Summary
Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.
Abstract
Dans le même patient, l’absence de l’expression de surface des ligands de NKG2D (NKG2DL) a été montrée pour distinguer des sous-populations leucémiques avec des propriétés de cellules souches (soi-disant cellules souches leucémiques, LSCs) des cellules leucémiques de contrepartie plus différenciées qui manquent de potentiel d’initiation de la maladie bien qu’elles portent des mutations génétiques spécifiques de leucémie semblables. Les NKG2DL sont des auto-molécules biochimiquement très diversifiées de type CMH de classe I. Les cellules saines dans des conditions homéostatiques n’expriment généralement pas NKG2DL à la surface cellulaire. Au lieu de cela, l’expression de ces ligands est induite lors de l’exposition au stress cellulaire (par exemple, transformation oncogène ou stimuli infectieux) pour déclencher l’élimination des cellules endommagées par la lyse par les cellules immunitaires exprimant les récepteurs NKG2D telles que les cellules tueuses naturelles (NK). Fait intéressant, l’expression de surface de NKG2DL est sélectivement supprimée dans les sous-populations de LSC, permettant à ces cellules d’échapper à la surveillance immunitaire médiée par NKG2D. Ici, nous présentons une analyse côte à côte de deux méthodes différentes de cytometry d’écoulement qui permettent la recherche sur l’expression de surface de NKG2DL sur des cellules cancéreuses c.-à-d., une méthode impliquant l’identification de pan-ligand et une méthode impliquant la souillure avec des anticorps multiples contre des ligands simples. Ces méthodes peuvent être utilisées pour séparer les sous-populations cellulaires négatives viables de NKG2DL ayant des propriétés putatives de cellules souches cancéreuses de NKG2DL non-LSC positives.
Introduction
Les cellules NK sont des effecteurs importants du système immunitaire inné qui peuvent reconnaître et éliminer les cellules malignes ou les cellules saines stressées (par exemple, par une infection virale) sans stimulation antigénique préalable1. Ce processus est étroitement régulé par un répertoire complexe de récepteurs activants ( tels que les récepteurs de cytotoxicité naturelle (RCN), NKG2D et CD16 - et de récepteurs inhibiteurs qui sont largement représentés par des récepteurs tueurs de type immunoglobuline (KIRs)2. La liaison des KIRs aux molécules humaines de classe I de l’antigène leucocytaire (HLA) sur les cellules somatiques assure l’auto-reconnaissance et transmet la tolérance des cellules NK. D’autre part, l’absence d’auto-reconnaissance et la liaison accrue des récepteurs activateurs à leurs ligands sur les cellules cibles déclenchent la libération de granules cytotoxiques conduisant à la cytotoxicité à médiation cellulaire NK1. Enfin, les cellules NK peuvent exercer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) en liant le récepteur activateur CD16 à des cibles exprimant la partie Fc d’Ig (FcR)2. Outre la cytotoxicité directe, les cellules NK peuvent également déclencher la libération de cytokines reliant l’inné au système immunitaire adaptatif3.
NKG2D est un récepteur activateur majeur exprimé sur les cellules T NK, NKT, γδ T et NAÏves CD8+4 qui permet à ces cellules immunitaires cytotoxiques de reconnaître et de lyser le ligand NKG2D (NKG2DL) exprimant les cellules cibles. Les cellules saines n’expriment généralement pas NKG2DL. Au lieu de cela, l’expression de NKG2DL est régulée à la hausse sur les cellules malignes ou infectées par un virus pour les rendre susceptibles de se prêter à la clairance immunitaire5.
La famille humaine NKG2DL comprend huit molécules connues parmi lesquelles les deux molécules A et B liées à la chaîne du CMH I (MICA et MICB6)et les protéines de liaison au cytomégalovirus UL16 1–6 (ULBP1-67). L’expression de NKG2DL est régulée sur les niveaux transcriptionnel, post-transcriptionnel ainsi que post-traductionnel8. En tant que tel, tandis que l’expression de NKG2DL n’est généralement pas discernable à la surface des cellules saines, NKG2DL ADN messagère9 et expression intracellulaire de protéine ont été rapportés dans les tissus sains. La pertinence fonctionnelle d’une telle expression et les mécanismes sous-jacents à de tels modèles d’expression discordants restent à définir10.
