Summary
Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.
Abstract
Innerhalb desselben Patienten wurde gezeigt, dass das Fehlen einer Oberflächenexpression von NKG2D-Liganden (NKG2DL) leukämische Subpopulationen mit Stammzelleigenschaften (sogenannte leukämische Stammzellen, LSCs) von differenzierteren leukämischen Gegenstückzellen unterscheidet, denen das Krankheitsinitiierungspotenzial fehlt, obwohl sie ähnliche leukämiespezifische genetische Mutationen aufweisen. NKG2DL sind biochemisch sehr vielfältige MHC-Klasse-I-ähnliche Selbstmoleküle. Gesunde Zellen unter homöostatischen Zuständen exprimieren im Allgemeinen kein NKG2DL auf der Zelloberfläche. Stattdessen wird die Expression dieser Liganden bei Exposition gegenüber zellulärem Stress (z. B. onkogene Transformation oder infektiöse Reize) induziert, um die Eliminierung geschädigter Zellen durch Lyse durch NKG2D-Rezeptor-exprimierende Immunzellen wie natürliche Killerzellen (NK) auszulösen. Interessanterweise wird die NKG2DL-Oberflächenexpression in LSC-Subpopulationen selektiv unterdrückt, so dass diese Zellen der NKG2D-vermittelten Immunüberwachung entgehen können. Hier präsentieren wir eine Parallelanalyse von zwei verschiedenen Durchflusszytometrie-Methoden, die die Untersuchung der NKG2DL-Oberflächenexpression auf Krebszellen ermöglichen, d.h. eine Methode mit Panligandenerkennung und eine Methode, bei der mit mehreren Antikörpern gegen einzelne Liganden gefärbt wird. Diese Methoden können verwendet werden, um lebensfähige NKG2DL-negative zelluläre Subpopulationen mit mutmaßlichen Krebsstammzelleigenschaften von NKG2DL-positiven Nicht-LSC-Eigenschaften zu trennen.
Introduction
NK-Zellen sind wichtige Effektoren des angeborenen Immunsystems, die bösartige Zellen oder gestresste gesunde Zellen (z.B. durch eine Virusinfektion) ohne vorherige Antigenstimulation erkennen und eliminieren können1. Dieser Prozess wird durch ein komplexes Repertoire an aktivierenden Rezeptoren – wie natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCRs), NKG2D und CD16 – und inhibitorische Rezeptoren, die weitgehend durch Killer-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs) repräsentiert werden, streng reguliert2. Die Bindung von KIRs an humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse-I-Moleküle auf somatischen Zellen gewährleistet die Selbsterkennung und vermittelt NK-Zelltoleranz. Auf der anderen Seite lösen das Fehlen von Selbsterkennung und die erhöhte Bindung von aktivierenden Rezeptoren an ihre Liganden auf den Zielzellen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die zu einer NK-zellvermittelten Zytotoxizität führen1. Schließlich können NK-Zellen eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ausüben, indem sie den aktivierenden Rezeptor CD16 an Ziele binden, die den Fc-Anteil von Ig (FcR)2exprimieren. Neben der direkten Zytotoxizität können NK-Zellen auch die Zytokinfreisetzung auslösen, die das Angeborene mit dem adaptiven Immunsystem überbrückt3.
NKG2D ist ein wichtiger aktivierender Rezeptor, der auf NK-, NKT-, γδ T- und naiven CD8+ T-Zellen4 exprimiert wird und es solchen zytotoxischen Immunzellen ermöglicht, NKG2D-Liganden (NKG2DL) exprimierende Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Gesunde Zellen exprimieren normalerweise kein NKG2DL. Stattdessen wird die NKG2DL-Expression auf bösartigen oder virusinfizierten Zellen hochreguliert, um diese für die Immunclearance 5 zuverbessern.
Die humane NKG2DL-Familie umfasst acht bekannte Moleküle, darunter die beiden MHC-I-Kettenmoleküle A und B (MICA und MICB6)und die Cytomegalievirus UL16-bindenden Proteine 1–6 (ULBP1-67). Die Expression von NKG2DL wird auf der transkriptionellen, posttranskriptionellen sowie post-translationalen Ebene8reguliert. Während die NKG2DL-Expression auf der Oberfläche gesunder Zellen normalerweise nicht nachweisbar ist, wurden NKG2DL mRNA9 und intrazelluläre Proteinexpression in gesunden Geweben berichtet. Die funktionelle Relevanz eines solchen Ausdrucks und die Mechanismen, die solchen abweichenden Ausdrucksmustern zugrunde liegen, müssen noch definiert werden10.
