Summary
אנו מציגים שני פרוטוקולי הכתמה שונים עבור NKG2D ליגנד (NKG2DL) זיהוי בלוקמיה מיאלואידית חריפה אנושית (AML) דגימות. הגישה הראשונה מבוססת על חלבון היתוך, המסוגל לזהות את כל הליבנדים הידועים ואולי עדיין לא ידועים, בעוד הפרוטוקול השני מסתמך על תוספת של נוגדנים מרובים נגד NKG2DL.
Abstract
בתוך אותו חולה, היעדר ליגנדים NKG2D (NKG2DL) ביטוי פני השטח הוכח להבחין בין תת אוכלוסין לוקמי עם תכונות תאי גזע (מה שנקרא תאי גזע לויקמיים, LSCs) מתאים לויקמיים עמיתים מובחנים יותר חסרי פוטנציאל חניכת מחלות למרות שהם נושאים מוטציות גנטיות ספציפיות לוקמיה דומות. NKG2DL הן ביוכימיות מגוונות מאוד MHC בכיתה I כמו מולקולות עצמיות. תאים בריאים בתנאים הומיאוסטטיים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL על פני התא. במקום זאת, ביטוי של ליגנדים אלה מושרה עם חשיפה ללחץ תאי (למשל, טרנספורמציה אונקוגנית או גירויים זיהומיים) כדי לעורר חיסול של תאים פגומים באמצעות תמוגה באמצעות תאי מערכת החיסון קולטן NKG2D כגון תאי רוצח טבעי (NK). מעניין, ביטוי פני השטח NKG2DL מודחק באופן סלקטיבי בתת-אוכלוסין LSC, ומאפשר לתאים אלה להתחמק ממעקב חיסוני בתיווך NKG2D. כאן, אנו מציגים ניתוח זה לצד זה של שתי שיטות ציטומטריית זרימה שונות המאפשרות חקירה של ביטוי פני השטח NKG2DL על תאים סרטניים כלומר, שיטה הכוללת זיהוי פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים עם נוגדנים מרובים נגד ליגנדים בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להפריד תת-אוכלוסין תאיים שלילי NKG2DL קיימא עם תכונות תאי גזע סרטן putative מ NKG2DL חיובי שאינו LSC.
Introduction
תאי NK הם משפיעים חשובים של מערכת החיסון המולדת שיכולים לזהות ולחסל תאים ממאירים או תאים בריאים לחוצים (למשל, על ידי זיהום ויראלי) ללא גירוי אנטיגן קודם1. תהליך זה מוסדר היטב באמצעות רפרטואר מורכב של הפעלת קולטנים - כגון קולטני ציטוטוקסיות טבעיים (NCRs), NKG2D ו- CD16 - וקולטנים מעכבים המיוצגים במידה רבה על ידי קולטנים דמויי אימונוגלובולין רוצח (KIRs)2. קשירת KIRs למולקולות אנטיגן מסוג לויקוציטים אנושי (HLA) מסוג I על תאים סומטיים מבטיחה הכרה עצמית ומעבירה סובלנות לתאי NK. מצד שני, היעדר הכרה עצמית וקשירה מוגברת של הפעלת קולטנים לליגנדים שלהם על תאי היעד מפעילים את שחרורם של גרגירים ציטוטוקסיים המובילים לציטוקסיות בתיווך תא NK1. לבסוף, תאי NK יכולים להפעיל ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) על ידי כריכה של קולטן הפעלת CD16 ליעדים המבטאים את החלק Fc של Ig (FcR)2. מלבד ציטוטוקסיות ישירה, תאי NK יכולים גם לעורר שחרור ציטוקינים המגשר בין המולדת למערכת החיסון האדפטיבית3.