La régulation mécaniste de l’expression de NKG2DL dans les cellules cancéreuses est un domaine fascinant de recherche. Les voies connues pour être impliquées dans le stress cellulaire, par exemple la voie de stress de choc thermique9,ou les voies associées aux dommages à l’ADN, telles que l’ataxie télangiectasie mutée (ATM) et la voie Rad3 connexe (ATR)11,ainsi que les infections virales ou bactériennes ont été directement liées à l’induction de l’expression NKG2DL12. Cependant, même si l’expression de surface de NKG2DL a été effectivement induite, cette expression peut être perdue à nouveau par l’excrétion protéolytique-négociée, un mécanisme associé à l’évasion immunitaire et au mauvais pronostic clinique dans certains cancers13.
L’absence de NKG2DL de surface cellulaire peut également jouer des rôles importants dans les patients avec AML. Ici, le traitement par chimiothérapie intensive induit souvent une rémission, mais la rechute se produit souvent à partir de cellules souches leucémiques (LSC), qui survivent sélectivement aux chimiothérapies et échappent à la réponse immunitaire. Comme nous l’avons récemment montré, les LSC, par exemple, échappent à la lyse des cellules NK en supprimant l’expression de surface NKG2DL14.
Inversement, l’absence d’expression de NKG2DL de surface peut être utilisée comme méthode pour identifier et isoler de manière viative des sous-populations de cellules de type radical putatif de sous-populations leucémiques homologues en vrac. Ici, nous présentons deux approches cytométriques en flux qui peuvent être utilisées pour détecter l’expression de surface de NKG2DL et identifier ainsi les cellules souches négatives de NKG2DL dans la leucémie et peut-être aussi dans d’autres cancers: Une méthode pour la reconnaissance de surface de pan-ligand et une méthode impliquant la coloration avec des anticorps simples ou regroupés reconnaissant des protéines NKG2DL connues individuelles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Des échantillons de patients ont été prélevés après approbation du Comité d’examen éthique des Hôpitaux universitaires de Bâle et de Tuebingen.
1. Biotinylation de la protéine de fusion NKG2D
REMARQUE: Cette étape est effectuée avec un kit de biotinylation (voir la table des matériaux) conformément aux instructions du fabricant. Cette étape du protocole doit être effectuée au moins 24 h avant la coloration. La protéine de fusion NKG2D biotinylée doit être conservée à -20 °C.
- Décongeler à la fois la biotine, ainsi que les tubes protéiques de fusion NKG2D à température ambiante (RT).
REMARQUE: Si les cellules doivent être stériles pour une utilisation expérimentale ultérieure (injection chez la souris, dosages d’unités formant colonies, etc.), reconstituer la protéine de fusion sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination. Sinon, chaque étape peut être effectuée sur un banc. - Faites tourner rapidement les 50μg de protéine de fusion NKG2D lyophilisée. Ajouter 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour reconstituer la poudre et bien mélanger à l’aide d’une micropipette P1000.
- Ajouter 100 μL de la protéine de fusion NKG2DL à un tube de biotine pour obtenir une concentration finale en stock de 100 μg/mL.
- Mélangez soigneusement la solution par remise en suspension continue avec une micropipette P100.
- Incuber la solution de protéine de fusion/biotine à une ta commandée pendant 24 h. La protéine de fusion est maintenant prête à l’emploi.
2. Dégel des cellules primaires de la LAM
REMARQUE : Environ 5 000 000 de cellules leucémiques congelées par patient stockées dans de l’azote liquide ont été décongelées, puis utilisées immédiatement pour les essais. Des cellules leucémiques ont été obtenues et congelées comme précédemment décrit15. Brièvement, des prises de sang périphériques rassemblées des patients présentant AML et des pourcentages élevés de cellules de souffle (>90% de souffle parmi les cellules mononucléaires) ont été traitées avec une séparation de gradient de densité pour obtenir les cellules mononucléaires et plus tard congelées dans le sérum foetal de veau (FCS) contenant la solution de sulfoxyde diméthylique de 10% (DMSO). Les nombres de cellules ont fortement varié entre les patients dépendant de la concentration de leucocyte dans le patient (gamme : 1.000.000 à 30.000.000 cellules leucémiques par sang de ml).
