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Cancer Research

एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया में बल्क सबपॉपुलेशन से स्टेम सेल को अलग करने के लिए NKG2D Ligand सतह का पता लगाने के दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण

Published: February 21, 2021 doi: 10.3791/61803
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 3, 1, 1,2,3
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel and University of Basel, 2Division for Hematology, University Hospital Basel and University of Basel, 3Department of Internal Medicine, Hematology and Oncology, University Hospital Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

हम मानव प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) नमूनों में NKG2D ligand (NKG2DL) का पता लगाने के लिए दो अलग-अलग धुंधला प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पहला दृष्टिकोण एक संलयन प्रोटीन पर आधारित है, जो सभी ज्ञात और संभावित रूप से अभी तक अज्ञात लिगामेंट्स को पहचानने में सक्षम है, जबकि दूसरा प्रोटोकॉल कई एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी के अलावा पर निर्भर करता है।

Abstract

एक ही रोगी के भीतर, NKG2D ligands (NKG2DL) सतह अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति को स्टेम सेल गुणों (तथाकथित ल्यूकेमिक स्टेम सेल, एलएससी) के साथ ल्यूकेमिक सबपॉलेशन को अलग करने के लिए दिखाया गया था, जो अधिक विभेदित समकक्ष ल्यूकेमिक कोशिकाओं से होता है, जिसमें रोग दीक्षा क्षमता की कमी होती है, हालांकि वे समान ल्यूकेमिया विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तन ले जाते हैं। एनकेजी2डीएल जैव रासायनिक रूप से अत्यधिक विविध एमएचसी वर्ग I-जैसे आत्म-अणु हैं। होम्योस्टेटिक स्थितियों में स्वस्थ कोशिकाएं आमतौर पर कोशिका की सतह पर NKG2DL व्यक्त नहीं करती हैं। इसके बजाय, इन लिगांड की अभिव्यक्ति सेलुलर तनाव (जैसे, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन या संक्रामक उत्तेजनाओं) के संपर्क में आने पर प्रेरित होती है ताकि एनकेजी2डी-रिसेप्टर-प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को व्यक्त करने के माध्यम से लाइसिस के माध्यम से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन को ट्रिगर किया जा सके। दिलचस्प बात यह है कि एनकेजी2डीएल सतह अभिव्यक्ति को एलएससी उपआबादी में चुनिंदा रूप से दबा दिया जाता है, जिससे इन कोशिकाओं को NKG2D-मध्यस्थता प्रतिरक्षा निगरानी से बचने की अनुमति होती है। यहां, हम दो अलग-अलग प्रवाह साइटोमेट्री विधियों का एक साथ-साथ विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं जो कैंसर कोशिकाओं पर NKG2DL सतह अभिव्यक्ति की जांच की अनुमति देते हैं यानी, पैन-लिगांड मान्यता और एकल लिगांड के खिलाफ कई एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली विधि शामिल है। इन तरीकों का उपयोग एनकेजी2डीएल सकारात्मक गैर-एलएससी से ख्यात कैंसर स्टेम सेल गुणों के साथ व्यवहार्य NKG2DL नकारात्मक सेलुलर उपजनसंख्या को अलग करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

एनके कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण प्रभावक हैं जो पूर्व एंटीजन उत्तेजना1के बिना घातक कोशिकाओं को पहचान और समाप्त कर सकती हैं या स्वस्थ कोशिकाओं (जैसे, वायरल संक्रमण से) पर बल दिया जा सकता है। इस प्रक्रिया को रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के जटिल प्रदर्शनों की सूची के माध्यम से कसकर विनियमित किया जाता है-जैसे प्राकृतिक साइटोटॉक्सीसिटी रिसेप्टर्स (एनसीआरएस), एनके2डी और सीडी 16-और निरोधात्मक रिसेप्टर्स जो काफी हद तक किलर इम्यूनोग्लोबुलिन जैसे रिसेप्टर्स (KIRs)2द्वारा प्रतिनिधित्व करते हैं । दैहिक कोशिकाओं पर मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) वर्ग I अणुओं के लिए KIRs का बंधन आत्म-मान्यता सुनिश्चित करता है और एनके सेल सहिष्णुता को व्यक्त करता है। दूसरी ओर, आत्म-मान्यता की अनुपस्थिति और लक्ष्य कोशिकाओं पर अपने लिगामेंट्स को सक्रिय करने के लिए रिसेप्टर्स को सक्रिय करने की बाध्यकारी वृद्धि से साइटोटॉक्सिक कणिकाओं की रिहाई को ट्रिगर किया जाता है जिससे एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी1होता है। अंत में, एनके कोशिकाएं आईजी (एफसीआर)2के एफसी हिस्से को व्यक्त करने के लक्ष्यों को सक्रिय रिसेप्टर सीडी 16 के बाध्यकारी द्वारा एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिटी (एडीसीसी) लागू कर सकती हैं। प्रत्यक्ष साइटोटॉक्सिकिटी के अलावा, एनके कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली3के साथ जन्मजात को पाटने के लिए साइटोकिन रिलीज को भी ट्रिगर कर सकती हैं।

