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Developmental Biology

डाउनस्ट्रीम इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण के लिए माउस सेमीनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड विच्छेदन

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/61800
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 3,4, 1,2, 3,4, 1, 1
1Institute of Biomedicine, Integrative Physiology and Pharmacology Unit, University of Turku, Turku, Finland, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, Turku, Finland, 3Centre for Reproductive Health, Hudson Institute of Medical Research, Melbourne, VIC 3168, Australia, 4Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, Melbourne, VIC 3800, Australia

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस सेमीनिफेरस ट्यूबल के खंडों के ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन का वर्णन करता है जो अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों और उसमें सेल प्रकारों का प्रतिनिधित्व करता है, और बाद में स्क्वैश तैयारी और बरकरार ट्यूबल सेगमेंट का इम्यूनोसटेनिंग करता है।

Abstract

शुक्राणुएटोजेनेसिस एक अनूठी भेदभाव प्रक्रिया है जो अंततः शरीर के सबसे अलग कोशिका प्रकारों में से एक शुक्राणु को जन्म देती है। रोगाणु कोशिकाओं का भेदभाव दैहिक सेर्टोली कोशिकाओं के साइटोप्लाज्मिक जेब में होता है जो एक साथ 4 से 5 पीढ़ियों की रोगाणु कोशिकाओं की मेजबानी करता है और उनके विकास को समन्वित और सिंक्रोनाइज करता है। इसलिए, एक क्रॉस-सेक्शन के भीतर रोगाणु कोशिका प्रकारों की संरचना स्थिर है, और इन सेल संघों को अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरणों (I-XII) के रूप में भी जाना जाता है। महत्वपूर्ण बात, चरणों को उनके अंतर प्रकाश अवशोषण/बिखराव विशेषताओं के आधार पर अक्षुण्ण अर्धनिषदीय ट्यूबलों से भी पहचाना जा सकता है, और यह तथ्य कि चरण संख्यात्मक क्रम में ट्यूबुल के साथ एक दूसरे का अनुसरण करते हैं । यह लेख माउस अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले अर्धनिफेरस ट्यूबल सेगमेंट के अलगाव के लिए ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि का वर्णन करता है। सेमिनिफेरस ट्यूबल के प्रकाश अवशोषण पैटर्न का पहले विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण किया जाता है, और फिर विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्यूबल सेगमेंट को काट दिया जाता है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है। यहां हम स्टेज-स्पेसिफिक स्क्वैश तैयारियों के लिए और अक्षुण्ण ट्यूबल सेगमेंट के लिए इम्यूनोस्टेपिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह विधि एक शोधकर्ता को शुक्राणुओं के विशिष्ट चरणों में होने वाली जैविक घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देती है, इस प्रकार शुक्राणुओं और अंतर्निहित आणविक तंत्र के विकासात्मक, विषविज्ञानी और साइटोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक अद्वितीय उपकरण प्रदान करती है।

Introduction

डिप्लोइड शुक्राणुओं से परिपक्व हैप्लॉयड स्पर्मटोगोनिया यानीशुक्राणुओं की कोशिकाओं का भेदभाव एक जटिल प्रक्रिया है जो यौन परिपक्व व्यक्ति के टेस्ट में सेमिनिफेरस ट्यूबल के एपिथेलियम में होती है1। A1 शुक्राणुओं के माइटोटिक वंशज पहले भेदभाव-प्रतिबद्ध आबादी का विस्तार करने के लिए पांच बार विभाजित होते हैं, फिर शुक्राणुओं के रूप में मेयोसिस में प्रवेश करते हैं जो अंततः हैप्लॉयड शुक्राणुओं को जन्म देते हैं। शुक्राणुओं में गोल शुक्राणुओं के विभेदन, यानी शुक्राणुओं की आकृति विज्ञान में जटिल परिवर्तन शामिल हैं,जिसमें परमाणु कॉम्पैक्टेशन और शुक्राणु-विशिष्ट संरचनाओं जैसे एक्रोसोम और फ्लैगेलम का निर्माण शामिल है। माउस में शुक्राणुओं की पूरी प्रक्रिया को पूरा करने में 35 दिन लगते हैं2,3.

किसी भी स्थान पर, सेमिनिफेरस एपिथेलियम कीटाणु कोशिकाओं के साथ-साथ जर्मलाइन स्टेम/जनक कोशिकाओं और दैहिक सेर्टोली कोशिकाओंको 1में अंतर करने के पांच साथियों तक होस्ट करता है । रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने से गाढ़ा परतें बनती हैं, जिनकी संरचना उम्मीद के मुताबिक होती है, और विकास के दिए गए कदम पर हैप्लॉयड कोशिकाएं हमेशा कुछ प्रकार के शुक्राणुओं और शुक्राणुओं के साथ संबद्ध होती हैं4,5। इसलिए, ट्यूबल का कोई भी क्रॉस-सेक्शन निरंतर संरचना की रोगाणु कोशिकाओं के साथियों को होस्ट करता है। इन विशिष्ट सेल संघों को अर्धनिफेरस एपिथेलियम के चरणों के रूप में परिभाषित किया गया है। चरण प्रति स्थिर चेक-पॉइंट जैसी राज्यों को प्रस्तुत नहीं करते हैं, लेकिन लगातार विकसित होते हैं क्योंकि रोगाणु कोशिका साथियों का भेदभाव सिंक्रोनी1,2,6में बढ़ता है। चूहों में, 12 चरण (आई-12)2 हैं जिन्हें अर्धनिफेरस ट्यूबल की देशांतर धुरी के साथ एक खंडीय फैशन में व्यवस्थित किया जाता है, और वे एक तार्किक क्रम में एक दूसरे का पालन करते हैं जिससे अर्धनिफेरस एपिथेलियम, या शुक्राणुओं की लहर7,8,9 (चित्रा 1)की लहर बनती है। शुक्राणुओं के पूरा होने से चार चक्र लगते हैं, और किसी भी अर्धनिफेरस ट्यूबल क्रॉस-सेक्शन के भीतर रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने की पदानुक्रमित परतें या साथियों को एक-दूसरे के अलावा अस्थायी रूप से एक अर्धनिफेरस चक्र होता है। चक्र की लंबाई प्रजातियों पर निर्भर है और माउस में प्रत्येक चक्र 8.6 दिन10लेता है।

