Summary
ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。
Abstract
同じ患者内で、NKG2Dリガンド(NKG2DL)表面発現の欠如は、同様の白血病特異的遺伝子変異を有するが疾患開始可能性を欠く、より分化された白血病細胞と幹細胞特性(いわゆる白血病幹細胞、LSC)を有する白血病亜集団を区別することが示された。NKG2DLは、生化学的に多様なMHCクラスI型自己分子です。恒常性状態の健康な細胞は、一般に、細胞表面上でNKG2DLを発現しない。その代わりに、これらのリガンドの発現は、細胞ストレス(例えば、発癌性転換または感染性刺激)への曝露時に誘導され、ナチュラルキラー(NK)細胞などのNKG2D受容体発現免疫細胞を介してライシスを介して損傷した細胞の排除を引き起こす。興味深いことに、NKG2DL表面発現はLSC亜集団において選択的に抑制され、これらの細胞はNKG2D媒介性免疫監視を回避することを可能にする。ここでは、がん細胞上でのNKG2DL表面発現の解析を可能にする2つの異なるフローサイトメトリー法、すなわち汎リガンド認識を含む方法、および単一リガンドに対する複数の抗体による染色を含む方法を並べて分析する。これらの方法は、NKG2DL陽性非LSCから推定癌幹細胞特性を有する生存可能なNKG2DL陰性細胞亜集団を分離するために使用することができる。
Introduction
NK細胞は、予め抗原刺激を伴わずに悪性細胞またはストレスを受けた健康な細胞(例えばウイルス感染によって)を認識・排除することができる自然免疫系の重要なエフェクターである。このプロセスは、天然細胞毒性受容体(NDR)、NKG2DおよびCD16などの活性化受容体の複雑なレパートリーと、主にキラー免疫グロブリン様受容体(KIRs)2によって表される阻害受容体を介して厳しく調節される。体細胞上のヒト白血球抗原(HLA)クラスI分子へのKIRsの結合は自己認識を保障し、NK細胞耐性を伝える。一方、自己認識の欠如および標的細胞上のそれらのリガンドへの活性化受容体の結合の増加は、NK細胞媒介細胞傷害性1につながる細胞傷害性顆粒の放出を引き起こす。最後に、NK細胞は、活性化受容体CD16をIg(FcR)2のFc部分を発現する標的に結合することにより、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を発揮することができる。直接的な細胞傷害性とは別に、NK細胞はまた、適応免疫系3と自然をつなぎサイトカイン放出を引き起こすことができる。
NKG2DはNK、NKT、γδT、およびナイーブCD8+T細胞4 上で発現される主要な活性化受容体であり、そのような細胞傷害性免疫細胞がNKG2Dリガンド(NKG2DL)を認識およびライゼすることを可能にする標的細胞である。健康な細胞は一般にNKG2DLを発現しない。代わりに、NKG2DL発現は悪性細胞またはウイルス感染細胞上でアップレギュレートされ、免疫クリアランス5に対してこれらを受け入れ可能にする。
ヒトNKG2DLファミリーは、2つのMHC I鎖関連分子AおよびB(MICAおよびMICB6)およびサイトメガロウイルスUL16結合タンパク質1~6(ULBP1-67)を含む8つの既知の分子から構成される。NKG2DLの発現は、転写、転写後、およびトランスレーショナル後レベル8で調節される。このように、NKG2DL発現は一般に健康な細胞の表面では検出できないが、NKG2DL mRNA9 および細胞内タンパク質発現は健康組織において報告された。このような式の機能的関連性と、このような不定式表現パターンの基礎となるメカニズムは、10に定義されたままである。
がん細胞におけるNKG2DL発現の機構調節は、魅力的な研究分野です。細胞ストレスのいずれかに関与することが知られている経路、例えば、熱ショックストレス経路9、または変異した運動失調性血管拡張症(ATM)およびRad3関連(ATR)経路11などのDNA損傷関連経路、ならびにウイルスまたは細菌感染がNKG2DL発現12の誘導に直接関連している。しかし、たとえNKG2DLの表面発現が効果的に誘導されたとしても、この発現は、タンパク質分解媒介性脱落を通じて再び失われ得る、一部の癌13における免疫脱出および悪い臨床予後に関連するメカニズムである。
細胞表面NKG2DLの不在は、AML患者において重要な役割を果たす可能性もある。ここで、集中的な化学療法による治療はしばしば寛解を誘発するが、再発はしばしば白血病幹細胞(LSC)から起こり、化学療法を選択的に生き残り、免疫応答を回避する。我々が最近示したように、LSCは、例えば、NKG2DL表面発現14を抑制することによってNK細胞のリシスを逃れる。
逆に、表面NKG2DL発現の欠如は、バルク対応白血病亜集団から細胞の推定茎様部分集団を同定し、生存可能に単離する方法として使用することができる。ここでは、NKG2DL表面発現を検出し、白血病および他の癌においてもNKG2DL陰性幹細胞を同定するために使用できる2つのフローサイトメトリックアプローチを提示する:汎リガンド表面認識のための方法および既知のNKG2DLタンパク質を認識する単一またはプール抗体による染色を含む方法。
