Summary
环境DNA检测需要严格的设计、测试、优化和验证，才能开始收集现场数据。在这里，我们提出一个协议，让用户完成设计特定物种、基于探针的 qPCR 检测和量化环境样本中目标物种 DNA 的每一步。
Abstract
正在开发新的非侵入性方法，以检测和监测物种的存在，以帮助渔业和野生动物保护管理。利用环境DNA（eDNA）样本检测大生物群是正在迅速流行并正在国家管理方案中实施的一组方法之一。在这里，我们专注于开发基于探针的定量 PCR （qPCR） 应用的物种特定靶向检测。使用基于探头的 qPCR 提供的特异性比仅使用引数就更具有特殊性。此外，量化样本中DNA数量的能力有助于我们了解电子DNA的生态学和解释该领域的eDNA检测模式。在开发和测试这些检测时需要仔细考虑，以确保从环境样本中检测目标物种的敏感性和特殊性。在此协议中，我们将划定设计和测试基于探针的检测目标物种所需的步骤;包括创建序列数据库、检测设计、检测选择和优化、测试检测性能和现场验证。遵循这些步骤将有助于实现高效、敏感和特定的检测，这些检测可以放心地使用。我们用我们的检测来证明这个过程，它专为在美国克林奇河发现的淡水贝类物种"粘液"（Actinonaias韧带）的种群而设计。
Introduction
研究人员和管理者对利用环境DNA检测技术进行物种检测越来越感兴趣。三十年来，定量或实时 PCR （qPCR/rtPCR） 已用于多个领域，用于核酸1、2的序列特定检测和定量。在相对较新的 eDNA 研究领域，使用这些具有标准曲线的检测结果来量化 eDNA 样本的体积或重量的目标 DNA 副本现已成为常规做法。线粒体DNA序列通常以eDNA检测为目标，因为线粒体基因组存在于每个细胞数千个拷贝中，但核DNA或RNA序列的检测也是可能的。必须了解，eDNA 样本的已发布检测在性能上并不总是相等的。由于检测设计、选择、优化和测试方式的不同，检测在检测目标物种的DNA（即特异性）和检测低数量目标DNA（即灵敏度）方面具有很大差异。报告检测绩效的定量衡量标准以前基本上被忽视了，但最近，提高检测开发透明度的标准正在出现3、4、5、6、7、8。
在研究设计和解释 eDNA 调查结果时优化和报告检测性能辅助工具。检测与非目标物种DNA的交叉反应可能导致误报检测，而敏感性差的检测可能无法检测目标物种DNA，即使它存在于样本中（假阴性）。了解检测灵敏度和选择性将有助于为检测稀有物种所需的采样工作提供信息。由于eDNA中有许多自然变异来源，研究必须尽可能限制可控的变异来源，包括完全优化和描述eDNA分析3。
直接影响检测特异性或灵敏度的条件将改变检测的性能。这可能发生在不同的实验室条件下（即不同的试剂、用户、机器等）。因此，在新条件下应用检测时应重新审视此协议。即使检测在文献中具有良好特征，也应在新实验室采用或使用不同试剂（如主混合解决方案）5、9时进行测试和优化。当应用于其他地理区域时，检测特异性可能会发生变化，因为该检测正应用于来自新生物群落的样本，其中可能包括未经检测的非目标物种，并且目标物种可能发生遗传变异。同样，在新位置使用时应重新评估检测。现场条件与实验室条件不同，因为在实地，PCR抑制剂更有可能存在于样品中。PCR抑制剂直接影响放大反应，从而影响检测性能。因此，在开发 eDNA 检测时需要内部正控制。
最后，该领域的环境条件可以通过DNA降解、运输和保留影响目标物种的DNA分子及其捕获。此外，DNA采集和提取的不同协议在效率和保留DNA的能力上各不相同。但是，必须注意，这些过程会影响 eDNA 的可检测性，但不会影响分子测定性能。因此，现场样本中目标物种的DNA可检测性既是 qPCR 检测技术性能以及现场条件和收集、存储和提取协议的函数。当使用具有良好特征且性能优美的检测时，用户可以对检测功能充满信心：使研究人员现在能够专注于了解影响 eDNA 检测的外部检测因素（即环境变量、捕获或提取协议的差异）。
在这里，我们特别注重通过严格的设计和优化来检测技术性能。我们使用一种基于探针的检测来证明该协议，该检测结果用于检测美国克林奇河取样的水中的淡水贝类，即泥巴（Actinonaias韧带）。最近，塔林格等人（2020年）提出了验证有针对性的eDNA检测的准则。按照我们的协议进行分析设计，将给Thallinger等人的4级带来检测，并朝着5级6迈出额外的一步。此时，检测技术性能将得到优化，并准备在实验室和现场应用中正常使用。进一步在实验室、中度和现场实验中使用检测可以解决有关 eDNA 检测和影响可检测性的因素的问题，这是 5 级验证6的最后步骤。
Protocol
1. 生成目标和非目标感兴趣物种线粒体DNA序列数据库
