Summary
Miljømæssige DNA-analyser kræver streng design, test, optimering og validering, før indsamlingen af feltdata kan begynde. Her præsenterer vi en protokol til at tage brugerne gennem hvert trin i udformningen af en artsspecifik, sonde-baseret qPCR analyse for påvisning og kvantificering af et mål arter DNA fra miljøprøver.
Abstract
Der er ved at blive udviklet nye, ikke-invasive metoder til påvisning og overvågning af artstilstedeværelsen for at støtte fiskeri og forvaltning af vilde dyr og planter. Brugen af miljø-DNA (eDNA) prøver til påvisning af makrobiota er en sådan gruppe af metoder, der hurtigt bliver populære og gennemføres i nationale ledelsesprogrammer. Her fokuserer vi på udvikling af artsspecifikke målrettede analyser til sondebaserede kvantitative PCR -applikationer (qPCR). Brug af sonde-baseret qPCR tilbyder større specificitet end det er muligt med primere alene. Desuden kan evnen til at kvantificere mængden af DNA i en prøve være nyttig i vores forståelse af eDNA's økologi og fortolkningen af eDNA-detektionsmønstre i marken. Der er behov for omhyggelig overvejelse i forbindelse med udvikling og afprøvning af disse analyseforanstaltninger for at sikre følsomheden og specificiteten af påvisning af målarten fra en miljøprøve. I denne protokol vil vi afgrænse de trin, der er nødvendige for at designe og teste sondebaserede assays til påvisning af en målart; herunder oprettelse af sekvensdatabaser, analysedesign, analysevalg og -optimering, testanalyseydelse og feltvalidering. Efter disse trin vil bidrage til at opnå en effektiv, følsom og specifik analyse, der kan bruges med tillid. Vi demonstrerer denne proces med vores analyse designet til populationer af mucket (Actinonaias ligamentina), en ferskvand musling arter findes i Clinch River, USA.
Introduction
Forskere og ledere bliver i stigende grad interesseret i brugen af miljømæssige DNA-analyse for artsdetektion. I tre årtier har kvantitativ eller realtid PCR (qPCR/rtPCR) været anvendt på en lang række områder til sekvensspecifik påvisning og kvantificering af nukleinsyrer1,2. Inden for det relativt nye område af eDNA forskning, brug af disse assays med en standard kurve for kvantificering af kopier af målet DNA per volumen eller vægt af eDNA prøve er nu blevet rutinemæssig praksis. Mitokondrie-DNA-sekvenser er generelt målrettet i eDNA-assays, fordi mitokondriegenomet er til stede i tusinder af kopier pr. celle, men assays for nukleare DNA- eller RNA-sekvenser er også mulige. Det er vigtigt at forstå, at offentliggjorte assays for eDNA prøver ikke altid er lige i ydeevne. En analyses pålidelighed ved kun at påvise DNA fra en målart (dvs. specificitet) og påvisning af lave mængder mål-DNA (dvs. følsomhed) kan variere betydeligt på grund af forskelle i, hvordan analysen blev designet, udvalgt, optimeret og testet. Rapportering kvantitative målinger af analysen resultater er tidligere stort set overset, men for nylig standarder for at forbedre gennemsigtigheden i analysen udvikling er ved at opstå3,4,5,6,7,8.
Optimering og rapportering af analyseydelseshjælpemidler i studiedesign og fortolkning af eDNA-undersøgelsesresultater. Assays, der krydsreagerer med ikke-målarter DNA kan føre til falske positive påvisninger, mens assays med dårlig følsomhed kan undlade at opdage målarterNE DNA, selv når det er til stede i prøven (falske negativer). En forståelse af analysens følsomhed og selektivitet vil bidrage til at informere om den prøveudtagningsindsats, der er nødvendig for at påvise sjældne arter. Fordi der er mange naturlige kilder til variation i eDNA, skal undersøgelser begrænse kontrollerbare kilder til variation så meget som muligt, herunder fuldt optimere og karakterisere eDNA assay3.
Betingelser, der direkte påvirker en analyse's specificitet eller følsomhed vil ændre analysens ydeevne. Dette kan ske under forskellige laboratorieforhold (dvs. forskellige reagenser, brugere, maskiner osv.). Derfor bør denne protokol revideres, når der anvendes en analyse under nye forhold. Selv assays, der er godt karakteriseret i litteraturen, skal testes og optimeres, når de vedtages af et nyt laboratorium, eller når der anvendes forskellige reagenser (f.eks. master-mix-opløsning)5,9. Assay specificitet kan ændre sig, når de anvendes til et andet geografisk område, fordi analysen anvendes på prøver fra et nyt biotisk samfund, der kan omfatte ikke-målarter, at analysen ikke er blevet testet mod, og genetisk variation i målarter kan forekomme. Igen bør analysen revurderes, når den bruges på et nyt sted. Feltforholdene adskiller sig fra laboratorieforholdene, fordi der i marken er større sandsynlighed for, at PCR-hæmmere er til stede i prøverne. PCR-hæmmere påvirker direkte forstærkningsreaktionen og påvirker dermed analysens ydeevne. Af denne grund kræves en intern positiv kontrol, når du udvikler en eDNA-analyse.
Endelig kan miljøforholdene i marken påvirke målartens DNA-molekyler og deres indfangning gennem DNA-nedbrydning, transport og fastholdelse. Desuden varierer forskellige protokoller for DNA-indsamling og -ekstraktion i deres effektivitet og evne til at bevare DNA. Det er dog vigtigt at bemærke, at disse processer påvirker detekterbarheden af eDNA, men ikke en molekylær analyses ydeevne. Detekterbarheden af DNA fra målarten i feltprøver er således en funktion af både qPCR-analysens tekniske ydeevne samt feltbetingelser og indsamlings-, opbevarings- og ekstraktionsprotokoller. Når du bruger en velkaraktersk og højtydende analyse, kan brugerne føle sig trygge ved analysens evner; gør det muligt for forskere nu at fokusere på at forstå de eksterne analysefaktorer (dvs. miljøvariabler, forskelle i fangst- eller ekstraktionsprotokoller), der påvirker eDNA-detektion.