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Protocol
患者サンプルは、バーゼル大学病院とテュービンゲン大学病院の倫理審査委員会の承認を受けて収集された。
1. NKG2D融合タンパク質のビオチン化
注: この手順は、製造元の指示に従って、ビオチン化キット( 資料表を参照)で実行されます。このプロトコルのステップは、染色の少なくとも24時間前に行わなければならない。ビオチン化されたNKG2D融合タンパク質は-20°Cで保存する必要があります。
- ビオチンとNKG2D融合タンパク質チューブ(RT)の両方を解凍する。
注:細胞がさらなる実験用(マウスでの注入、コロニー形成ユニットアッセイなど)のために無菌である必要がある場合は、混入を避けるために層流フードの下で融合タンパク質を再構成してください。それ以外の場合は、各ステップをベンチで実行できます。 - 50μgの凍結乾燥NKG2D融合タンパク質を素早くスピンダウンします。500 μL のリン酸緩衝生理食塩分 (PBS) を加え、粉末を再構成し、P1000 マイクロピペットを使用して十分に混合します。
- NKG2DL融合タンパク質100μLをビオチンチューブに加え、最終ストック濃度100μg/mLを得ます。
- P100マイクロピペットで連続再懸濁液を使用して溶液を完全に混合します。
- 24時間制御されたRTで融合タンパク質/ビオチン溶液をインキュベートする。融合タンパク質を使用する準備ができました。
2. 原発AML細胞の解凍
注:液体窒素に貯蔵された患者1人につき約5,000,000個の凍結白血病細胞を解凍し、すぐにアッセイに使用しました。白血病細胞を得て、前述の15のように凍結した。簡単に言えば、AMLおよび高い爆風細胞パーセント(単核細胞中の爆風の>90%)を有する患者から採取した末梢血試料を、単核細胞を得るために密度勾配分離で処理し、その後10%ジメチルスルホキシド溶液(DMSO)を含む胎児子牛血清(FCS)で凍結した。細胞数は、患者の白血球濃度に依存する患者間で非常に変化した(範囲:1,000,000〜30,000,000の白血病細胞/mL血液)。
- 水浴を用いて37°CでFCSの10%を含むプレウォームRPMI培地。AML細胞のバイアル(1mL FCS + 10%DMSO内の最大30,000,000個の細胞)に対して、15 mL反応チューブに10mLのプリウォーム培地を加えます。
- 液体窒素貯蔵から原発AMLを含む凍結を取り除き、37°Cの水浴を使用して細胞をすぐに解凍する。チューブを水の中でゆっくりと前後に動かし、小さな氷の結晶だけが残るまでバイアルの内容物を解凍させます。
- 解凍した細胞を培地含有チューブにすぐに移し、1mLの培地を使用してバイアルをすすいします。
- 細胞を10分間 300xg で遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。
- FCSの10%を含むRPMI培地の5mLで細胞を洗浄し、遠心分離機を 300xg で10分間洗浄します。
3. セルカウント
- FCSの10%を含むRPMI培地の既知の体積で細胞ペレットを再懸濁する。
- 細胞懸濁液の少量を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、生細胞/死細胞の識別を可能にするトリパンブルーまたは他の代替色素との既知の比率で希釈します。
- 任意のデバイスを使用してセルをカウントします。
- 細胞を10分間 300xg で遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。
4. ビオチン化NKG2D融合タンパク質を用いた原発AML細胞の染色
- 500 mL PBS に牛血清アルブミン(BSA)とエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)をそれぞれ0.07 mMと2 mMの最終濃度に補って、染色バッファーを調製します。必要に応じて pH (7.2 ~ 7.4) を調整します。
- 染色バッファーを含む細胞ペレットを、0.5 x 107 細胞 /mL の最終濃度まで再懸濁します。
注:必要に応じて、染色する前に、細胞をブロッキング剤(例えばhIgG(1μg/ml)を用いてRTまたはFcR遮断剤で30分間インキュベートすることができます。 - 細胞懸濁液100μLを細胞培養96ウェルU-底板に移し、プレートを 300xg で10分間遠心分離する。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
- ビオチン化されたNKG2D融合タンパク質のマスターミックスを準備し、細胞が井戸当たり50μLの最終体積で再懸濁し、井戸当たり10μg/mLの最終濃度になるようにします。
- ステップ4.4で作成したマスターミックスを100μLピペットで追加し、300μLのマルチチャンネルピペットでセルペレットを再中断します。
注:細胞の数に応じて最終体積を縮小し、染色に必要な融合タンパク質の量を減らします。 - 細胞懸濁液をRTで25分間、または4°Cで50分間インキュベートする。