Die mechanistische Regulation der NKG2DL-Expression in den Krebszellen ist ein faszinierendes Untersuchungsgebiet. Signalwege, von denen bekannt ist, dass sie entweder an zellulärem Stress beteiligt sind, z. B. der Hitzeschockstressweg9,oder DNA-schadensbedingte Signalwege, wie der Ataxie-Teleangiektasie-mutierte (ATM) und Rad3-assoziierte (ATR) Weg11,sowie virale oder bakterielle Infektionen wurden direkt mit der Induktion der NKG2DL-Expression12in Verbindung gebracht. Aber selbst wenn die Oberflächenexpression von NKG2DL effektiv induziert wurde, kann diese Expression durch proteolytisch vermittelte Ausscheidung wieder verloren gehen, ein Mechanismus, der bei einigen Krebsarten mit Immunentwehung und schlechter klinischer Prognose verbunden ist13.
Das Fehlen von Zelloberflächen-NKG2DL kann auch bei Patienten mit AML eine wichtige Rolle spielen. Hier induziert die Behandlung mit intensiver Chemotherapie oft eine Remission, aber ein Rückfall tritt häufig aus leukämischen Stammzellen (LSC) auf, die Chemotherapien selektiv überleben und der Immunantwort entgehen. Wie wir kürzlich gezeigt haben, entgehen LSCs beispielsweise der NK-Zelllyse, indem sie die NKG2DL-Oberflächenexpression14unterdrücken.
Umgekehrt kann das Fehlen einer Oberflächen-NKG2DL-Expression als Methode verwendet werden, um mutmaßliche stammähnliche Subpopulationen von Zellen aus leukämischen Subpopulationen zu identifizieren und kämisch zu isolieren. Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Ansätze vor, mit denen die NKG2DL-Oberflächenexpression nachgewiesen und damit NKG2DL-negative Stammzellen bei Leukämie und vielleicht auch bei anderen Krebsarten identifiziert werden können: Eine Methode zur Panliganden-Oberflächenerkennung und eine Methode zur Färbung mit einzelnen oder gepoolten Antikörpern, die einzelne bekannte NKG2DL-Proteine erkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientenproben wurden nach Bewilligung durch die Ethikprüfungskommission der Universitätsspitäler Basel und Tübingen erhoben.
1. Biotinylierung des NKG2D-Fusionsproteins
HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem Biotinylierungskit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dieser Schritt des Protokolls muss mindestens 24 Stunden vor der Färbung durchgeführt werden. Das biotinylierte NKG2D-Fusionsprotein sollte bei -20 °C gelagert werden.
- Tauen Sie sowohl das Biotin als auch die NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur (RT) auf.
HINWEIS: Wenn die Zellen für weitere experimentelle Verwendungen steril sein müssen (Injektion in Mäuse, koloniebildende Einheitentests usw.), rekonstituieren Sie das Fusionsprotein unter einer laminaren Strömungshaube, um eine Kontamination zu vermeiden. Ansonsten kann jeder Schritt auf einer Bank durchgeführt werden. - Drehen Sie schnell das 50μg lyophilisierte NKG2D-Fusionsprotein herunter. Fügen Sie 500 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P1000-Mikropipette.
- 100 μL des NKG2DL-Fusionsproteins werden in ein Biotinröhrchen gegeben, um eine endgültige Stammkonzentration von 100 μg/ml zu erhalten.
- Mischen Sie die Lösung gründlich durch kontinuierliches Wiederaufbewenden mit einer P100-Mikropipette.
- Inkubieren Sie die Fusionsprotein/Biotinlösung bei einem kontrollierten RT für 24 h. Das Fusionsprotein ist nun einsatzbereit.