Her fokuserer vi specifikt på analyseteknisk ydeevne gennem stringent design og optimering. Vi demonstrerer protokollen ved hjælp af en sonde-baseret analyse udviklet til påvisning af en ferskvandsmusling, mucket (Actinonaias ligamentina), fra vand udtaget i Clinch-floden, USA. For nylig fremlagde Thalinger et al. (2020) retningslinjer for validering af målrettede eDNA-assays. Assay design efter vores protokol vil bringe en analyse til Thalinger et al.'s niveau 4 plus et ekstra skridt i retning af niveau 56. På dette tidspunkt en analyse tekniske ydeevne vil blive optimeret, og det vil være klar til regelmæssig brug i laboratorium og felt applikationer. Yderligere brug af analysen i laboratoriet, mesocosm og feltforsøg kan derefter behandle spørgsmål vedrørende eDNA-detektion og faktorer, der påvirker detektering, de sidste trin for niveau5-validering 6.
Protocol
1. Generering af en sekvensdatabase over mitokondrie-DNA-sekvenser fra målarter og ikke-målarter af interesse
- Definer det spørgsmål, de mål og det system, der behandles. Identificer målarten for eDNA-detektion. Identificer det geografiske system, hvor analysen vil blive brugt. Lav en liste over arter af interesse, herunder målarter, sympatriske (co-forekommende) arter inden for samme taxa (normalt orden eller familieniveau), og nært beslægtede allopatric arter, dem, der måske ikke er i samme geografiske placering som målet (Figur 1).
BEMÆRK: Her blev clinch-flodpopulationerne af arten A. ligamentina målrettet. - Søg og download sekvenser fra flere genområder efter arter på listen fra trin 1. Sekvensdatabaser som NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) og DDBJ (DNA Data Bank of Japan) kan bruges. NCBI, EMBL og DDBJ deler alle sekvensoplysninger.
- Ved hjælp af NCBI's Nukleotiddatabase skal du søge efter målorganismen (f.eks. Actinonaias ligamentina)og genregion (f.eks. cytochrom c oxidase I (COI) eller NADH-dehydrogenase 1 (ND1); Eksempel søgestreng: Actinonaias ligamentina OG ND1)
- Vælg derefter alle sekvenser, der svarer til specifikationerne, og vælg Send til. Vælg Komplet post, Fil og hentningsformat som enten GenBank eller FASTA , og opret derefter Filer. Disse sekvenser gemmes nu på computeren.
- Gentag disse trin for alle de arter på listen, der er defineret i trin 1. Hold sekvenser for hvert genområde i en separat fil, da disse analyseres separat.
- Download alle relevante sekvenser (eller en stor, repræsentativ andel af sekvenser) for målarten, der er identificeret i trin 1. Medtag geografiske varianter, hvis det er muligt.
- Gentag søge- og downloadsekvenserne for beslægtede og sympatriske ikke-målarter af samme taksonomiske gruppe, som blev identificeret i trin 1 (f.eks. hvis målarten er mucket (A. ligamentina) downloadsekvenser for alle andre ferskvandsmuslingearter i Family Unionidae, der forekommer i det pågældende system).
- Gentag søgningen og download efter nært beslægtede, men allopatric (geografisk adskilte) arter, der er opført i trin 1.1.
BEMÆRK: Ikke alle arter (mål og ikke-mål) vil være tilgængelige i de offentlige databaser. Øg den lokale referencedatabase ved at forstærke og sekventere taksonomisk verificerede eksemplarer af arter af interesse internt. Hvis du arbejder med en art, der har høj indenarts genetisk mangfoldighed eller arbejder i et geografisk stort område, hvor geografiske varianter kan forventes, skal du samle sekvenser fra hele området.
2. Assay design
- Juster sekvenser fra hver genregion separat ved hjælp af justeringssoftware, der kan findes i forskellige genetiske sekvensredigerings- og bioinformatikprogrammer. Gør denne tilpasning for hver af de forskellige genregioner.
- For eksempel importerer brugen af Geneious Prime-software (https://www.geneious.com) de downloadede sekvensfiler til programmet.
- Opret separate mapper for hvert genområde.
- Vælg alle sekvenser i en mappe, der indeholder sekvenser fra ét genområde.
- Brug værktøjet Flere justeringer til at oprette en nukleotidjustering af de markerede sekvenser. Der kan være flere muligheder for den type tilpasning, ved hjælp af Geneious eller MUSCLE justeringer og standard parametre fungerer godt.
- Vælg lovende områder til analysedesign gennem visualisering af justerede sekvensdata. En region, der har mange sekvensdata til rådighed for de pågældende arter, er meget forskellig fra art til art og udviser lav variation inden for arterne, er en god kandidat. Dette vil øge sandsynligheden for, at primere og sonder designet vil være i stand til at diskriminere målet fra ikke-målarter, samtidig med at intraspecifikke varianter vil forstærke med analysen.
- Design af analyse primere og sonde.
- Brug qPCR assay design software og følg instruktionerne. IDT's PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) til at designe 5 sæt qPCR-assays blev brugt her.
- Indsæt den sekvens, der blev valgt i trin 2.2, i indtastningsfeltet Sekvens. Hvis justeringen skabte mellemrum, skal du slette dem fra sekvensen.
- Vælg qPCR 2 Primere + Probe i indstillingen Vælg dit design.
- Download de anbefalede assays.
- Kopier sekvenserne fra den forreste primer i den første analyse, og søg efter denne primersekvens i den justering, der blev oprettet i trin 2.1.4. Hvis du bruger Geneious Prime, skal du bruge annotate- og forudsigelsesværktøjet til at føje primerområdet til justeringen. Gør dette for alle primer- og sondekombinationer(figur 2).
- Undersøg disse regioner for at tilpasse sig variationen inden for målarten såvel som inden for de samforekomne arter.
- Hvis der er intraspecifik genetisk variation, skal du søge efter assays, hvor primere og sonde ikke falder inden for disse regioner.
- For at forhindre forstærkning af ikke-målarter skal der søges efter uoverensstemmelser med ikke-målarter. Vælg assays med de mest uoverensstemmelser for yderligere validering. Currier et al. (2018) foreslår at vælge sæt med mindst to af de tre regioner (de to primere, eller en primer og en sonde), der har mindst to uoverensstemmelser med alle de ikke-målarter. Husk dog, at uoverensstemmelser ved sonden bidrager mindre til specificitet10.
BEMÆRK: Forskelle inden for 3 basispar i 3' slutningen af hver primer øger specificiteten bedre end forskellene i 5' slutningen af primerne10.
- Overvej følgende vigtige parametre i analysedesign.
- Bestem primernes og sondens smelte- og udglødningstemperaturer. Ideelt set bør smeltetemperaturen (Tm) for primere være mellem 60-64 °C og inden for 2 °C fra hinanden, og sondens Tm skal være 6-8 grader højere end primernes Tm. QPCR-reaktionens udglødningstemperatur (Ta) indstilles til 5 °C under smeltetemperaturen, ca. 55-60 °C11.