NKG2D एनके, एनकेटी, γδ टी और भोली सीडी 8 + टी कोशिकाओं पर व्यक्त किया गया एक प्रमुख सक्रिय रिसेप्टर है जो इसतरह के साइटोटॉक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित कोशिकाओं को व्यक्त करने और NKG2D ligand (NKG2DL) को पहचानने और lyse करने में सक्षम बनाता है। स्वस्थ कोशिकाएं आमतौर पर NKG2DL व्यक्त नहीं करती हैं। इसके बजाय, NKG2DL अभिव्यक्ति घातक या वायरस संक्रमित कोशिकाओं पर विनियमित करने के लिए इन प्रतिरक्षा निकासी5के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए है ।

मानव NKG2DL परिवार में आठ ज्ञात अणु शामिल हैं जिनमें से दो MHC I श्रृंखला से संबंधित अणु ए और बी (MICA और MICB6)और साइटोमेगालोवायरस UL16-बाध्यकारी प्रोटीन 1-6 (ULBP1-67)शामिल हैं । NKG2DL की अभिव्यक्ति ट्रांसक्रिप्शनल, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल के साथ-साथ पोस्ट-ट्रांसलेशनल स्तर8पर विनियमित है। जैसे, जबकि NKG2DL अभिव्यक्ति आमतौर पर स्वस्थ कोशिकाओं की सतह पर पता लगाने योग्य नहीं है, NKG2DL mRNA9 और इंट्रासेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्वस्थ ऊतकों में सूचित किया गया । ऐसी अभिव्यक्ति की कार्यात्मक प्रासंगिकता और ऐसे विकृत अभिव्यक्ति पैटर्न में अंतर्निहित तंत्र कोपरिभाषितकिया जाना बाकी है ।

कैंसर कोशिकाओं में NKG2DL अभिव्यक्ति का यंत्रवादी नियमन जांच का एक आकर्षक क्षेत्र है । या तो सेलुलर तनाव में शामिल होने के लिए जाना जाता रास्ते, उदाहरण के लिए, गर्मी सदमे तनाव मार्ग9,या डीएनए क्षति से जुड़े रास्ते, जैसे ataxia telangiectasia उत्परिवर्तित (ATM) और Rad3 संबंधित (एटीआर) मार्ग11,साथ ही वायरल या जीवाणु संक्रमण सीधे NKG2DL अभिव्यक्ति12के शामिल होने से जुड़ा हुआ है । हालांकि, भले ही NKG2DL की सतह अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से प्रेरित किया गया है, इस अभिव्यक्ति को प्रोटियोलिटिक-मध्यस्थता शेडिंग के माध्यम से फिर से खोया जा सकता है, कुछ कैंसर13में प्रतिरक्षा भागने और खराब नैदानिक पूर्वानुमान से जुड़े तंत्र।

सेल सरफेस एनके2डीएल की अनुपस्थिति भी एएमएल के साथ रोगियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। यहां, गहन कीमोथेरेपी के साथ उपचार अक्सर छूट लाती है, लेकिन पतन अक्सर ल्यूकेमिक स्टेम सेल (एलएससी) से होता है, जो चुनिंदा रूप से कीमोथेरपी से बचते हैं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचते हैं। जैसा कि हमने हाल ही में दिखाया, उदाहरण के लिए, एलएससी, एनके 2डीएल सतह अभिव्यक्ति14को दबाकर एनके सेल लाइसिस से बच गया।

इसके विपरीत, सतह NKG2DL अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति को थोक समकक्ष ल्यूकेमिक उप-आबादी से कोशिकाओं की ख्यात स्टेम जैसी उप-आबादी की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां, हम दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण पेश करते हैं जिनका उपयोग NKG2DL सतह अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और इस तरह ल्यूकेमिया में NKG2DL नकारात्मक स्टेम कोशिकाओं की पहचान करता है और शायद अन्य कैंसर में भी: पैन-लिगांड सतह मान्यता के लिए एक विधि और व्यक्तिगत ज्ञात NKG2DL प्रोटीन को पहचानने वाले एकल या पूल किए गए एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली विधि।

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Protocol

बेसल और Tuebingen के विश्वविद्यालय अस्पतालों के नैतिकता की समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन के बाद रोगी नमूने एकत्र किए गए ।

1. NKG2D फ्यूजन प्रोटीन का बायोटिनाइलेशन

नोट: यह कदम निर्माता के निर्देश के अनुसार बायोटिनाइलेशन किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ किया जाता है। प्रोटोकॉल के इस कदम को धुंधला करने से पहले कम से कम 24 घंटे किया जाना चाहिए। बायोटिनीलेटेड एनके2डी फ्यूजन प्रोटीन को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