2. Auftauen primärer AML-Zellen
HINWEIS: Ungefähr 5.000.000 gefrorene leukämische Zellen pro Patient, die in flüssigem Stickstoff gelagert wurden, wurden aufgetaut und dann sofort für die Assays verwendet. Leukämische Zellen wurden wie zuvor beschrieben gewonnen und eingefroren15. Kurz gesagt, periphere Blutproben, die von Patienten mit AML und hohen Blastenzellanteilen (>90% der Blasten zwischen mononukleären Zellen) entnommen wurden, wurden mit einer Dichtegradiententrennung verarbeitet, um mononukleäre Zellen zu erhalten, und anschließend in fetalem Kalbserum (FCS) mit 10% Dimethylsulfoxidlösung (DMSO) eingefroren. Die Zellzahlen variierten stark zwischen den Patienten in Abhängigkeit von der Leukozytenkonzentration im Patienten (Bereich: 1.000.000 bis 30.000.000 leukämische Zellen pro ml Blut).
- Vorwärmen rpmI-Medium mit 10% FCS bei 37 °C in einem Wasserbad. Für jede Durchstechflasche mit AML-Zellen (bis zu 30.000.000 Zellen in 1 ml FCS + 10% DMSO) werden 10 ml vorgewärmtes Medium in ein 15 ml Reaktionsröhrchen gegeben.
- Entfernen Sie die kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und tauen Sie die Zellen sofort mit einem 37 °C Wasserbad auf. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist.
- Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das mediumhaltige Röhrchen und spülen Sie die Durchstechflasche mit 1 ml Medium aus.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Waschen Sie die Zellen mit 5 ml RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min.
3. Zellzählung
- Das Zellpellet wird in einem bekannten RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, wieder aufsetzen.
- Ein kleines Volumen der Zellsuspension wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in einem bekannten Verhältnis mit Trypanblau oder einem anderen alternativen Farbstoff verdünnt, der eine Unterscheidung zwischen lebenden Zellen und toten Zellen ermöglicht.
- Verwenden Sie ein beliebiges Gerät, um die Zellen zu zählen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
4. Färbung primärer AML-Zellen mit dem biotinylierten NKG2D-Fusionsprotein
- Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 500 ml PBS mit Rinderserumalbumin (BSA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf eine Endkonzentration von 0,07 mM bzw. 2 mM ergänzen. Passen Sie den pH-Wert (7,2–7,4) bei Bedarf an.
- Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 x 107 Zellen/ml resuspendiert.
HINWEIS: Optional können die Zellen vor der Färbung mit einem Blockierungsmittel (z.B. hIgG (1μg/ml) für 30 min bei RT oder FcR-Blockierungsmittel) inkubiert werden. - 100 μL der Zellsuspension auf eine Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung mit einer Endkonzentration von 10 μg / ml pro Vertiefung resuspendiert werden.
- Fügen Sie die in Schritt 4.4 hergestellte Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
HINWEIS: Skalieren Sie das endende Volumen entsprechend der Anzahl der Zellen, um die menge an Fusionsprotein zu reduzieren, die für die Färbung erforderlich ist. - Inkubieren Sie die Zellsuspension für 25 min bei RT oder 50 min bei 4 °C.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8.
HINWEIS: Die hier beschriebene Färbung erfolgt in einer Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte. Daher werden Waschschritte aufgrund der geringen Volumenkapazität solcher Platten zweimal durchgeführt. Die Färbung kann auch in anderen Röhrchen durchgeführt werden und Waschschritte können dann nur einmal mit einem größeren Volumen durchgeführt werden. - Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin-PE vor (siehe Tabelle 1 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL resuspendiert werden.
HINWEIS: Fügen Sie Selektionsantikörper für Ihren Zelltyp von Interesse hinzu, wie z.B. CD33, CD34.... für AML. - Fügen Sie die in Schritt 4.10 vorbereitete Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
- Inkubieren Sie die Zellsuspensionen für 15 min bei RT oder 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.13 und 4.14.
- Bereiten Sie eine Lösung aus Färbepuffer einschließlich 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) oder einem reagenz an, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden.
- Resuspend-Zellpellets in 200 μL Färbepuffer + 7-AAD, hergestellt in Schritt 4.16 unter Verwendung einer 300 μL Mehrkanal-Mikropipette.
- Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.
5. Färbung einzelner oder gepoolter einzelner Anti-NKG2DL-Antikörper
- Verwenden Sie dieselbe Zellsuspension wie in Schritt 4.2.
- 100 μL der Zellsuspension mit einer 300 μL Mehrkanalpipette auf eine Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte übertragen und die Platte bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Bereiten Sie für jeden primären Antikörper oder gepoolte Antikörper einen Antikörper-Master-Mix vor (siehe Tabelle 2 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL resuspendiert werden.