- Undersøg GC-indholdet. Vælg mellem 35 – 65 % GC-indhold, og undgå områder med 4 eller flere på hinanden følgende G'er. At have 1 eller 2 Gs eller Cs i de 5 sidste baser i 3 'slutningen af primeren (GC klemme) kan øge specificiteten, da det ville hjælpe primeren til at gøre en stærkere obligation12.
- Søg efter hårnåle- og dimerstrukturer. Test primere og sonde for forudsagte hårnål strukturer og dimers ved hjælp af en oligonukleotid analysere program (f.eks OligoAnalyzer-IDT13; OligoCalculator14). Disse strukturer kan forårsage ikke-mål forstærkning og lavere effektivitet. Undgå assays, som forventes at danne disse strukturer.
- Bestem primerlængden. Sigt efter primere mellem 18-25 baser i længde og sondelængde mellem 20 -25 baser. Længere primere og sonder kan have lavere forstærkning effektivitet.
- Bestem ampliconlængden. Det skal være mellem ca. 100 og 250 basepar. Dette interval er generelt kort nok til høj PCR effektivitet, men længe nok til at lette kontrollen af Sanger sekventering4,15.
- Design sonder. Sørg for, at sonderne ikke har en G-base i 5's ende, da det kan dæmpe signalet fra grønne og gule farvestoffer11. Vi designede dobbeltslukkede sonder med IDT 3IABkFQ og ZEN-quenchers og FAM eller HEX fluorophorer.
BEMÆRK: Bestem MGB sonder: TaqMan MGB (mindre groove bindemiddel) sonder bruges ofte til eDNA undersøgelser. Men fordi disse sonder er meget korte, kan de binde sig til ikke-mål, selv med en 2 eller 3 base par mismatch10. - Bestem sonden Tm. Sondens smeltetemperatur skal være 6-8°C højere end primerne. Lavere temperaturer reducerer sondens bindende succes.
- Bestem sondens længde og placering. Sonden skal være mellem 20 og 25 bp i længden og ideelt placeret tæt på primerbindingsstedet på samme streng uden at overlappe den.
3. Assay screening og optimering
- I silico assay udvikling og test. Før du bestiller primer-probe sæt, vurdere specificitet (potentielle ikke-mål forstærkning) ved at teste primer forstærkning i silico.
- Test primere gennem NCBI's Primer-Blast16 eller lignende programmer, der kan identificere potentielle ikke-mål i NCBI nt / nr database, der kan forstærke med analysen. Hvis du bruger Primer-Blast indsætte primere på Brug min egen primer boks under Primer parametre. I indstillingerne For kontrol af primerparrets specificitetstjekning skal du vælge nr. som database og skrive rækkefølgen af den pågældende organisme (f.eks. "Unionida" eller "Unionoida") i organismeboksen.
- Fortsæt med at vurdere primer/probe sæt visuelt på justerede sekvensdata.
- For at vurdere primere og sonder på samme tid i silico, skal du oprette en tekststreng af den forreste primer, 12 N'er, sonden, 12 N'er og det omvendte supplement til den omvendte primer. Hvis sondesekvensen er inden for 12 basispar af en af primerne, skal du bruge antallet af N'er, der svarer til antallet af basispar mellem primeren og sonden.
- Brug NCBI's Nukleotide Blast-søgning (Blastn) til at søge i nr.database17. Brug fanen Taksonomi til at søge efter arter, der ikke er målarter, med få uoverensstemmelser. disse bør testes i laboratoriet under analyseoptimering.
BEMÆRK: I silico test hjælper udelukke ikke-specifikke assays, men potentielt specifikke assays skal testes empirisk (in vitro), da ikke alle arter har sekvenser i de genetiske databaser og primer og sonder kan stadig binde sig til ikke-mål, selv om det anses for usandsynligt af softwaren.
- Vælg tre til fem primer/sondekombinationer, der skal testes i laboratoriet.
- Bestil primere, sonder og en syntetisk DNA-standard samt yderligere M13-tailed primere til amplicon sekventering.
- Bestil syntetiske oligonukleotid primere og sonder fra et firma, der gør oligoer. Sonder er mærket med et fluorescerende farvestof og en quencher. Der bør vælges forskellige fluorophorer til assays, der skal multixes. Tjek dit qPCR-instrument for at se en liste over, hvilke fluorophores instrumentet kan registrere.
- Design og bestil M13-tailed primere til verifikation af qPCR-detektioner med Sanger-sekventering ved at tilføje M13 Forward (-20) sekvensen GTA AAA CGA CGG CCA GT, til 5 ' slutningen af den forreste primer og M13 Reverse (-27) sekvensen, CAG GAA ACA GCT ATG AC, til 5 ' slutningen af den omvendte primer.
- Den syntetiske DNA-standard indeholder målsekvensen (herunder primerregionerne) i en kendt koncentration i kopier/μL. Kvantificere ukendte prøver baseret på en kurve lavet af kendte koncentrationer af denne standard (dvs. standardkurven). Erhverve den syntetiske standard fra det samme firma, der fremstiller primere og sonde. Følg producentens anbefalinger for genbrug og opbevaring. Fortynd standarder i TE-buffer med en tRNA-holder, der bruger plastartikler med lav tilbageholdelse til at reducere hydrolyse og binding til overflader.
BEMÆRK: Hvis standardkurven ikke fungerer godt (dårlig PCR-effektivitet, se trin 3.4.2), kan du prøve at suspendere standarden igen i vand eller Tris-HCl. - Ophæng primere og sonder i nuklease frit vand, Tris-HCl eller TE buffer ved bekvemme koncentrationer til analysebrug. Generelt fortyndes arbejdslagre 20 gange i masterblandingen for at opnå den optimerede endelige analysekoncentration. Opbevar ophængte oligoer ved konstant -20 °C, når de ikke er i brug.
- In vitro (i laboratoriet) analyseoptimering og testning. Afvis assays, der har dårlig effektivitet, krydsreagerer med samforekomne arter eller har dårlig følsomhed18. Medtag brugen af en intern positiv kontrol (IPC) under analyseudvikling samt ved kørsel af faktiske prøver.
- Først skal du finde de optimale temperatur- og primer/sondekoncentrationsværdier for analysen. Når disse parametre er optimeret til PCR-effektivitet (trin 3.4.2), krydsreaktivitet (trin 3.4.3) og følsomhed (trin 3.4.4), skal du fortsætte med at teste analysen med en multiplekseret IPC (trin 3.4.5).
- Test optimal udglødningstemperatur (Ta) for primer og sonder ved hjælp af en PCR-temperaturgradient centreret 5 ° C under den forventede gennemsnitlige primer Tm.