- Milieu RPMI préchauffé contenant 10 % de FCS à 37 °C au bain-marie. Pour chaque flacon de cellules AML (jusqu’à 30 000 000 de cellules dans 1 mL FCS + 10% DMSO), ajouter 10 mL de milieu préchauffé à un tube de réaction de 15 mL.
- Retirer le cryovial contenant de la LAM primaire du stockage de l’azote liquide et décongeler immédiatement les cellules à l’aide d’un bain-marie à 37 °C. Déplacez doucement le tube d’avant en arrière dans l’eau, ce qui permet au contenu du flacon de dégeler jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace.
- Transférer immédiatement les cellules décongelées dans le tube contenant du milieu et rincer le flacon à l’aide de 1 mL de milieu.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
- Laver les cellules avec 5 mL de milieu RPMI contenant 10% de FCS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
3. Comptage cellulaire
- Ressusciter la pastille cellulaire dans un volume connu de milieu RPMI contenant 10 % de FCS.
- Transférer un petit volume de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et diluer à un rapport connu avec du bleu de trypan ou tout autre colorant alternatif qui permet une discrimination cellule vivante/cellule morte.
- Utilisez n’importe quel appareil pour compter les cellules.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
4. Coloration des cellules primaires de la LAM à l’aide de la protéine de fusion NKG2D biotinylée
- Préparer le tampon de coloration en complétant 500 mL pbs avec de l’albumine sérique bovine (BSA) et de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 0,07 mM et 2 mM, respectivement. Ajustez le pH (7,2 à 7,4) si nécessaire.
- Ressusciter le culot cellulaire avec tampon de coloration à une concentration finale de 0,5 x 107 cellules/mL.
REMARQUE: Éventuellement, avant la coloration, les cellules peuvent être incubées avec un agent bloquant (par exemple hIgG (1μg / ml) pendant 30 min à RT ou agent de blocage FcR).NOTE: Optionally, prior to staining, the cells can be incubated with a blocking agent (e.g. hIgG (1μg/ml) for 30 min at RT or FcR-blocking agent).. - Transférer 100 μL de la suspension cellulaire sur une plaque de fond en U de 96 puits de culture cellulaire et centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
- Préparer un mélange maître de protéines de fusion NKG2D biotinylées afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL par puits avec une concentration finale de 10 μg/mL par puits.
- Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 4.4 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
REMARQUE: Réduisez le volume final en fonction du nombre de cellules pour réduire la quantité de protéine de fusion nécessaire à la coloration. - Incuber la suspension cellulaire pendant 25 min à TA ou 50 min à 4 °C.
- Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits avec une pipette multicanal de 300 μL.
- Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
- Répétez les étapes 4.7 et 4.8.
REMARQUE: La coloration décrite ici est réalisée dans une culture cellulaire de 96 puits en U-bottom. Par conséquent, les étapes de lavage sont effectuées deux fois en raison de la faible capacité de volume de ces plaques. La coloration peut également être effectuée dans d’autres tubes et les étapes de lavage peuvent alors être effectuées une seule fois en utilisant un volume plus important. - Préparer un mélange maître à l’aide de streptavidine-PE (voir le tableau 1 pour les dilutions) afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL.
REMARQUE: Ajoutez des anticorps de sélection pour votre type de cellule d’intérêt comme par exemple CD33, CD34.... pour AML. - Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 4.10 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
- Incuber les suspensions cellulaires pendant 15 min à TA ou 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits avec une pipette multicanal de 300 μL.
- Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
- Répétez les étapes 4.13 et 4.14.