- 定义正在处理的问题、目标和系统。确定用于 eDNA 检测的目标物种。确定将使用检测的地理系统。列出感兴趣的物种，包括目标物种、同一分类（通常顺序或家族级别）内的共生（共生）物种，以及密切相关的同位素物种，这些物种可能与目标位置不同（图1）。
注：在这里，克林奇河种群的 A.韧带成为 攻击目标。 - 从多个基因区域搜索和下载序列，从步骤 1 中列出的物种。可以使用NCBI（国家生物技术信息中心）、BOLD（生命数据库条形码）、EMBL（欧洲分子生物学实验室）和DDBJ（日本DNA数据库）等序列数据库。NCBI、EMBL 和 DDBJ 都共享序列信息。
- 使用NCBI的核苷酸数据库，搜索目标生物体（如 Actinonaias 韧带）和基因区域（如细胞色素 c 氧化酶 I （COI） 或 NADH-脱氢酶 1 （ND1）：示例搜索字符串：Actinonaias 韧带和 ND1）
- 接下来，选择匹配规格的所有序列，然后选择 "发送到"。 选择 完整的记录， 文件 和下载格式作为 根银行 或 FASTA， 然后 创建文件。这些序列现在保存到计算机。
- 重复这些步骤，以访问步骤 1 中定义的列表中的所有物种。将每个基因区域的序列保留在单独的文件中，因为这些序列将分别分析。
- 下载第 1 步中确定的目标物种的所有相关序列（或具有代表性的大比例序列）。如果可能，包括地理变体。
- 重复搜索和下载步骤 1 中确定的同一分类组的相关和共生非目标物种的搜索和下载序列（例如，如果目标物种是利益体系中发生的家族联盟中所有其他淡水贝类物种的泥巴（A. 韧带） 下载序列）。
- 重复搜索和下载步骤 1.1 中列出的密切相关但同位素（地理上分离）的物种。
注：并非所有物种（目标和非目标）都可在公共数据库中找到。通过放大和排序内部感兴趣的物种分类验证样本，增加本地参考数据库。如果与具有高物种内遗传多样性的物种合作，或在地理上可能预期有变异的大面积工作，则从整个范围收集序列。
2. 分析设计
- 使用可在各种基因序列编辑和生物信息学程序中找到的对齐软件，分别对齐来自每个基因区域的序列。针对每个不同的基因区域进行此对齐。
- 例如，使用 Geneious Prime 软件 （https://www.geneious.com） 将下载的序列文件导入程序中。
- 为每个基因区域创建单独的文件夹。
- 在包含一个基因区域序列的文件夹中，选择所有序列。
- 使用 多重对齐 工具创建所选序列的核苷酸对齐。使用 基因 或 MUSCLE 对齐和默认参数时，可能有几个对齐类型的选项。
- 通过对齐序列数据的可视化，选择有前途的区域进行检测设计。一个拥有大量可供感兴趣物种使用序列数据的区域，物种之间差异很大，并且表明物种内部变化低是一个很好的选择。这将增加引物和探针设计能够区分目标与非目标物种的可能性，同时确保特定变异将随着检测而放大。
- 分析引号和探头的设计。
- 使用 qPCR 检测设计软件并按照说明操作。此处使用了 IDT 的引物查询工具 （https://www.idtdna.com/） 来设计 5 套 qPCR 检测。
- 将步骤 2.2 中选择的序列粘贴到序列条目框中。如果对齐创建了空格，则从序列中删除这些空间。
- 在"选择您的设计选项"中选择qPCR 2引号+探头。
- 下载推荐的分析。
- 复制第一个测定的前引物中的序列，并在步骤 2.1.4 中创建的对齐中搜索此引物序列。如果使用基因素数，请使用 注释和预测 工具将引号区域添加到对齐中。为所有引物和探头组合（图 2）进行此工作。
- 检查这些区域的对齐，以了解目标物种内以及共发生的物种内部的变化。
- 如果存在特定的遗传变异，则搜索引物和探针不属于这些区域的检测结果。
- 为了防止非目标物种的放大，寻找与非目标物种不匹配的物种。选择最不匹配的检测结果以进行进一步验证。Currier 等人（2018 年）建议选择三个区域中至少有两个区域（两个引言或引言和探头）与所有非目标物种至少存在两个不匹配的套装。然而，请记住，在探头的不匹配对特异性的贡献较小。
注：每个引言3'端的3个基对内的差异比引座10的5'端的差异增加特异性更好。
- 在分析设计中考虑以下重要参数。
- 确定引金和探头的熔化和退化温度。理想情况下，引体的熔化温度 （Tm） 应在 60-64 °C 之间，彼此在 2 °C 以内，探针的 Tm 应比引漆的 Tm 高 6-8 度。将 qPCR 反应的退化温度 （Ta） 设置为低于熔化温度 5 °C，约为 55-60 °C11。
- 检查GC内容。在35-65%的GC内容之间进行选择，并避免连续使用4个或更多G的区域。在引物（GC 夹）末端的 5 个最后基础中拥有 1 或 2 G 或 C 可能会增加特异性，因为它有助于引物产生更强的键12。