- Test optimale primer- og sondekoncentrationer. Typisk testes 200 nM,400 nM og 800 nM primerkoncentrationer og 75 nM, 125 nM og 200 nM sondekoncentrationer.
- Opret en standardkurve, og bestem effektivitet og lineært område. Mindst seks 10-dobbelte fortyndinger af en syntetisk DNA-standard, der indeholder målsekvensen, testes med ca.10 0 kopier/reaktion på 105 kopier/reaktion (Figur 3A).
- Brug qPCR-softwaren til at afbilde Cq-værdien (tærskel for cyklus ved kvantificering) af hver standard på y-aksen og logbasen 10 af den oprindelige standardkoncentration i kopier/reaktion på x-aksen. QPCR-softwaren skal automatisk køre en lineær regression (Figur 3B).
- Beregn effektiviteten fra regressionshældningen, E = -1 + 10(-1/slope). Hvis hældningen f.eks. Kontroller også r2-værdierne, som angiver, hvor godt standarden replikerer passer på kurven. QPCR-softwaren skal også automatisk beregne dette (Figur 3B). Mål for effektivitetsværdier på 100% (±10%) og r2-værdier på ≥0,989,15,19,20,21,22.
- Undersøg visuelt standardkurven for bias,dvs.
- Specificitet: Vurder krydsreaktivitet med ikke-målarter for at mindske risikoen for falske positiver. Hvis eDNA-registreringer kan resultere i dyre ledelsesbeslutninger, skal du kontrollere positive detektioner ved ampliconsekvensering.
- Ikke-mål: Kør analysen mod genomiske DNA-ekstraktioner af taksonomisk verificerede enheder af beslægtede arter og geografisk forekommende arter; højeste prioritet er at teste mod nært beslægtede, samforekomne arter. Brug lignende samlede DNA-koncentrationer til både målprøver og ikke-målprøver. Den valgte koncentration bør give forstærkning fra målartsprøver nær midten af standardkurvens lineære område. Forstærkning bør kun observeres med målarten.
- Hvis der observeres forstærkning uden for målet, skal produktet rengøres og sekvenseres for at bekræfte dets identitet. Det er ikke ualmindeligt at observere kontaminering fra målarten i vævsprøver af ikke-målarter, og derfor bør alle forstærkninger på dette stadium verificeres ved sekventering. Reamplify rensede ampliconer fra specificitetstest ved hjælp af M13 tailed primere og sekvens med M13 primere.
- I post-PCR-laboratoriet overføres de qPCR-produkter, der skal sekventereres, til friske rør. Fjern restprimere og reaktionskomponenter med et oprydningssæt (f.eks. MinElute PCR-rensesæt).
- Lav 1:100 fortyndinger af elueringerne og amplify 1 μL af hver i 30 cyklusser i en 50 μL PCR reaktion med M13 tailed primere og en high-fidelity polymerase (f.eks. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase).
- Kør 10 μL af hver reaktion på en 1% agarosegel for at kontrollere, om der er et enkelt bånd af den forventede størrelse. Hvis der ikke observeres noget bånd, skal du øge antallet af cyklusser eller mængden af prøve. Hvis der observeres flere bånd, renser gelet båndet af den forventede størrelse.
- Fjern resterende primere og reaktionskomponenter med et oprydningssæt som ovenfor og mål DNA-koncentrationerne af elueringerne.
- Opsæt sekventeringsreaktioner med M13-primerne i overensstemmelse med instruktionerne fra rækkefølgefaciliteten.
BEMÆRK: Åbn aldrig forstærkede prøver i qPCR-laboratoriet. Forbered prøver til sekventering i et laboratorium dedikeret til post-PCR prøver.
- Følsomhed: Følsomhed påvirker risikoen for falske negativer, eller manglende påvisning af målartens DNA, når den er til stede. Vurder detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ) for hver analyse. Endelig skal du medtage en intern positiv kontrol (IPC) til vurdering af PCR-hæmning af prøver. Multiplex og teste denne IPC analyse med den designede analyse for at sikre de to assays ikke forstyrrer hinanden.
- LOD: Lav seks 4-fold serielle fortyndinger af den syntetiske DNA-standard, med 8-24 replikater pr standard fortynding (Figur 4). Den laveste koncentration i første omgang beregnes med 95 % detektion. LOD- og LOQ-plots kan genereres med en LOD/LOQ lommeregner R script5.
BEMÆRK: Data under LOD bør ikke censureres. På grund af pcr's specificitet er der ingen nedre grænse for ægte positiver. LOD er den højeste koncentration, under hvilken der kan forventes falske negativer. - LOQ: Fra samme fortyndingsserie beregnes den laveste oprindelige DNA-standardkoncentration, der kan kvantificeres, med en variationskoefficient (CV) under 35 %.
BEMÆRK: LOD og LOQ skal rapporteres i kopier/reaktion. Når der anvendes en valideret analyse, og feltprøver forstærkes under LOQ, skal resultaterne rapporteres som % detektioner i stedet for eDNA-koncentrationer, fordi den nøjagtige koncentration ikke kan måles med sikkerhed5.
- LOD: Lav seks 4-fold serielle fortyndinger af den syntetiske DNA-standard, med 8-24 replikater pr standard fortynding (Figur 4). Den laveste koncentration i første omgang beregnes med 95 % detektion. LOD- og LOQ-plots kan genereres med en LOD/LOQ lommeregner R script5.
- Brug en intern positiv kontrol (IPC) til at teste for PCR-hæmning. Hæmning kan føre til et fald i følsomhed og falske negativer. Test IPC-analysens evne til at blive multiplekseret med målanalysen.
- En IPC assay kan multiplexed med målet assay ved hjælp af en sonde med en anden reporter farvestof end målet assay. Denne IPC-analyse består af en kort syntetisk DNA-sekvens fra en art, der ikke er relateret til mål-taxaen, indarbejdet i qPCR-masterblandingen ved en lav koncentration på ca. 102 kopier / reaktion sammen med primer og sonder, der registrerer den. Denne lavere koncentration er nødvendig for at undgå konkurrence med målsekvensen for polymerase og nukleotider23.
- Sammenlign Cq-værdien for eksemplets IPC-skabelon med værdien for IPC-skabelonen i kontrolelementet Ingen skabelon. I dette ntc (no template control) er det eneste DNA-input IPC-skabelonen. IPC-skabelonen i denne reaktion bør forstærkes som forventet. Hvis IPC-skabelonen i et eksempel forstærkes ved 2 eller flere cyklusser, der er forskellige fra IPC-skabelonen i NTC, hæmmes eDNA-prøven. Prøver, der viser hæmning, kan fortyndes 1:10 og testes igen. Hvis en prøve forbliver hæmmet, skal prøven fjernes fra analysen.
