Summary
Мы представляем два различных протокола окрашивания для обнаружения лиганда NKG2D (NKG2DL) в образцах первичного острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) человека. Первый подход основан на слиянии белка, способного распознавать все известные и потенциально еще неизвестные лиганды, в то время как второй протокол основан на добавлении нескольких антител против NKG2DL.
Abstract
Было показано, что отсутствие поверхностной экспрессии лигандов NKG2D (NKG2DL) отличает лейкемические субпопуляции со свойствами стволовых клеток (так называемые лейкемические стволовые клетки, LSC) от более дифференцированных аналогов лейкемических клеток, которые не имеют потенциала инициации заболевания, хотя они несут аналогичные специфические генетические мутации лейкемии. NKG2DL являются биохимически очень разнообразными MHC класса I-подобными самомолекулярными молекулами. Здоровые клетки в гомеостатических условиях обычно не экспрессирует NKG2DL на поверхности клеток. Вместо этого экспрессия этих лигандов индуцируется при воздействии клеточного стресса (например, онкогенной трансформации или инфекционных стимулов), чтобы вызвать устранение поврежденных клеток посредством лизиса через NKG2D-рецептор-экспрессировающие иммунные клетки, такие как естественные киллеры (NK) клетки. Интересно, что поверхностная экспрессия NKG2DL избирательно подавляется в субпопуляциях LSC, что позволяет этим клеткам уклоняться от NKG2D-опосредованного иммунного надзора. Здесь мы представляем параллельный анализ двух различных методов проточной цитометрии, которые позволяют исследуть поверхностную экспрессию NKG2DL на раковых клетках, то есть метод, включающий распознавание панлигандов, и метод, включающий окрашивание несколькими антителами против отдельных лигандов. Эти методы могут быть использованы для отделения жизнеспособных отрицательных клеточных субпопуляций NKG2DL с предполагаемой свойствами раковых стволовых клеток от NKG2DL положительных не-LSC.
Introduction
NK-клетки являются важными эффекторами врожденной иммунной системы, которые могут распознавать и устранять злокачественные клетки или стрессовые здоровые клетки (например, вирусной инфекцией) без предварительной стимуляции антигена1. Этот процесс жестко регулируется с помощью сложного репертуара активирующих рецепторов, таких как естественные рецепторы цитотоксичности (NCR), NKG2D и CD16, и ингибирующих рецепторов, которые в значительной степени представлены иммуноглобулиноподобными рецепторами-киллерами (KIRs)2. Связывание KIRs с молекулами лейкоцитарного антигена человека (HLA) класса I на соматических клетках обеспечивает самораспознавание и передает толерантность NK-клеток. С другой стороны, отсутствие самораспознавания и повышенное связывание активирующих рецепторов с их лигандами на клетках-мишенях вызывают высвобождение цитотоксических гранул, приводящих к NK-клеточной опосредорованию цитотоксичностью1. Наконец, NK-клетки могут оказывать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) путем связывания активирующего рецептора CD16 с мишенями, экспрессирующими Fc-часть Ig(FcR)2. Помимо прямой цитотоксичности, NK-клетки также могут вызывать высвобождение цитокинов, соединяющее врожденную с адаптивной иммунной системой3.
NKG2D является основным активирующим рецептором, экспрессируемым на NK, NKT, γδ T и наивных CD8 + Т-клетках4, который позволяет таким цитотоксическим иммунным клеткам распознавать и лизировать лиганд NKG2D (NKG2DL), экспрессирующий клетки-мишени. Здоровые клетки обычно не экспрессивают NKG2DL. Вместо этого экспрессия NKG2DL регулируется на злокачественных или инфицированных вирусом клетках, чтобы сделать их поддаются иммунному клиренсу5.
Человеческое семейство NKG2DL включает восемь известных молекул, среди которых две связанные с цепью MHC I молекулы A и B (MICA и MICB6)и цитомегаловирус UL16-связывающие белки 1-6 (ULBP1-67). Выражение NKG2DL регулируется на транскрипционном, посткриптиционном, а также постпереводяном уровнях8. Таким образом, в то время как экспрессия NKG2DL обычно не обнаруживается на поверхности здоровых клеток, мРНК NKG2DL9 и внутриклеточная экспрессия белка были зарегистрированы в здоровых тканях. Функциональная значимость такого выражения и механизмы, лежащие в основе таких дискрепрепантных паттернов выражения, еще предстоит определить10.