NKG2D הוא קולטן הפעלה מרכזי המתבטא ב- NK, NKT, γδ T, ותאי CD8 + T נאיביים4 המאפשרים לתאי חיסון ציטוקסיים כאלה לזהות וליזה ליגנד NKG2D (NKG2DL) המבטאים תאי יעד. תאים בריאים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL. במקום זאת, ביטוי NKG2DL הוא upregulated על תאים ממאירים או נגועים בווירוס כדי להפוך אותם נוחים לאישור מערכת החיסון5.
משפחת NKG2DL האנושית כוללת שמונה מולקולות ידועות ביניהן שתי המולקולות הקשורות לשרשרת MHC I A ו- B (MICA ו- MICB6) וחלבוני cytomegalovirus UL16 מחייבים 1-6 (ULBP1-67). הביטוי של NKG2DL מוסדר על תמלול, לאחר תמלול, כמו גם את הרמות שלאחר התרגום8. ככזה, בעוד ביטוי NKG2DL הוא בדרך כלל לא ניתן לזהות על פני השטח של תאים בריאים, NKG2DL mRNA9 וביטוי חלבון תאי דווחו ברקמות בריאות. הרלוונטיות התפקודית של ביטוי כזה והמנגנונים שבביד דפוסי ביטוי אי התאמה כאלה נותרים מוגדרים10.
הרגולציה המכניסטית של ביטוי NKG2DL בתאי הסרטן היא תחום חקירה מרתק. מסלולים ידועים להיות מעורבים או מתח תאי, למשל, מסלול הלחץ הלם חום9, או נתיבים הקשורים נזק DNA, כגון אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM) ו Rad3 הקשורים (ATR) מסלול11, כמו גם זיהומים ויראליים או חיידקיים קושרו ישירות אינדוקציה של ביטוי NKG2DL12. עם זאת, גם אם ביטוי פני השטח של NKG2DL הושרה ביעילות, ביטוי זה יכול ללכת לאיבוד שוב באמצעות שפיכה בתיווך פרוטאוליטי, מנגנון הקשורים לבריחה חיסונית ופרוגנוזה קלינית לקויה בכמה סוגי סרטן13.
היעדר משטח התא NKG2DL עשוי גם לשחק תפקידים חשובים בחולים עם AML. כאן, טיפול עם כימותרפיה אינטנסיבית לעתים קרובות גורם הפוגה, אבל הישנות מתרחשת לעתים קרובות מתאי גזע לויקמיים (LSC), אשר באופן סלקטיבי לשרוד כימותרפיה ולהתחמק תגובה חיסונית. כפי שהראינו לאחרונה, LSCs, למשל, לברוח תמוגה תא NK על ידי דיכוי ביטוי פני השטח NKG2DL14.
הפוך, היעדר ביטוי NKG2DL משטח יכול לשמש כשיטה לזהות ולבודד באופן מעשי תת-אוכלוסין דמוי גזע putative של תאים מתת אוכלוסין לויקמי מקביל בתפזורת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ציטומטריות זרימה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL ובכך לזהות תאי גזע שליליים NKG2DL בלוקמיה ואולי גם בסרטנים אחרים: שיטה לזיהוי משטח פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים בנוגדנים בודדים או מרופדים המזהים חלבוני NKG2DL ידועים בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות מטופלים נאספו לאחר אישור הוועדה לבדיקת אתיקה של בתי החולים האוניברסיטאיים באזל וטובינגן.
1. ביו-טינילציה של חלבון ההיתוך NKG2D
הערה: שלב זה מבוצע עם ערכת ביוטינילציה (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראת היצרן. שלב זה של הפרוטוקול חייב להתבצע לפחות 24 שעות לפני הכתם. חלבון ההיתוך NKG2D הביוטיניל צריך להיות מאוחסן ב -20 °C (50 °F).