- Préparer une solution de tampon de coloration comprenant de la 7-AAD (7-Aminoactinomycine D, 1:1000) ou tout réactif pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
- Ressusciter les pastilles cellulaires dans un tampon de coloration de 200 μL + 7-AAD préparées à l’étape 4.16 à l’aide d’une micropipette multicanal de 300 μL.
- Analyser les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux.
5. Coloration d’anticorps anti-NKG2DL simples ou regroupés
- Utilisez la même suspension de cellule qu’à l’étape 4.2.
- Transférer 100 μL de la suspension cellulaire sur une plaque de fond en U de 96 puits de culture cellulaire à l’aide d’une pipette multicanal de 300 μL et centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
- Préparer un mélange maître d’anticorps pour chaque anticorps primaire ou anticorps mis en commun (voir le tableau 2 pour les dilutions) afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL.
- Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 5.3 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
- Incuber les cellules pendant 25 minutes à ta.
- Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits à l’aide d’une pipette multicanal de 300 μL.
- Centrifuger la plaque de fond en U de 96 puits de culture cellulaire à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber le culot.
- Répétez les étapes 5.6 et 5.7.
- Préparer un mélange maître d’anticorps en ajoutant l’anticorps secondaire (voir le tableau 2 pour les dilutions) afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL par puits.
- Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 5.9 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
- Incuber pendant 15 min à TA ou 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Laver en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits à l’aide d’une pipette multicanal de 300 μL.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
- Répétez les étapes 5.12 et 5.13.
- Ressusciter les pastilles cellulaires dans un tampon de coloration de 200 μL contenant du 7-AAD préparé à l’étape 4.16.
- Analyser les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux tel que décrit à l’étape 6.
6. Acquisition de données
REMARQUE: Assurez-vous que les contrôles de qualité hebdomadaires du cytomètre de flux sont effectués pour s’assurer que les lasers fonctionnent correctement. Pour le protocole présenté ici, un processus hebdomadaire de cytomètre et de suivi (CTS) est effectué avec des perles relatives pour vérifier les performances laser sur tous les canaux. Après le CTS, 10 000 événements sont enregistrés en utilisant les billes de 8 pics comme contrôle interne. Tous les pics doivent être dans la même position à l’intérieur de leurs portes et bien séparés les uns des autres.
- Créer la compensation matricielle pour soustraire le chevauchement spectral entre les détecteurs avec des billes ou avec des cellules16.
- Enregistrez 10 000 événements pour les cellules non colorées et les perles colorées simples. Pour les contrôles de fluorescence moins un (FMO), enregistrez 50 000 événements et pour les échantillons entièrement colorés, enregistrez jusqu’à 100 000 événements.
REMARQUE: Alternativement, des échantillons colorés simples peuvent être effectués sur les cellules. Si c’est le cas, assurez-vous que les cellules ont un signal positif pour le marqueur souhaité. - Acquérir un seul échantillon de cellules colorées ou de perles pour chaque fluorophore utilisé dans l’expérience afin de révéler la quantité de chevauchement spectral. Utilisez le créateur de compensation du dispositif de cytométrie de flux pour calculer les valeurs de débordement et appliquer la matrice de compensation à tous les échantillons mesurés.
REMARQUE: Les anticorps secondaires ne peuvent pas être utilisés pour la création de compensation à l’aide de billes si la compensation est calculée avec des billes. Selon le type de billes de compensation, les anticorps secondaires ne peuvent pas être utilisés pour la compensation avec des billes. - Pour les contrôles FMO et les échantillons entièrement colorés avec la protéine de fusion, tout d’abord, sélectionnez les cellules en fonction de leur diffusion vers l’avant (FSC) et de leur dispersion latérale (SSC). Après l’exclusion des doublets, portez les cellules en fonction de leur négativité pour le signal 7-AAD (PercP-Cy5.5) d’exclure les cellules mortes (voir étape 5.15). Le graphique final montre l’expression de CD34 (axe des Y) et de NKG2DL (axe des X) sur les singlets vivants.
- Pour les anticorps anti-NKG2DL simples, appliquez la même stratégie aux échantillons, mais notez que la positivité du ligand réside dans Alexa Fluor 488 et non dans le canal PE.