Механистическая регуляция экспрессии NKG2DL в раковых клетках является увлекательной областью исследования. Пути, которые, как известно, участвуют либо в клеточном стрессе, например, в пути стресса теплового шока9,либо в пути, связанные с повреждением ДНК, такие как мутировавший телеангиэктазия атаксии (ATM) и связанный с Rad3 (ATR)путь 11,а также вирусные или бактериальные инфекции были напрямую связаны с индудукцией экспрессии NKG2DL12. Однако, даже если поверхностная экспрессия NKG2DL была эффективно индуцирована, эта экспрессия может быть снова потеряна через протеолитически-опосредованную линьку, механизм, связанный с иммунным побегом и плохим клиническим прогнозом при некоторых видах рака13.
Отсутствие клеточной поверхности NKG2DL также может играть важную роль у пациентов с ОМЛ. Здесь лечение интенсивной химиотерапией часто вызывает ремиссию, но рецидив часто возникает от лейкемических стволовых клеток (LSC), которые избирательно переживают химиотерапию и уклоняются от иммунного ответа. Как мы недавно показали, LSC, например, избегают лизиса NK-клеток, подавляя поверхностную экспрессию NKG2DL14.
И наоборот, отсутствие поверхностной экспрессии NKG2DL может быть использовано в качестве метода для идентификации и жизнеспособного выделения предполагаемой стволоподобной субпопуляции клеток от объемных аналогов лейкемических субпопуляций. Здесь мы представляем два проточных цитометрических подхода, которые могут быть использованы для обнаружения поверхностной экспрессии NKG2DL и тем самым идентификации отрицательных стволовых клеток NKG2DL при лейкемии и, возможно, также при других видах рака: метод распознавания поверхности панлиганда и метод, включающий окрашивание одиночными или объединенными антителами, распознающими отдельные известные белки NKG2DL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы пациентов были собраны после одобрения Советом по этике университетских больниц Базеля и Тюбингена.
1. Биотинилирование белка слияния NKG2D
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с помощью набора для биотинилирования (см. Таблицу материалов)в соответствии с инструкцией производителя. Этот этап протокола должен быть выполнен не менее чем за 24 часа до окрашивания. Биотинилированный слитый белок NKG2D должен храниться при -20 °C.
- Разморозить как биотин, так и белковые трубки NKG2D при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки должны быть стерильными для дальнейшего экспериментального использования (инъекции мышам, колониеобразующие единичные анализы и т. Д.), Повторно воссоздайте белок слияния под ламинарной капотом потока, чтобы избежать загрязнения. В противном случае каждый шаг можно выполнить на скамейке. - Быстро вращайте 50 мкг лиофилизированного белка слияния NKG2D. Добавьте 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для повторного образования порошка и тщательно перемешайте с помощью микропипетки P1000.
- Добавьте 100 мкл слитого белка NKG2DL в биотиновую трубку для получения конечной концентрации запаса 100 мкг/мл.
- Тщательно перемешайте раствор путем непрерывного повторного усыпления с помощью микропипетки P100.
- Инкубировать раствор слитого белка/биотина на контролируемом РТ в течение 24 ч. Слитый белок теперь готов к использованию.
2. Размораживание первичных клеток ОМЛ
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 5 000 000 замороженных лейкозных клеток на одного пациента, хранящихся в жидком азоте, были разморожено, а затем сразу же использованы для анализов. Лейкемические клетки были получены и заморожены, какописано ранее 15. Вкратце, образцы периферической крови, собранные у пациентов с ОМЛ и высоким процентом бластных клеток (>90% бластов среди мононуклеарных клеток), обрабатывали с разделением градиента плотности для получения мононуклеарных клеток и впоследствии замораживали в сыворотке теленка плода (FCS), содержащей 10% раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Количество клеток сильно варьировалось между пациентами в зависимости от концентрации лейкоцитов у пациента (диапазон: от 1 000 000 до 30 000 000 лейкозных клеток на мл крови).