- להפשיר הן את הביוטין, כמו גם את צינורות חלבון היתוך NKG2D בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: אם התאים צריכים להיות סטריליים לשימוש ניסיוני נוסף (הזרקה בעכברים, מושבה להרכיב ישבן יחידה, וכו '), לבסס מחדש את חלבון ההיתוך תחת מכסה המנוע זרימה למינאר כדי למנוע זיהום. אחרת, כל צעד יכול להתבצע על ספסל. - ספין במהירות את 50μg של חלבון היתוך NKG2D ליופילי. הוסיפו 500 מיקרו-אל של תמיסת מלח (PBS) עם אגירה בפוספט כדי ליישב מחדש את האבקה ולערבב היטב באמצעות מיקרופיט P1000.
- הוסף 100 μL של חלבון היתוך NKG2DL לצינור ביוטין כדי להשיג ריכוז מלאי סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
- ערבבו את הפתרון ביסודיות על ידי הוצאה חוזרת רציפה עם מיקרופיט P100.
- לדגור על פתרון חלבון היתוך / ביוטין ב RT מבוקר עבור 24 שעות. חלבון ההיתוך מוכן כעת לשימוש.
2. הפשרת תאי AML ראשוניים
הערה: כ -5,000,000 תאים לויקמיים קפואים לכל מטופל המאוחסנים בחנקן נוזלי הופשרו ולאחר מכן שימשו לבדיקות מיד. תאים לויקמיים הושגו והוקפאו כפי שתואר בעבר15. בקצרה, דגימות דם היקפיות שנאספו מחולים עם AML ואחוזי תאי פיצוץ גבוהים (>90% מהתפוצצויות בקרב תאים מונונוקלאריים) עובדו עם הפרדה הדרגתית בצפיפות כדי להשיג תאים מונונוקלאריים ולאחר מכן קפוא בסרום עגל עוברי (FCS) המכיל 10% תמיסת דימתיל סולפוקסיד (DMSO). מספרי התאים מגוונים מאוד בין חולים בתלות בריכוז לויקוציטים בחולה (טווח: 1,000,000 עד 30,000,000 תאים לויקמיים לדם mL).
- מדיום RPMI חם מראש המכיל 10% של FCS ב 37 °C (50 °F) באמצעות אמבט מים. עבור כל מ"ל של תאי AML (עד 30,000,000 תאים ב FCS 1 מ"ל + 10% DMSO), להוסיף 10 מ"ל של בינוני מחומם מראש לצינור תגובה 15 מ"ל.
- הסר את cryovial המכיל AML ראשוני מאחסון חנקן נוזלי מיד להפשיר את התאים באמצעות אמבט מים 37 °C. מעבירים בעדינות את הצינור קדימה ואחורה במים, ומאפשרים לתוכן המצוין להפשיר עד שנותר רק גבישי קרח קטן.
- מיד להעביר את התאים המופשרים לתוך הצינור המכיל בינוני ולשטוף את המשחקון באמצעות 1 מ"ל של בינוני.
- צנטריפוגות התאים ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של RPMI בינוני המכיל 10% של FCS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות.
3. ספירת תאים
- resuspend גלולה התא בנפח ידוע של RPMI בינוני המכיל 10% של FCS.
- העבר נפח קטן של מתלה התא לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל לדלל ביחס ידוע עם כחול טריפן או כל צבע חלופי אחר המאפשר אפליה של תאים חיים / תאים מתים.
- השתמש בכל התקן כדי לספור את התאים.
- צנטריפוגות התאים ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
4. הכתמה של תאי AML ראשוניים באמצעות חלבון היתוך NKG2D ביוטיניל
- הכן את מאגר הכתמים על ידי שכשהם 500 מ"ל PBS עם אלבומין בסרום בקר (BSA) וחומצה אתילנדימינטראצטית (EDTA) לריכוז סופי של 0.07 מ"מ ו-2 מ"מ, בהתאמה. התאימו את ה-pH (7.2–7.4) במידת הצורך.
- resuspend גלולה התא עם חוצץ כתמים לריכוז הסופי של 0.5 x 107 תאים / מ"ל.