- 寻找发夹和较暗的结构。使用寡核苷酸分析程序（例如，奥利戈分析器-IDT13）测试引物和探针预测发夹结构和二十铃器：寡头计算器14）.这些结构可能导致非目标放大和效率降低。避免预测形成这些结构的检测。
- 确定引号长度。目标引座在18-25个基地之间的长度和探针长度之间的20-25基地。更长的引物和探头的放大效率可能较低。
- 确定放大龙的长度。它应该是大约100和250碱基对之间。这个范围一般足够短，可以提高PCR效率，但足够长的时间，通过桑格测序4，15的验证。
- 设计探头。确保探针在5'端没有G基座，因为它可以抑制来自绿色和黄色染料11的信号。我们设计了双淬火探头，配有IDT 3IABKFQ和ZEN淬火器以及FAM或六氟化物。
注：确定 MGB 探头：塔克曼 MGB（小凹槽粘合剂）探头常用于 eDNA 研究。然而，由于这些探头非常短，即使与2或3个碱基对不匹配10，它们也可以与非目标结合。 - 确定探头 Tm. 探头的熔化温度应比引漆高 6-8°C。较低的温度会降低探针的结合成功率。
- 确定探头的长度和位置。探头长度应在 20 到 25 bp 之间，理想位置靠近同一链上的引座绑定点，且不会重叠。
3. 分析筛选和优化
- 在西里科检测开发和测试。在订购引号探针集之前，通过测试西里科的引号放大来评估特异性（潜在的非目标放大）。
- 通过 NCBI 的引言爆炸16 或类似程序测试引言，这些程序可以识别 NCBI nt/nr 数据库中可能通过检测放大的潜在非目标。如果在底漆参数下使用底漆-爆炸粘贴底漆 ，请使用我自己的底漆 盒。在引物对特异性检查参数选项中，选择 nr 作为数据库，并在 有机 体框中键入感兴趣的有机体的顺序（例如，"联盟"或"联盟"）。
- 继续对入门/探针设置进行直观评估，直观地评估对齐的序列数据。
- 为了在 silico 中同时评估引物和探头，创建前向引物、12 N、探头、12 N 和反向引物的反向补充的文本串。如果探针序列位于其中一个引座的 12 个碱基对内，请使用与引座和探头之间的基对数相对应的 N 数。
- 使用NCBI的核苷酸爆炸搜索（布拉森）搜索对nr数据库17。使用分类选项卡查找很少不匹配的非目标物种;这些应在检测优化过程中在实验室中测试。
注意：在 silico 测试中，有助于排除非特定的检测，但潜在的特定检测必须进行经验测试（体外测试），因为并非所有物种在遗传数据库和引物中都有序列，即使软件认为不太可能，探针仍然可以与非靶点结合。
- 选择三到五个引物/探针组合在实验室中测试。
- 订购引物、探针和合成 DNA 标准，以及用于放大器测序的附加 M13 尾引物。
- 从生产寡头的公司订购合成寡核苷酸引物和探针。探针上标有荧光染料和淬火器。应选择不同的氟化物进行需要多路复用的检测。检查您的 qPCR 仪器，了解仪器可以检测到哪些氟磷的列表。
- 设计并订购 M13 尾底漆，通过将 M13 转发 （-20） 序列 GTA A A CGA CGG CCA GT 添加到前引物的 5' 端，以及 M13 反向 （-27） 序列（CAG GAA ACA GCT ATG AC）添加到反向引物的 5' 端来验证 QPCR 检测。
- 合成DNA标准包含目标序列（包括引物区域），在副本/μL中已知浓度。 根据已知浓度该标准（即标准曲线）的曲线对未知样本进行量化。从生产引物和探针的同一家公司获得合成标准。遵循制造商关于暂停和存储的建议。使用低保留塑料器具的 TRNA 载体稀释 TE 缓冲器中的标准，以减少水解和与表面的结合。
注意：如果标准曲线性能不佳（PCR 效率差，请参阅步骤 3.4.2），请尝试在水中或 Tris-HCl 中重新悬挂标准。 - 将引物和探针悬挂在无核水、Tris-HCl 或 TE 缓冲器中，以方便的浓度进行检测使用。一般来说，稀释工作库存20倍于主组合，以实现优化的最终检测浓度。不使用时，将悬浮寡头以恒定的-20°C存储。
- 体外（在实验室）检测优化和测试。拒绝效率低下、与共发生的物种发生交叉反应或灵敏度差的检测18.包括在检测开发过程中以及在运行实际样本时使用内部正对照 （IPC）。
- 首先，为分析找到最佳温度和引言/探针浓度值。一旦这些参数优化为 PCR 效率（步骤 3.4.2）、交叉反应性（步骤 3.4.3）和灵敏度（步骤 3.4.4），继续使用多路复用 IPC（步骤 3.4.5）进行测试。
- 使用 PCR 温度梯度（低于预测的平均引物 Tm）5°C 测试引物和探头的最佳退化温度 （Ta）。
- 测试最佳引物和探针浓度。通常，测试 200 nM、400 nM 和 800 nM 引物浓度以及 75 nM、125 nM 和 200 nM 探针浓度。
- 创建标准曲线并确定效率和线性范围。测试包含目标序列的合成DNA标准的至少6个10倍稀释，大约为100份/反应，105份/反应（图3A）。