- Предварительно нагревайте RPMI среду, содержащую 10% FCS при 37 °C, с помощью водяной бани. На каждый флакон клеток ОМЛ (до 30 000 000 клеток в 1 мл FCS + 10% DMSO) добавляют 10 мл предварительно нагретой среды в реакционную трубку объемом 15 мл.
- Удалите криовиал, содержащий первичный ОМЛ, из хранилища жидкого азота и немедленно разморозьте клетки с помощью водяной бани с 37 °C. Осторожно перемещайте трубку вперед и назад в воде, позволяя содержимому флакона оттаивать, пока не останется только небольшой кристалл льда.
- Немедленно переложите размороженные клетки в средосодержащую трубку и промойте флакон, используя 1 мл среды.
- Центрифугируют ячейки при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
- Промыть ячейки 5 мл rpmI среды, содержащей 10% FCS, и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин.
3. Подсчет клеток
- Повторно суспендируют ячейку гранулы в известном объеме rpmI среды, содержащей 10% FCS.
- Переложите небольшой объем клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и разбавьте в известном соотношении трипан-синим или любым другим альтернативным красителем, который позволяет различать живые клетки / мертвые клетки.
- Используйте любое устройство для подсчета ячеек.
- Центрифугируют ячейки при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
4. Окрашивание первичных клеток AML с использованием биотинилированного белка слияния NKG2D
- Подготовьте буфер окрашивания, дополнив 500 мл PBS бытовым сывороточным альбумином (BSA) и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) до конечной концентрации 0,07 мМ и 2 мМ соответственно. При необходимости отрегулируйте рН (7,2–7,4).
- Повторно суспендируют ячейку гранулы с буфером окрашивания до конечной концентрации 0,5 х 107 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно, перед окрашиванием, клетки могут быть инкубированы с блокирующим агентом (например, hIgG (1 мкг/мл) в течение 30 мин при RT или FcR-блокирующем агенте). - Переложить 100 мкл клеточной суспензии на клеточную культуру 96-скважинной U-нижней пластины и центрифугировать пластину при 300 х г в течение 10 мин. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
- Приготовьте мастер-смесь биотинилированного белка слияния NKG2D таким образом, чтобы клетки повторно суспендировались в конечном объеме 50 мкл на скважину с конечной концентрацией 10 мкг/мл на скважину.
- Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 4.4, используя пипетку 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите конечный объем в соответствии с количеством клеток, чтобы уменьшить количество белка слияния, необходимого для окрашивания. - Инкубируют клеточную суспензию в течение 25 мин при RT или 50 мин при 4 °C.
- Промывайте ячейки, добавляя 200 мкл окрашивающего буфера на скважину многоканальной пипеткой 300 мкл.
- Центрифугировать пластину при 300 х г в течение 10 мин и выбросить супернатант, не нарушая гранулу.
- Повторите шаги 4.7 и 4.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание, описанное здесь, выполняется в клеточной культуре 96-скважинной U-нижней пластины. Поэтому этапы промывки выполняются дважды из-за малой объемной емкости таких пластин. Окрашивание также может быть выполнено в других трубах, а этапы промывки могут быть выполнены только один раз с использованием большего объема. - Приготовьте мастер-микс с использованием Стрептавидина-ПЭ (см. Таблицу 1 для разбавлений) таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте селекционо-антитела для вашего типа клеток, представляющих интерес, например, CD33, CD34.... для AML. - Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 4.10 с использованием пипетки 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
- Инкубировать клеточные суспензии в течение 15 мин при RT или 30 мин при 4 °C в темноте.
- Промывайте ячейки, добавляя 200 мкл окрашивающего буфера на скважину многоканальной пипеткой 300 мкл.
- Центрифугировать пластину при 300 х г в течение 10 мин и выбросить супернатант, не нарушая гранулу.
- Повторите шаги 4.13 и 4.14.