चरणों की पहचान सेलुलर संरचना और हिस्टोलॉजिकल टेस्टिस सेक्शन5 (चित्रा 1 और चित्रा 2)पर सेमिनिफेरस एपिथेलियम के संगठन के आधार पर की जा सकती है। हालांकि, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण श्रमसाध्य, समय लेने वाला है और फिक्सिंग और धुंधला करने की आवश्यकता होती है, और इसलिए, ऊतक जीने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि चक्र के विभिन्न चरणों(चित्रा 2)द्वारा प्रदर्शित विशिष्ट प्रकाश अवशोषण/स्कैटर पैटर्न का लाभ उठाकर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जीवित ऊतक पर भी मंचन किया जा सकता है । प्रकाश को अवशोषित और तितर - बितर करने के लिए प्रत्येक चरण की क्षमता देर से पोस्ट-मेयोटिक शुक्राणुओं के क्रोमेटिन संघनन के स्तर के सापेक्ष होती है जो किसी भी मंच मेजबान और बंडलों में इन कोशिकाओं कीपैकिंग 7,11। शुक्राणुभेदी विभेदन, यानीशुक्राणुओं की रोकथाम को आगे 16 विकासात्मक चरणों में विभाजित किया गया है, जिसमें गोल शुक्राणुओं के 8 चरण (चरण 1-8) और 8 चरण शुक्राणु (चरण 9-16) भेदभाव(चित्र 1)शामिल हैं। चरण 9-11 लम्बी शुक्राणु (चरण IX-XI) केवल क्रोमेटिन संघनन का निम्न स्तर प्रदर्शित करता है जिसके परिणामस्वरूप कम मात्रा में प्रकाश अवशोषित होता है। क्रोमेटिन संघनन चरण 11 शुक्राणुओं (चरण XI) में शुरू होता है, और चरण 15-16 लम्बी शुक्राणुओं (चरण IV-VIII) में पूरी तरह से गाढ़ा क्रोमेटिन होते हैं, और इसलिए अधिकतम प्रकाश अवशोषण(चित्रा 3)प्रदर्शित करते हैं। क्रोमेटिन को शुक्राणु सिर में कसकर पैक करने के लिए गाढ़ा होना चाहिए। प्रकाश अवशोषण पैटर्न में योगदान देने वाले अतिरिक्त कारक एपिथेलियम (बेसल बनाम एपिकल) के भीतर शुक्राणुओं को बढ़ाने और लम्बी शुक्राणुओं (द्वितीय-वी चरणों में स्पष्ट)11 (चित्र 3)के बंडलिंग के स्थान हैं। बंडलों को ट्यूबल के बीच में धब्बे के रूप में देखा जाता है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे किनारों पर धारियों के रूप में और क्रोमेटिन को अधिक गाढ़ा किया जाता है, जोजगह/धारी 11गहरा होता है ।

यह लेख अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले अर्धनिफेरस ट्यूबुल खंडों के अलगाव के लिए ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि के उपयोग का वर्णन करता है। एक बार अलग होने के बाद, मंचन ट्यूबल सेगमेंट विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के अधीन हो सकते हैं, जिनमें जैव रासायनिक आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण12,13,14,15,प्रवाह साइटोमेट्री16, पूर्व वीवो ट्यूबल संस्कृति 17 और इम्यूनोदाता18 शामिल हैं। यहां हम लाइव सेल रूपात्मक विश्लेषण और बाद में इम्यूनोस्टेटिंग के साथ-साथ ट्यूबल सेगमेंट के पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग के लिए मंचन ट्यूबल सेगमेंट के कुचल मोनोलेयर तैयार करने के लिए विस्तृत डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। अंक 4में वर्णित संक्षेप में कार्यप्रवाह ।

ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि चरणों की सिंक्रोनाइज्ड सेलुलर संरचना के लिए भेदभाव के विशिष्ट चरणों में रोगाणु कोशिकाओं की सटीक पहचान और अलगाव की अनुमति देती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह जीवित ऊतकों पर शुक्राणुओं के दौरान चरण पर निर्भर घटनाओं के अध्ययन को भी सक्षम बनाता है। शुक्राणुओं के लिए स्कैलेबल इन विट्रो मॉडल की कमी को देखते हुए, इस विधि में चरण-विशिष्ट ट्यूबल सेगमेंट पूर्व वीवो12, 17पर लक्षित अल्पकालिक विकासात्मक और विषाक्त अध्ययनों की अनुमति देने का एक अनूठा लाभ भी है। जब हम माउस के लिए यहां विधि का वर्णन करते हैं, तो चूहा4,7,15,19,20जैसे अर्धनिफेरस एपिथेलियल चरणों की देशांतर और खंडीय व्यवस्था के साथ किसी भी स्तनधारी प्रजाति पर एक ही प्रक्रिया लागू की जा सकती है।

Protocol

प्रयोगशाला चूहों और सभी पशु प्रयोगों का रखरखाव तुर्कू विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए प्रासंगिक दिशा-निर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया था।

1. माइक्रोडिसेक्शन के लिए सेमिनिफेरस ट्यूबल की तैयारी

  1. सीओ 2 श्वास के माध्यम से एक वयस्क पुरुष माउस (≥8 सप्ताह पुराना, टेस्टिस 80-120 मिलीग्राम तनाव और उम्र के आधार पर) का बलिदान करें औरइसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था।
    नोट: माउस यौन परिपक्व होना चाहिए, और अधिमानतः कम से कम 8 सप्ताह पुराना होना चाहिए। किशोर चूहों का ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न वयस्क से अलग है क्योंकि अर्धनिफेरस एपिथेलियम की लहर अभी पूरी तरह से स्थापित नहीं हुई है, और शुक्राणुओं की पहली लहर का समय अलग है21,22। <4-सप्ताह पुराने पुरुष चूहों में शुक्राणुओं को बढ़ाने की कमी ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन के लिए उनके उपयोग को रोकती है। सामान्य शुक्राणुओं वाले सभी माउस उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है।
  2. 70% इथेनॉल के साथ वेंट्रल पेट स्प्रे करें। बाँझ कैंची का उपयोग करके एब्डोमिनोपेल्विक गुहा खोलें, जिससे वी-आकार का उद्घाटन हो।
  3. बाँझ संदंश के साथ एपीडिडिमल फैट पैड पर खींचना, टेस्ट्स का पता लगाएं, कैंची का उपयोग करके उन्हें विच्छेदन करें और उन्हें पीबीएस युक्त बाँझ 100-एमएम पेट्री डिश पर रखें।
    नोट: बंध्यता बनाए रखने के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी लैबवेयर और सर्जिकल उपकरण बाँझ हैं।
  4. ठीक इत्तला दे दी कैंची का उपयोग ट्यूनिका एल्बुगिया मेंएक भट्ठा काटने से वृषण decapsulate, मोटी रेशेदार चादर टेस्टिस encapsulating । फिर एक जोड़ी संदंश का उपयोग करके ट्यूनिका को खुला फाड़ें। ट्यूबल्स को संदंश के साथ दबाकर बाहर निकालें और ट्यूनिका को त्याग दें।
    नोट: ट्यूनिका को त्यागते समय, यह कुछ डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकता है कि धमनी वृषण को ट्यूनिका के साथ हटा दिया जाता है। सेमिनिफेरस ट्यूबल्स को नुकसान पहुंचाने से बचें।
  5. एक नई पेट्री डिश के लिए अर्धनिफेरस ट्यूबल ले जाएँ और पेट्री डिश के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त बाँझ PBS डालना। इसके बाद, धीरे-धीरे ट्यूबलों को अलग करें लेकिन ट्यूबलों को नुकसान पहुंचाने से बचें।
    नोट: बहुत अधिक यांत्रिक तनाव ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न पर अतिक्रमण करेगा और ऊतक और उसके सेलुलर वास्तुकला की व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा। ट्यूबलों को मंचन (3 बी) के बिना इस बिंदु से पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग के लिए भी संसाधित किया जा सकता है। कभी-कभी शुक्राणुओं को अलग करने में व्यक्त प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी को शामिल करके पूर्वव्यापी रूप से मंच को परिभाषित करने के लिए पर्याप्त होता है, जैसे SALL4, सी-किट और DNMT3A18,23। शुक्राणुओं का घनत्व अपेक्षाकृत विश्वसनीय चरण संकेतक(चित्र 2)है।

2. ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन

  1. पेट्री डिश को स्टेज पर टेप करके एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे मजबूती से रखें।
    नोट: पेट्री डिश को अपने आंदोलन को रोकने के लिए अच्छी तरह से टेप करना महत्वपूर्ण है जो एकत्र मंचन अर्धनिफेरस ट्यूबल सेगमेंट के मिश्रण का कारण बन सकता है।
  2. फोकस के तहत सेमिनिफेरस ट्यूबल के प्रकाश अवशोषण पैटर्न को प्रकट करने के लिए, सुनिश्चित करें कि नमूना नीचे से प्रकाशित होता है और प्रकाश नमूने के माध्यम से गुजरता है, यानी,यह ट्रांसलिमुलिनेटेड है।
    नोट: अवशोषित/बिखरे हुए प्रकाश की मात्रा शुक्राणुओं को बढ़ाने में क्रोमेटिन संघन के स्तर के सापेक्ष है और अर्धनिफेरस ट्यूबल के अंदर उनके बंडलिंग: अधिक गाढ़ा, अधिक प्रकाश अवशोषित होता है, यानी,गहरा दिखाई देता है।
  3. चित्रा 2, चित्रा 5A और चित्रा S1 में वर्णित विभिन्न चरणों के हल्के अवशोषण पैटर्न से परिचित हो जाओ, ठीक संदंश का उपयोग करके ट्यूबल के बंडलों को ध्यान से ले जाकर।
    नोट: चरण हमेशा एक तार्किक क्रम में एक दूसरे का पालन करते हैं, जिससे अर्धनिफेरस एपिथेलियम की लहर बनती है। हालांकि, यह जानना महत्वपूर्ण है कि शुक्राणुओं की लहर की दिशा कभी-कभी उलट जाती है और फिर फिर से वापस लौट जाती है (जिसे मॉड्यूलेशन4, 9के रूप में भी जानाजाताहै), कभी-कभी प्रक्रिया को जटिल बना देता है। इसके अलावा, प्रत्येक चरण की लंबाई, ट्यूबल के कितने मिमी के संदर्भ में, काफी भिन्न होती है।
  4. एक कांटेदार टिप के साथ संदंश का उपयोग करके ब्याज के ट्यूबल को सावधानीपूर्वक उठाएं, और फिर माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके उचित लंबाई के एक खंड में कटौती करें (पूरक वीडियो 1देखें)। संदंश की नोक पर एक हुक उठाने और एक ट्यूबल आसान पकड़ बनाता है और इसे निचोड़ से बचने में मदद करता है ।
    नोट: खंडों की लंबाई में कटौती की जानी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर निर्भर करती है। प्रोटीन या आरएनए विश्लेषण12, 13(II-V, VII-VIII और IX-XI, चित्रा 5B)के लिए एक विशिष्ट चरण के पूल्ड ट्यूबल टुकड़ों के संग्रह के लिए लंबाई आमतौर पर 2-5 मिमी होती है। जब मानक फेनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग किया जाता है, तो लगभग 200 एनजी आरएनए 1 मिमी ट्यूबल से प्राप्त किया जा सकता है। मंचन ट्यूबल सेगमेंट के पूरे माउंट धुंधला के लिए, खंडों की लंबाई और gt;5 मिमी होनी चाहिए। स्क्वैश तैयारी के लिए खंडों की लंबाई 1-2 मिमी से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि सेगमेंट के बीच में कोशिकाएं बहुत लंबी होने पर बाहर निकलने में विफल हो सकती हैं। ट्यूबल लंबाई के सटीक माप के लिए पेट्री डिश के तहत एमएम स्केल का उपयोग करें।