- 使用 qPCR 软件绘制 y 轴上每个标准的 Cq 值（在量化时为周期阈值）和 x 轴上副本/反应中初始标准浓度的日志基数 10。qPCR 软件应自动运行线性回归 （图3B）。
- 计算回归坡度的效率，E = -1 = 10（-1/斜坡）。例如，如果坡度为 -3.4，E= -1 = 10（0.29） = 0.97 或 97%。还要检查r2值，该值指示标准复制在曲线上的配合程度。qPCR 软件也应该自动计算此（图3B）。实现 100% 的效率值（±10%）和r2值≥0.989，15，19，20，21，22。
- 目视检查标准曲线是否存在偏差，即偏离回归方向的一致方向，或以效率和 r2值（图 3 C 和3D）衡量的标准曲线性能差。
- 特异性：评估与非目标物种的交叉反应，以减少误报的机会。如果 eDNA 检测可能导致昂贵的管理决策，则通过放大器测序验证阳性检测。
- 非目标：对相关物种和地理上共发生的物种的分类验证标本的基因组DNA提取进行检测：最优先的是测试密切相关的共发生物种。在目标样本和非目标样本中使用类似的DNA浓度。选择的浓度应从标准曲线线性范围中间附近的目标物种样本中产生放大。放大只应观察目标物种。
- 如果观察到非目标放大，则清洁并对其进行排序以验证其身份。在非目标物种的组织样本中观察目标物种的污染并不罕见，因此现阶段的所有放大都应该通过测序来验证。使用 M13 尾部引物和 M13 引物序列，从特异性测试中重新放大清洁放大器。
- 在 PCR 后实验室中，将 qPCR 产品转移到新鲜管中。使用清理套件（例如，最小化 PCR 净化套件）去除残留的引物和反应组件。
- 用 M13 尾部引物和高保真聚合酶（如磷高保真 DNA 聚合酶）进行 50μL PCR 反应，对每个 elutions 进行 1：100 稀释，并放大每个 30 个周期的 1μL。
- 在 1% 的蔗糖凝胶上运行每个反应的 10 μL，以检查预期大小的单个波段。如果没有观察到带，则增加周期数或样本量。如果观察到多个波段，凝胶将净化预期大小的波段。
- 在上面用清理套件去除残留的引物和反应组件，并测量这些的 DNA 浓度。
- 根据测序设施的说明，使用 M13 引金设置测序反应。
注：切勿在 qPCR 实验室中打开放大样本。在专门研究 PCR 后样品的实验室中准备样品进行测序。
- 敏感性：敏感性影响假阴性的机会，或未能检测目标物种DNA时，它的存在。评估每次检测的检测限制 （LOD） 和定量 （LOQ） 的限值。最后，包括内部阳性控制 （IPC）来评估样品的 PCR 抑制。多路复用，并测试此 IPC 检测与设计检测，以确保两个检测不干扰彼此。
- LOD：对合成DNA标准进行6次4倍的连续稀释，每次标准稀释8-24次复制（图4）。以 95% 的检测率计算最低初始浓度。LOD 和 LOQ 绘图可以生成 LOD/LOQ 计算器 R 脚本5。
注：不应审查 LOD 下方的数据。由于 PCR 的特殊性，真正的正数没有下限。LOD 是预计会发生假阴性的情况的最高浓度。 - LOQ：从相同的稀释系列中，计算最低初始DNA标准浓度可量化，变异系数（CV）低于35%。
注：LOD 和 LOQ 应以副本/反应报告。当使用经验证的检测和现场样品放大低于 LOQ 时，结果应报告为百分比检测，而不是 eDNA 浓度，因为确切浓度无法自信地5来测量。
- LOD：对合成DNA标准进行6次4倍的连续稀释，每次标准稀释8-24次复制（图4）。以 95% 的检测率计算最低初始浓度。LOD 和 LOQ 绘图可以生成 LOD/LOQ 计算器 R 脚本5。
- 使用内部阳性控制 （IPC） 测试 PCR 抑制。抑制可导致敏感性和假阴性降低。测试 IPC 检测与目标检测进行多路复用的能力。
- IPC 检测可以与目标检测进行多路复用，使用与目标检测不同的记者染料的探头。此 IPC 检测由与目标分类无关的物种的短合成 DNA 序列组成，以大约 102 份/反应的低浓度融入 qPCR 主组合中，以及检测该分类的引物和探头。这种较低的浓度是必要的，以避免与聚合酶和核苷酸23的目标序列竞争。
- 将样品 IPC 模板的 Cq 值与无模板控制中的 IPC 模板值进行比较。在此无模板控制 （NTC） 中，唯一的 DNA 输入是 IPC 模板输入的输入。此反应中的 IPC 模板应按预期放大。如果样本中的 IPC 模板放大的周期与 NTC 中的 IPC 模板不同，则 eDNA 示例将处于抑制。显示抑制的样本可以在 1：10 稀释并重新测试。如果样品仍然受到抑制，则应从分析中删除该样本。