הערה: אופציונלי, לפני הכתמה, התאים יכולים להיות דגירה עם סוכן חסימה (למשל hIgG (1μg/ml) במשך 30 דקות ב סוכן חסימת RT או FcR).. - העבר 100 μL של השעיית התא לתרבות תא 96-well U-למטה צלחת צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
- הכן תערובת ראשית של חלבון היתוך ביוטינילציה NKG2D כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 μL לבאר עם ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל לבאר.
- הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 4.4 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצי.
הערה: להקטין את הנפח הסופי בהתאם למספר התאים כדי להפחית את כמות חלבון ההיתוך הדרוש להכתמה. - לדגור על השעיית התא במשך 25 דקות ב RT או 50 דקות ב 4 °C (70 °F).
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר עם 300 μL pipette רב ערוצי.
- צנטריפוגות את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות להשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- חזור על שלבים 4.7 ו- 4.8.
הערה: הכתמים המתוארים כאן מבוצעים בצלחת U-תחתית 96-well. לכן, צעדי כביסה מבוצעים פעמיים בגלל קיבולת נפח קטנה של צלחות כאלה. הכתמים יכולים להתבצע גם בצינורות אחרים וצעדי כביסה עשויים להתבצע רק פעם אחת באמצעות נפח גדול יותר. - הכן תערובת אב באמצעות Streptavidin-PE (ראה טבלה 1 עבור דילול) כך שהתאים יתחנכו מחדש באמצעי אחסון סופי של 50 μL.
הערה: הוסף נוגדני בחירה עבור סוג העניין של התא שלך כ- CD33, CD34.... עבור AML. - הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 4.10 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצי.
- לדגור על השעיות התא במשך 15 דקות ב RT או 30 דקות ב 4 °C (50 °F) בחושך.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר עם 300 μL pipette רב ערוצי.
- צנטריפוגות את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות להשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- חזור על שלבים 4.13 ו-4.14.
- הכן פתרון של חיץ כתמים כולל 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) או כל ריאגנט להבחין בין תאים חיים ומתים.
- כדורים של תאים resuspend במאגר כתמים μL 200 + 7-AAD מוכן בשלב 4.16 באמצעות 300 μL רב ערוצית מיקרופיפט.
- נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה.
5. הכתמה של נוגדנים יחידים או מאוגדים יחידים נגד NKG2DL
- השתמש באותו השעיית תא כמו בשלב 4.2.
- העבר 100 μL של השעיית התא לתרבות תא 96-well U-bottom צלחת באמצעות 300 μL pipette רב ערוצי וצנטריפוגה את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
- הכן תערובת אב נוגדנים עבור כל נוגדן ראשוני או נוגדנים מקבצים (ראה טבלה 2 עבור דילול) כך התאים הם resuspended בנפח סופי של 50 μL.
- הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 5.3 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצי.
- לדגור על התאים במשך 25 דקות ב RT.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר באמצעות 300 μL pipette רב ערוצי.
- צנטריפוגות את תרבית התא 96-היטב U-צלחת תחתון ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- חזור על שלבים 5.6 ו- 5.7.
- הכן תערובת אב נוגדנים על-ידי הוספת הנוגדן המשני (ראה טבלה 2 לדילול) כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 μL לבאר.
- הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 5.9 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצית.
- דגירה במשך 15 דקות ב RT או 30 דקות ב 4 °C (50 °F) בחושך.
- לשטוף על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר באמצעות 300 μL pipette רב ערוצי.
- צנטריפוגות השעיית התא ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
- חזור על שלבים 5.12 ו- 5.13.
- חידשו את כדורי התא במאגר הכתמים של 200 מיקרו-לן המכיל 7-AAD שהוכן בשלב 4.16.
- נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה כמתואר בשלב 6.