- 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、1 ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
- プレートを 300xg で10分間遠心し、ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
- 手順 4.7 と 4.8 を繰り返します。
注:ここで説明する染色は、細胞培養96ウェルU-底板で行われます。そのため、洗浄工程は、このようなプレートの体積容量が小さいため2回行われる。染色は他のチューブでも行え、洗浄工程は、より大きな体積を使用して1回だけ行われる可能性があります。 - 細胞が50 μLの最終容積で再懸濁されるようにストレプトアビジン-PE( 希釈については表1 を参照)を使用してマスターミックスを準備します。
注:CD33、CD34..など、関心のある細胞タイプの選択抗体を追加します。AML の場合。 - ステップ4.10で作成したマスターミックスを100μLピペットで追加し、300μLマルチチャンネルピペットでセルペレットを再中断します。
- 細胞懸濁液をRTで15分間、暗で4°Cで30分間インキュベートします。
- 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、1 ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
- プレートを 300xg で10分間遠心し、ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
- ステップ 4.13 と 4.14 を繰り返します。
- 7-AAD(7-アミノアクチノマイシンD、1:1000)または生細胞と死細胞を区別するために任意の試薬を含む染色バッファーの溶液を準備します。
- 300 μL マルチチャネルマイクロピペットを使用したステップ 4.16 で 200 μL 染色バッファー + 7-AAD で細胞ペレットを再懸濁します。
- フローサイトメトリー装置を用いて細胞を解析する。
5. 単一またはプールされた単一抗NKG2DL抗体の染色
- ステップ 4.2 と同じセル懸濁液を使用します。
- 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して細胞培養 96 ウェル U-底板に細胞懸濁液100 μL を移し、プレートを 300 x g で 10 分間遠心分離します。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
- 各一次抗体またはプールされた抗体(希釈については 表2 を参照)に対して抗体マスターミックスを調製し、細胞を50μLの最終体積で再懸濁させます。
- ステップ5.3で作成したマスターミックスを100μLピペットで追加し、300μLマルチチャンネルピペットでセルペレットを再中断します。
- RTで25分間細胞をインキュベートする。
- 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
- 遠心分離細胞培養96ウェルUボトムプレートを 300xg で10分間、ペレットを乱すことなく上清を捨てる。
- ステップ 5.6 と 5.7 を繰り返します。
- 細胞がウェルあたり50μLの最終体積で再懸濁されるように、二次抗体(希釈については 表2 を参照)を加えて抗体マスターミックスを調製します。
- ステップ5.9で作成したマスターミックスを100 μLピペットで追加し、300 μLマルチチャンネルピペットでセルペレットを再サスペンドします。
- RTで15分間、暗闇の中で4°Cで30分間インキュベートします。
- 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、1 ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて洗浄します。
- 細胞懸濁液を10分間 300xg で遠心し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。
- ステップ 5.12 と 5.13 を繰り返します。
- ステップ4.16で調製した7-AADを含む200μL染色バッファー内の細胞ペレットを再懸濁する。
- ステップ6で説明したようにフローサイトメトリー装置を用いて細胞を解析する。
6. データ取得
注:レーザーが正常に機能していることを確認するために、フローサイトメーターの毎週の品質管理が行われていることを確認してください。ここで紹介するプロトコルでは、週に一度のサイトメーターとトラッキング(CTS)プロセスを相対的なビーズで行い、すべてのチャンネルでレーザー性能をチェックします。CTSの後、内部制御として8ピークビーズを使用して10,000のイベントが記録されます。すべてのピークは、ゲート内の同じ位置にあり、互いに十分に分離されている必要があります。
- ビーズまたはセル16を使用して検出器間のスペクトルの重複を減算するマトリックス補正を作成します。