- 首先，为分析找到最佳温度和引言/探针浓度值。一旦这些参数优化为 PCR 效率（步骤 3.4.2）、交叉反应性（步骤 3.4.3）和灵敏度（步骤 3.4.4），继续使用多路复用 IPC（步骤 3.4.5）进行测试。
- 原位检测开发和测试
- 在实验室中：如果有机会进入实验室中的生物体以及共生物种：从这些物种的外壳中采集水样，处理样品并测试这些 eDNA 样本的检测结果。使用 M13 尾部引物对预期目标的放大进行排序。
- 在字段中：
- 识别已知目标有机体发生且已知不会发生的地点。最好在目标物种发生的每个地点进行一定程度的丰度测量。
- 决定使用哪些样品量和样品收集方法（如过滤、离心等）。
- 包括每个站点的场面空白或负控，这是已带到现场的清洁水，然后收集和准备与相同的现场设备和协议用于 eDNA 采样24。现场空白的目的是检测带到现场的取样设备和现场设备的污染情况。在处理现场水样之前，先将田地空白取走。
- 每个地点采集多个水样，最好是每个站点 3 个样本。
- 回到实验室，处理和提取样品。
- 使用类似于图 5A的板运行测定，并将 eDNA 浓度和检测频率与已知站点在发生和丰度上的差异进行比较。通过测序24，25确认所有检测。
注：以上内容将通过Thallinger等人（2020年）第 6 级（优化检测技术性能）的第4 级验证检测，并开始收集支持 5 级检测验证的数据。第 5 级包含概率建模和用于 eDNA 生态学研究的测定。我们认为这超出了基本检测开发的范围，但我们鼓励这些实验室和现场审查检测的应用，以改善检测设计和数据解释。
Representative Results
在为泥巴（A.韧带）设计一个物种特定的qPCR检测时，下载了克林奇河中所有联盟物种的可用序列。密切相关的物种，如兰普西利斯西里奎利亚也被列入参考数据库，即使它们没有在同一条河中发现。在GenBank，并非所有感兴趣的河流系统物种都被发现，因此在内部对更多的物种进行了排序。序列使用基因软件对齐，引物任务 （IDT） 软件用于设计多个检测。在对齐中增加了五组引金和探头，用于视觉评估（图 2）。然后，他们使用引力爆炸在西里科测试，之后他们被命令在体外进行进一步测试。在实验室中，所有检测都使用27个可用物种的DNA提取进行测试，以验证特异性。一个测定（A.lig.1）成功地只放大了目标物种（表1：表2）。此检测向前推进，以进一步测试检测效率、LOD 和 LOQ。它有121个碱基对的放大子长度。表3显示用于A.韧带合成DNA标准的序列。图 3A和图 3B显示了具有良好效率和 r2值的成功检测结果。图 3C和图 3D显示标准曲线效率低的检测：此检测被丢弃。所选测定（A.lig.1）的LOD和LOQ都被发现是5.00份/反应使用克莱穆斯和5中描述的离散方法。与检测结果（表3-6）混合的IPC不会影响A.韧带检测的标准曲线。我们使用的 IPC 是鼠标 HemT 成绩单的片段。此检测由 IDT 预设计用于另一个应用程序，但我们将其用作实验室 eDNA 应用程序的 IPC。
成功的 qPCR 运行应符合每个性能指标的某些标准（即标准曲线放大、基因组 DNA 正向控制、无模板控制和内部正控）。目标检测标准应具有指数放大曲线。如果允许运行足够的周期，这些曲线应达到终点高原。这表明荧光探头在反应过程中被完全消耗，荧光水平达到最大极限。以后放大标准可能在 40 个周期内无法达到高原。正对照（基因组DNA和IPC）应该具有相同的模式。未知可能放大，也可能不放大，但未知的放大也应该有指数模式和终点高原（图5）。
在质量 qPCR 中，标准稀释放大到大约每 3.3 个周期均匀间隔的 Cq，以达到浓度的 10 倍差异。标准稀释的每个复制都以紧密分组的方式放大，具有几乎相同的 Cq（由 r2值表示）。所有标准稀释应显示放大（图3A）。在较差的 qPCR 中，标准可能表现出非指数形状、稀释之间的 Cq 值的不均匀变化，不会到达终点高原，或者某些稀释可能根本不放大（图 3D）。
标准曲线的重要参数是效率、r2、斜率和 y-拦截。效率应下降90%-110%之间，理想值接近100%，r2值应高于0.98，理想结果接近1.015，22。斜值应在 -3.2 和 -3.5 之间，理想结果接近 -3.322。y 拦截值应落在 Cq 34-41 之间，理想结果为 Cq 为 37.0。y 拦截是具有 1 个目标序列副本的反应的预测 Cq，这是可以用单个 qPCR 测量的最小单位。Cq大于y拦截的未知因素可能会受到抑制。运行超过 40 个周期的 PCR 可能需要在抑制或低效引物集的情况下检测目标，但在这种情况下无法进行量化，并且应运行没有目标序列但包含与未知数相似的完全 DNA 的其他负控件，以排除来自非特定来源的放大。