6. רכישת נתונים
הערה: ודא כי בקרות איכות שבועיות של cytometer הזרימה מבוצעות כדי להבטיח כי לייזרים מתפקדים כראוי. עבור הפרוטוקול המוצג כאן, תהליך Cytometer ומעקב שבועי (CTS) מבוצע עם חרוזים יחסית לבדיקת הופעות לייזר בכל הערוצים. לאחר CTS, 10,000 אירועים נרשמים באמצעות חרוזים 8-שיא כבקרה פנימית. כל הפסגות צריכות להיות באותה תנוחה בתוך השערים שלהן ומופרדות היטב זו מזו.
- צור את פיצוי מטריצה כדי להפחית חפיפה ספקטרלית בין גלאים עם חרוזים או עם תאים16.
- תעד 10,000 אירועים עבור התאים הלא מזוהמים והחרוזים המוכתמים הבודדים. עבור פקדי הפלואורסצנטיות מינוס פקד אחד (FMO), תעד 50,000 אירועים ועל הדגימות המוכתמות במלואן רשמו עד 100,000 אירועים.
הערה: לחלופין, ניתן לבצע דגימות מוכתמות בודדות על התאים. אם כן, ודא כי התאים יש אות חיובי עבור הסמן הרצוי. - לרכוש תא מוכתם יחיד או מדגם חרוז עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי כדי לחשוף את כמות החפיפה הספקטרלית. השתמש ביוצר הפיצוי של התקן ציטומטריית הזרימה כדי לחשב ערכי גלישה וליישם את מטריצת הפיצוי על כל הדגימות שנמדדו.
הערה: לא ניתן להשתמש בנוגדנים משניים ליצירת פיצוי באמצעות חרוזים אם הפיצוי מחושב עם חרוזים. בהתאם לסוג חרוזי הפיצוי, לא ניתן להשתמש בנוגדנים משניים לפיצוי עם חרוזים. - עבור פקדי FMO ואת הדגימות המוכתמות המלאות עם חלבון ההיתוך, ראשית, לבחור את התאים בהתבסס על הפיזור הקדמי שלהם (FSC) ופיזור צד (SSC). לאחר ההדרה של כפולים, שער התאים בהתבסס על השליליות שלהם עבור 7-AAD (PercP-Cy5.5) אות כדי לא לכלול את התאים המתים (ראה שלב 5.15). העלילה הסופית מציגה את הביטוי של CD34 (ציר Y) ו- NKG2DL (ציר X) על סינגלים חיים.
- עבור נוגדנים יחידים נגד NKG2DL, להחיל את אותה אסטרטגיה על הדגימות אבל לשים לב כי חיוביות ליגנד טמון אלכסה Fluor 488 ולא ערוץ PE.
- התאם שערים בהתאם לבקרות FMO לאסטרטגיית גיטינג החל מהשלב 6.4 ו- 6.5 (ראה טבלה 3) לפקדי FMO מתאימים לביצוע עבור ניסוי זה: בתוכנת הניתוח, צייר שער על השבר השלילי. בעת הקלטת המדגם המוכתם במלואו, התאים מעל השער שנוצר בעבר הם חיוביים עבור הסמן המנותח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שני הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים העשרה של AML LSC על ידי ניתוחים ציטומטריים זרימה באמצעות CD34, סמן ידוע של LSC17, בשילוב עם ביטוי פני השטח NKG2DL על ידי שימוש בזיהוי פאן-ליגנד או כתמים עם נוגדנים משולבים נגד ליגנדים בודדים. באיור 1, אנו מראים כי דגימות AML המנותחות חיוביות עבור CD34 ו- NKG2DL, אך קיימות גם אוכלוסיות משנה שליליות, המוצגות על ידי נוכחות של ארבע אוכלוסיות שונות בסך הכל. הנתונים שלנו מראים את אסטרטגיית הגינג הטיפוסית להכתמת כזה, החל בבחירת האוכלוסייה העיקרית של תאים באמצעות ה- FSC וה- SSC שלהם. מכפילים ותאים מתים אינם נכללים בניתוח במורד הזרם(איור 1A). השערים מותאמים באמצעות פקדי FMO כדי להבטיח זיהוי נכון של תאים חיוביים (איור 1B).