3. विभिन्न तैयारियों का इम्यूनोदाता

  1. स्क्वैश तैयारी: स्टेज वेरिफिकेशन और इम्यूनोदाता
    नोट: चरण-विशिष्ट ट्यूबल टुकड़ों को एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक कवर ग्लास के साथ कुचल दिया जा सकता है ताकि चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी और बाद में इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा जीवित कोशिकाओं का रूपात्मक विश्लेषण किया जा सके। ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि से परिचित होने पर चरणों को सत्यापित करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक शुरुआत की सिफारिश की जाती है।
    1. एक पिपेट का उपयोग करके 10 माइक्रोल की मात्रा में सेगमेंट को इकट्ठा करें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ले जाएं।
    2. ट्यूबल पर एक कवर ग्लास (20 मिमी x 20 मिमी) को ध्यान से रखकर ट्यूबल को स्क्वैश करें। नतीजतन, कोशिकाएं ट्यूबल को प्रवाहित करेंगी और एक लाइव-सेल मोनोलेयर का रूप लेगी। कोशिकाओं के प्रसार को सुविधाजनक बनाने के लिए कवर ग्लास के किनारे पर एक फिल्टर पेपर रखें। कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए बहुत अधिक स्क्वैशिंग से बचें।
    3. माइक्रोस्कोप के नीचे फैलने वाली कोशिका की निगरानी करें। मौजूद सेल प्रकारों(चित्रा 2, चित्रा S2)की जांच करके चरण मान्यता को सत्यापित करने के लिए 40x उद्देश्य पर चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप काउपयोग करें।
    4. एक बार कोशिकाओं को ट्यूबल के दोनों सिरों से एक गोल मोनोलेयर बनाने के लिए फैल गया है, एक तरल नाइट्रोजन युक्त कंटेनर में स्लाइड डुबकी जबकि यह संदंश के साथ पकड़े । इसे 10 एस के लिए जलमग्न रखें। वैकल्पिक रूप से ठंड के लिए एक सूखी बर्फ की थाली पर स्लाइड रखें।
    5. कवर ग्लास को स्केलपेल का उपयोग करके इसे फ्लिप करके हटा दें।
    6. बिना किसी देरी के, निर्धारण के साथ आगे बढ़ें और जल्दी से 2-5 मिनट के लिए 90% इथेनॉल के साथ एक कंटेनर में स्लाइड रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि स्क्वैश तैयारी 90% इथेनॉल को रखने से पहले गल नहीं जाती है। अन्य फिक्सेटिव्स का उपयोग 10 मिनट के लिए एसीटोन जैसे एसीटोन भी किया जा सकता है।
    7. हवा सूखी और कमरे के तापमान (आर टी) (कुछ दिनों तक) या -80 डिग्री सेल्सियस (दीर्घकालिक) पर स्टोर करें।
    8. इम्यूनोदाता के लिए, आरटी में 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में नमूनों को ठीक करने के बाद।
    9. पीबीएस में कुल्ला और 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ परमीलिज।
    10. पीबीएस में कुल्ला और प्रत्येक स्क्वैश नमूने के आसपास एक तेल की अंगूठी आकर्षित।
    11. तेल की अंगूठी के अंदर पीबीएस (पीबीएसटी) में 0.1% ट्वीन में 10% बीएसए (गोजातीय सीरम एल्बुमिन) के 50-100 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 30 मिनट के लिए नमूनों को ब्लॉक करें।
    12. बीएसए समाधान निकालें और आरटी में 1 घंटे के लिए पीबीएसए में 10% बीएसए में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
    13. पीबीएएसटी के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं।
    14. पीबीएसए में 10% बीएसए में एक माध्यमिक एंटीबॉडी पतला के साथ इनक्यूबेट।
      नोट: एक्रोसोम्स को दाग देने के लिए, नमूनों को विशिष्ट प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के बजाय आरटी(चित्रा S3)में 1 घंटे के लिए पीबीएसटी में 10% बीएसए में रोडामाइन-लेबल मूंगफली एग्लुटिनिन एंटीबॉडी (पीएनए, 1:1000) के साथ इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।
    15. पीबीएसटी के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x धोएं, पीबीएस के साथ कुल्ला करें और DAPI युक्त माउंटेंट के साथ माउंट करें।
  2. सेमिनिफेरस ट्यूबल्स का संपूर्ण माउंट इम्यूनोस्टेपिंग
    नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में मंचन के लिए पूरे माउंट धुंधला (चरण 2.4 से) ट्यूबल सेगमेंट का वर्णन किया गया है। यदि एक शोधकर्ता (चरण 1.5 से) मंचन के बिना पूरे माउंट धुंधला प्रदर्शन करना चाहता है, 3.2.1 और 3.2.7 में नोटों पर ध्यान देना।
    1. एक पिपेट का उपयोग करके, बर्फ-ठंडे पीबीएस में ट्यूबल सेगमेंट (चरण 2.4 से) को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और उन्हें बर्फ पर तलछट करने की अनुमति दें।
      नोट: यदि 1.5 से बिना मंचन ट्यूबल का उपयोग कर रहे हैं, तो एक पेट्री डिश में ट्यूबल को कई बार झुका हुआ पकवान पर और वापस करके अलग करें। कट टिप के साथ 1-एमएल पिपेट का इस्तेमाल करें। इस कदम का उद्देश्य ऊतक की संरचना को खोलना है। हालांकि, बहुत अधिक पाइपिंग से बचें क्योंकि यह ट्यूबल्स को नुकसान पहुंचा सकता है। ट्यूबलों की तलछट में कुछ दसियों सेकंड लगेंगे। छोटे ट्यूबल टुकड़े, मध्यवर्ती कोशिकाएं और सेल मलबे सुपरनेट में रहते हैं।
    2. पिपटिंग या एस्पिरेटर के साथ सुपरनेट (एसएन) को सावधानी से हटा दें। बर्फ के 10 एमएल-ठंडे पीबीएस जोड़ें और उलटा करके मिलाएं।
    3. तलछट की अनुमति दें और फिर पहले की तरह एसएन को हटा दें।
    4. 4% पीएफए के 5 एमएल जोड़ें और +4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन तालिका (20-30 आरपीएम) पर 5 घंटे के लिए ठीक करें।
      नोट: निर्धारण समय ब्याज के प्रोटीन और उनके उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर निर्भर करता है। परमाणु और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लिए, 2 एच निर्धारण आमतौर पर पर्याप्त होता है, हालांकि, झिल्ली मार्कर, जैसे GFRα1 (GDNF परिवार रिसेप्टर अल्फा 1; चित्रा 6ए, बी),लंबे समय तक निर्धारण से लाभ, 6 घंटे तक।
    5. तलछट की अनुमति दें, पहले की तरह एसएन (पीएफए) निकालें, और पीबीएस के 10 एमएल जोड़कर और ट्यूब को उलटा करके संक्षेप में कुल्ला करें।
    6. तलछट की अनुमति दें, पहले की तरह एसएन को हटा दें, और पीबीएस वाशिंग स्टेप को कम से कम 10 मिनट के लिए दोहराएं + 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन टेबल पर और धुंधला या स्टोर के साथ आगे बढ़ें + 4 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: यदि काम करने की स्थिति बाँझ है और साफ नमूनों संग्रहीत किया जा सकता है और कम से कम कुछ हफ्तों के लिए इस्तेमाल किया। वैकल्पिक रूप से, सोडियम Azide को 2% स्टॉक समाधान से 0.02% (w/v) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें ताकि +4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले ट्यूबलों को संरक्षित करने में मदद मिल सके।
    7. 1-एमएल पिपेट का उपयोग करके, 10-20 फिक्स्ड ट्यूबल सेगमेंट को 2-एमएल राउंड-बॉटम ट्यूब पर ले जाएं। तलछट और एसएन को हटाने के लिए अनुमति दें।
      नोट: यदि लंबे ट्यूबलों के साथ काम करना है जिसका मंचन नहीं किया गया है, तो ट्यूबल को पेट्री डिश पर डालें और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करें और लगभग 5-20 मिमी के कट सेगमेंट को संदंश करें। बहुत लंबे खंड धुंधला प्रक्रिया के दौरान उलझन में होंगे, जबकि बहुत कम सेगमेंट आसानी से खो जाते हैं।
    8. पीबीएस (पीबीएसएक्स) में 03% ट्राइटन एक्स-100 में 2% बीएसए + 10% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम) का 1 एमसीएल जोड़ें। आरटी में एक घूर्णन तालिका (20-30 आरपीएम) पर कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
    9. पीबीएसएक्स के 1 एमएल के साथ कुल्ला, पीबीएसएक्स (1:100-1:2000 कमजोर पड़ने) में 1% बीएसए में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 250 माइक्रोन को पाइपिंग करके एसएन को हटा दें और जोड़ें। एक घूर्णन तालिका (20-30 आरपीएम) पर +4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या रात भर में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    10. ऊपर के रूप में PBSX के 1 एमएल के साथ ट्यूबलों को पिपिंग करके और कुल्ला करके एंटीबॉडी समाधान निकालें। आरटी में एक घूर्णन तालिका (20-30 आरपीएम) पर PBSX में 1 घंटे के लिए तीन बार धोएं ।
      नोट: इस पहली धोने के बाद नमूना +4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दिया जा सकता है यदि आवश्यक हो।
    11. एसएन निकालें और PBSX में 1% बीएसए में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 250 माइक्रोन जोड़ें (आमतौर पर फ्लोरोसेंट-लेबल एंटीबॉडी का 1:500 कमजोर पड़ना)। 1 घंटे के लिए आरटी में एक घूर्णन तालिका (20-30 आरपीएम) पर पन्नी और इनक्यूबेट में कवर करें।
    12. दोहराएं 3.2.10।
    13. अंत में एसएन को हटा दें और ट्यूबल को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर डालें। धीरे-धीरे अलग करें और जेल-लोडिंग युक्तियों का उपयोग करके रैखिक स्ट्रिप्स में ट्यूबल की व्यवस्था करें। अतिरिक्त बफर को छान लें और बढ़ते मध्यम और एक कवरस्लिप जोड़ें।
      नोट: ट्यूबलों को व्यवस्थित करते समय सूखने से बचें। ज्यादातर मामलों में डीएपीआई के साथ नाभिक का काउंटर-धुंधला करना आवश्यक नहीं है। नमूना सुखाने और गिरावट को रोकने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारे को सील करें। स्लाइड इमेजिंग से पहले +4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

Representative Results

माउस सेमीनिफेरस ट्यूबल का एक सफल ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड स्टेजिंग और माइक्रोडिसेक्शन मुख्य रूप से उचित प्रकाश स्थितियों और एक उपयुक्त विच्छेदन माइक्रोस्कोप खोजने पर निर्भर करता है, और प्रत्येक चरण की विशेषता वाली विशिष्ट विशेषताओं को पहचानने की क्षमता। चरण VII-VIII समरूप रूप से अंधेरे दिखाई देते हैं क्योंकि उनमें पूरी तरह से गाढ़ा विस्तारित शुक्राणुओं की एक उच्च संख्या होती है जो एपिथेलियम(चित्रा 5A और चित्रा S1)की एपिकल सतह पर गठबंधन किए जाते हैं। परिपक्व शुक्राणुओं को शुक्राणु में ल्यूमेन में छोड़े जाने के बाद, एपिथेलियम में गाढ़ा लम्बी शुक्राणुओं की अनुपस्थिति के कारण नौवीं-ग्यारहवीं चरणों में ट्यूबल बहुत पीला दिखाई देता है। ट्रांसिल्यूमिनेटेड ट्यूबल पर पहचान करने के लिए सबसे आसान सुविधा शुक्राणु का बिंदु है (चित्रा 5A और चित्रा S1में तारक), यह डार्क जोन (सातवीं-आठवीं) से पीला क्षेत्र (IX-XI) में अचानक संक्रमण है । पीला जोन कमजोर स्पॉट जोन (बारहवीं-1) के बाद होता है। धब्बेदार उपस्थिति बंडलों में गाढ़ा क्रोमेटिन के साथ शुक्राणुओं को बढ़ाने के संगठन से निकलती है। निम्नलिखित मजबूत स्पॉट जोन (II-V) में बंडल बहुत प्रमुख हो जाते हैं। इसके अलावा, शुक्राणु बंडल सेर्टोली सेल नाभिक की ओर पलायन करते हैं जो बेसल लैमिना के करीब स्थित होते हैं, जो स्टेज II-वी ट्यूबल की धारीदार उपस्थिति के रूप में परिलक्षित होता है जब ट्रांसलिलिनेटेड(चित्रा 2, चित्रा 5ए, बी और चित्रा एस 1)। बंडल अंत में छठी चरण में फैलते हैं और आठवीं चरण में एपिथेलियम से जारी किए जाने वाले ल्यूमेन के करीब ले जाते हैं।