- Ajustez les portes en fonction des contrôles FMO pour la stratégie de contrôle des étapes 6.4 et 6.5 (voir le tableau 3)pour que les contrôles FMO appropriés fonctionnent pour cette expérience: Dans le logiciel d’analyse, tracez une porte sur la fraction négative. Lors de l’enregistrement de l’échantillon entièrement coloré, les cellules au-dessus de la porte précédemment créée sont positives pour le marqueur analysé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les deux protocoles présentés ici permettent l’enrichissement d’AML LSC par des analyses cytométriques en flux utilisant CD34, un marqueur connu de LSC17,en combinaison avec l’expression de surface de NKG2DL en utilisant la reconnaissance pan-ligand ou la coloration avec des anticorps groupés contre des ligands individuels. Dans la figure 1, nous montrons que les échantillons analysés de laM sont positifs pour CD34 et NKG2DL, mais qu’il existe également des sous-populations négatives, ce qui est démontré par la présence de quatre populations différentes au total. Nos données montrent la stratégie de contrôle typique pour une telle coloration, en commençant par la sélection de la population principale de cellules via leur FSC et SSC. Les doublets et les cellules mortes sont exclus de l’analyse en aval (Figure 1A). Les barrières sont ajustées à l’aide de contrôles FMO pour assurer une identification appropriée des cellules positives(Figure 1B).
Dans la figure 1C,nous mettons en évidence les intensités de fluorescence des cellules positives pour CD34 (APC, axe Y) par rapport à NKG2DL (PE, axe X). Les cellules de LAM qui sont positives pour CD34 montrent une expression de surface inférieure de NKG2DL (Figure 1C), ce qui est conforme aux résultats précédents de notre laboratoire, montrant que l’expression de NKG2DL est associée à un manque de stemness14.
La figure 2 indique la robustesse des deux méthodes de coloration NKG2DL. Dans la figure 2A,nous étudions trois échantillons primaires de LAM côte à côte montrant 19,8, 49,8 et 89,4 %, respectivement, d’événements positifs pour la coloration de la protéine de fusion contre 20,4, 50,4 et 90,6 % pour la coloration des anticorps anti-NKG2DL regroupés (anticorps regroupés contre le MICA, le MICB, l’ULBP1, l’ULBP2/5/6 et l’ULBP3), respectivement. D’autre part, la coloration d’un seul ligand (contre MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 ou ULBP3) montre une gamme d’événements positifs allant jusqu’à 92%(Figure 2B). Ce pourcentage varie en fonction du ligand lui-même et du patient, par exemple, ULBP3(Figure 2B). Il convient de noter qu’une seule cellule peut exprimer plusieurs NKG2DL.
Lorsque plusieurs anticorps anti-NKG2DL sont regroupés et combinés en un seul tube, le pourcentage de cellules positives est comparable au pourcentage de la protéine de fusion (Figure 2A). En tant que tels, les deux protocoles fonctionnent bien et peuvent fournir des résultats similaires concernant l’expression de NKG2DL sur les cellules primaires d’AML. Dans certaines LAM, la méthode des protéines de fusion peut permettre une sensibilité plus élevée puisqu’elle peut permettre la reconnaissance d’autres protéines NKG2DL.