באיור 1C, אנו מדגישים את עוצמות הפלואורסצנטיות של תאים חיוביים עבור CD34 (APC, ציר Y) לעומת NKG2DL (PE, ציר X). תאי AML חיוביים עבור CD34 מראים ביטוי משטח נמוך יותר של NKG2DL (איור 1C),אשר עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים מהמעבדה שלנו, מראה כי ביטוי NKG2DL קשור לחוסר גזע14.
איור 2 מציין את החוסן של שתי שיטות ההכתמה של NKG2DL. באיור 2A, אנו חוקרים שלוש דגימות AML עיקריות זו לצד זו המציגות 19.8, 49.8 ו-89.4%, בהתאמה של אירועים חיוביים עבור כתמי חלבון ההיתוך לעומת 20.4, 50.4 ו-90.6% עבור כתמי נוגדני NKG2DL (נוגדנים מאוגדים נגד MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 ו-ULBP3), בהתאמה. מצד שני, ליגנד יחיד (נגד MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 או ULBP3) מכתים מראה מגוון של אירועים חיוביים עד 92%(איור 2B). אחוז זה משתנה בהתאם לליגנד עצמו ולמטופל, לדוגמה, ULBP3 (איור 2B). שימו לב, תא בודד יכול לבטא NKG2DL מרובים.
כאשר נוגדנים מרובים נגד NKG2DL משולבים ומשולבים בצינור אחד בודד, אחוז התאים החיוביים דומה לאחוז חלבון ההיתוך (איור 2A). ככזה, שני הפרוטוקולים פועלים היטב ועשויים לספק תוצאות דומות לגבי ביטוי NKG2DL בתאי AML ראשיים. בחלק AML, שיטת חלבון ההיתוך עשויה לאפשר רגישות גבוהה יותר שכן היא יכולה לאפשר זיהוי של חלבונים נוספים NKG2DL.
איור 1: אסטרטגיית גטינג טיפוסית של דגימות AML ראשיות. (A)תאים מגודרים תחילה בהתבסס על גודלם (ציר X) ומורכבותם (למשל, פירוט, ציר Y). לאחר מכן, מכפילים אינם נכללים על-ידי התוויית הגובה או הרוחב אל מול האזור לפיזור קדימה. לבסוף, תאים חיים נבחרים על סמך גודלם (ציר X) לעומת השליליות שלהם עבור 7AAD (PerCP-Cy5.5, ציר Y). (B)פקדי FMO משמשים כדי להגדיר את השערים המסייעים להפלות בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות עבור סמנים מסומנים. אסטרטגיית הגטינג נותרה זהה לזו המתוארת באיור 1A. (C)עלילת ציטומטריה של זרימה המציגה אירועים חיוביים ושליליים עבור CD34 (APC, ציר Y) לעומת NKG2DL (PE או AlexaFluor488, ציר X). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואת פרוטוקולי הכתמים. (A)תרשימי עמודות המציגים את אחוז האירועים החיוביים עבור חלבון ההיתוך לעומת נוגדני האנטי-NKGD2L (n = 3 דגימות AML) מתאים חיים בודדים מגודרים. (B)תרשימי עמודות המציגים את אחוז האירועים החיוביים עבור כתמי ליגנד יחיד עבור כל הנוגדנים הידועים נגד NKG2DL וליגנדים בודדים ומאוחסנים (ראה טבלת חומרים למידע מפורט על נוגדנים). גטינג בוצע שוב על תאים חיים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם צינור | אנטיגן | פלואורופור | דילול/ריכוז |
| תאים לא נגועים | - | - | - |
| כתם יחיד PE |
NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 לשלב ראשי 1:100 עבור שלב משני |
| כתם יחיד 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| כתם יחיד נגמ"ש |
CD34 | נגמ"ש | 1:25 |
| תאים מוכתמים מלאים | CD34 | נגמ"ש | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 לשלב ראשי 1:100 עבור שלב משני | |
| חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
טבלה 1: צינורות נדרשים להכתים דגימות עם חלבון היתוך NKG2D. טבלה זו מציגה את הצינורות הנדרשים כדי להגדיר את הניסוי.