ट्यूबल सेगमेंट के सटीक चरण को स्क्वैश तैयारी(चित्रा 2 और चित्रा S2)के चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा सटीक रूप से सत्यापित किया जा सकता है। स्क्वैश तैयारी में विशिष्ट चरणों को चरण 1-8 गोल शुक्राणुओं के एक्रोसोमल विकास, शुक्राणुओं को बढ़ाने में क्रोमेटिन संघननन की स्थिति और शुक्राणुओं के बंडलों की उपस्थिति16 (चित्र 3 और चित्रा S2)के आधार परपहचाना जाता है। इसके अलावा, पहले के सेल प्रकारों की उपस्थिति, जैसे टाइप बी स्पर्मेटोगोनिया और लेप्टोटीन या जाइगोटीन शुक्राणु, जिन्हें उनकी रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर पहचाना जा सकता है, का उपयोग मंच मान्यता का समर्थन करने के लिए किया जा सकता है। पाचिटेन शुक्राणुओं का आकार लगभग चरण VI में आकार में बढ़ जाता है, जो मंचन में अतिरिक्त मदद भी प्रदान कर सकता है।

मंचन स्क्वैश तैयारी इम्यूनोदाता का उपयोग कर seminiferous एपीथेलियम में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रत्येक चरण में अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर संरचना के कारण सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति के बहुत सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है। चरण-विशिष्ट अभिव्यक्ति को एक्रोसोम(उदाहरण के लिए,पीएनए के साथ) के सह-धुंधला द्वारा और बढ़ाया जा सकता है जो गोल शुक्राणुओं के विभेदन के अलग-अलग चरणों के दृश्य को सक्षम बनाता है। चित्रा S3में विभिन्न चरणों में पीएनए-दाग एक्रोसोम्स की प्रतिनिधि छवियां प्रदान की जाती हैं। एक्रोसोमल धुंधला भी मंच भूतलक्षी प्रभाव को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड स्टेजिंग बेतरतीब तरीके से बिना चरणबद्ध टुकड़ों का उपयोग करने की तुलना में वांछित चरण खोजने के लिए काफी आसान और तेज तरीका है।