  1. दोनों बायोटिन, साथ ही कमरे के तापमान (आरटी) पर NKG2D संलयन प्रोटीन ट्यूब गल ।
    नोट: यदि कोशिकाओं को आगे प्रयोगात्मक उपयोग (चूहों में इंजेक्शन, कॉलोनी बनाने इकाई परख, आदि) के लिए बाँझ होने की जरूरत है, तो संदूषण से बचने के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत संलयन प्रोटीन का पुनर्गठन करें। अन्यथा, प्रत्येक चरण को एक बेंच पर किया जा सकता है।
  2. जल्दी से lyophilized NKG2D संलयन प्रोटीन के 50μg नीचे स्पिन। पाउडर का पुनर्गठन करने और P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 500 माइक्रोल जोड़ें।
  3. 100 μg/mL की अंतिम स्टॉक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक बायोटिन ट्यूब में NKG2DL संलयन प्रोटीन के 100 μL जोड़ें।
  4. P100 माइक्रोपिपेट के साथ लगातार रिसिप्ट करके समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. 24 घंटे के लिए एक नियंत्रित आरटी पर फ्यूजन प्रोटीन/बायोटिन समाधान इनक्यूबेट । फ्यूजन प्रोटीन अब इस्तेमाल करने के लिए तैयार है।

2. प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं का विगलन

नोट: तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत रोगी प्रति रोगी लगभग 5,000,000 जमे हुए ल्यूकेमिक कोशिकाओं को गल गया था और फिर तुरंत परख के लिए उपयोग किया जाता था। ल्यूकेमिक कोशिकाओं को प्राप्त किया गया और पहले के रूप में15वर्णित जमे हुए थे । संक्षेप में, एएमएल और उच्च विस्फोट कोशिका प्रतिशत (मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के बीच विस्फोटों का >90%) के साथ रोगियों से एकत्र किए गए परिधीय रक्त नमूनों को मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए घनत्व ढाल पृथक्करण के साथ संसाधित किया गया था और बाद में भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) में जमे हुए थे जिसमें 10% डाइमेथिल सल्फॉक्साइड समाधान (डीएमओ) शामिल थे। रोगी में ल्यूकोसाइट एकाग्रता पर निर्भरता में रोगियों के बीच सेल संख्या अत्यधिक भिन्न होती है (सीमा: 1,000,000 से 30,000,000 ल्यूकेमिक कोशिकाएं प्रति एमएल रक्त)।

  1. पानी के स्नान का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर एफसीएस का 10% युक्त प्री-वार्म आरपीएमआई माध्यम। एएमएल कोशिकाओं की प्रत्येक शीशी के लिए (1 एमएल एफसीएस + 10% DMSO में 30,000,000 कोशिकाओं तक), 15 एमएल रिएक्शन ट्यूब में प्री-गर्म माध्यम के 10 एमएल जोड़ें।
  2. तरल नाइट्रोजन भंडारण से प्राथमिक एएमएल युक्त क्रायोवियल निकालें और तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान का उपयोग करके कोशिकाओं को पिघलाएं। धीरे-धीरे ट्यूब को पानी में आगे और पीछे ले जाएं, जिससे शीशी की सामग्री गल न जाए जब तक कि केवल एक छोटा सा बर्फ क्रिस्टल न रह जाए।
  3. गल कोशिकाओं को तुरंत मध्यम युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और मध्यम के 1 एमएल का उपयोग करके शीशी को कुल्ला करें।
  4. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें।
  5. आरपीएमआई माध्यम के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं जिसमें 10% एफसीएस और सेंट्रलाइज 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर होता है।

3. सेल गिनती

  1. एफसीएस के 10% वाले आरपीएमआई माध्यम की एक ज्ञात मात्रा में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  2. सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्राइपैन ब्लू या किसी अन्य वैकल्पिक डाई के साथ एक ज्ञात अनुपात में पतला करें जो लाइव सेल/डेड सेल भेदभाव की अनुमति देता है।
  3. कोशिकाओं की गिनती करने के लिए किसी भी डिवाइस का उपयोग करें।
  4. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें।

4. बायोटिनेलेटेड NKG2D फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग कर प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं का धुंधला