未知样品中的内部正对照 （IPC） 放大应与负模板控制 IPC 的结果进行比较，因为不存在试剂的竞争，也不存在抑制剂。IPC 的 Cq 为 2 周期或大于 NTC 的平均 Cq 值或未放大的未知数应视为抑制。如果样品中没有抑制剂，则所有 IPC 放大应在绘图中紧密分组，其 Cq 值与 NTC（图 6）大致相同。
最后，对检测进行了现场测试。2019年9月25日至26日，在距离已知有 A.韧带的贝类床500米范围内，对来自克林奇河的20个水样和3个田间空白样本进行了过滤。每个取样地点过滤了大约四个1L水样。位置地点包括在溪底的贝类床，靠近岸边的贝类床底部，河床下游100米，河床下游500米，床下游500米近岸（图7）。回到实验室，每个过滤器被切成两半，DNA只从一半的过滤器中提取。每个样品的剩余滤光片一半存储在 -80 °C 冰柜中。然后使用与 IPC 混合的 A.lig.1 检测法运行样本。在23个样本中，有5个被发现受到抑制。这些样本被稀释1：10，稀释被重新运行。20 个现场样本中，有 19 个使用设计检测放大。在这19个样本中，5个样本高于检测的LOD和LOQ的5份/反应：这意味着大多数样品都有 eDNA 检测，但在可能出现虚假阴性结果的水平上，检测无法自信地量化这 14 个样本的拷贝编号。然而，在四个生物站点中，有75%至100%在每个采样点进行放大。三个字段空白中有两个是负数，而一个场面空白确实显示了放大，强调了清洁技术在该领域的重要性。
图1：线粒体DNA序列数据库构建的工作流程。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：克林奇河贝类物种与潜在引物和Actinonaias韧带 ND1检测探针的序列对齐。深绿色前引门，红色探针，浅绿色反向引引器。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：标准曲线和线性回归示例。A.从六个标准稀释中每个复制的三个复制物中得出的可接受的标准曲线示例。标准浓度在左侧的 10 倍标准稀释系列，浓度降低到右侧。横穿所有痕迹的水平线是量值 （Cq） 周期阈值。每个跟踪跨越此阈值的位置是确定 Cq 的位置。 B.线性回归由图 3A 的标准复制品制成。标准稀释的复制品被绘制成圆圈，未知（样本）用 x 的绘制。效率为 98.9%，r2 接近 1.0，坡度为 -3.349。 C.从六个标准稀释中每个复制的三个复制物中得出的不良标准曲线示例。 D.形成标准复制标准曲线的线性回归放大示例 3C。注意效率差和r2 值。另请注意，6 项标准中只有 4 项被放大。如果重复运行后，标准曲线没有改善，问题可能出在底漆/探针设置不按预期放大目标 DNA 的情况下，不应考虑此检测。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：LOD和LOQ标准qPCR运行的板设置示例。曲线中使用的标准为蓝色，标准浓度从深蓝色降至浅蓝色。绿色DNA阳性控制，黄色无模板控制（NTC）。灰色实验标准浓度显示每个标准稀释的 24 个复制品。稀释系列被镀在两个板块（A、B）上，每个板块都有标准曲线、正控和NTC。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5：qPCR 运行中的板设置和放大痕迹。A.板设置，以蓝色显示的标准，较深的颜色表示标准浓度最高。绿色DNA阳性控制，黄色（NTC）无模板控制，样本目标为灰色。 B.从 qPCR 运行中放大痕迹。以蓝色显示的标准，绿色DNA阳性控制，黄色无模板控制，红色未知。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：内部正控制 （IPC） 的放大痕迹。IPC 跟踪洋红色和 IPC 中所有未知样品，这些样品来自橙色和三角形的无模板控件 （NTCs）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：地图显示沿弗吉尼亚/田纳西州边境的克林奇河中贝类床的eDNA收集地点。样本在床底的瓦伦斯弯道、床下游100米和床下游500米收集。站点要么收集在溪流中间（在溪流中），要么在距离海岸线（岸边）约1-2米处收集。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 元件 | 名字 | 序列5'-3' | 荧光标签 | |
| 前进引门 | A.lig.1-f | 中小板 | ||
| 反向引引器 | A.lig.1-r | 加特加塔特卡特卡塔 | ||
| 探针 | A.lig.1 探头 | 特克特加格特格特 | 家庭 | |
表1：设计了 Actinonaias 韧带 qPCR 检测 （A.lig.1）， 包括前置和反向引物和探头的序列。