सेमिनिफेरस ट्यूबुल पूरे माउंट स्टेनिंग का उपयोग आमतौर पर सेल प्रकारों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जो सेमिनिफेरस एपिथेलियम के तहखाने झिल्ली के संपर्क में होते हैं, या तो ट्यूबलर साइड (शुक्राणुतोगोनिया, प्रीप्टोटीन स्पर्मेटोसाइट्स और सेर्टोली कोशिकाएं; चित्रा 6ए, बी)या इंटरस्टिशियल साइड (पेरिटुबुलर मायोइड कोशिकाएं और पेरिट्यूबुलर मैक्रोफेज; चित्रा 6C और चित्रा S4A)24। हालांकि, इस विधि का उपयोग उन कोशिकाओं या संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जो एपिथेलियम में गहरे स्थित हैं, जैसे रक्त-टेस्टिस बैरियर (एस्पिन, फिगर S4B),या पोस्टमेयोटिक रोगाणु कोशिकाएं (एक्रोसोम मार्कर पीएनए, फिगर S4C)। यदि बिना चरण के ट्यूबल सेगमेंट का उपयोग किया जाता है, तो शुक्राणुओं (A1, A2, A3, A4, इन और बी; सामूहिक रूप से एकडिफ)(चित्रा 2)में अंतर करने में व्यक्त किए गए प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके भूतलक्षी प्रभाव से किसी दिए गए चरण का अनुमान लगाना संभव है। इसके बाद मंचन सिंकिटियल एडिफ के घनत्व पर निर्भर करता है जो शुक्राणुओं के विभेदन के पहले चक्र के दौरान एक चरण पर निर्भर तरीके से छह माइटोटिक डिवीजनों से गुजरता है1, इसलिए प्रत्येक डिवीजन1,25के बाद सिंकिटिया में एकडिफ शुक्राणुओं की संख्या दोगुनी हो जाती है। हालांकि, भूतलक्षी मंचन ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड स्टेजिंग की तुलना में कम सटीक है क्योंकि एकडिफ की अलग पीढ़ियों के लिए कोई विशिष्ट मार्कर नहीं हैं औरडिफ घनत्व का आकलन त्रुटि से ग्रस्त हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: माउस शुक्राणुओं के मंचन के लिए अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र मानचित्र। ऊर्ध्वाधर कॉलम अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विभिन्न चरणों में सेल संघों को दिखाते हैं (रोमन अंकों के साथ चिह्नित I-XII)। सबसे अपरिपक्व रोगाणु कोशिकाएं सबसे नीचे होती हैं, जबकि सबसे अधिक विभेदित शीर्ष पर होती हैं। रोगाणु कोशिका भेदभाव की प्रगति का पालन करने के लिए, किसी को बाएं से दाएं और नीचे से ऊपर की ओर बढ़ना पड़ता है। अर्धनिफेरस एपिथेलियम का एक चक्र चरणों की एक पूरी श्रृंखला है जो संख्यात्मक क्रम में एक-दूसरे का पालन करता है। एकअण्ड,अविभेदित शुक्राणुटोगोनिया; A1-4, टाइप A1-A4 शुक्राणु; में, मध्यवर्ती शुक्राणुटोगोनिया; बी, टाइप बी शुक्राणुटोगोनिया; पीएल, प्रीप्टोटोटीन शुक्राणु; एल, लेप्टोटीन शुक्राणु; जेड, जाइगोटीन शुक्राणु; पी, पाचिटेन शुक्राणु; डी, डिप्लोटीन शुक्राणु; 2 डिग्री, माध्यमिक शुक्राणुओं के अलावा मेयोटिक डिवीजन। अरबी अंक 1-16 पोस्ट-मेइटिक स्पर्मेटिक्स परिपक्वता (शुक्राणुओं) के चरणों को संदर्भित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरणों में सेल संघ। अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरण एक तार्किक क्रम में एक दूसरे का पालन करते हैं, और इस प्रकार एक अर्धनिफेरस ट्यूबल की देशांतर धुरी के साथ शुक्राणुओं की लहर बनाते हैं। शीर्ष पैनल विभिन्न चरणों में रोगाणु कोशिका संघों को दिखाता है, और सेनिफेरस एपिथेलियम में सेर्टोली कोशिकाओं (हल्के ग्रे) के साइटोप्लाज्मिक जेब के भीतर सेल प्रकारों का स्थान दिखाता है। सेमीनिफेरस ट्यूबल का चित्रण शुक्राणुओं की लहर और पीला, कमजोर स्थान, मजबूत स्थान और अंधेरे क्षेत्रों के विशिष्ट ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न की कल्पना करता है। प्रत्येक संकेतित चरण से, स्क्वैश तैयारी और आवधिक एसिड-शिफ (पीए) के प्रतिनिधि लिविंग सेल चरण-विपरीत छवियां- दाग वाले टेस्टिस क्रॉस-सेक्शन दिखाए जाते हैं। नीचे दो पैनलों ट्रांसिल्यूमिनेशन (ऊपर) या SALL4 (लाल, एक पैन शुक्राणु मार्कर) और DNMT3A (ग्रीन, एक एक डिफ मार्कर) के खिलाफ एंटीबॉडी(नीचे) के साथ धुंधला के बाद seminiferous ट्यूबुल के खंडों को दिखाने के लिए । नौवीं-ग्यारहवीं, बारहवीं और छठी चरणों के लिए ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न बॉक्स्ड क्षेत्रों के साथ हाइलाइट किए गए हैं। दोनों प्रकाश अवशोषण पैटर्न (ऊपर) और DNMT3A के घनत्व-सकारात्मक विभेदक शुक्राणु (नीचे) का उपयोग अर्धनिफेरस चक्र के (अनुमानित) चरण को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है। एक डिफ की उत्तरोत्तर पीढ़ियों को टाइप A1-A4, मध्यवर्ती (इन) और टाइप बी शुक्राणुटोगोनिया के रूप में जानाजाता है। प्रत्येक परिणाम का विभाजन शुक्राणुओं के कोशिका घनत्व को दोगुना करने में होता है। अर्धनिफेरस एपिथेलियम के तहखाने झिल्ली पर उच्चतम कोशिका घनत्व छठी-आठवीं चरणों में देखा जाता है जब मेयोटिक प्रीप्टोटोटीन शुक्राणुओं (पीएल) को देखा जाता है। स्केल बार: स्क्वैश तैयारी। 10 माइक्रोन, अन्य 50μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: शुक्राणुओं के चरण। शुक्राणुओं के विभिन्न चरणों में शुक्राणुओं की विशिष्ट विशेषताएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: इस अध्ययन का कार्यप्रवाह। ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न पूरी तरह से एक वयस्क (>8 सप्ताह पुराने) माउस में स्थापित किया गया है। माउस का त्याग करें और बिना किसी देरी के टेस्टिस विच्छेदन और डेपुटेशन के साथ आगे बढ़ें। धीरे-धीरे एक पेट्री डिश पर ट्यूबलों को अलग खींचें। पूरे माउंट धुंधला के लिए ट्यूबल ठीक करें या ट्रांसिल्यूमिनेशन के साथ आगे बढ़ें। ट्रांसिल्यूमिनेशन 1 के तहत) स्क्वैश तैयारी (गुणवत्ता नियंत्रण या इम्यूनोस्टेपिंग के लिए) या 2) के लिए विशिष्ट चरण (एस) के छोटे ट्यूबल सेगमेंट में कटौती आरएनए और प्रोटेओमिक्स विश्लेषण, ऊतक संस्कृति या पूरे माउंट स्टेनिंग के लिए स्टेज पूल एकत्र करने के लिए लंबे खंडों में कटौती करें। पीबीएस के 10 माइक्रोन वॉल्यूम में शॉर्ट ट्यूबल सेगमेंट को माइक्रोस्कोप स्लाइड में ट्रांसफर करें। कोशिकाओं को मजबूर करने और लाइव सेल मोनोलेयर बनाने के लिए सेगमेंट पर एक कवर स्लिप रखें। एक माइक्रोस्कोप के नीचे सेल प्रकार का निरीक्षण करें, फिर ठीक करें और दाग दें। WMS, पूरे माउंट धुंधला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ट्रांसिल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी के तहत देखे जाने वाले वयस्क माउस का अर्धनिफेरस ट्यूबल। (क)सेमिनिफेरस ट्यूबल का एक लंबा खंड जैसा कि ट्रांसिल्यूमिनेशन के तहत देखा जाता है जो सेमिनिफेरस एपिथेलियम की लहर को प्रदर्शित करता है । शुक्राणुओं में क्रोमेटिन कॉम्पिटिशन और एपिथेलियम के भीतर उनके स्थानीयकरण के आधार पर चार अलग-अलग क्षेत्रों की पहचान की जा सकती है: डार्क जोन (चरण सातवीं-आठवीं), पीला क्षेत्र (चरण नौवीं-ग्यारहवीं), कमजोर स्पॉट जोन (चरण बारहवीं-1), और मजबूत स्पॉट जोन (चरण II-VI)। तारांकन, शुक्राणु बिंदु। तीर कमजोर स्पॉट जोन के भीतर दो छोटे खंडों का संकेत देते हैं जिनमें ट्यूबल पर यांत्रिक तनाव के कारण एक पीला रूप होता है। स्केल बार: 500 माइक्रोन। इनसेट 1-5 चयनित ट्यूबल सेगमेंट से अधिक आवर्धन हैं। (ख) द्वितीय-वी (मजबूत स्थान क्षेत्र), सातवीं-आठवीं (डार्क जोन) और नौवीं-ग्यारहवीं (पीला क्षेत्र) का प्रतिनिधित्व करने वाले अर्धनिफेरस ट्यूबल के पूल्ड सेगमेंट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: शुक्राणुओं, सेर्टोली सेल और पेरिट्यूबुलर मैक्रोफेज मार्कर का उपयोग करके पूरे माउंट इम्यूनोस्टेपिंग। (A)GFRα1 (लाल), SALL4 (ग्रीन) और DNMT3B (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ स्टेज XI-II का प्रतिनिधित्व करने वाले खंड के लिए पूरे माउंट धुंधला । धुंधला शुक्राणुओं की तीन अलग-अलग आबादी का पता चलताहै:अकेले-अलग (ए) या युग्मित (एकपीआर)अविभेदित स्टेम शुक्राणुतोगोनिया (GFRα1+/ SALL4+/ DNMT3B-;सफेद बिंदीदार क्षेत्र), लघु सिंक्टाइल (यहां 4 गठबंधन कोशिकाएं; एकal4)जनक शुक्राणुतोगोनिया (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B-, पीले बिंदीदार क्षेत्रों) और स्पर्मटोगोनिया में अंतर (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B+)। SALL4+/DNMT3B+ कोशिकाएं टाइप A3-A4 शुक्राणुएंटोगोनिया हैं । (ख)जीएफआर 1 (लाल), USF1 (ग्रीन) और SOX9 (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पूरे माउंट सेमीनिफेरस ट्यूबल धुंधला । GFRα1 शुक्राणुओं के स्टेम सबसेट दाग। USF1 स्पर्मटोगोनिया और SOX9+ Sertoli कोशिकाओं दोनों द्वारा व्यक्त किया जाता है। (ग)वयस्क चूहों में पेरिट्यूबुलर मैक्रोफेज F4/80 (लाल) और MHCII (नीला) दोनों के लिए सकारात्मक हैं । DAPI दाग डीएनए (हरा) । चमकीले बड़े नाभिक पेरिट्यूबुलर मायोइड सेल नाभिक होते हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1: सेमिनिफेरस ट्यूबल का एक लंबा खंड जैसा कि ट्रांसिल्यूमिनेशन के तहत देखा गया है जो सेमिनिफेरस एपिथेलियम की लहर को प्रदर्शित करता है। शुक्राणुओं में क्रोमेटिन कॉम्पिटिशन और एपिथेलियम के भीतर उनके स्थानीयकरण के आधार पर चार अलग-अलग क्षेत्रों की पहचान की जा सकती है: कमजोर स्पॉट जोन (बारहवीं-1 चरण), मजबूत स्पॉट जोन (चरण II-VI), डार्क जोन (चरण सातवीं-आठवीं), और पीला क्षेत्र (नौवीं-ग्यारहवीं चरण)। शुक्राणुकरण बिंदु (तारक) को अंधेरे क्षेत्र के रूप में मान्यता दी जा सकती है अचानक पीला क्षेत्र में पारगमन। स्केल बार: 500 माइक्रोन। इनसेट 1-4 चयनित ट्यूबल सेगमेंट से अधिक आवर्धन हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S2: सेमीनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विभिन्न चरणों के लाइव-सेल मोनोलेयर की चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी। (A)स्टेज I. स्टेप 1 राउंड स्पर्मेटिस में अभी भी एक्रोसोमल स्ट्रक्चर की कमी है । उन्हें एक विशिष्ट एकल क्रोमोसेंटर (सफेद तीर) के साथ एक छोटे गोल नाभिक (लाल घेरे) की विशेषता है। क्रोमेटॉयड शरीर परमाणु झिल्ली (नीले तीर) के निकट संपर्क में एक अंधेरे कणिका के रूप में साइटोप्लाज्म में दिखाई देता है। सेर्टोली सेल न्यूक्लियस (व्हाइट सर्कल) में तीन डार्क फोसी होते हैं: दो उपग्रह क्रोमोसेंटर के साथ एक बड़ा न्यूक्लियोलस। Sertoli कोशिकाओं स्क्वैश तैयारी में देखा नहीं कर रहे हैं, लेकिन वे कभी कभार रोगाणु कोशिकाओं के साथ ट्यूबल से बाहर प्रवाह । (ख)चरण द्वितीय-IV । स्टेप 4 राउंड स्पर्मेटिस (लाल घेरे) में, एक्रोसोमल संरचना (लाल तीर) परमाणु लिफाफे से जुड़े सफेद थोड़ा चपटा वेसिकल के रूप में दिखाई देती है। स्पर्मेट्रेड बंडलों को बढ़ाते हैं और पहले से ही एक मोटी फ्लैगेलम (सफेद तीर) होती है जो शुक्राणु पूंछ के मध्य टुकड़े में माइटोकॉन्ड्रियल म्यान की उपस्थिति का संकेत देती है। पचीटेन शुक्राणुओं (पीएसपीसी) का नाभिक लगभग दो गुना अधिक होता है जो गोल शुक्राणुओं के समान होता है और पूरे नाभिक में वितरित अंधेरे क्रोमेटिन क्षेत्रों की विशेषता होती है। (C)स्टेज वी-VI । चरण 5-6 गोल शुक्राणुओं (लाल घेरे) में, एक्रोसोम को और चपटा किया जाता है और नाभिक (लाल तीर) पर फैलता है। एक्रोसोम का सामना कर रहे परमाणु लिफाफे का क्षेत्र एक्रोप्लाज्मोम की उपस्थिति के कारण अंधेरा दिखाई देता है, एक्रोसोमल झिल्ली और परमाणु झिल्ली के बीच एक प्रोटीन युक्त प्लेट। लम्बी शुक्राणुओं को बंडलों (सफेद तीर) से छोड़ा जाता है। एपिथेलियम में पाचिटेन स्पर्मेटोसाइट्स (पीएसपीसी) अक्सर देखे जाते हैं। 1)स्टेज सातवीं-आठवीं। कलाबाजी (लाल तीर), सफेद छाया के साथ परमाणु लिफाफे पर एक अंधेरे अस्तर, पूरी तरह से विस्तारित है और कदम 7-8 दौर शुक्राणुओं (लाल हलकों) के लगभग पूरे apical पक्ष को शामिल किया गया । इस चरण में परिपक्व शुक्राणुओं (सफेद तीर) की विशेषता है जो स्क्वैश तैयारी के कई हिस्सों पर प्रचुर मात्रा में हो सकते हैं। पचीटेन शुक्राणुओं (पीएसपीसी) का नाभिक विकास के दौरान आकार में बढ़ता है और पिछले चरणों की तुलना में सातवीं-आठवीं चरण में बड़ा दिखाई देता है। उच्च ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और मेइटिक घटनाओं के कारण पचीटेन शुक्राणुओं (पीएसपीसी) के नाभिक के अंदर अंधेरे क्रोमेटिन क्षेत्र फजी दिखाई देते हैं। 1)स्टेज एक्स स्टेप 10 शुक्राणुएक नाभिक (सफेद तीर) ने विस्तार की शुरुआत की है लेकिन क्रोमेटिन अभी तक गाढ़ा नहीं हुआ है । एक्रोसोम परमाणु टिप (लाल तीर) पर एक हुक बनाने लगते हैं। पचिटेन शुक्राणुओं (पीएसपीसी) का नाभिक बहुत बड़ा दिखाई देता है क्योंकि वे मेयोटिक डिवीजनों की तैयारी कर रहे हैं। (एफ)स्टेज 12वीं । स्टेज बारहवीं मेयोटिक मेटाफेस प्लेटों (सफेद धराशायी हलकों) की उपस्थिति की विशेषता है। विशिष्ट संघनित क्रोमेटिन पैटर्न वाली छोटी गोल कोशिकाएं जाइगोटेन शुक्राणुएं(जेडस्पीसी) हैं, जिसमें बहन गुणसूत्र सिनैप्टोनमल जटिल गठन शुरू करने के लिए संरेखित हैं। स्केल बार: 10 माइक्रोन। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S3: एक्रोसोमल और परमाणु धुंधला के आधार पर अर्धनिर्धारित एपिथेलियल चक्र के चरण की पहचान करना। एसीटोन-फिक्स्ड स्क्वैश तैयारी रोडामाइन-संयुग्मित पीएनए और डीएपीआई से सना हुआ था। चरण I: जबकि कोई एक्रोसोम चरण 1 गोल शुक्राणुओं में मौजूद नहीं है, एक पूरी तरह से विकसित एक्रोसोम का पता शुक्राणुओं को बढ़ाने में लगाया जा सकता है। चरण II-IV: एक्रोसोमल विकास गोल शुक्राणुओं में प्रोक्रोसोमल/एक्रोसोमल कणिकाओं की उपस्थिति के साथ शुरू होता है। परमाणु सतह पर एक्रोसोमल वेसिकल चरण 3 शुक्राणुओं तक गोल दिखाई देता है, और फिर चरण 4 शुक्राणुओं में सपाट हो जाता है। स्टेज वी: एक्रोसोम द्वारा उभरा कोण 40 डिग्री से अधिकतम 95 डिग्री तक फैला हुआ है। चरण VI-VII: एक्रोसोम द्वारा उभरा हुआ कोण 95 डिग्री से 120 डिग्री तक फैला हुआ है। चरण आठवीं-नौवीं: एक्रोसोम पूरी तरह से चरण 8 शुक्राणुओं (चरण आठवीं) में बढ़ाया गया है, और प्लाज्मा झिल्ली (नहीं दिखाया गया) के साथ संपर्क बनाने वाले कोशिका के एपिकल पक्ष पर नाभिक ध्रुवीकरण। नौवीं चरण तक शुक्राणु नाभिक विकृत हो जाता है; पृष्ठीय और वेंट्रल सतहों को पहली बार देखा जाता है। चरण एक्स-XI: शुक्राणु पृष्ठीय कोण दिखाते हैं। चरण बारहवीं: यह चरण सबसे अच्छा मेयोटिक डिवीजनों की उपस्थिति की विशेषता है; मेटाफेस प्लेटें सफेद तीर से इंगित की जाती हैं। उनके कलासूत्रों के साथ शुक्राणुओं को बढ़ाना भी देखा जाता है। स्केल बार: 10μm। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S4: अपरंपरागत मार्कर के लिए पूरे माउंट धुंधला । (क) अल्फा स्मूथ मांसपेशी ऐक्टिन (ASMA) पेरिट्यूबुलर मायोइड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है। (ख) एस्पिन सेर्टोली सेल टाइट जंक्शनों को स्थानीयकृत करता है और रक्त-टेस्टिस बैरियर में योगदान देता है । (ग) पीएनए शुक्राणुओं के एक्रोसोम्स को स्थानीयकृत करता है । स्केल बार: 50μm। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो 1: सातवीं-आठवीं चरण का प्रतिनिधित्व करने वाले अर्धनिफेरस ट्यूबल के एक छोटे खंड को काटना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमारे ऊपर वर्णित ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि शुक्राणुओं के अध्ययन के लिए एक चरण उन्मुख दृष्टिकोण को सक्षम बनाती है। शुक्राणुएटोजेनेसिस एक अत्यधिक सिंक्रोनाइज्ड प्रक्रिया है, और शुक्राणुजनित विभेदन के दौरान सभी प्रमुख चरणों को चरणबद्ध रूप से सीमित और निष्पादित किया जाता है, जैसे कि विभेदन प्रतिबद्धता (सातवीं-आठवीं चरणों में), मेयोसिस (सातवीं-आठवीं), मेयोटिक डिवीजनों (बारहवीं) की शुरुआत, शुक्राणु विस्तार (आठवीं) और शुक्राणुना(आठवीं)1,26,27। चरण उन्मुख विश्लेषण इन विशेष घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है जो शुक्राणुओं के विशिष्ट चरणों तक सीमित हैं और इसलिए केवल अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के परिभाषित चरणों में पाए जाते हैं। विधि माहिर कुछ अभ्यास लेता है और एक अच्छी गुणवत्ता विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और उचित रोशन स्थितियों सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । रोजमर्रा के टूलकिट के एक भाग के रूप में इस विधि को लागू करने के लिए शुक्राणुओं के दौरान आणविक घटनाओं के अधिक सटीक विच्छेदन की अनुमति देकर पुरुष प्रजनन कार्यों पर अनुसंधान के प्रभाव और जैविक प्रासंगिकता में बहुत सुधार करने की क्षमता है।