- 染色されていない細胞と単一の染色されたビーズに対して10,000件のイベントを記録します。蛍光マイナス1(FMO)コントロールの場合、50,000のイベントを記録し、完全染色されたサンプルは最大100,000のイベントを記録します。
注: または、単一の染色サンプルをセルに対して実行することもできます。その場合は、目的のマーカーに対してセルに正のシグナルがあることを確認します。 - 実験で使用したフルオロフォアごとに、単一の染色された細胞またはビーズサンプルを取得し、スペクトルの重なりの量を明らかにする。フローサイトメトリーデバイスの補償作成者を使用して、こぼれ過ぎ値を計算し、測定されたすべてのサンプルに補償マトリックスを適用します。
注: 二次抗体は、報酬がビーズで計算される場合、ビーズを使用して補償を作成するために使用することはできません。補償ビーズの種類によっては、二次抗体をビーズによる補償に使用することはできません。 - FMOコントロールおよび融合タンパク質を含む完全な染色サンプルについては、まず、前方散乱(FSC)および側面散乱(SSC)に基づいて細胞を選択する。ダブレットを除外した後、7-AAD(PercP-Cy5.5)シグナルの否定性に基づいて細胞をゲートし、死んだ細胞を除外します(ステップ5.15を参照)。最終プロットは、生きているシングルに対するCD34(Y軸)とNKG2DL(X軸)の表現を示しています。
- 単一の抗NKG2DL抗体の場合、サンプルに同じ戦略を適用しますが、リガンド陽性はPEチャネルではなくAlexa Fluor 488にあることに注意してください。
- この実験に対して実行する適切な FMO 制御については、ステップ 6.4 および 6.5 のゲーティングストラテジーの FMO 制御に従ってゲートを調整します( 表 3を参照)。完全に染色されたサンプルを記録している間、以前に作成されたゲートの上のセルは、解析されたマーカーに対して正の値になります。
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Representative Results
ここで提示されるプロトコルは両方とも、パンリガンド認識を利用するか、個々のリガンドに対してプールされた抗体で染色することによってNKG2DL表面発現と組み合わせて、LSC17の既知のマーカーであるCD34を使用したフローサイトメトリック分析によるAML LSCの濃縮を可能にする。図1では、分析されたAMLサンプルがCD34およびNKG2DLに対して正であるが、負の亜集団も存在することを示し、これは合計で4つの異なる集団の存在によって示されている。我々のデータは、FSCおよびSSCを介した細胞の主な集団の選択から始まる、このような染色のための典型的な格言戦略を示している。ダウンストリーム解析では、ダブレットとデッドセルは除外されます (図 1A)。ゲートは、正の細胞を正しく識別するために FMO コントロールを使用して調整されます (図 1B)。
図1Cでは、CD34(APC、Y軸)対NKG2DL(PE、X軸)に対して陽性細胞の蛍光強度を強調しています。CD34に陽性であるAML細胞は、NKG2DL(図1C)の低表面発現を示し、これは我々の研究室からの以前の知見と一致しており、NKG2DL発現がステムの欠如に関連していることを示す14。
図2 は、両方のNKG2DL染色方法の堅牢性を示しています。 図2Aでは、3つの主要なAMLサンプルを並べて19.8を示し、 49.8、および89.4%は、それぞれ、プールされた抗NKG2DL抗体染色(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2/5/6、およびULBP3に対するプール抗体)に対する20.4、50.4、および90.6%に対する融合タンパク質染色に対する陽性事象のそれぞれである。一方、単一のリガンド(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2/5/6、またはULBP3のいずれかに対して)染色は、92%までの陽性事象の範囲を示す(図2B)。この割合は、リガンド自体および患者、例えばULBP3(図2B)によって異なる。なお、1つのセルは複数のNKG2DLを表現できる。
複数の抗NKG2DL抗体をプールして1つのチューブに結合すると、陽性細胞の割合は融合タンパク質の割合に匹敵する(図2A)。したがって、両方のプロトコルがうまく機能し、プライマリAML細胞上のNKG2DL発現に関して同様の結果を提供する可能性があります。いくつかのAMLでは、融合タンパク質法は、さらにNKG2DLタンパク質の認識を可能にすることができるので、より高い感度を可能にする可能性がある。