- Først skal du finde de optimale temperatur- og primer/sondekoncentrationsværdier for analysen. Når disse parametre er optimeret til PCR-effektivitet (trin 3.4.2), krydsreaktivitet (trin 3.4.3) og følsomhed (trin 3.4.4), skal du fortsætte med at teste analysen med en multiplekseret IPC (trin 3.4.5).
- In situ assay udvikling og test
- I laboratoriet: Hvis der er adgang til organismen i laboratoriet samt sympatriske arter; tage vandprøver fra anlæg med disse arter, behandle prøverne og teste analysen i forhold til disse eDNA-prøver. Sekvens produkter som ovenfor for at kontrollere forstærkning af det tilsigtede mål ved hjælp af M13 tailed primere.
- I marken:
- Identificer steder, hvor målorganismen vides at forekomme og vides ikke at forekomme. Det er at foretrække at have en vis grad af overflod på hvert sted, hvor målarten forekommer.
- Det skal besluttes, hvilke prøvemængder og prøveindsamlingsmetoder (f.eks. filtrering, centrifugering osv.) der skal anvendes.
- Medtag et felt tomt eller negativ kontrol på hvert sted, dette er rent vand, der er blevet bragt til markstedet og derefter indsamlet og forberedt med det samme feltudstyr og protokoller, der bruges til eDNA-prøveudtagning24. Formålet med feltet blank er at påvise kontaminering af prøveudtagningsudstyr og feltredskaber bragt til stedet. Tag feltet tomt, før du behandler feltvandprøver.
- Der udtages flere vandprøver pr. sted, helst 3 prøver pr. sted.
- Tilbage i laboratoriet, behandle og udtrække prøver.
- Kør analysen ved hjælp af en plade, der er sat op svarende til figur 5A, og sammenlign eDNA-koncentrations- og detektionsfrekvens med kendte stedforskelle i forekomst og overflod. Bekræft alle registreringer ved sekventering24,25.
BEMÆRK: Ovenstående ville validere en analyse gennem niveau 4 i Thalinger et al.s (2020) skala6 (optimering af analysens tekniske ydeevne) og begynde at indsamle data, der understøtter niveau 5-analysevalidering. Niveau 5 inkorporerer sandsynlighed modellering og brug af analysen for eDNA økologi undersøgelser. Vi føler, at dette ligger uden for rammerne af grundlæggende analyse udvikling, men vi opfordrer til disse anvendelser af laboratorie-og felt undersøgt assays at forbedre analysen design og data fortolkning.
Representative Results
Ved udformningen af en artsspecifik qPCR-analyse til mucket (A. ligamentina) blev tilgængelige sekvenser af alle Unionidae-arter i Clinch-floden downloadet. Nært beslægtede arter som Lampsilis siliquoidea blev også medtaget i referencedatabasen, selv om de ikke findes i samme flod. Ikke alle arter i flodsystemet af interesse blev fundet i GenBank, så yderligere arter blev sekventeret i hus. Sekvenser blev justeret ved hjælp af Geneious software og Primer Quest (IDT) software blev brugt til at designe flere assays. Fem sæt primere og sonder blev føjet til justeringen for visuel vurdering (figur 2). De blev derefter testet i silico ved hjælp af Primer-Blast, hvorefter de blev bestilt til yderligere test in vitro. I laboratoriet blev alle assays testet ved hjælp af DNA-ekstraktioner af 27 tilgængelige arter for at verificere specificitet. En analyse (A.lig.1) forstærkede kun målarten(tabel 1; Tabel 2) Denne analyse bevægede sig fremad for yderligere test af analyseeffektivitet, LOD og LOQ. Det har en amplicon længde på 121 base par. Tabel 3 viser den sekvens, der anvendes til A. ligamentina syntetisk DNA-standard. Figur 3A og figur 3B viser resultaterne af en vellykket analyse med god effektivitet ogr 2-værdier. Figur 3C og figur 3D viser en analyse, hvis standardkurve har en dårlig effektivitet. denne analyse blev kasseret. Lod og LOQ for den valgte analyse (A.lig.1) blev begge anset for at være 5,00 eksemplarer/reaktion ved hjælp af den diskrete metode, der er beskrevet i Klymus etal. 5. IPC, der var multiplexed med analysen (Tabel 3-6) påvirkede ikke A. ligamentina assay standard kurve. IPC vi bruger, er et fragment af musen HemT udskrift. Denne analyse blev foruddesignet af IDT til et andet program, men vi ændrede brugen som IPC til vores labs eDNA-applikationer.
En vellykket qPCR-kørsel bør opfylde visse kriterier for hvert mål for ydeevne (dvs. standardkurveforstærkning, genomisk DNA-positiv kontrol, ingen skabelonkontrol og intern positiv kontrol). Målanalysestandarderne bør have eksponentielle forstærkningskurver. Disse kurver bør nå et slutpunkt plateau, hvis lov til at køre nok cykler. Dette er tegn på, at lysstofrørssonden forbruges fuldstændigt under reaktionen, og at fluorescensniveauerne når op på en maksimumsgrænse. Senere forstærke standarder kan ikke nå et plateau i 40 cyklusser. De positive kontroller (genomisk DNA og IPC) bør have samme mønster. Ubekendte kan eller ikke kan forstærke, men forstærkning i ubekendte bør også have en eksponentiel mønster og et slutpunkt plateau (Figur 5).
I en kvalitet qPCR, standard fortyndinger forstærke ved jævnt fordelt Cq af ca hver 3,3 cykler for hver 10-fold forskel i koncentration. Hver replikat af en standard fortynding forstærker på en tæt grupperet måde med næsten samme Cq (repræsenteret ved r2 værdier). Alle standardfortyndinger skal udvise forstærkning(figur 3A). I en dårlig qPCR kan standarder udvise ikke-eksponentiel form, ujævn variation i Cq-værdier mellem fortyndinger, ikke komme til et slutpunktsplateau, eller nogle fortyndinger forstærkes måske slet ikke (Figur 3D).