- Готовят раствор окрашивающего буфера, включающий 7-AAD (7-аминоактиномицин D, 1:1000) или любой реагент для различения живых и мертвых клеток.
- Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 мкл окрашивающего буфера + 7-AAD, приготовленных на этапе 4.16 с использованием многоканальной микропипетки 300 мкл.
- Анализируйте клетки с помощью устройства проточной цитометрии.
5. Окрашивание одиночных или объединенных одиночных антител NKG2DL
- Используйте ту же суспензию ячеек, что и на шаге 4.2.
- Переложите 100 мкл клеточной суспензии на клеточную культуру 96-скважинной U-донной пластины с помощью многоканальной пипетки 300 мкл и центрифугируют пластину при 300 х г в течение 10 мин. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
- Подготовьте смесь антител для каждого первичного антитела или объединенных антител (см. Таблицу 2 для разведений) таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 мкл.
- Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 5.3, используя пипетку 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
- Инкубировать клетки в течение 25 мин при РТ.
- Промыть ячейки, добавив 200 мкл окрашивающего буфера на скважину с помощью многоканальной пипетки 300 мкл.
- Центрифугируют клеточную культуру 96-луночной U-донной пластиной при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
- Повторите шаги 5.6 и 5.7.
- Приготовьте смесь антител путем добавления вторичного антитела (см. Таблицу 2 для разведения) таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 мкл на скважину.
- Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 5.9, используя пипетку 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
- Инкубировать в течение 15 мин при RT или 30 мин при 4 °C в темноте.
- Промывайте, добавляя 200 мкл буфера окрашивания на скважину с помощью многоканальной пипетки 300 мкл.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
- Повторите шаги 5.12 и 5.13.
- Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 мкл окрашивающего буфера, содержащего 7-AAD, приготовленное на этапе 4.16.
- Анализ клеток с помощью устройства проточной цитометрии, как описано в шаге 6.
6. Сбор данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что еженедельный контроль качества проточного цитометра выполняется, чтобы убедиться, что лазеры функционируют должным образом. Для протокола, представленного здесь, еженедельный процесс цитометра и отслеживания (CTS) выполняется с относительными шариками для проверки производительности лазера на всех каналах. После CTS 10 000 событий регистрируются с использованием 8-пиковых бусин в качестве внутреннего контроля. Все вершины должны находиться в одном положении внутри своих ворот и хорошо отделены друг от друга.
- Создайте матричную компенсацию для вычитания спектрального перекрытия между детекторами с шариками или с ячейками16.
- Запишите 10 000 событий для неокрашивых клеток и одиночных окрашенных шариков. Для элементов управления флуоресценцией минус один (FMO) регистрируйте 50 000 событий, а для полностью окрашенных образцов регистрируйте до 100 000 событий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, одиночные окрашенные образцы могут быть выполнены на клетках. Если это так, убедитесь, что клетки имеют положительный сигнал для нужного маркера. - Приобретите один окрашенный образец клетки или бусины для каждого флуорофора, используемого в эксперименте, чтобы выявить количество спектрального перекрытия. Используйте создателя компенсации устройства проточной цитометрии для расчета значений побочных эффектов и применения компенсационной матрицы ко всем измеренным образцам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела не могут быть использованы для создания компенсации с помощью бусин, если компенсация рассчитывается с помощью бусин. В зависимости от типа компенсационных шариков вторичные антитела не могут быть использованы для компенсации бусинами. - Для элементов управления FMO и полных окрашенных образцов с белком слияния, во-первых, выберите клетки на основе их прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). После исключения дублетов, загладейте клетки на основе их негативности для сигнала 7-AAD (PercP-Cy5.5), чтобы исключить мертвые клетки (см. шаг 5.15). На заключительном графике показано выражение CD34 (ось Y) и NKG2DL (ось X) на живых синглетах.
- Для одиночных анти-NKG2DL-антител примените ту же стратегию к образцам, но обратите внимание, что положительность лиганда лежит в Alexa Fluor 488, а не в канале PE.
