluminationsmönstret ännu inte fastställts fullt ut, och därför bör endast möss äldre än 8 veckor användas. Det är också viktigt att komma ihåg att klämma och dra tubules oundvikligen kommer att inkrossa på transillumination mönstret eftersom det förvränger cellulära arkitekturen inom seminiferous epitel.
De isolerade seminiferous tubule segmenten kan också odlas möjliggör ex vivo observation och manipulation av spermatogenesis-kopplade processer, inklusive meios. För att säkerställa vävnadens livskraft och förhindra RNA och proteinnedbrytning bör proverna samlas in och bearbetas senast 2 timmar efter att musen offrats. För ex vivo-kultur av seminiferous tubules bör tiden från offer till början av kulturen inte överstiga 1 timme. Tubulefragmentens integritet kan vanligtvis bibehållas upp till 72 timmar in vitro om de skördas korrekt.
Scenen i den seminiferous epitelial cykeln kan verifieras och ännu mer exakt definieras med hjälp av fas-kontrast mikroskopi av squash preparat16. Mikroskopi utförs på levande celler, vilket ger en ytterligare dimension i analysen och möjliggör observation av organell- eller cellrörelser i specifika stadier av spermatogenes28,29,30. Faskontrastmikroskopi ger exakt iscensättning för efterföljande immunostaining, vilket möjliggör mycket detaljerad analys av proteinuttryck och lokaliseringsdynamik under spermatogenes, inklusive stegspecifika förändringar.
Medan celler frigörs från epitelsammanhanget i squashpreparat, möjliggör helmonterade immunostainings av tubulesegment studier av spermatogena celler i deras fysiologiska miljö. Därför kan helmonterade preparat ge en bättre visualisering av seminiferous tubule arkitektur och dess intercellulära kontakter än immunostaining på tvärsnitt. Viktigt är att transilluminationsassisterad iscensättning av tubulesegmenten före immunostaining gör tillvägagångssättet ännu kraftfullare genom att inkludera information om det specifika stadiet i ett visst segment. Helmonterad färgning är ett särskilt användbart verktyg för studier av celler i periferin av seminiferous tubules, såsom peritubulära myoidceller, peritubulära makrofager och spermatogonia, men kan också öppna nya insikter i forskning om meiotiska och postmetiotiska könsceller.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Finlands Akademi [315948, 314387 till N.K.]; Sigrid Jusélius Stiftelse [till N.K., J.T.]; Emil Aaltonens stiftelse [till J.-A.M., T.L.]; Åbo forskarutbildning i molekylär medicin [S.C.-M., O.O.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| cover glass 20x20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
| Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
| microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
| Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
| rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).
- Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).
- de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. , ELseiver. (2018).
- Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).
- Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154 (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).
- Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. Histological and histopathological evaluation of the testis. , Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).
- Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).
- Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30 (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).
- Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).
- Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).
- Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).
- Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).
- Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142 (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).
- La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).
- Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).
- Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).
- Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).
- Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).
- Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).
- Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).