De vigtige parametre for en standardkurve er effektivitet, r2, hældning og y-skæringspunkt. Effektiviteten bør falde mellem 90%-110% med ideelle værdier nær 100% og r2 værdier bør være over 0,98 med ideelle resultater nærmer sig 1,015,22. Hældningsværdier skal være mellem -3,2 og -3,5 med ideelle resultater nær -3,322. Y-intercept-værdierne skal falde mellem en Cq på 34-41 med ideelle resultater med en Cq på 37,0. Y-skæringspunktet er den forudsagte Cq af en reaktion med 1 kopi af målsekvensen, den mindste enhed, der kan måles i en enkelt qPCR. Ubekendte med Cq's større end y-skæringspunktet vil sandsynligvis blive hæmmet. Det kan være nødvendigt at køre mere end 40 cyklusser af PCR for at detektere målet i tilfælde af hæmning eller et ineffektivt primersæt, men kvantificering er ikke mulig under disse omstændigheder, og yderligere negative kontroller uden målsekvensen, men indeholder total DNA svarende til det ukendte, bør køres for at udelukke forstærkning fra ikke-specifikke kilder.
Forstærkningen af intern positiv kontrol (IPC) i ukendte prøver skal sammenlignes med resultaterne af den negative skabelonkontrol IPC, da der ikke er nogen konkurrence om reagenser, og der ikke er nogen hæmmere til stede. Ubekendte med en IPC, der har en Cq på 2 cyklusser eller større end ntc'ens gennemsnitlige Cq-værdi, eller som ikke forstærker, bør betragtes som hæmmet. Hvis der ikke er nogen hæmmere i prøverne, skal al IPC-forstærkning have en tæt gruppering i området med Cq-værdier nær det samme som NTC (Figur 6).
Endelig in situ test af analysen fandt sted. Tyve vandprøver fra Clinch-floden og tre feltprøve blev filtreret mellem 25.-26. september 2019 inden for 500 meter fra en muslingebund, der vides at have A. ligamentina. Omkring fire 1 L prøver vand blev filtreret pr prøveudtagning sted. Placeringssteder, der indgår i bunden af muslingebunden i strøm, bunden af muslingebunden nær kysten, 100 m nedstrøms for sengen i strøm, 500 m nedstrøms af sengen i strøm og 500 m nedstrøms af sengen nær kysten (Figur 7). Tilbage i laboratoriet blev hvert filter skåret i halvdelen, og DNA blev udvundet fra kun halvdelen af et filter. Den resterende filterhalvdel for hver prøve blev opbevaret i en fryser på -80 °C. Prøverne blev derefter kørt ved hjælp af A.lig.1 assay multiplexed med IPC. Af de 23 prøver blev fem fundet hæmmet. Disse prøver blev fortyndet 1:10 og fortyndinger blev re-run. Nitten af de 20 feltprøver forstærket ved hjælp af den designede analyse. Af disse 19 prøver lå fem over analysens LOD og LOQ på 5 kopier/reaktion. det betyder, at de fleste af prøverne havde en eDNA-detektion, men på et niveau, hvor der sandsynligvis vil forekomme falske negative resultater, og at analysen ikke med tillid kunne kvantificere kopinummeret for disse 14 prøver. Ikke desto mindre replikerer 75-100 % af de fire biologiske lokaliteter forstærket på hvert prøvested. To af de tre felt blanks var negative, mens et felt blank viste forstærkning, understreger betydningen af ren teknik i marken.
Figur 1: Arbejdsgang for mitokondrie-DNA-sekvensdatabasekonstruktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sekvensjusteringer for arter af clinch-flodmuslinger med potentielle primere og sonder til Actinonaias ligamentina ND1-analysen. Fremad primere i mørkegrøn, sonde i rød og omvendt primer i lysegrøn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempler på standardkurve og lineær regression. A.Eksempel på en acceptabel standardkurve, der er afledt af forstærkningen af tre replikater hver af seks standardfortyndinger. En 10-fold standard fortynding serie med den højeste koncentration af standarden til venstre, med faldende koncentrationer bevæger sig til højre. Den vandrette linje, der krydser alle spor, er tærsklen for cyklus ved kvantantitation (Cq). Hvis hver spor krydser denne tærskel, er det der, hvor Cq bestemmes. B.Lineær regression fremstillet af standardreplikater af figur 3A. Replikater af standardfortyndingerne afbildes i cirkler, og de ukendte (prøver) afbildes med x'er. Effektiviteten er 98,9%, r2 nærmer sig 1,0, og hældning på -3,349. C.Eksempel på en dårlig standardkurve, der stammer fra forstærkningen af tre replikater hver af seks standardfortyndinger. D. En lineær regression, der danner standardkurven for standardreplikeringerne forstærket i eksempel 3C. Bemærk den dårlige effektivitet og r2 værdier. Bemærk også, at kun 4 af de 6 standarder forstærkes. Hvis standardkurven efter gentagne kørsler ikke forbedres, kan problemet være med et dårligt primer/ sondesæt, der ikke forstærker mål-DNA som forventet, i hvilket tilfælde denne analyse ikke bør overvejes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempler på pladeopsætninger for LOD- og LOQ-standard qPCR-kørsler. Standarder, der anvendes i kurven er i blå, standard koncentration falder fra mørk til lyseblå. DNA-positiv kontrol i grøn og ingen skabelonkontrol (NTC) i gult. Eksperimentelle standardkoncentrationer i gråtoner, der viser 24 replikater for hver standardfortynding. Fortyndingsserien blev belagt på tværs af to plader (A, B), hver med en standardkurve, positiv kontrol og NTC. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Pladeopsætning og forstærkningsspor fra en qPCR-kørsel. A.Pladeopsætning, standarder vist med blå, mørkere farve, der angiver den højeste koncentration af standarden. DNA-positiv kontrol i grøn, ingen skabelonkontrol i gult (NTC), prøvemål i gråt. B.Forstærkningsspor fra en qPCR-kørsel. Standarder vist med blå, DNA-positiv kontrol i grøn, ingen skabelonkontrol i gult og ukendte i rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Forstærkningsspor for den interne positive kontrol (IPC). IPC-sporinger for alle ukendte eksempler i magenta og IPC fra ntcs (No Template Controls), der vises i orange med trekanter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kort, der viser eDNA-samlingsstederne for en muslingebund i Clinch-floden langs grænsen mellem Virginia og Tennessee. Prøver blev indsamlet ved Wallens Bend i bunden af sengen, 100 m nedstrøms af sengen og 500 m nedstrøms for sengen. Steder blev enten indsamlet i midten af åen (i strøm) eller omkring 1 - 2 meter fra kysten (kysten). Klik her for at se en større version af dette tal.