  1. गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और एथिलेंडियामाइमेटेस्ट्रेक्एकेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ क्रमशः 0.07 mm और 2 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए 500 एमएल पीबीएस को पूरक करके धुंधला बफर तैयार करें। यदि आवश्यक हो तो पीएच (7.2-7.4) को समायोजित करें।
  2. 0.5 x 107 कोशिकाओं/
    नोट: वैकल्पिक रूप से, धुंधला होने से पहले, कोशिकाओं को एक अवरुद्ध एजेंट (जैसे एचआईजीजी (1μg/ml) के साथ आरटी या एफसीआर-ब्लॉकिंग एजेंट में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।
  3. सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को सेल कल्चर 96-वेल यू-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर प्लेट को अपकेंद्रित्र करें। पैलेट को बिना परेशान किए ही सुपरनेट को छोड़ दें।
  4. बायोटिनेलेटेड एनके2डी फ्यूजन प्रोटीन का मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि कोशिकाओं को 10 माइक्रोग्राम/एमएल प्रति अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता के साथ 50 माइक्रोन प्रति की अंतिम मात्रा में पुनः निलंबित किया जा सके।
  5. 100 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके चरण 4.4 में तैयार मास्टर मिश्रण जोड़ें और 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ सेल छर्रों को फिर से खर्च करें।
    नोट: धुंधला के लिए आवश्यक संलयन प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए कोशिकाओं की संख्या के अनुसार अंतिम मात्रा नीचे स्केल ।
  6. आरटी में 25 मिनट या 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  7. 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोन धुंधला बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  8. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें।
  9. चरण 4.7 और 4.8 दोहराएं।
    नोट: यहां वर्णित धुंधला एक सेल संस्कृति ९६-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट में किया जाता है । इसलिए, ऐसी प्लेटों की छोटी मात्रा क्षमता के कारण धोने के कदम दो बार किए जाते हैं। धुंधला भी अन्य ट्यूबों में किया जा सकता है और धोने के कदम तो केवल एक बार एक बड़ी मात्रा का उपयोग कर किया जा सकता है।
  10. स्ट्रेप्टाविडिन-पीई (कमजोर पड़ने के लिए तालिका 1 देखें) का उपयोग करके एक मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि कोशिकाओं को 50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित किया जा सके।
    नोट: जैसे CD33, CD34 जैसे अपने सेल प्रकार के हित के लिए चयन एंटीबॉडी जोड़ें.... एएमएल के लिए।
  11. 100 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके चरण 4.10 में तैयार मास्टर मिश्रण जोड़ें और 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ सेल छर्रों को फिर से उठाया जाए।
  12. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी में 15 मिनट या 30 मिनट के लिए सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  13. 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोन धुंधला बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  14. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें।
  15. चरण 4.13 और 4.14 दोहराएं।
  16. लाइव और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) या किसी भी अभिवात सहित धुंधला बफर का एक समाधान तैयार करें।
  17. 200 माइक्रोल स्टेनिंग बफर + 7-AAD में 300 माइक्रोचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करने में चरण 4.16 में तैयार सेल छर्रों को रीसुस्पेंड करें।
  18. एक प्रवाह साइटोमेट्री डिवाइस का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

5. एकल या पूल्ड सिंगल एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी का धुंधला

  1. चरण 4.2 में एक ही सेल निलंबन का उपयोग करें।
  2. सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को सेल कल्चर 96-वेल यू-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें, जिसमें 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्लेट को 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। पैलेट को बिना परेशान किए ही सुपरनेट को छोड़ दें।
  3. प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी या पूल किए गए एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने के लिए तालिका 2 देखें) के लिए एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि कोशिकाओं को 50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित किया जा सके।
  4. 100 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके चरण 5.3 में तैयार मास्टर मिश्रण जोड़ें और 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ सेल छर्रों को फिर से उठाया जाए।
  5. आर टी में 25 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोन धुंधला बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  7. सेंट्रलाइज सेल कल्चर 96-वेल यू-बॉटम प्लेट 10 मिनट के लिए 300 x g पर और पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनैंट को त्यागें।
  8. चरण 5.6 और 5.7 दोहराएं।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने के लिए तालिका 2 देखें) जोड़कर एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि कोशिकाओं को 50 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से अंतिम मात्रा में पुनः निलंबित किया जा सके।
  10. 100 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके चरण 5.9 में तैयार मास्टर मिश्रण जोड़ें और 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ सेल छर्रों को फिर से खर्च करें।
  11. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी में 15 मिनट या 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  12. 300 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से धुंधला बफर के 200 माइक्रोल जोड़कर धोएं।
  13. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को त्याग दें।
  14. 5.12 और 5.13 चरणों को दोहराएं।
  15. स्टेप 4.16 में तैयार 7-AAD युक्त 7-AAD युक्त 200 μL धुंधला बफर में सेल छर्रों resuspend सेल छर्रों।
  16. चरण 6 में वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री डिवाइस का उपयोग करके कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

6. डेटा अधिग्रहण

नोट: सुनिश्चित करें कि प्रवाह साइटोमीटर के साप्ताहिक गुणवत्ता नियंत्रण यह सुनिश्चित करने के लिए किए जाते हैं कि लेजर ठीक से काम कर रहे हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए, सभी चैनलों पर लेजर प्रदर्शन की जांच करने के लिए सापेक्ष मोतियों के साथ एक साप्ताहिक साइटोमीटर और ट्रैकिंग (सीटीएस) प्रक्रिया की जाती है। सीटीएस के बाद, 10,000 घटनाओं को आंतरिक नियंत्रण के रूप में 8-पीक मोतियों का उपयोग करके दर्ज किया जाता है। सभी चोटियों को अपने द्वार के अंदर एक ही स्थिति में होना चाहिए और अच्छी तरह से एक दूसरे से अलग होना चाहिए।