- Fügen Sie die in Schritt 5.3 hergestellte Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
- Inkubieren Sie die Zellen für 25 minuten bei RT.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie die Zellkultur 96-Well-U-Bodenplatte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7.
- Bereiten Sie einen Antikörper-Master-Mix vor, indem Sie den sekundären Antikörper hinzufügen (siehe Tabelle 2 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung resuspendiert werden.
- Fügen Sie die in Schritt 5.9 vorbereitete Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
- 15 min bei RT oder 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
- Waschen Sie durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.12 und 5.13.
- Resuspend Zellpellets in 200 μL Färbepuffer mit 7-AAD, hergestellt in Schritt 4.16.
- Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät, wie in Schritt 6 beschrieben.
6. Datenerfassung
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass wöchentliche Qualitätskontrollen des Durchflusszytometers durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Laser ordnungsgemäß funktionieren. Für das hier vorgestellte Protokoll wird ein wöchentlicher CtS-Prozess (Cytometer and Tracking) mit relativen Perlen durchgeführt, um die Laserleistung auf allen Kanälen zu überprüfen. Nach dem CTS werden 10.000 Ereignisse mit den 8-Peak-Perlen als interne Kontrolle aufgezeichnet. Alle Gipfel sollten sich in der gleichen Position innerhalb ihrer Tore befinden und gut voneinander getrennt sein.
- Erzeugen Sie die Matrixkompensation, um die spektrale Überlappung zwischen Detektoren mit Perlen oder mit Zellen16zu subtrahieren.
- Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse für die nicht gefärbten Zellen und die einzelnen gefärbten Perlen auf. Für die Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) zeichnen Sie 50.000 Ereignisse auf und für die vollständig gefärbten Proben bis zu 100.000 Ereignisse auf.
HINWEIS: Alternativ können einzelne gefärbte Proben an den Zellen durchgeführt werden. Wenn ja, stellen Sie sicher, dass die Zellen ein positives Signal für den gewünschten Marker haben. - Erwerben Sie eine einzelne gefärbte Zell- oder Perlenprobe für jedes Fluorophor, das im Experiment verwendet wird, um die Menge der spektralen Überlappung aufzudecken. Verwenden Sie den Kompensationsersteller des Durchflusszytometriegeräts, um Spillover-Werte zu berechnen und die Kompensationsmatrix auf alle gemessenen Proben anzuwenden.
HINWEIS: Sekundäre Antikörper können nicht für die Kompensationserstellung mit Perlen verwendet werden, wenn die Kompensation mit Perlen berechnet wird. Je nach Art der Kompensationsperlen können sekundäre Antikörper nicht für die Kompensation mit Perlen verwendet werden. - Für die FMO-Kontrollen und die vollständig gefärbten Proben mit dem Fusionsprotein wählen Sie zunächst die Zellen basierend auf ihrer Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) aus. Nach dem Ausschluss von Duplätten die Zellen basierend auf ihrer Negativität für das 7-AAD-Signal (PercP-Cy5.5) ein, um die toten Zellen auszuschließen (siehe Schritt 5.15). Das letzte Diagramm zeigt den Ausdruck von CD34 (Y-Achse) und NKG2DL (X-Achse) auf lebenden Singustücken.
- Wenden Sie für die einzelnen Anti-NKG2DL-Antikörper die gleiche Strategie auf die Proben an, beachten Sie jedoch, dass die Ligandenpositivität in Alexa Fluor 488 und nicht im PE-Kanal liegt.