| komponent | Navn | Sekvens 5' – 3' | Lysstofrør | |
| Fremad primer | A.lig.1-f | CCCTCATCACGTACCTCTTAATC | ||
| Omvendt primer | A.lig.1-r | GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA | ||
| sonde | A.lig.1 sonde | TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT | Fam. | |
Tabel 1: Den designede Actinonaias ligamentina qPCR assay (A.lig.1), herunder sekvenser for de forreste og omvendte primere og sonden.
| art | Forstærket | I Clinch-floden |
| 1. Actinonaias ligamentina | Ja | Ja |
| 2. Actinonaias pectorosa | Nej | Ja |
| 3. Amblema plicata | Nej | Ja |
| 4. Corbicula spp. | Nej | Ja |
| 5. Cumberlandia monodonta | Nej | Ja |
| 6. Cyclonaias tuberculata | Nej | Ja |
| 7. Cyprogenia stegaria | Nej | Ja |
| 8. Elliptio dilatata | Nej | Ja |
| 9. Epioblasma-brevidens | Nej | Ja |
| 10. Epioblasma capsaeformis | Nej | Ja |
| 11. Epioblasma florentina aureola | Nej | Ja |
| 12. Epioblasma triquetra | Nej | Ja |
| 13. Fusconaia cor | Nej | Ja |
| 14. Fusconaia subrotunda | Nej | Ja |
| 15. Lamperilis ovata | Nej | Ja |
| 16. Lamperilis siliquoidea | Nej | Nej |
| 17. Lasmigona costata | Nej | Ja |
| 18. Lemiox rimosus | Nej | Ja |
| 19. Lexingtonia dolabelloides | Nej | Ja |
| 20. Medionidus conradicus | Nej | Ja |
| 21. Plethobasus cyphyus | Nej | Ja |
| 22. Pleurobema plenum | Nej | Ja |
| 23. Ptychobranchus fasciolaris | Nej | Ja |
| 24. Ptychobranchus subtentus | Nej | Ja |
| 25. Quadrula pustulosa | Nej | Ja |
| 26. Strophitus undulatus | Nej | Ja |
| 27. Villosa iris | Nej | Ja |
Tabel 2: En liste over arter, der er anvendt til in vitro-specificitetstest af A.lig.1-analysen. Analysen forstærkede målets genomiske DNA (Actinonaias ligamentina) og forstærkede ikke nogen af de ikke-målarter.
| komponent | Sekvens 5'-3' | ||||
| Actinonaias ligementina standard | CCCTCATCACGTAC 1984, s. 1555, præmis 13, OG AF 17.12.1989, SML.1979, s. 1733, PRÆMIS 23. | ||||
| AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC | |||||
| 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23. | |||||
| 1984, s. 1773, PRÆMIS 13, OG AF 17.12.1990, KOM(95) 100 OG EF-KOMMISSIONEN | |||||
| GACAATTATTCCATTCCATTTATANTATCATCCCAAATANTTTTGGTATGCTTCCTATT | |||||
| 2. A) FOR SÅ MEGET SOM MULIGT KAN DER GØRES EN STOR DEL AF DEN 10. | |||||
| AATATGCCCTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA | |||||
| TAAC | |||||
| IPC-skabelon (Hem-T) | 1984, S. 1555, PRÆMIS13, OG AF 17.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, MIN | ||||
| 1984, S. 1555, PRÆMIS 13, OG AF17.12.1989,S. 1333, PRÆMIS 23. | |||||
Tabel 3: Sekvens (5'-3') af Actinonaias ligamentina standard og IPC skabelon (Hem-T), der anvendes til denne analyse. Sekvensen for de forreste og omvendte primere er med fed skrift og kursiv, og sondens er understreget.
| komponent | Navn | Sekvens 5' – 3' | Lysstofrør | |
| Fremad primer | HemT-F | TCTGAGTGTCCCTCGAATCT | ||
| Omvendt primer | HemT-R | GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC | ||
| sonde | HemT-P | 1984, s. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 17.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23. | Cy5 | |
Tabel 4: Analysen intern positiv kontrol (IPC), herunder sekvenser for de forreste og omvendte primere og sonden.
| Volumen pr. prøve (μL) | komponent |
| 10 | Miljø Master Mix |
| 1 | 20uM A. lig.1 F/R mix |
| 1 | 2,5 a. lig.1 sonde |
| 1 | 5uM IPC primer mix (HemT-F/ R) |
| 0.75 | 2.5uM IPC-sonde (HemT-P) |
| 1.5 | 1 X 103 koncentration af IPC-skabelonen |
| 2.75 | H20 |
| 2 | prøve |
| 20 | Samlet volumen |
Tabel 5: Den PCR-blanding, der anvendes til A.lig.1-analysen, der er multixet med IPC-analysen.
| skridt | Temperatur (°C) | Tidspunkt | |
| 1 | Oprindelig denaturering | 95 | 10 min. |
| 2 | Denaturering | 95 | 15 sek. |
| 3 | Udglødning | 60 | 1 min. |
| 4 | Gå til trin 2, gentag 39X |
Tabel 6: Reaktionsbetingelser for A.lig.1-analysen.