  1. मोतियों के साथ या कोशिकाओं के साथ डिटेक्टरों के बीच स्पेक्ट्रल ओवरलैप घटाना मैट्रिक्स मुआवजा बनाएं16.
  2. अन दाग कोशिकाओं और एकल दाग मोतियों के लिए रिकॉर्ड १०,० घटनाओं । फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के लिए, रिकॉर्ड 50,000 घटनाओं और पूर्ण दाग वाले नमूनों के लिए 100,000 घटनाओं तक रिकॉर्ड करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं पर एकल दाग नमूने किए जा सकते हैं। यदि हां, तो सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं वांछित मार्कर के लिए एक सकारात्मक संकेत है ।
  3. स्पेक्ट्रल ओवरलैप की मात्रा प्रकट करने के लिए प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए एक एकल दाग कोशिका या मनका नमूना प्राप्त करें। फैल-ओवर मूल्यों की गणना करने और सभी मापा नमूनों के लिए मुआवजा मैट्रिक्स लागू करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री डिवाइस के मुआवजा निर्माता का उपयोग करें।
    नोट: यदि मुआवजे की गणना मोतियों के साथ की जाती है तो मोतियों का उपयोग करके मुआवजे के निर्माण के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग नहीं किया जा सकता है। मुआवजे मोती के प्रकार के आधार पर, माध्यमिक एंटीबॉडी मोतियों के साथ मुआवजे के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।
  4. एफएमओ नियंत्रण और संलयन प्रोटीन के साथ पूर्ण दाग नमूनों के लिए, सबसे पहले, उनके आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) के आधार पर कोशिकाओं का चयन करें । डबल्स के बहिष्कार के बाद, मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए 7-AAD (PercP-Cy5.5) संकेत के लिए उनकी नकारात्मकता के आधार पर कोशिकाओं को गेट करें (चरण 5.15 देखें)। अंतिम साजिश जीवित सिंगल्स पर CD34 (वाई-एक्सिस) और NKG2DL (एक्स-एक्सिस) की अभिव्यक्ति दिखाती है।
  5. एकल विरोधी NKG2DL-एंटीबॉडी के लिए, नमूनों के लिए एक ही रणनीति लागू होते हैं, लेकिन ध्यान दें कि ligand सकारात्मकता एलेक्सा फ्लोर ४८८ में निहित है और नहीं पीई चैनल ।
  6. इस प्रयोग के लिए प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त एफएमओ नियंत्रण के लिए चरण 6.4 और 6.5 (तालिका 3देखें) से गेटिंग रणनीति के लिए एफएमओ नियंत्रण के अनुसार गेट्स को समायोजित करें: विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, नकारात्मक अंश पर एक गेट आकर्षित करें। पूर्ण दाग नमूना रिकॉर्डिंग करते हुए, पहले से बनाए गए गेट के ऊपर की कोशिकाएं विश्लेषण किए गए मार्कर के लिए सकारात्मक हैं।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत किए गए दोनों प्रोटोकॉल सीडी 34 का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषणों द्वारा एएमएल एलएससी के संवर्धन की अनुमति देते हैं, जो एलएससी17का एक ज्ञात मार्कर है, एनकेजी2डीएल सतह अभिव्यक्ति के संयोजन में या तो पैन-लिगांड मान्यता का उपयोग करके या व्यक्तिगत लिगांड के खिलाफ पूल किए गए एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाता है। चित्रा 1में, हम बताते हैं कि विश्लेषण एएमएल नमूने सीडी 34 और एनकेजी2डीएल के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन नकारात्मक उपआबादी भी मौजूद है, जो कुल चार अलग-अलग आबादी की उपस्थिति से दिखाई देती है। हमारे डेटा इस तरह के एक धुंधला के लिए ठेठ गेटिंग रणनीति से पता चलता है, उनके एफएससी और एसएससी के माध्यम से कोशिकाओं की मुख्य आबादी के चयन के साथ शुरू । डाउनस्ट्रीम विश्लेषण(चित्रा 1A)में डबल्स और मृत कोशिकाओं को बाहर रखा गया है। गेट्स को सकारात्मक कोशिकाओं(चित्रा 1B)की उचित पहचान सुनिश्चित करने के लिए एफएमओ नियंत्रणों का उपयोग करके समायोजित किया जाता है।

चित्रा 1Cमें, हम सीडी 34 (एपीसी, वाई-एक्सिस) बनाम एनके2डीएल (पीई, एक्स-एक्सिस) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता को उजागर करते हैं। एएमएल कोशिकाएं जो सीडी 34 के लिए सकारात्मक हैं, NKG2DL(चित्रा 1C)की निचली सतह अभिव्यक्ति दिखाती हैं, जो हमारी प्रयोगशाला से पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है, यह दर्शाता है कि NKG2DL अभिव्यक्ति स्टेमनेस14की कमी से जुड़ी हुई है।

चित्र 2 दोनों NKG2DL धुंधला तरीकों की मजबूती को इंगित करता है । चित्रा 2Aमें, हम तीन प्राथमिक एएमएल नमूनों की जांच के साथ-साथ १९.८ दिखा रहा है, 49.8, और 89.4%, क्रमशः फ्यूजन प्रोटीन धुंधला बनाम 20.4, 50.4, और 90.6% के लिए सकारात्मक घटनाओं के पूल्ड एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी धुंधला (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6, और ULBP3 के खिलाफ जमा एंटीबॉडी), क्रमशः। दूसरी ओर, एकल लिगामेंट (या तो अभ्रक, एमआईसीबी, यूएलबीपी 1, उलबीपी 2/5/6, या यूएलबीपी 3 के खिलाफ) धुंधला 92%(चित्रा 2B)तक सकारात्मक घटनाओं की एक श्रृंखला दिखाता है। यह प्रतिशत लिगामेंट के आधार पर बदलता रहता है और रोगी, उदाहरण के लिए, ULBP3(चित्रा 2B)। ध्यान दें, एक एकल सेल कई NKG2DL व्यक्त कर सकते हैं ।