- Passen Sie die Gatter entsprechend den FMO-Steuerungen für die Gating-Strategie aus schritt 6.4 und 6.5 (siehe Tabelle 3)an, um geeignete FMO-Kontrollen für dieses Experiment durchzuführen: Zeichnen Sie in der Analysesoftware ein Tor auf die negative Fraktion. Während der Aufzeichnung der vollständig gefärbten Probe sind die Zellen über dem zuvor erzeugten Gate positiv für den analysierten Marker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beide hier vorgestellten Protokolle ermöglichen die Anreicherung von AML LSC durch durchflusszytometrische Analysen mit CD34, einem bekannten Marker von LSC17, in Kombination mit NKG2DL-Oberflächenexpression durch entweder unter Verwendung der Panligandenerkennung oder Färbung mit gepoolten Antikörpern gegen einzelne Liganden. In Abbildung 1zeigen wir, dass die analysierten AML-Proben positiv für CD34 und NKG2DL sind, aber auch negative Subpopulationen existieren, was durch das Vorhandensein von insgesamt vier verschiedenen Populationen gezeigt wird. Unsere Daten zeigen die typische Gating-Strategie für eine solche Färbung, beginnend mit der Auswahl der Hauptpopulation von Zellen über ihre fSC und SSC. Dupositen und abgestorbene Zellen sind in der nachgeschalteten Analyse ausgeschlossen (Abbildung 1A). Die Gates werden mit FMO-Kontrollen eingestellt, um eine ordnungsgemäße Identifizierung positiver Zellen zu gewährleisten (Abbildung 1B).
In Abbildung 1Czeigen wir die Fluoreszenzdicken von Zellen, die für CD34 (APC, Y-Achse) im Vergleich zu NKG2DL (PE, X-Achse) positiv sind. AML-Zellen, die positiv für CD34 sind, zeigen eine geringere Oberflächenexpression von NKG2DL (Abbildung 1C), was mit früheren Ergebnissen aus unserem Labor im Einklang steht und zeigt, dass die NKG2DL-Expression mit einem Mangel an Stammigkeit verbunden ist14.
Abbildung 2 zeigt die Robustheit der beiden NKG2DL-Färbemethoden. In Abbildung 2Auntersuchen wir drei primäre AML-Proben nebeneinander, die 19,8, 49,8 bzw. 89,4 % positive Ereignisse für die Fusionsproteinfärbung im Vergleich zu 20,4, 50,4 % bzw. 90,6 % für die gepoolte Anti-NKG2DL-Antikörperfärbung (gepoolte Antikörper gegen MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 und ULBP3) zeigen. Auf der anderen Seite zeigt die Färbung eines einzelnen Liganden (entweder gegen MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 oder ULBP3) eine Reihe positiver Ereignisse von bis zu 92%(Abbildung 2B). Dieser Prozentsatz variiert je nach Ligand selbst und Patient, z. B. ULBP3 (Abbildung 2B). Bemerkenswert ist, dass eine einzelne Zelle mehrere NKG2DL exprimieren kann.
Wenn mehrere Anti-NKG2DL-Antikörper gebündelt und in einem einzigen Röhrchen kombiniert werden, ist der Prozentsatz der positiven Zellen vergleichbar mit dem Prozentsatz des Fusionsproteins (Abbildung 2A). Daher funktionieren beide Protokolle gut und können ähnliche Ergebnisse in Bezug auf die NKG2DL-Expression auf primären AML-Zellen liefern. Bei einigen AML kann die Fusionsproteinmethode eine höhere Empfindlichkeit ermöglichen, da sie die Erkennung weiterer NKG2DL-Proteine ermöglichen kann.
Abbildung 1: Typische Gating-Strategie von primären AML-Proben. (A) Zellen werden zunächst basierend auf ihrer Größe (X-Achse) und Komplexität (z. B. Granularität, Y-Achse) gated. Duplättungen werden dann ausgeschlossen, indem die Höhe oder Breite gegen die Fläche für die Vorwärtsstreuung dargestellt wird. Schließlich werden lebende Zellen basierend auf ihrer Größe (X-Achse) im Vergleich zu ihrer Negativität für 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y-Achse) ausgewählt. (B) FMO-Kontrollen werden verwendet, um die Tore einzurichten, die dazu beitragen, zwischen positiven und negativen Populationen für indizierte Marker zu unterscheiden. Die Gating-Strategie bleibt identisch wie in Abbildung 1Adargestellt. (C) Durchflusszytometrie-Diagramm mit positiven und negativen Ereignissen für CD34 (APC, Y-Achse) vs NKG2DL (PE oder AlexaFluor488, X-Achse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vergleich der Färbungsprotokolle. (A) Balkendiagramme, die den Prozentsatz der positiven Ereignisse für das Fusionsprotein im Vergleich zu den gepoolten Anti-NKGD2L-Antikörpern (n = 3 AML-Proben) aus gated einzelnen lebenden Zellen zeigen. (B) Balkendiagramme, die den Prozentsatz der positiven Ereignisse für die Einzelligandenfärbung aller bekannten Anti-NKG2DL-Antikörper und gepoolten Einzelliganden anzeigen (detaillierte Informationen zu Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle). Gating wurde wieder an einzelnen lebenden Zellen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name der Röhre | Antigen | Fluorophor | Verdünnung/Konzentration |
| Nicht gefärbte Zellen | - | - | - |
| Einzelner Fleck PE |
NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 für den primären Schritt 1:100 für den sekundären Schritt |
| Einzelner Fleck 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Einzelner Fleck APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Voll gefärbte Zellen | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 für den primären Schritt 1:100 für den sekundären Schritt | |
| Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabelle 1: Röhrchen, die zum Färben von Proben mit dem NKG2D-Fusionsprotein erforderlich sind. Diese Tabelle zeigt die Röhrchen, die für den Aufbau des Experiments erforderlich sind.