Figure 1 : Stratégie de gating typique des échantillons primaires de LAM. (A) Les cellules sont d’abord fermées en fonction de leur taille (axe des X) et de leur complexité (p. ex., granularité, axe des Y). Les doublets sont ensuite exclus en traçant la hauteur ou la largeur par rapport à la zone de diffusion vers l’avant. Enfin, les cellules vivantes sont sélectionnées en fonction de leur taille (axe X) par rapport à leur négativité pour 7AAD (PerCP-Cy5.5, axe Y). (B) Les contrôles FMO sont utilisés pour mettre en place les points de contrôle aidant à faire la distinction entre les populations positives et négatives pour les marqueurs indiqués. La stratégie de gating reste identique, comme le montre la figure 1A. (C) Diagramme de cytométrie de flux montrant des événements positifs et négatifs pour CD34 (APC, axe Y) vs NKG2DL (PE ou AlexaFluor488, axe X). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Comparaison des protocoles de coloration. (A) Graphiques à barres montrant le pourcentage d’événements positifs pour la protéine de fusion par rapport aux anticorps anti-NKGD2L regroupés (n = 3 échantillons de LAM) à partir de cellules vivantes uniques fermées. (B) Graphiques à barres montrant le pourcentage d’événements positifs pour la coloration d’un seul ligand pour tous les anticorps anti-NKG2DL connus et les ligands simples regroupés (voir la table des matériaux pour des informations détaillées sur les anticorps). Le gating a été de nouveau exécuté sur les cellules vivantes simples. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nom du tube | Antigène | Fluorophore | Dilution/concentration |
| Cellules non colorées | - | - | - |
| Tache unique PE |
NKG2D-Fusionprotéine | PE | 1:10 pour l’étape principale 1:100 pour l’étape secondaire |
| Tache unique 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Tache unique APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Cellules pleines colorées | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotéine | PE | 1:10 pour l’étape principale 1:100 pour l’étape secondaire | |
| Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tableau 1 : Tubes requis pour colorer les échantillons avec la protéine de fusion NKG2D. Ce tableau montre les tubes nécessaires à la mise en place de l’expérience.
| Nom du tube | Antigène | Fluorophore | Dilution/concentration |
| Cellules non colorées | - | - | - |
| Tache unique Alexa Fluor 488 |
ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL pour l’étape primaire 4 μg/ml pour l’étape secondaire |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| tache unique 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Tache unique APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Cellules pleines colorées | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL pour l’étape primaire 4 μg/ml pour l’étape secondaire |
|
| Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tableau 2 : Tubes requis pour colorer les échantillons avec les anticorps anti-NKG2DL. Ce tableau montre les tubes nécessaires à la mise en place de l’expérience.
| Nom du tube | Antigène | Fluorophore | Dilution/concentration |
| Cellules non colorées | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL pour l’étape primaire 4 μg/mL pour l’étape secondaire |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Fusionprotéine | PE | 1:10 pour l’étape principale 1:100 pour l’étape secondaire |
|
| Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL pour l’étape primaire 4 μg/mL pour l’étape secondaire |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Fluor 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotéine | PE | 1:10 pour l’étape principale 1:100 pour l’étape secondaire |
|
| Vivant/Mort | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tableau 3 : Tubes nécessaires à la mise en place des commandes indispensables. Ce tableau montre les tubes requis pour mettre en place des contrôles appropriés des anticorps FMO, primaires et secondaires. Tous les contrôles requis (FMO) doivent être ajoutés par l’expérimentateur pour obtenir des résultats valides et des données interprétables.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous présentons deux méthodes cytométriques de flux qui peuvent détecter l’expression de surface de NKG2DL sur les cellules primaires humaines d’AML. Nous montrons que les deux méthodes de détection peuvent être utilisées en conjonction avec d’autres colorations d’anticorps (par exemple, la détection de l’expression de CD34). Des taches similaires peuvent également être effectuées sur d’autres types de cellules primaires et lignées cellulaires.
Nous avons récemment montré que l’absence de NKG2DL à la surface des blastes des patients atteints de LMA peut enrichir le LSC14. Dans la LAM, les sous-populations leucémiques négatives de NKG2DL, mais pas de NKG2DL, possèdent des capacités de leucémie-initiation clonogènes et in vivo. De futures recherches montreront si l’absence d’expression de surface de NKG2DL peut également être utilisée comme outil pour enrichir les cellules souches dans d’autres types de cancer.
Cd34 a été classiquement montré pour marquer les LSC dans la LAM, mais la LAM est une maladie très hétérogène et tous les patients atteints de LAM ne montrent pas d’expression cd34 (c.-à-d., CD34 négatif AML18). Nous avons précédemment prouvé que l’absence de l’expression de surface de NKG2DL fournit un outil original pour identifier le LSC dans ce sous-groupe d’AML cd34 négatif. Ici, en revanche, nous nous concentrons sur le sous-groupe des LMR cd34-positives et montrons que différentes sous-populations peuvent se produire. Des recherches futures montreront si la co-coloration du NKG2DL en conjonction avec d’autres marqueurs (p. ex. CD34) peut enrichir plus efficacement la LSC.