जब कई एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी को एक ट्यूब में एकत्र और संयुक्त किया जाता है, तो सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत संलयन प्रोटीन(चित्रा 2 ए)के प्रतिशत के बराबर होता है। जैसे, दोनों प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम करते हैं और प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं पर NKG2DL अभिव्यक्ति के बारे में समान परिणाम प्रदान कर सकते हैं। कुछ एएमएल में, फ्यूजन प्रोटीन विधि उच्च संवेदनशीलता की अनुमति दे सकती है क्योंकि यह आगे NKG2DL प्रोटीन की मान्यता की अनुमति दे सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्राथमिक एएमएल नमूनों की विशिष्ट गेटिंग रणनीति। (क)कोशिकाओं को पहले उनके आकार (एक्स-एक्सिस) और जटिलता (जैसे, दानेदारता, वाई-अक्ष) के आधार पर गेट किया जाता है। इसके बाद डबल्स को आगे के स्कैटर के लिए क्षेत्र के खिलाफ ऊंचाई या चौड़ाई की साजिश रचने से बाहर रखा जाता है । अंत में, जीवित कोशिकाओं को उनके आकार (एक्स-एक्सिस) बनाम उनकी नकारात्मकता बनाम 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y-अक्ष) के आधार पर चुना जाता है। (ख)एफएमओ नियंत्रण का उपयोग संकेतित मार्कर के लिए सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बीच भेदभाव करने में मदद करने वाले फाटकों को स्थापित करने के लिए किया जाता है । गेटिंग रणनीति समान बनी हुई है जैसा कि चित्र 1एमें दर्शाया गया है । (ग)प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट CD34 (एपीसी, वाई-एक्सिस) बनाम NKG2DL (पीई या AlexaFluor488, एक्स-एक्सिस) के लिए सकारात्मक और नकारात्मक घटनाओं को दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्टेनिंग प्रोटोकॉल तुलना। (ए)बार रेखांकन संलयन प्रोटीन बनाम पूल्ड एंटी-एनकेजीडी2एल एंटीबॉडी (एन = 3 एएमएल नमूने) गेटेड सिंगल लिविंग सेल्स से के लिए सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाता है । (ख)सभी ज्ञात एंटी-एनके2डीएल एंटीबॉडी और पूल किए गए एकल लिगामेंट्स (विस्तृत एंटीबॉडी जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें) के लिए एकल लिगांड धुंधला के लिए सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत प्रदर्शित करने वाले बार रेखांकन। गेटिंग फिर से एकल जीवित कोशिकाओं पर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ट्यूब नाम प्रतिजन फ्लोरोफोर कमजोर पड़ने/एकाग्रता
अन दागदार कोशिकाएं - - -
एकल दाग
पीई		 एनकेजी2डी-फ्यूजनप्रोटीन पीई माध्यमिक चरण के लिए प्राथमिक चरण 1:100 के लिए 1:10
एकल दाग
7AAD (PerCP-Cy5.5)		 लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000
एकल दाग
एपीसी		 सीडी34 एपीसी 1:25
पूर्ण दाग कोशिकाएं सीडी34 एपीसी 1:25
एनकेजी2डी-फ्यूजनप्रोटीन पीई माध्यमिक चरण के लिए प्राथमिक चरण 1:100 के लिए 1:10
लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000

तालिका 1: NKG2D संलयन प्रोटीन के साथ नमूनों को दाग करने के लिए आवश्यक ट्यूब। यह तालिका प्रयोग स्थापित करने के लिए आवश्यक ट्यूबों को दिखाती है।

ट्यूब नाम प्रतिजन फ्लोरोफोर कमजोर पड़ने/एकाग्रता
अन दागदार कोशिकाएं - - -
एकल दाग
एलेक्सा फ्लोर 488		 उल्बीपी-1 एलेक्सा फ्लोर 488 प्राथमिक चरण के लिए 10 μg/mL
माध्यमिक कदम के लिए 4 μg/ml
उल्बीपी-2/5/6
यूएलपीबी-3
अभ्रक
एमआईसीबी
एकल दाग
7AAD (PerCP-Cy5.5)		 लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000
एकल दाग
एपीसी		 सीडी34 एपीसी 1:25
पूर्ण दाग कोशिकाएं सीडी34 एपीसी 1:25
एनकेजी2डीएल एलेक्सा फ्लोर 488 प्राथमिक चरण के लिए 10 μg/mL
माध्यमिक कदम के लिए 4 μg/ml
लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000

तालिका 2: एंटी-एनकेजी2डीएल एंटीबॉडी के साथ नमूनों को दाग देने के लिए आवश्यक ट्यूब। यह तालिका प्रयोग स्थापित करने के लिए आवश्यक ट्यूबों को दिखाती है।