| Name der Röhre | Antigen | Fluorophor | Verdünnung/Konzentration |
| Nicht gefärbte Zellen | - | - | - |
| Einzelner Fleck Alexa Fluor 488 |
ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml für Primärschritt 4 μg/ml für sekundären Schritt |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| einzelner Fleck 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Einzelner Fleck APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Voll gefärbte Zellen | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml für Primärschritt 4 μg/ml für sekundären Schritt |
|
| Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabelle 2: Röhrchen, die erforderlich sind, um Proben mit den Anti-NKG2DL-Antikörpern zu färben. Diese Tabelle zeigt die Röhrchen, die für den Aufbau des Experiments erforderlich sind.
| Name der Röhre | Antigen | Fluorophor | Verdünnung/Konzentration |
| Nicht gefärbte Zellen | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml für Primärschritt 4 μg/ml für sekundären Schritt |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 für den primären Schritt 1:100 für den sekundären Schritt |
|
| Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/ml für Primärschritt 4 μg/ml für sekundären Schritt |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Fluor 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 für den primären Schritt 1:100 für den sekundären Schritt |
|
| Leben/Tot | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabelle 3: Rohre, die für die Einrichtung der wesentlichen Kontrollen erforderlich sind. Diese Tabelle zeigt die Röhrchen, die erforderlich sind, um geeignete FMO-, primäre und sekundäre Antikörperkontrollen einzurichten. Alle erforderlichen Kontrollen (FMO) müssen vom Experimentator hinzugefügt werden, um gültige Ergebnisse und interpretierbare Daten zu erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Methoden vor, die die NKG2DL-Oberflächenexpression auf menschlichen primären AML-Zellen nachweisen können. Wir zeigen, dass beide Nachweismethoden in Verbindung mit anderen Antikörperfärbungen (z.B. Nachweis der CD34-Expression) eingesetzt werden können. Ähnliche Färbungen können auch an anderen primären Zelltypen und Zelllinien durchgeführt werden.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Fehlen von NKG2DL auf der Oberfläche von AML-Patientenblasten LSC14anreichern kann. Bei AML besitzen NKG2DL-negative, aber nicht NKG2DL-positive leukämische Subpopulationen klonogene und in vivo Leukämie-initiierende Kapazitäten. Zukünftige Forschungen werden zeigen, ob das Fehlen einer NKG2DL-Oberflächenexpression auch als Werkzeug zur Anreicherung von Stammzellen bei anderen Krebsarten verwendet werden kann.
Es wurde klassisch gezeigt, dass CD34 LSCs bei AML markiert, aber AML ist eine sehr heterogene Erkrankung und nicht alle AML-Patienten zeigen eine CD34-Expression (dh CD34-negative AML18). Wir haben bereits gezeigt, dass das Fehlen einer NKG2DL-Oberflächenexpression ein neuartiges Werkzeug zur Identifizierung von LSC in dieser Untergruppe der CD34-negativen AML bietet. Hier konzentrieren wir uns dagegen auf die Untergruppe der CD34-positiven AMLs und zeigen, dass unterschiedliche Subpopulationen auftreten können. Zukünftige Forschungen werden zeigen, ob die Co-Färbung von NKG2DL in Verbindung mit solchen anderen Markern (z. B. CD34) LSC effektiver anreichern kann.