| 物种 | 放大 | 在克林奇河 |
| 1. 阿克蒂诺奈亚斯韧带 | 是的 | 是的 |
| 2. 阿克蒂诺尼亚斯·佩克托罗萨 | 不 | 是的 |
| 3. 安布尔马普利卡塔 | 不 | 是的 |
| 4. 科比库拉 | 不 | 是的 |
| 5. 坎伯兰迪亚单体 | 不 | 是的 |
| 6. 基科纳亚斯块茎 | 不 | 是的 |
| 7. 西普罗根尼亚斯特加里亚 | 不 | 是的 |
| 8. 埃利普蒂奥·迪拉塔塔 | 不 | 是的 |
| 9. 埃皮奥贝拉斯马布雷维登斯 | 不 | 是的 |
| 10. 埃皮奥贝拉斯马辣椒 | 不 | 是的 |
| 11. 埃皮奥拉斯马弗洛伦蒂娜·奥雷奥拉 | 不 | 是的 |
| 12. 埃皮奥贝拉斯马三轮车 | 不 | 是的 |
| 13. 富斯科奈亚·科尔 | 不 | 是的 |
| 14. 富斯科纳亚亚亚罗通达 | 不 | 是的 |
| 15. 兰普西利斯·奥瓦塔 | 不 | 是的 |
| 16. 兰普西利斯·西里奎迪亚 | 不 | 不 |
| 17. 拉斯米戈纳·科斯塔塔 | 不 | 是的 |
| 18. 莱米奥克斯里莫苏斯 | 不 | 是的 |
| 19. 列克星敦尼亚多拉贝洛德斯 | 不 | 是的 |
| 20. 梅迪亚尼杜斯对心花 | 不 | 是的 |
| 21. 普莱索巴苏斯·西菲乌斯 | 不 | 是的 |
| 22. 普洛贝马全会 | 不 | 是的 |
| 23. 普蒂乔布兰丘斯法西斯 | 不 | 是的 |
| 24. 普蒂乔布兰丘斯子滕图斯 | 不 | 是的 |
| 25. 夸德鲁拉·普斯托洛萨 | 不 | 是的 |
| 26. 频闪 | 不 | 是的 |
| 27. 维洛萨虹膜 | 不 | 是的 |
表2：用于A.lig.1检测体外特异性测试的物种列表。 检测放大了目标的基因组DNA（Actinonaias韧带），并没有放大任何非靶种。
| 元件 | 序列 5'-3' | ||||
| 阿克蒂诺奈亚斯利格门蒂娜 标准 | 中小康反恐委员会 | ||||
| 阿格特克特行动卡塔奇加格CC卡阿塔阿加塔特格卡特克茨 | |||||
| 中加塔加特克塔克塔克特加特卡卡卡特 | |||||
| 卡卡塔克卡特卡塔卡卡特塔克塔克特 | |||||
| 加卡特塔卡特 | |||||
| 特格特卡特克茨塔克塔卡卡格特卡卡特卡 | |||||
| 阿塔塔格塔格塔克塔克卡 | |||||
| 塔克 | |||||
| IPC 模板（下摆- T） | 卡塔塔阿卡卡特卡克特加特克特卡加特卡加特 | ||||
| 格塔·特加卡格特格特加卡特克·克特·克特·克特·克特克特·克特克特·塔格特·塔格特克·阿克 | |||||
表3：用于此检测的 Actinonas 韧带 标准和 IPC 模板 （Hem-T） 的序列 （5'-3'）。 前向和反向引物的序列为粗体和斜体，并强调探针的顺序。
| 元件 | 名字 | 序列5'-3' | 荧光标签 | |
| 前进引门 | 赫姆特 - F | 贸易技术 | ||
| 反向引引器 | 亨特 - r | 加卡塔加格 | ||
| 探针 | 赫姆特 - P | 特加卡格特克特克特格特加卡塔茨克 | Cy5 | |
表4：内部正控 （IPC） 分析，包括前向和反向引物和探头的序列。
| 每个样本的体积 （μL） | 元件 |
| 10 | 环境大师混合 |
| 1 | 20uM A. lig.1 F/R 混合 |
| 1 | 2.5uM A. lig.1 探头 |
| 1 | 5uM IPC 引物组合（赫姆特-F/R） |
| 0.75 | 2.5uM IPC 探头（亨特-P） |
| 1.5 | IPC 模板的 1 X10 3 浓度 |
| 2.75 | H20 |
| 2 | 样本 |
| 20 | 总成交量 |
表5：用于与IPC检测多路复用的A.lig.1检测的PCR组合。
| 步 | 温度 （°C ） | 时间 | |
| 1 | 初始装饰 | 95 | 10 分钟 |
| 2 | 装饰 | 95 | 15 秒 |
| 3 | 退火 | 60 | 1 分钟 |
| 4 | 转到步骤2，重复39X |
表6：A.lig.1检测的反应条件。
Discussion