- Отрегулируйте затворы в соответствии с элементами управления FMO для стратегии гаширования с шагов 6.4 и 6.5 (см. Таблицу 3)для соответствующих элементов управления FMO для этого эксперимента: В аналитическом программном обеспечении нарисуйте затвор на отрицательной дроби. При записи полностью окрашенного образца клетки над ранее созданным затвором являются положительными для анализируемого маркера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оба протокола, представленные здесь, позволяют обогащать AML LSC с помощью проточных цитометрических анализов с использованием CD34, известного маркера LSC17,в сочетании с поверхностной экспрессией NKG2DL путем либо использования распознавания панлигандов, либо окрашивания объединенными антителами против отдельных лигандов. На рисунке 1мы показываем, что проанализированные образцы AML положительны на CD34 и NKG2DL, но также существуют отрицательные субпопуляции, что проявляется в наличии четырех различных популяций в общей сложности. Наши данные показывают типичную стратегию гастировки для такого окрашивания, начиная с отбора основной популяции клеток через их FSC и SSC. Дублеты и мертвые клетки исключаются в последующем анализе(рисунок 1A). Затворы настраиваются с помощью элементов управления FMO для обеспечения правильной идентификации положительных ячеек(рисунок 1B).
На рисунке 1Cмы выделяем интенсивность флуоресценции клеток, положительную для CD34 (APC, ось Y) против NKG2DL (PE, ось X). Клетки AML, которые являются положительными для CD34, показывают более низкую поверхностную экспрессию NKG2DL(рисунок 1C),что соответствует предыдущим результатам нашей лаборатории, показывая, что экспрессия NKG2DL связана с отсутствием стволовости14.
На рисунке 2 показано надежность обоих методов окрашивания NKG2DL. На рисунке 2Aмы исследуем три первичных образца AML бок о бок, показывающие 19,8, 49,8 и 89,4% соответственно положительных событий для окрашивания белка слияния против 20,4, 50,4 и 90,6% для окраски антител против NKG2DL (объединенные антитела против MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 и ULBP3) соответственно. С другой стороны, окрашивание одним лигандом (по отношению к MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 или ULBP3) показывает диапазон положительных событий до 92%(рисунок 2B). Этот процент варьируется в зависимости от самого лиганда и пациента, например, ULBP3(рисунок 2B). Следует отметить, что одна клетка может экспрессить несколько NKG2DL.
Когда несколько антител против NKG2DL объединяются и объединяются в одну единую трубку, процент положительных клеток сопоставим с процентом белка слияния(рисунок 2A). Таким образом, оба протокола работают хорошо и могут обеспечить аналогичные результаты в отношении экспрессии NKG2DL на первичных клетках AML. В некоторых ОМЛ метод слияния белков может обеспечить более высокую чувствительность, поскольку он может позволить распознать дальнейшие белки NKG2DL.
Рисунок 1: Типичная стратегия гастиля первичных образцов AML. (A)Ячейки сначала закрыты в зависимости от их размера (ось X) и сложности (например, гранулярность, ось Y). Затем дублеты исключаются путем построения высоты или ширины по отношению к области для прямого рассеяния. Наконец, живые клетки выбираются на основе их размера (ось X) по сравнению с их негативностью для 7AAD (PerCP-Cy5.5, ось Y). (B)Средства контроля FMO используются для установки ворот, помогающих различать положительные и отрицательные популяции для указанных маркеров. Стратегия гаширования остается идентичной, как показано на рисунке 1A. (C)График проточной цитометрии, показывающий положительные и отрицательные события для CD34 (APC, ось Y) против NKG2DL (PE или AlexaFluor488, ось X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение протоколов окрашивания. (A)Гистограммы, показывающие процент положительных событий для белка слияния по сравнению с объединенными антителами против NKGD2L (n = 3 образца AML) из закрытых одиночных живых клеток. (B) Гистограммы, отображающие процент положительных событий для окрашивания одного лиганда для всех известных антител против NKG2DL и объединенных одиночных лигандов (см. Таблицу материалов для получения подробной информации об антителах). Гатирование снова проводилось на одиночных живых клетках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Название трубки | Антиген | Флуорофор | Разбавление/концентрация |
| Неокрашившиеся клетки | - | - | - |
| Одно пятно ЧП |
NKG2D-Фьюжнпротеин | ЧП | 1:10 для первичного шага 1:100 для второго шага |
| Одно пятно 7AAD (Перц-Cy5.5) |
Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 |
| Одно пятно БТР |
СД34 | БТР | 1:25 |
| Полностью окрашенные клетки | СД34 | БТР | 1:25 |
| NKG2D-Фьюжнпротеин | ЧП | 1:10 для первичного шага 1:100 для второго шага | |
| Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 |
Таблица 1: Пробирки, необходимые для окрашивания образцов слитым белком NKG2D. В этой таблице показаны трубки, необходимые для проведения эксперимента.