सभी डब्ल्यूटी माउस उपभेदों कि हमने अध्ययन किया है एक समान ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न प्रदर्शित करता है और अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरणों में संरक्षित सेल संघों को प्रदर्शित करता है। इस शर्त पर कि रोगाणु कोशिकाओं का शुक्राणुजनित विभेदन डब्ल्यूटी चूहों से बिल्कुल अलग नहीं है, यही उन सभी नॉकआउट माउस मॉडल पर भी लागू होता है जिनका हमने अध्ययन किया है। इसके अलावा, इसे अन्य प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है जो अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र7के चरणों की देशांतर खंडीय व्यवस्था प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, गैर-सेगमेंटल चरणों (जैसे मानव) वाली प्रजातियों का उपयोग नहीं किया जा सकता है। ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न को परिभाषित करने में शुक्राणुओं को बढ़ाने में क्रोमेटिन संघनन की आवश्यक भूमिका को देखते हुए, यह स्पष्ट है कि इस प्रक्रिया का कोई भी गलतीकरण अनिवार्य रूप से इस विधि के कार्यान्वयन पर अतिक्रमण करेगा । किशोर चूहों और युवा वयस्कों (5-6 सप्ताह) में ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न अभी तक पूरी तरह से स्थापित नहीं किया गया है, और इसलिए, केवल 8 सप्ताह से पुराने चूहों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि ट्यूबलों को निचोड़ना और खींचना अनिवार्य रूप से ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न पर अतिक्रमण करेगा क्योंकि यह अर्धनिफेरस एपिथेलियम के भीतर सेलुलर वास्तुकला को विकृत करता है।