ट्यूब नाम प्रतिजन फ्लोरोफोर कमजोर पड़ने/एकाग्रता
अन दागदार कोशिकाएं - - -
FMO_APC उल्बीपी-1 एलेक्सा फ्लोर 488 प्राथमिक चरण के लिए 10 μg/mL
माध्यमिक कदम के लिए 4 μg/mL
उल्बीपी-2/5/6
यूएलपीबी-3
अभ्रक
एमआईसीबी
एनकेजी2डी-फ्यूजनप्रोटीन पीई प्राथमिक चरण के लिए 1:10
माध्यमिक कदम के लिए 1:100
लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000
FMO_PE सीडी34 एपीसी 1:25
उल्बीपी-1 एलेक्सा फ्लोर 488 प्राथमिक चरण के लिए 10 μg/mL
माध्यमिक कदम के लिए 4 μg/mL
उल्बीपी-2/5/6
यूएलपीबी-3
अभ्रक
एमआईसीबी
लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000
FMO_Alexa फ्लोर 488 सीडी34 एपीसी 1:25
एनकेजी2डी-फ्यूजनप्रोटीन पीई प्राथमिक चरण के लिए 1:10
माध्यमिक कदम के लिए 1:100
लाइव/डेड 7एडी
(PerCP-Cy5.5)		 1:1000

तालिका 3: आवश्यक नियंत्रण स्थापित करने के लिए आवश्यक ट्यूब। यह तालिका उचित एफएमओ, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण स्थापित करने के लिए आवश्यक ट्यूबों को दिखाती है। वैध परिणाम और व्याख्या योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगकर्ता द्वारा सभी आवश्यक नियंत्रण (एफएमओ) जोड़े जाने चाहिए।

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Discussion

यहां हम दो फ्लो साइटोमेट्रिक तरीके पेश करते हैं जो मानव प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं पर NKG2DL सतह अभिव्यक्ति का पता लगा सकते हैं। हम बताते हैं कि दोनों डिटेक्शन विधियों का उपयोग अन्य एंटीबॉडी स्टेनिंग (उदाहरण के लिए, सीडी 34 अभिव्यक्ति का पता लगाने) के साथ मिलकर किया जा सकता है। इसी तरह के धुंधला अन्य प्राथमिक कोशिका प्रकारों और सेल लाइनों पर भी किया जा सकता है।

हमने हाल ही में दिखाया कि एएमएल रोगी विस्फोटों की सतह पर एनकेजी2डीएल का अभाव एलएससी14को समृद्ध कर सकता है । एएमएल में, एनकेजी2डीएल नकारात्मक लेकिन एनकेजी2डीएल सकारात्मक ल्यूकेमिक उप-आबादी के पास क्लोनोजेनिक और वीवो ल्यूकेमिया-शुरू करने की क्षमताओं में नहीं है। भविष्य के अनुसंधान से पता चलेगा कि क्या NKG2DL सतह अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति भी अन्य कैंसर प्रकारों में स्टेम कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

CD34 को प्रतिष्ठित रूप से एएमएल में एलएससी को चिह्नित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन एएमएल एक अत्यधिक विषम रोग है और सभी एएमएल रोगियों को सीडी 34 अभिव्यक्ति (यानी, सीडी 34 नकारात्मक एएमएल18)नहीं दिखाते हैं। हमने पहले दिखाया है कि NKG2DL सतह अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति CD34 नकारात्मक एएमएल के इस उपसमूह में एलएससी की पहचान करने के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करती है। यहां, इसके विपरीत, हम सीडी 34-सकारात्मक एएमएलएस के उपसमूह पर ध्यान केंद्रित करते हैं और दिखाते हैं कि विभिन्न उपआबादी हो सकती है। भविष्य के अनुसंधान से पता चलेगा कि क्या ऐसे अन्य मार्कर (जैसे, सीडी 34) के साथ मिलकर NKG2DL के लिए सह-धुंधला एलएससी को अधिक प्रभावी ढंग से समृद्ध कर सकता है।

प्रवाह साइटोमेट्री में, प्रयोगकर्ता को सकारात्मक और नकारात्मक घटनाओं के बीच सही ढंग से भेदभाव करने में मदद करने के लिए एफएमओ जैसे पर्याप्त नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हर इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक नियंत्रण यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं कि धुंधला की अनुपस्थिति खराब एंटीबॉडी के कारण नहीं है। हम यहां जो प्रोटोकॉल पेश करते हैं, वह केवल सीमित संख्या में सतह मार्कर का उपयोग करता है, जिसे प्रयोगकर्ता की आवश्यकता के अनुसार बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, CD33 या संभावित एलएससी मार्कर19के अलावा। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस को अनुकूलित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इस तरह के परिवर्तन सबसे अच्छा कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए एक एंटीबॉडी टिटरेशन के साथ किया जाना चाहिए ।