| Название трубки | Антиген | Флуорофор | Разбавление/концентрация |
| Неокрашившиеся клетки | - | - | - |
| Одно пятно Алекса Флюор 488 |
УЛЬБП-1 | Алекса Флюор 488 | 10 мкг/мл для первичной ступени 4 мкг/мл для вторичной ступени |
| УЛЬБП-2/5/6 | |||
| УЛПБ-3 | |||
| СЛЮДА | |||
| ВПК | |||
| одиночное пятно 7AAD (Перц-Cy5.5) |
Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 |
| Одно пятно БТР |
СД34 | БТР | 1:25 |
| Полностью окрашенные клетки | СД34 | БТР | 1:25 |
| НКГ2ДЛ | Алекса Флюор 488 | 10 мкг/мл для первичной ступени 4 мкг/мл для вторичной ступени |
|
| Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 |
Таблица 2: Пробирки, необходимые для окрашивания образцов антителами против NKG2DL. В этой таблице показаны трубки, необходимые для проведения эксперимента.
| Название трубки | Антиген | Флуорофор | Разбавление/концентрация |
| Неокрашившиеся клетки | - | - | - |
| FMO_APC | УЛЬБП-1 | Алекса Флюор 488 | 10 мкг/мл для первичной ступени 4 мкг/мл для вторичной ступени |
| УЛЬБП-2/5/6 | |||
| УЛПБ-3 | |||
| СЛЮДА | |||
| ВПК | |||
| NKG2D-Фьюжнпротеин | ЧП | 1:10 для основного шага 1:100 для второго шага |
|
| Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | СД34 | БТР | 1:25 |
| УЛЬБП-1 | Алекса Флюор 488 | 10 мкг/мл для первичной ступени 4 мкг/мл для вторичной ступени |
|
| УЛЬБП-2/5/6 | |||
| УЛПБ-3 | |||
| СЛЮДА | |||
| ВПК | |||
| Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Флуор 488 | СД34 | БТР | 1:25 |
| NKG2D-Фьюжнпротеин | ЧП | 1:10 для основного шага 1:100 для второго шага |
|
| Живые/Мертвые | 7ААД (ПерЦП-Cy5.5) |
1:1000 |
Таблица 3: Трубы, необходимые для установки основных элементов управления. В этой таблице показаны пробирки, необходимые для создания надлежащего контроля FMO, первичных и вторичных антител. Все необходимые элементы управления (FMO) должны быть добавлены экспериментатором для получения достоверных результатов и интерпретируемых данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем два метода проточной цитометрии, которые могут обнаруживать поверхностную экспрессию NKG2DL на первичных клетках AML человека. Показано, что оба метода обнаружения могут быть использованы в сочетании с другими окрашиваниями антител (например, обнаружение экспрессии CD34). Подобные окрашивания могут также выполняться на других первичных типах клеток и клеточных линиях.
Недавно мы показали, что отсутствие NKG2DL на поверхности бластов пациентов с ОМЛ может обогатить LSC14. При ОМЛ отрицательные NKG2DL, но не положительные лейкемические субпопуляции NKG2DL обладают клоногенной и in vivo лейкозной способностью. Будущие исследования покажут, может ли отсутствие поверхностной экспрессии NKG2DL также использоваться в качестве инструмента для обогащения стволовых клеток при других типах рака.