En cytométrie de flux, il est important d’inclure des contrôles adéquats tels que FMO pour aider l’expérimentateur à faire correctement la distinction entre les événements positifs et négatifs. De plus, des témoins positifs pour chaque anticorps utilisé sont nécessaires pour s’assurer que l’absence de coloration n’est pas due à un mauvais fonctionnement de l’anticorps. Le protocole que nous présentons ici n’utilise qu’un nombre limité de marqueurs de surface, qui peuvent être étendus en fonction des besoins de l’expérimentateur, par exemple, par l’ajout de marqueurs CD33 ou LSC potentiels19. De plus, les fluorophores utilisés dans ce protocole peuvent être adaptés. Il est important de noter que de tels changements doivent être accompagnés d’un titrage d’anticorps pour déterminer la meilleure dilution.
Une étape critique avant la coloration est le dégel des cellules primaires de la LAM. En effet, en plus de leur fragilité, de tels échantillons sont conservés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), qui est en soi toxique pour les cellules. Par conséquent, les échantillons doivent être manipulés avec soin et doivent être rincés à fond pour éviter une exposition prolongée au DMSO. Bien que nos échantillons aient été traités et congelés selon un protocole15précédemment établi, il est important de suivre attentivement les étapes décrites dans le manuscrit pour assurer une récupération cellulaire élevée. Travailler avec des échantillons frais assurera une meilleure viabilité et est donc recommandé. Cependant, dans la plupart des cas, cela n’est pas réalisable.
Un autre facteur influençant la méthode décrite est la déviation spécifique à l’échantillon qui peut entraîner différents profils de diffusion cellulaire observés via la cytométrie en flux. En raison de l’hétérogénéité de la maladie, cela est inévitable, mais devrait être pris en compte dans l’analyse. Une variabilité supplémentaire peut être introduite par la congélation/décongélation ou d’autres étapes mécaniques dans le traitement des échantillons. En général, la rapidité est la clé pour éviter la mort cellulaire. Pourtant, les cellules et les débris mourants ne peuvent être évités et doivent être pris en compte et exclus dans l’analyse. Les gating basés sur fsc/SSC doivent être faits avec minutie et un œil critique car il s’agit de la première étape de l’analyse de l’échantillon.
Un avantage majeur de la protéine de fusion est sa puissance pour détecter tous les NKG2DL connus et potentiellement inconnus, tandis que les anticorps anti-NKG2DL spécifiques (par exemple, MICA, MICB) introduisent un biais de sélection. Les deux méthodes sont également réalisables. Pour le nombre limité d’échantillons analysés, ils ont également montré des résultats très comparables. L’utilisation de la protéine de fusion NKG2D présente des avantages majeurs: moins de temps, diminution du nombre de réactifs et du nombre d’échantillons de coloration, ainsi qu’une probabilité plus faible d’erreurs humaines (c’est-à-dire des erreurs de pipetage). De plus, cette méthode peut également être plus efficace pour capturer l’expression de NKG2DL dans certains échantillons, car elle devrait également capturer l’expression de protéines inconnues avec la fonction NKG2DL, qui peut être exprimée dans certains cas de LAM. Tout en fournissant un aperçu de la présence en surface de NKG2DL, ces méthodes ne fournissent pas d’informations sur les niveaux intracellulaires de NKG2DL, leur trafic ou leur régulation, et d’autres tests devraient donc être effectués pour acquérir davantage de connaissances sur ces questions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du Fonds national suisse de la recherche scientifique (179239), de la Fondation de lutte contre le cancer (Zuerich), de la Fondation Wilhelm Sander au CL (2019.042.1) et de la Fondation Novartis pour la recherche médico-biologique à C.L. En outre, ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 765104. Nous remercions le Centre de cytométrie en flux de Bâle pour son soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