Discussion
Som med enhver undersøgelse er det første skridt at definere det spørgsmål, der skal behandles, og udformningen af eDNA-analysen afhænger af undersøgelsens omfang.26. For eksempel, hvis målet med forskning eller undersøgelse er at opdage en eller nogle få arter, en målrettet sonde-baseret analyse er bedst. Men hvis målet er at vurdere en større suite eller samling af arter, høj gennemløb sekventering metabarcoding assays er bedre egnet. Når det er bestemt, hvilken tilgang der skal tages, anbefales en pilotundersøgelse, herunder analysedesign, test og optimering24. Assay design starter med en liste over arter som beskrevet i Figur 1. Denne liste vil danne grundlag for at forstå, hvor godt en analyse klarer sig med hensyn til specificitet og det geografiske område, den kan anvendes på6,10. Det opfordres til at udforme analysen for et bestemt geografisk område, så designeren bedre kan teste en analyse for krydsreaktivitet i forhold til andre arter i dette område, og at være opmærksom på de begrænsninger, dette har for at udvide en analyse til andre områder, hvor en målart kan forekomme24. Når listen er færdig, kan sekvenser downloades fra offentlige genetiske databaser. Da disse databaser er ufuldstændige27, bør man sekvens så mange arter på listen som muligt i huset for at fuldføre den lokale reference database over sekvenser, der vil blive brugt i analysen design. Prioriter co-forekommende nært beslægtede arter, da disse er de mest sandsynlige ikke-mål, der vil forstærke. Fokus på alle arter inden for samme slægt eller familie som målarten er et godt sted at starte. Sammenligninger med nært beslægtede arter vil hjælpe med at identificere sekvensområder, der er unikke for målarten. Dette kan hjælpe med at informere, hvordan analysen kan udføre i andre systemer eller steder. Mitokondrieregioner er det sædvanlige valg til analyseudvikling, fordi der findes mere sekvensinformation fra en bredere vifte af arter på mitokondriegener, der er blevet brugt i stregkode af livsprojekter, og fordi mitokondrie-DNA er til stede i langt større koncentration i kopier / celler end nukleart DNA24,28,29. Flere genregioner bør vurderes for yderligere analyseudvikling, da sekvensdækningen varierer mellem taxa i de genetiske arkivdatabaser. Efter denne lokale database med referencesekvenser er oprettet, en kombination af manuel visualisering af justerede sekvensdata og edb-software-programmer bruges til at designe primer / sonde assays. Man bør ikke stole strengt på software til at afgøre, hvilke assays at teste. Det er vigtigt at kontrollere visuelt om justeringer, hvor primere og sonder sidde på mål og ikke-mål for at få en bedre forståelse af, hvordan de kan handle i en PCR. Endelig assay screening og optimering omfatter tre niveauer (i silico, in vitro og in situ)6,7,24,25. I silico design og test er vigtige for at producere en kort liste over assays med en god chance for succes, men empiriske (in vitro) test er afgørende for at vælge analysen med den bedste faktiske ydeevne. In vitro optimering og test af assays omfatter måling af reaktionen effektivitet og definere analysen følsomhed og specificitet. Grænser for detektion og kvantificering er to parametre, der ofte overses i analysen udvikling, men vigtigt for data fortolkning. Ved at køre flere replikater af standardkurverne for en analyse kan LOD og LOQ nemt måles1,5,30. Få undersøgelser diskuterer resultater med hensyn til analysens LOD eller LOQ, men Sengupta et al. (2019) inkorporerer deres analyse LOD og LOQ i deres datafortolkning og grafik for en klarere forståelse af deres resultater31. Interne positive kontroller bør også multixeres ind i den designede analyse. Uden test for PCR-hæmning i prøverne kan der forekomme falske negativer24,32. Vi foreslår brug af en multiplekseret IPC-analyse med målanalysen som den nemmeste metode til PCR-hæmningstest23. Endelig er in situ-test af analysen fra mark- og laboratorieoplyste prøver nødvendig for at sikre, at målforstærkning forekommer i miljøprøver24.
Der er begrænsninger for brugen af artsspecifikke, sondebaserede qPCR-assays med eDNA-prøver. For eksempel kan designet af flere assays til test være begrænset af sekvenstilgængelighed, og kompromis kan være nødvendigt med aspekter af analysens ydeevne. Disse valg skal være styret af undersøgelsens mål og skal rapporteres med resultaterne26. Hvis målet f.eks. er påvisning af en sjælden art, og der kun forventes få positiver, kan der anvendes en analyse med ufuldkommen specificitet (dvs. forstærkning af ikke-målarter), hvis alle fund vil blive verificeret ved sekventering. Hvis målet er at overvåge det geografiske område af en art, og eDNA-koncentrationsdata ikke er nødvendige, kan der anvendes en analyse med ufuldkommen effektivitet, og data rapporteres kun som procentdetektion. Desuden, medmindre alle potentielle artsarter testes i laboratoriet, hvilket sjældent er muligt, kan man ikke med absolut sikkerhed vide den sande specificitet af en analyse. For eksempel blev analysen designet og testet mod flere ferskvandsmuslingearter i Clinch-floden. For at bruge denne analyse i et andet flodsystem, ville vi nødt til at teste det mod en suite af arter i den nye placering. Genetisk variation inden for de arter eller populationer, der ikke testes under analysen udvikling kan også påvirke specificitet. Endelig, selv om en analyse er blevet kontrolleret for at have høj teknisk ydeevne; forholdene ændrer sig, når du arbejder i marken. Ikke-analyserelaterede tilstande som vandgennemstrømning, pH og dyrs adfærd kan ændre eDNA-detektabilitet, ligesom brug af forskellige eDNA-indsamlings- og ekstraktionsprotokoller. Brug af assays, der er optimeret og godt beskrevet, vil hjælpe med at lette forståelsen af den indflydelse, sådanne parametre har på eDNA-detektion.
EDNA-området er ved at modnes ud over den sonderende analysefase til at øge standardiseringen af metoder og teknikker. Denne udvikling vil forbedre vores forståelse af eDNA-teknikker, -evner og -begrænsninger. Den optimeringsproces, vi skitserer ovenfor, forbedrer en analyses følsomhed, specificitet og reproducerbarhed. Det endelige mål med denne raffinement og standardisering af eDNA-metoder er at forbedre forskernes evne til at drage slutninger baseret på eDNA-data samt øge slutbrugerens og interessenternes tillid til resultaterne.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansieringssponsorerne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen; indsamling, analyse eller fortolkning af data i håndskriftets skrivning eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.
Acknowledgments
Vi takker Alvi Wadud og Trudi Frost, der hjalp med primer udvikling og test. Finansiering af analysen design rapporteret i denne undersøgelse blev leveret af Department of Defense Strategic Environmental Research and Development Program (RC19-1156). Enhver brug af handels-, produkt- eller firmanavne er kun til beskrivende formål og indebærer ikke godkendelse fra den amerikanske regering. Data, der genereres i løbet af denne undersøgelse, er tilgængelige som en USGS-dataudgivelse https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
References
- Kubista, M., et al.
- Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology. 10, 5 (1992).
- Mauvisseau, Q., et al. Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches. Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).
- Hernandez, C., et al. 60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada. Environmental DNA. , (2020).
- Klymus, K. E., et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environmental DNA. , (2019).
- Thalinger, B., et al. A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. bioRxiv. , (2020).
- Helbing, C. C., Hobbs, J. Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring. CSA Group. , (2019).
- Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management. Trends in Ecology & Evolution. , (2020).
- Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).
- Prediger, E. How to design primers and probes for PCR and qPCR. IDT. , Available from: http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes (2020).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).
- Owczarzy, R., et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).
- Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).
- Taylor, S. C., et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 5279. , ed Bio-Rad (2020).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 6894. , Bio-Rad (2020).
- Eurogentec. Eurogentec. Vol. 0708-V2. , ed Eurogentec (2020).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
- Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
- Guan, X., et al. Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America. Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).
- Mosher, B. A., et al. Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners. Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).
- Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences. Cladistics. 28, 6 (2012).
- Rees, H. C., et al. REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).
- Evans, N. T., Lamberti, G. A. Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool. Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Sengupta, M. E., et al. Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).
- Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).