अलग-थलग सेमिनिफेरस ट्यूबल सेगमेंट को पूर्व वीवो अवलोकन और मेयोसिस सहित शुक्राणुओं के युग्मित प्रक्रियाओं में हेरफेर को सक्षम करने के लिए भी सुसंस्कृत किया जा सकता है। ऊतक की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने और आरएनए और प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए, नमूनों को एकत्र किया जाना चाहिए और माउस का त्याग करने के 2 घंटे से अधिक समय तक संसाधित नहीं किया जाना चाहिए। अर्धनिफेरस ट्यूबल्स की पूर्व वीवो संस्कृति के लिए, बलिदान से संस्कृति की शुरुआत तक का समय 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। ट्यूबल टुकड़ों की अखंडता आम तौर पर विट्रो में ७२ घंटे तक बनाए रखा जा सकता है अगर ठीक से काटा ।

सेमीनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरण को सत्यापित किया जा सकता है और स्क्वैश तैयारी के चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और भी अधिक सटीक रूप से परिभाषित किया जा सकता है16। माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं पर किया जाता है, जो विश्लेषण में एक अतिरिक्त आयाम प्रदान करता है औरशुक्राणु28, 29,30के विशिष्ट चरणों में ऑर्गेनेल या कोशिका आंदोलनों के अवलोकन की अनुमति देता है। चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी बाद में इम्यूनोस्टेपिंग के लिए सटीक मंचन प्रदान करता है, जो शुक्राणुओं के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण गतिशीलता का बहुत विस्तृत विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है, जिसमें चरण-विशिष्ट परिवर्तन शामिल हैं।

जबकि कोशिकाओं को स्क्वैश तैयारी में एपिथेलियल संदर्भ से जारी किया जाता है, ट्यूबल सेगमेंट के पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग अपने शारीरिक वातावरण में शुक्राणुओं की कोशिकाओं के अध्ययन को सक्षम करते हैं। इसलिए, पूरे माउंट तैयारी सेमिनिफेरस ट्यूबल आर्किटेक्चर और क्रॉस-सेक्शन पर इम्यूनोसटेनिंग की तुलना में इसके अंतरकोशिकीय संपर्कों का बेहतर दृश्य प्रदान कर सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इम्यूनोस्टेपिंग से पहले ट्यूबल सेगमेंट के ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड स्टेजिंग किसी दिए गए सेगमेंट के विशिष्ट चरण पर जानकारी को शामिल करके दृष्टिकोण को और भी शक्तिशाली बनाता है। पूरे माउंट धुंधला सेमिनिफेरस ट्यूबलों की परिधि में कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी उपकरण है, जैसे पेरिटुबुलर मायोइड कोशिकाएं, पेरिटुब्युलर मैक्रोफेज और शुक्राणुटोगोनिया, लेकिन मेइओटिक और पोस्टमेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं पर शोध में उपन्यास अंतर्दृष्टि भी खोल सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को फिनलैंड अकादमी [315948, 314387 से एनके] के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन [एनके, जेटी के लिए]; एमिल Aaltonen फाउंडेशन [जे-ए.M, T.L.]; तुरकू डॉक्टोरल प्रोग्राम ऑफ मॉलिक्यूलर मेडिसिन [एस.C-एम., ओ.ओ.] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumin (BSA) Sigma A9647
cover glass 20x20 mm Menzel Gläser 11961988
Falcon conical tube 15-ml Sarstedt 62.554.502
fetal bovine serum (FBS) Biowest S1810
grease pen (ImmEdge) Vector Laboratories H-4000
microscope slide Superfrost Plus Thermo Scientific 22-037-246
Parafolmaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714
Petri dish (100-mm) Greiner 664160
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 11503387
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher P36962
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) Vector Laboratories RL-1072
Triton X-100 Sigma 93443
Tween-20 Sigma P2287

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 164 माउस शुक्राणु अर्धनिफेरस एपिथेलियम चरण ट्रांसिल्यूमिनेशन स्क्वैश तैयारी पूरे माउंट धुंधला शुक्राणु विज्ञान
डाउनस्ट्रीम इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण के लिए माउस सेमीनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड विच्छेदन
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Mäkelä, J. A., Cisneros-Montalvo, S., Lehtiniemi, T., Olotu, O., La, H. M., Toppari, J., Hobbs, R. M., Parvinen, M., Kotaja, N. Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses. J. Vis. Exp. (164), e61800, doi:10.3791/61800 (2020).

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