与任何研究一样，确定要解决的问题是第一步，eDNA检测的设计取决于研究的范围26.例如，如果研究或调查的目标是检测一个或几个物种，则最好采用有针对性的基于探针的检测。但是，如果目标是评估更大的套件或物种组合，则高吞吐量测序元条编码测定更适合。一旦确定采用哪种方法，建议进行包括检测设计、测试和优化在内的试点研究24.分析设计从描述的物种列表开始 图1.此列表将是了解测定在特异性和可能应用于地理范围方面的表现的基础6,10.我们鼓励为特定地理区域设计检测结果，使设计者能够更好地测试该区域其他物种的交叉反应性，并意识到这对于将检测扩展到可能发生目标物种的其他区域的局限性24.列表完成后，可以从公共遗传数据库下载序列。由于这些数据库不完整27，应尽可能多地在内部对名单上的物种进行排序，以完成将用于检测设计的序列的本地参考数据库。优先考虑共同发生的密切相关的物种，因为这些是最有可能扩大的非目标。关注与目标物种相同的属或家族内的所有物种是一个很好的开始。与密切相关的物种进行比较将有助于确定目标物种特有的序列区域。这有助于告知检测可能在其他系统或位置中如何执行。线粒体区域是检测发展的常见选择，因为在用于生命项目条形码的线粒体基因中，来自更多种类物种的序列信息更多，而且线粒体DNA在拷贝/细胞中的浓度远高于核DNA24,28,29.应评估多个基因区域以进一步检测开发，因为基因库数据库中的分类范围各不相同。创建此参考序列的本地数据库后，将对齐序列数据和计算机软件程序的手动可视化组合用于设计引物/探头分析。人们不应该严格依赖软件来确定要测试的检测。重要的是要在目标和非目标的引物和探头所在的对齐位置上进行视觉验证，以便更好地了解它们在 PCR 中可能如何执行。最后，检测筛选和优化包括三个级别（在西里科、体外和原位）6,7,24,25.在 silico 设计和测试中，生成具有良好成功机会的分析短列表非常重要，但实证（体外）测试对于选择具有最佳实际性能的检测至关重要。体外优化和检测测试包括测量反应效率和定义检测的灵敏度和特异性。检测和量化的局限性是检测开发中经常忽略的两个参数，但对于数据解释很重要。通过运行标准曲线的多个复制品进行检测，可以轻松测量 LOD 和 LOQ1,5,30.很少有研究讨论与检测的LOD或LOQ有关的结果，但Sengupta等人（2019年）将他们的检测的LOD和LOQ纳入他们的数据解释和图形中，以便更清楚地了解其结果31.内部正控应多路复用到设计分析中。如果不在样品中检测 PCR 抑制，可能会发生假阴性24,32.我们建议使用多路复用 IPC 检测与目标检测作为 PCR 抑制测试的最简单方法23.最后，有必要对现场和实验室采集的样品进行现场检测，以确保环境样品中发生目标放大24.
使用带有 eDNA 样本的基于探针的 qPCR 检测存在限制。例如，测试的多个检测设计可能受序列可用性的限制，并且可能需要在检测性能方面做出妥协。这些选择必须以研究的目标为指导，并且必须报告结果26。例如，如果目标是检测稀有物种，并且预计很少出现阳性，则如果所有检测都将通过测序验证，则可以使用非目标物种的异常检测（即非目标物种的放大）。如果目标是监测物种的地理范围，并且不需要 eDNA 浓度数据，则可以使用效率不完美的检测，并且仅以百分比检测方式报告数据。此外，除非在实验室中测试所有潜在的特异性，这很少是可能的，否则人们不能绝对肯定地知道检测的真正特异性。例如，该检测是针对克林奇河中的几个淡水贝类物种进行设计和测试的。要在不同的河流系统中使用此检测，我们需要根据新位置的一组物种进行测试。在检测发育过程中未测试的物种或种群中的遗传变异也可能影响特异性。最后，即使检测已验证具有较高的技术性能：在外地工作时，情况会发生变化。非检测相关条件，如水流、pH 和动物行为，可以改变 eDNA 的可检测性，也可以使用不同的 eDNA 收集和提取协议。使用优化和描述良好的检测将有助于理解这些参数对 eDNA 检测的影响。
eDNA领域正在从探索性分析阶段走向日益标准化的方法和技术。这些发展将提高我们对 eDNA 技术、能力和局限性的理解。我们上面概述的优化过程提高了分析的灵敏度、特异性和可重复性。eDNA 方法的改进和标准化的最终目标是提高研究人员根据 eDNA 数据进行推断的能力，并提高最终用户和持股人对结果的信心。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。资助赞助者在研究设计方面没有作用：在数据的收集、分析或解释中;在手稿的写作中;或在决定公布结果。
Acknowledgments
我们感谢阿尔维·瓦杜德和特鲁迪·弗罗斯特，他们帮助了引物的开发和测试。本研究报告的检测设计经费由国防部战略环境研究与发展方案（RC19-1156）提供。任何使用贸易、产品或公司名称都仅用于描述性目的，并不意味着美国政府的认可。本研究期间生成的数据可作为美国地质调查局的数据发布 https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
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