| שם צינור | אנטיגן | פלואורופור | דילול/ריכוז |
| תאים לא נגועים | - | - | - |
| כתם יחיד אלכסה פלור 488 |
ULBP-1 | אלכסה פלור 488 | 10 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב ראשי 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב משני |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| כתם יחיד 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| כתם יחיד נגמ"ש |
CD34 | נגמ"ש | 1:25 |
| תאים מוכתמים מלאים | CD34 | נגמ"ש | 1:25 |
| NKG2DL | אלכסה פלור 488 | 10 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב ראשי 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב משני |
|
| חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
טבלה 2: צינורות נדרשים להכתים דגימות עם נוגדנים נגד NKG2DL. טבלה זו מציגה את הצינורות הנדרשים כדי להגדיר את הניסוי.
| שם צינור | אנטיגן | פלואורופור | דילול/ריכוז |
| תאים לא נגועים | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | אלכסה פלור 488 | 10 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב ראשי 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב משני |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 לשלב ראשוני 1:100 עבור שלב משני |
|
| חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | נגמ"ש | 1:25 |
| ULBP-1 | אלכסה פלור 488 | 10 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב ראשי 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור שלב משני |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| MICA | |||
| MICB | |||
| חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa פלור 488 | CD34 | נגמ"ש | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 לשלב ראשוני 1:100 עבור שלב משני |
|
| חי/מת | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
טבלה 3: צינורות נדרשים על מנת להגדיר את הפקדים החיוניים. טבלה זו מציגה את הצינורות הדרושים כדי להגדיר בקרות FMO, ראשיות ומשניות מתאימות. כל הפקדים הנדרשים (FMO) חייבים להתווסף על ידי הנסיין כדי להשיג תוצאות חוקיות ונתונים הניתנים לפרשנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים שתי שיטות ציטומטריות זרימה שיכולות לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL על תאי AML ראשיים אנושיים. אנו מראים כי ניתן להשתמש בשתי שיטות הזיהוי בשילוב עם כתמי נוגדנים אחרים (למשל, זיהוי ביטוי CD34). כתמים דומים עשויים להתבצע גם בסוגי תאים ראשיים אחרים וקווי תאים.
לאחרונה הראינו כי היעדר NKG2DL על פני השטח של תקיעות חולה AML יכול להעשיר LSC14. ב- AML, NKG2DL שלילי אך לא NKG2DL תת-אוכלוסין לוקמי חיוביים בעלי יכולות קלוגוגניות ויוו לויקמיה. מחקר עתידי יראה אם היעדר ביטוי פני השטח NKG2DL יכול לשמש גם ככלי להעשרת תאי גזע בסוגי סרטן אחרים.
CD34 הוכח באופן קלאסי לסמן LSCs ב- AML, אבל AML היא מחלה הטרוגנית מאוד ולא כל חולי AML להראות ביטוי CD34 (כלומר, CD34 שלילי AML18). הוכחנו בעבר כי היעדר ביטוי פני השטח של NKG2DL מספק כלי חדשני לזיהוי LSC בקבוצת משנה זו של AML שלילי CD34. כאן, לעומת זאת, אנו מתמקדים בקבוצת המשנה של AMLs חיובי CD34 ומראים כי אוכלוסין שונה יכול להתרחש. מחקר עתידי יראה אם כתמים משותפים עבור NKG2DL בשילוב עם סמנים אחרים כאלה (למשל, CD34) יכולים להעשיר את LSC בצורה יעילה יותר.