धुंधला होने से पहले एक महत्वपूर्ण कदम प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं का विगलन है। दरअसल, उनकी कमजोरी के अलावा, ऐसे नमूनों को डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में संरक्षित किया जाता है, जो कोशिकाओं के लिए विषाक्त है। इसलिए, नमूनों को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और डीएमएसओ के लंबे समय तक संपर्क से बचने के लिए अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। यद्यपि हमारे नमूनों को पहले से स्थापित प्रोटोकॉल15के अनुसार संसाधित और जमे हुए थे, लेकिन उच्च सेल वसूली सुनिश्चित करने के लिए पांडुलिपि में वर्णित चरणों का सावधानीपूर्वक पालन करना महत्वपूर्ण है। नए नमूनों के साथ काम करने से बेहतर व्यवहार्यता सुनिश्चित होगी और इस प्रकार इसकी सिफारिश की जाती है । हालांकि, ज्यादातर मामलों में यह व्यावहारिक नहीं है।

वर्णित विधि को प्रभावित करने वाला एक अन्य कारक नमूना-विशिष्ट विचलन है जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से देखे गए विभिन्न सेल बिखरने वाले प्रोफाइल हो सकते हैं। रोग विषमता के कारण, यह अपरिहार्य है लेकिन विश्लेषण में विचार किया जाना चाहिए। नमूना प्रसंस्करण में ठंड/विगलन या अन्य यांत्रिक चरणों द्वारा अतिरिक्त परिवर्तनशीलता शुरू की जा सकती है । सामान्य तौर पर, सेल मौत से बचने के लिए तेजी महत्वपूर्ण है। फिर भी, मरने वाली कोशिकाओं और मलबे से बचा नहीं जा सकता है और विश्लेषण में ध्यान में रखा जाना चाहिए और बाहर रखा जाना चाहिए । एफएससी/एसएससी पर आधारित गेटिंग पूर्णता और आलोचनात्मक आंखों के साथ की जानी चाहिए क्योंकि यह नमूना विश्लेषण का पहला कदम है ।

फ्यूजन प्रोटीन का एक प्रमुख लाभ सभी ज्ञात और संभावित अज्ञात NKG2DLs का पता लगाने के लिए इसकी शक्ति है, जबकि विशिष्ट एंटी-एनकेजी2डीएल एंटीबॉडी (जैसे, MICA, MICB) चयन पूर्वाग्रह पेश करते हैं। दोनों तरीके समान रूप से व्यवहार्य हैं । नमूनों की विश्लेषण सीमित संख्या के लिए, वे भी बहुत तुलनीय परिणाम दिखाया । NKG2D संलयन प्रोटीन का उपयोग करने के कुछ प्रमुख लाभ हैं: कम समय लेने वाली, अभिकर् य संख्या में कमी आई है, और धुंधला नमूनों की संख्या के साथ-साथ मानव गलतियों की कम संभावना (यानी, पिपटिंग गलतियां)। इसके अलावा, यह विधि कुछ नमूनों में NKG2DL अभिव्यक्ति पर कब्जा करने में भी अधिक प्रभावी हो सकती है, क्योंकि इसे NKG2DL समारोह के साथ अज्ञात प्रोटीन की अभिव्यक्ति को भी पकड़ना चाहिए, जिसे कुछ एएमएल मामलों में व्यक्त किया जा सकता है। NKG2DL की सतह उपस्थिति में अंतर्दृष्टि प्रदान करते समय, ये विधि NKG2DL के इंट्रासेलुलर स्तर, उनके अवैध व्यापार या विनियमन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है, और इसलिए ऐसे प्रश्नों पर आगे ज्ञान प्राप्त करने के लिए अन्य परखें की जानी चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (179239), कैंसर के खिलाफ लड़ाई के लिए फाउंडेशन (Zuerich), विल्हेम सैंडर फाउंडेशन सीएल (2019.042.1) और मेडिकल-बायोलॉजिकल रिसर्च के लिए नोवार्टिस फाउंडेशन से सी.एल. इसके अलावा, इस परियोजना को मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 765104 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है । हम समर्थन के लिए बेसल में फ्लो साइटोमेट्री सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD) Invitrogen A1310 Viability dye
96 well plate U bottom Sarstedt 833925500 96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34 BD 555824 Antibody detecting CD34
RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin PanReac AppliChem A1391,0050 Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Roth 8043.1 Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BioConcept 2-01F10-I Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2 BD / Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A21222 Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB
RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF R&D 1299-NK-050 Fusion Protein detecting all NKG2DLs
RRID:
Human ULBP-1 Antibody R&D AF1380 Antibody detecting ULBP1
RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody R&D AF1298 Antibody detecting ULBP2/5/6
RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody R&D AF1517 Antibody detecting ULBP3
RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody Thermo Scientific PA5-35346 Antibody detecting MICA
RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody Thermo Scientific PA5-66698 Antibody detecting MICB
RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions Miltenyibiotec 130-093-385 Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-500ML Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A11034 Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs
RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um Spherotech Inc. RCP-30-20A Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium Sigma Aldrich R8758-500ML Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads Raybiotech 137-00013-100 Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL Invitrogen S866 Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection

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References

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एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया में बल्क सबपॉपुलेशन से स्टेम सेल को अलग करने के लिए NKG2D Ligand सतह का पता लगाने के दो प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण
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Landerer, H., Arnone, M., Wieboldt,… More

Landerer, H., Arnone, M., Wieboldt, R., Goersch, E., Stanger, A. M. P., Konantz, M., Lengerke, C. Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (168), e61803, doi:10.3791/61803 (2021).

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