Было классически показано, что CD34 маркирует LSC в AML, но AML является очень гетерогенным заболеванием, и не все пациенты с ОМЛ демонстрируют экспрессию CD34 (т. Е. CD34 отрицательный AML18). Ранее мы показали, что отсутствие поверхностной экспрессии NKG2DL обеспечивает новый инструмент для идентификации LSC в этой подгруппе CD34 отрицательного AML. Здесь, напротив, мы фокусируемся на подгруппе CD34-положительных AML и показываем, что могут возникать различные субпопуляции. Будущие исследования покажут, может ли совместное окрашивание для NKG2DL в сочетании с такими другими маркерами (например, CD34) более эффективно обогащать LSC.
В проточной цитометрии важно включить адекватные средства контроля, такие как FMO, чтобы помочь экспериментатору правильно различать положительные и отрицательные события. Кроме того, положительный контроль для каждого использованного антитела необходим для обеспечения того, чтобы отсутствие окрашивания не было связано с неисправным антителом. Протокол, который мы представляем здесь, использует только ограниченное количество поверхностных маркеров, которые могут быть расширены в соответствии с потребностями экспериментатора, например, путем добавления CD33 или потенциальных маркеров LSC19. Кроме того, флуорофоры, используемые в этом протоколе, могут быть адаптированы. Важно отметить, что такие изменения должны сопровождаться титрованием антител для определения наилучшего разведения.
Одним из критических шагов перед окрашиванием является оттаивание первичных клеток AML. Действительно, в дополнение к их хрупкости, такие образцы сохраняются в диметилсульфоксиде (ДМСО), который само по себе токсичен для клеток. Поэтому с образцами следует обращаться осторожно и тщательно промывать, чтобы избежать длительного воздействия ДМСО. Хотя наши образцы были обработаны и заморожены в соответствии с ранее установленным протоколом15,важно тщательно следовать шагам, описанным в рукописи, чтобы обеспечить высокое восстановление клеток. Работа со свежими образцами обеспечит улучшенную жизнеспособность и поэтому рекомендуется. Однако в большинстве случаев это практически невозможно.
Другим фактором, влияющим на описанный метод, является отклонение от конкретного образца, которое может привести к различным профилям рассеяния клеток, наблюдаемым с помощью проточной цитометрии. Из-за неоднородности заболевания это неизбежно, но должно быть учтено в анализе. Дополнительная изменчивость может быть введена замораживанием/оттаиванием или другими механическими этапами обработки образцов. В целом, быстротой является ключ к предотвращению гибели клеток. Тем не менее, умирающих клеток и мусора нельзя избежать, и их необходимо учитывать и исключать при анализе. Гейминг на основе FSC/SSC должен проводиться с тщательностью и критическим взглядом, так как это первый шаг анализа образцов.
Одним из основных преимуществ слитого белка является его способность обнаруживать все известные и потенциально неизвестные NKG2DL, в то время как специфические антитела против NKG2DL (например, MICA, MICB) вводят смещение выбора. Оба метода одинаково осуществимы. Для проанализированного ограниченного числа образцов они также показали очень сопоставимые результаты. Использование слитого белка NKG2D имеет некоторые основные преимущества: меньшее количество трудоемких, уменьшенное количество реагентов и количество образцов окрашивания, а также более низкая вероятность человеческих ошибок (т. Е. Ошибок пипетирования). Кроме того, этот метод также может быть более эффективным при захвате экспрессии NKG2DL в некоторых образцах, поскольку он также должен захватывать экспрессию неизвестных белков с функцией NKG2DL, которая может быть экспрессирована в некоторых случаях AML. Обеспечивая понимание поверхностного присутствия NKG2DL, этот метод не предоставляет информацию о внутриклеточных уровнях NKG2DL, их незаконном обороте или регуляции, и поэтому для получения дополнительных знаний по таким вопросам следует проводить другие анализы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Швейцарского национального научного фонда (179239), Фонда борьбы с раком (Zuerich), Фонда Вильгельма Сандера для CL (2019.042.1) и Фонда медико-биологических исследований Novartis для C.L. Кроме того, этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 765104. Мы благодарим Центр проточной цитометрии в Базеле за поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