בציטומטריית הזרימה, חשוב לכלול בקרות נאותות כגון FMO כדי לעזור לנסיין להפלות כראוי בין אירועים חיוביים ושליליים. בנוסף, יש צורך בבקרות חיוביות לכל נוגדן משומש כדי להבטיח שהיעדר כתמים אינו נובע מנוגדן לקוי. הפרוטוקול שאנו מציגים כאן משתמש רק במספר מוגבל של סמני שטח, אשר ניתן להרחיב על פי הצורך של הנסיין, למשל, על ידי תוספת של CD33 או סמני LSC פוטנציאליים19. יתר על כן, פלואורופורים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן להתאים. חשוב לציין, שינויים כאלה צריכים להיות מלווים טיטציה נוגדן כדי לקבוע את הדילול הטוב ביותר.
צעד קריטי אחד לפני הכתמים הוא הפשרת תאי AML ראשוניים. ואכן, בנוסף לשבריריות שלהם, דגימות כאלה נשמרות דימתיל סולפוקסיד (DMSO), שהוא כשלעצמו רעיל עבור התאים. לכן, הדגימות צריך להיות מטופל בזהירות ויש לשטוף ביסודיות כדי למנוע חשיפה ממושכת DMSO. למרות שהדגימות שלנו עובדו והוקפאו על פי פרוטוקול15שהוקם בעבר , חשוב לעקוב בקפידה אחר השלבים המתוארים בכתב היד כדי להבטיח שחזור תא גבוה. עבודה עם דגימות טריות תבטיח כדאיות משופרת ולכן מומלץ. עם זאת, ברוב המקרים זה לא מעשי.
גורם נוסף המשפיע על השיטה המתוארת הוא סטייה ספציפית לדגימה שיכולה לגרום לפרופילי פיזור תאים שונים שנצפו באמצעות ציטומטריית זרימה. בשל הטרוגניות המחלה, זה בלתי נמנע אבל צריך להיחשב בניתוח. שונות נוספת יכולה להיות מוצגת על ידי הקפאה / הפשרה או שלבים מכניים אחרים בעיבוד מדגם. באופן כללי, מהירות היא המפתח כדי למנוע מוות של תאים. עם זאת, לא ניתן להימנע מתאים מתים ומפסולת ויש לקחתם בחשבון ולהחריג אותם בניתוח. Gating המבוסס על FSC / SSC צריך להיעשות עם יסודיות ועין קריטית כפי שהוא הצעד הראשון של ניתוח מדגם.
אחד היתרונות העיקריים של חלבון ההיתוך הוא העוצמה שלו לזהות את כל NKG2DLs ידועים ואולי לא ידועים, בעוד נוגדנים ספציפיים נגד NKG2DL (למשל, MICA, MICB) להציג הטיית בחירה. שתי השיטות אפשריות באותה מידה. עבור המספר המוגבל שנותח של דגימות, הם גם הראו תוצאות דומות מאוד. לשימוש בחלבון ההיתוך NKG2D יש כמה יתרונות עיקריים: פחות זמן רב, מספר ריאגנט מופחת, ומספר דגימות מכתימים, כמו גם הסתברות נמוכה יותר לטעויות אנושיות (כלומר, טעויות צנרת). יתר על כן, שיטה זו עשויה להיות גם יעילה יותר בלכידת ביטוי NKG2DL בדגימות מסוימות, שכן היא צריכה גם ללכוד ביטוי של חלבונים לא ידועים עם הפונקציה NKG2DL, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי במקרים מסוימים AML. תוך מתן תובנה על נוכחות פני השטח של NKG2DL, שיטה זו אינה מספקת מידע על הרמות התאיות של NKG2DL, הסחר או הרגולציה שלהם, ובדיקות אחרות ולכן יש לבצע כדי לקבל ידע נוסף על שאלות כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדע השוויצרית (179239), הקרן למאבק בסרטן (Zuerich), קרן וילהלם סנדר ל- CL (2019.042.1) וקרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי ל- C.L. יתר על כן, פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie מס '765104. אנו מודים למתקן ציטומטריית הזרימה בבאזל על התמיכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