図1:一次AMLサンプルの典型的な格言戦略。(A) セルは、サイズ(X軸)と複雑さ(粒度、Y軸など)に基づいて最初にゲートされます。次に、前方散布の領域に対して高さまたは幅をプロットすることで、Doublets が除外されます。最後に、生細胞は、7AAD(PerCP-Cy5.5、Y軸)のそれらの否定性に対するサイズ(X軸)に基づいて選択されます。(B) FMO コントロールは、示されたマーカーの正と負の母集団を区別するためにゲートを設定するために使用されます。この格言戦略は 、図 1Aに示されているように同じままです。(C) CD34 (APC, Y 軸) 対 NKG2DL (PE または AlexaFluor488, X 軸) の正と負のイベントを示すフローサイトメトリープロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:染色プロトコルの比較(A)ゲートされた単一の生細胞からプールされた抗NKGD2L抗体(n=3 AMLサンプル)に対する融合タンパク質の陽性事象の割合を示す棒グラフ。(B)既知のすべての抗NKG2DL抗体およびプールされた単一リガンドの単一リガンド染色に対する単一リガンド染色に対する陽性事象の割合を示す棒グラフ(詳細な抗体情報については、材料表を参照)。単一の生細胞に対して再度行われた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| チューブ名 | 抗原 | フルオロフォア | 希釈/濃縮 |
| 染色されていない細胞 | - | - | - |
| 単染色 PE |
NKG2D-融合タンパク質 | PE | 1:10 プライマリステップの場合 1:100 (セカンダリステップの場合) |
| 単染色 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| 単染色 APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| 完全な染色された細胞 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-融合タンパク質 | PE | 1:10 プライマリステップの場合 1:100 (セカンダリステップの場合) | |
| ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 |
表1:NKG2D融合タンパク質を用いてサンプルを染色するのに必要なチューブ。 次の表は、実験を設定するために必要なチューブを示しています。
| チューブ名 | 抗原 | フルオロフォア | 希釈/濃縮 |
| 染色されていない細胞 | - | - | - |
| 単染色 アレクサ・フルーオール 488 |
ウルBP-1 | アレクサ・フルーオール 488 | 10 μg/mL (一次ステップ用) 2次ステップの場合は4 μg/ml |
| ウルBP-2/5/6 | |||
| ウルPB-3 | |||
| 雲母 | |||
| マイクブ | |||
| 単染色 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| 単染色 APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| 完全な染色された細胞 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | アレクサ・フルーオール 488 | 10 μg/mL (一次ステップ用) 2次ステップの場合は4 μg/ml |
|
| ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 |
表2:抗NKG2DL抗体でサンプルを染色するのに必要なチューブ。 次の表は、実験を設定するために必要なチューブを示しています。
| チューブ名 | 抗原 | フルオロフォア | 希釈/濃縮 |
| 染色されていない細胞 | - | - | - |
| FMO_APC | ウルBP-1 | アレクサ・フルーオール 488 | 10 μg/mL (一次ステップ用) 2次ステップの場合は4 μg/mL |
| ウルBP-2/5/6 | |||
| ウルPB-3 | |||
| 雲母 | |||
| マイクブ | |||
| NKG2D-融合タンパク質 | PE | 1:10 (プライマリステップ) 2 次ステップの場合は 1:100 |
|
| ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ウルBP-1 | アレクサ・フルーオール 488 | 10 μg/mL (一次ステップ用) 2次ステップの場合は4 μg/mL |
|
| ウルBP-2/5/6 | |||
| ウルPB-3 | |||
| 雲母 | |||
| マイクブ | |||
| ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexaフルーター 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-融合タンパク質 | PE | 1:10 (プライマリステップ) 2 次ステップの場合は 1:100 |
|
| ライブ/デッド | 7AAD (パーCP-Cy5.5) |
1:1000 |
表3:必須のコントロールを設定するために必要なチューブ。 この表は、適切なFMO、一次および二次抗体制御を設定するために必要なチューブを示しています。有効な結果と解釈可能なデータを得るには、実験者が必要とするすべてのコントロール (FMO) を追加する必要があります。
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Discussion