In der Durchflusszytometrie ist es wichtig, angemessene Kontrollen wie FMO einzubeziehen, um dem Experimentator zu helfen, korrekt zwischen positiven und negativen Ereignissen zu unterscheiden. Darüber hinaus sind Positivkontrollen für jeden verwendeten Antikörper notwendig, um sicherzustellen, dass das Fehlen einer Färbung nicht auf einen fehlerhaften Antikörper zurückzuführen ist. Das hier vorstellente Protokoll verwendet nur eine begrenzte Anzahl von Oberflächenmarkern, die je nach Bedarf des Experimentators erweitert werden können, z.B. durch Zugabe von CD33 oder potentiellen LSC-Markern19. Darüber hinaus können die in diesem Protokoll verwendeten Fluorophore angepasst werden. Wichtig ist, dass solche Veränderungen von einer Antikörpertitration begleitet werden sollten, um die beste Verdünnung zu bestimmen.
Ein kritischer Schritt vor der Färbung ist das Auftauen der primären AML-Zellen. Tatsächlich werden solche Proben zusätzlich zu ihrer Zerbrechlichkeit in Dimethylsulfoxid (DMSO) konserviert, das per se für die Zellen toxisch ist. Daher sollten die Proben mit Vorsicht behandelt und gründlich gespült werden, um eine längere Exposition gegenüber DMSO zu vermeiden. Obwohl unsere Proben nach einem zuvor festgelegten Protokoll15verarbeitet und eingefroren wurden, ist es wichtig, die im Manuskript beschriebenen Schritte sorgfältig zu befolgen, um eine hohe Zellrückgewinnung zu gewährleisten. Die Arbeit mit frischen Proben gewährleistet eine verbesserte Lebensfähigkeit und wird daher empfohlen. In den meisten Fällen ist dies jedoch nicht praktikabel.
Ein weiterer Einflussfaktor auf die beschriebene Methode ist die probenspezifische Abweichung, die zu unterschiedlichen Zellstreuprofilen führen kann, die mittels Durchflusszytometrie beobachtet werden. Aufgrund der Krankheitsheterogenität ist dies unvermeidbar, sollte aber in der Analyse berücksichtigt werden. Zusätzliche Variabilität kann durch Einfrieren/Auftauen oder andere mechanische Schritte in der Probenverarbeitung eingeführt werden. Im Allgemeinen ist Schnelligkeit der Schlüssel, um den Zelltod zu vermeiden. Absterbnde Zellen und Trümmer können jedoch nicht vermieden werden und müssen bei der Analyse berücksichtigt und ausgeschlossen werden. Gating auf Basis von FSC/SSC sollte mit Gründlichkeit und kritischem Auge erfolgen, da es der erste Schritt der Probenanalyse ist.
Ein großer Vorteil des Fusionsproteins ist seine Potenz, alle bekannten und potenziell unbekannten NKG2DLs nachzuweisen, während spezifische Anti-NKG2DL-Antikörper (z. B. MICA, MICB) einen Selektionsbias einführen. Beide Methoden sind gleichermaßen durchführbar. Für die analysierte begrenzte Anzahl von Proben zeigten sie ebenfalls sehr vergleichbare Ergebnisse. Die Verwendung des NKG2D-Fusionsproteins hat einige wichtige Vorteile: Weniger zeitaufwendig, geringere Reagenzanzahl und Anzahl der Färbeproben sowie eine geringere Wahrscheinlichkeit menschlicher Fehler (d. H. Pipettierfehler). Darüber hinaus kann diese Methode auch effektiver bei der Erfassung der NKG2DL-Expression in einigen Proben sein, da sie auch die Expression unbekannter Proteine mit der NKG2DL-Funktion erfassen sollte, die in einigen AML-Fällen exprimiert werden kann. Diese Methode bietet zwar Einen Einblick in das Oberflächenvorhandensein von NKG2DL, liefert jedoch keine Informationen über die intrazellulären Konzentrationen von NKG2DL, deren Handel oder Regulierung, und andere Assays sollten daher durchgeführt werden, um weitere Erkenntnisse über solche Fragen zu gewinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Schweizerischen Nationalfonds (179239), der Stiftung zur Krebsbekämpfung (Zürich), der Wilhelm Sander Stiftung an CL (2019.042.1) und der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung an C.L. Darüber hinaus wurde dieses Projekt aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 765104 gefördert. Wir danken der Durchflusszytometrie-Anlage in Basel für die Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