ここでは、ヒトの原生AML細胞上でNKG2DL表面発現を検出できる2つのフローサイトメトリック法を紹介する。我々は、両方の検出方法が他の抗体染色(例えば、CD34発現を検出する)と組み合わせて使用できることを示す。同様の染色は、他の一次細胞型および細胞株にも行うことができる。
我々は最近、AML患者の爆風の表面にNKG2DLの不在がLSC14を豊かにすることができることを示した。AMLでは、NKG2DL陰性であるがNKG2DL陽性白血病亜集団は、クロノゲン性および インビボ 白血病を起こす能力を有する。今後の研究では、NKG2DL表面発現の欠如が他のがんタイプの幹細胞を豊かにするツールとしても使用できるかどうかを示す。
CD34はAMLでLSCをマークするために古典的に示されているが、AMLは非常に異種性疾患であり、すべてのAML患者がCD34発現を示すわけではない(すなわち、CD34陰性AML18)。以前は、NKG2DL表面発現の欠如は、CD34陰性AMLのこのサブグループ内のLSCを同定するための新しいツールを提供することを示した。ここでは、対照的に、CD34陽性のAMLsのサブグループに焦点を当て、異なる亜集団が発生する可能性があることを示しています。今後の研究では、このような他のマーカー(例えば、CD34)と組み合わせてNKG2DLの共同染色がより効果的にLSCを豊かにすることができるかどうかを示す。
フローサイトメトリーでは、実験者が正と負の事象を正しく区別するのに役立つFMOなどの適切な制御を含める必要があります。また、使用される抗体の陽性制御は、染色の欠如が誤動作抗体によるものではないことを確認するために必要です。ここで提示するプロトコルは限られた数の表面マーカーのみを使用し、例えばCD33または潜在的なLSCマーカー19を添加することによって、実験者の必要性に応じて拡張することができる。さらに、このプロトコルで使用される蛍光色素を適応させることができる。重要なことに、このような変化は、最良の希釈を決定するために抗体滴定を伴うべきである。
染色前の重要なステップの1つは、原発性AML細胞の解凍である。実際、それらの脆弱性に加えて、そのようなサンプルはジメチルスルホキシド(DMSO)で保存され、これは細胞に対して毒性があります。したがって、サンプルは注意して取り扱う必要があり、DMSOへの長時間の暴露を避けるために十分に洗いすが必要です。我々のサンプルは、以前に確立されたプロトコル15に従って処理され凍結されたが、高い細胞回復を確実にするために、原稿に記載されている手順に注意深く従うことが重要である。新鮮なサンプルを使用することで、実行可能性が向上し、推奨されます。しかし、ほとんどの場合、これは実用的ではありません。
記載された方法に影響を与えるもう一つの要因は、フローサイトメトリーを介して観察される異なる細胞散乱プロファイルをもたらす可能性のあるサンプル特異的偏差である。疾患の異質性のために、これは避けられないが、分析で考慮されるべきです。サンプル処理における凍結/解凍またはその他の機械的なステップによって、追加のばらつきが導入される可能性があります。一般に、細胞死を避けるためには、迅速性が鍵となります。しかし、死にかけている細胞や破片は避けられず、分析で考慮され、除外する必要があります。FSC/SSCに基づく格紙は、サンプル分析の第一歩であるため、徹底し、批判的な目で行う必要があります。
融合タンパク質の主な利点の1つは、既知および潜在的に未知のNKG2DLをすべて検出する効力であり、特定の抗NKG2DL抗体(例えば、MICA、MICB)は選択バイアスを導入する。どちらの方法も同様に実現可能です。分析された限られた数のサンプルについては、非常に同等の結果も示しました。NKG2D融合タンパク質を使用すると、時間のかかる時間が減り、試薬数が減少し、染色サンプルの数が減少し、人間のミス(すなわちピペットミス)の可能性が低いという大きな利点があります。さらに、この方法は、いくつかのAMLの場合に発現され得るNKG2DL機能を有する未知のタンパク質の発現を捕捉する必要があるため、一部のサンプルでNKG2DL発現を捕捉する上でより効果的である可能性がある。NKG2DLの表面存在に関する洞察を提供する一方で、これらの方法は、NKG2DLの細胞内レベル、それらの人身売買または規制に関する情報を提供しないため、そのような質問に関するさらなる知識を得るために実行されるべきである。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、スイス国立科学財団(179239)、がんとの闘いのための財団(チューリッヒ)、ウィルヘルム・サンダー財団からCL(2019.042.1)、ノバルティス医学生物学研究財団からの助成金によって支援されました。さらに、このプロジェクトは、マリー・スクウォドフスカ・キュリー交付金第765104の下で、欧州連合のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。バーゼルのフローサイトメトリー施設にサポートを感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
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