Summary
पर्यावरण डीएनए परख क्षेत्र डेटा के संग्रह शुरू कर सकते हैं इससे पहले कि कठोर डिजाइन, परीक्षण, अनुकूलन और सत्यापन की आवश्यकता होती है। यहां, हम पर्यावरण के नमूनों से एक लक्षित प्रजाति डीएनए का पता लगाने और मात्राकरण के लिए एक प्रजाति-विशिष्ट, जांच-आधारित क्यूपीसीआर परख डिजाइन करने के प्रत्येक कदम के माध्यम से उपयोगकर्ताओं को लेने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मत्स्य पालन और वन्यजीव संरक्षण प्रबंधन में सहायता के लिए प्रजातियों की उपस्थिति का पता लगाने और निगरानी के लिए नए, गैर-आक्रामक तरीके विकसित किए जा रहे हैं । मैक्रोबायोटा का पता लगाने के लिए पर्यावरण डीएनए (ईडीएनए) नमूनों का उपयोग तरीकों का एक ऐसा समूह है जो तेजी से लोकप्रिय हो रहा है और राष्ट्रीय प्रबंधन कार्यक्रमों में लागू किया जा रहा है । यहां हम जांच आधारित मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) अनुप्रयोगों के लिए प्रजातियों-विशिष्ट लक्षित परख के विकास पर ध्यान केंद्रित करते हैं। जांच-आधारित क्यूपीसीआर का उपयोग अकेले प्राइमर के साथ संभव की तुलना में अधिक विशिष्टता प्रदान करता है। इसके अलावा, एक नमूने में डीएनए की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता eDNA की पारिस्थितिकी और क्षेत्र में eDNA का पता लगाने पैटर्न की व्याख्या के बारे में हमारी समझ में उपयोगी हो सकता है । पर्यावरणीय नमूने से लक्षित प्रजातियों का पता लगाने की संवेदनशीलता और विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए इन परखों के विकास और परीक्षण में सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में हम एक लक्षित प्रजातियों का पता लगाने के लिए जांच आधारित परख को डिजाइन और परीक्षण करने के लिए आवश्यक कदमों को चित्रित करेंगे; अनुक्रम डेटाबेस, परख डिजाइन, परख चयन और अनुकूलन, परीक्षण परख प्रदर्शन, और क्षेत्र सत्यापन के निर्माण सहित। इन चरणों के बाद एक कुशल, संवेदनशील, और विशिष्ट परख है कि विश्वास के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है प्राप्त करने में मदद मिलेगी । हम इस प्रक्रिया को अपने परख के साथ प्रदर्शित करते हैं जो कि कड़ी नदी, संयुक्त राज्य अमेरिका में पाई जाने वाली मीठे पानी की मसल प्रजातियों गोबर(Actinonaias स्नायु बंधन)की आबादी के लिए डिज़ाइन किया गया है।
Introduction
शोधकर्ताओं और प्रबंधकों को तेजी से प्रजातियों का पता लगाने के लिए पर्यावरण डीएनए परख के उपयोग में रुचि हो रही है । तीन दशकों से, मात्रात्मक या वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर/आरटीपीसीआर) का उपयोग कई क्षेत्रों में न्यूक्लिक एसिड1,2के अनुक्रम-विशिष्ट पहचान और मात्राकरण के लिए किया गया है। EDNA अनुसंधान के अपेक्षाकृत नए क्षेत्र के भीतर, मात्रा या eDNA नमूने के वजन प्रति लक्ष्य डीएनए की प्रतियां की मात्रा के मात्राकरण के लिए एक मानक वक्र के साथ इन परख का उपयोग अब नियमित अभ्यास बन गया है । माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दृश्यों को आम तौर पर ईडीएनए में लक्षित किया जाता है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम प्रति सेल हजारों प्रतियों में मौजूद है, लेकिन परमाणु डीएनए या आरएनए दृश्यों के लिए परख भी संभव है। यह समझना महत्वपूर्ण है कि eDNA नमूनों के लिए प्रकाशित परख हमेशा प्रदर्शन में बराबर नहीं हैं। केवल एक लक्ष्य प्रजातियों (यानी, विशिष्टता) के डीएनए का पता लगाने में एक परख की विश्वसनीयता और लक्ष्य डीएनए (यानी, संवेदनशीलता) की कम मात्रा का पता लगाने में काफी अंतर के कारण कैसे परख डिजाइन किया गया था, चयनित, अनुकूलित और परीक्षण में अंतर हो सकता है । परख प्रदर्शन के मात्रात्मक उपायों की रिपोर्टिंग पहले काफी हद तक अनदेखी की गई है, लेकिन हाल ही में परख विकास में पारदर्शिता में सुधार के लिएमानक3, 4,5,6,7,8उभर रहे हैं ।
अध्ययन डिजाइन और एडीएनए सर्वेक्षण परिणामों की व्याख्या में परख प्रदर्शन एड्स का अनुकूलन और रिपोर्टिंग। परक कहते हैं कि गैर-लक्षित प्रजातियों डीएनए के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया झूठी सकारात्मक पहचान का कारण बन सकती है, जबकि खराब संवेदनशीलता के साथ परख नमूने (झूठी नकारात्मक) में मौजूद होने पर भी लक्षित प्रजातियों के डीएनए का पता लगाने में विफल हो सकती है। परख संवेदनशीलता और चयनशीलता की समझ दुर्लभ प्रजातियों का पता लगाने के लिए आवश्यक नमूना प्रयास को सूचित करने में मदद करेगी। चूंकि ईडीएनए में भिन्नता के कई प्राकृतिक स्रोत हैं, इसलिए अध्ययनों को जितना संभव हो भिन्नता के नियंत्रणीय स्रोतों को सीमित करना चाहिए, जिसमें पूरी तरह से अनुकूलन और एडीएनए परख3की विशेषता शामिल है।
स्थितियां जो सीधे परख की विशिष्टता या संवेदनशीलता को प्रभावित करेंगी, परख के प्रदर्शन को बदल देंगी। यह विभिन्न प्रयोगशाला स्थितियों (यानी, विभिन्न अभिकर्षकों, उपयोगकर्ताओं, मशीनों, आदि) के तहत हो सकता है। इसलिए, नई शर्तों के तहत परख लागू करते समय इस प्रोटोकॉल पर फिर से गौर किया जाना चाहिए। यहां तक कि साहित्य में अच्छी तरह से विशेषता का परीक्षण किया जाना चाहिए और अनुकूलित जब एक नई प्रयोगशाला द्वारा अपनाया या जब विभिन्न अभिकर्दकों (जैसे, मास्टर-मिक्स समाधान) का उपयोग कर5,9। परख विशिष्टता बदल सकता है जब एक अलग भौगोलिक क्षेत्र के लिए लागू है, क्योंकि परख एक नए बायोटिक समुदाय है कि गैर लक्ष्य प्रजातियों है कि परख के खिलाफ परीक्षण नहीं किया गया है शामिल हो सकते है से नमूनों के लिए लागू किया जा रहा है, और लक्ष्य प्रजातियों में आनुवंशिक भिन्नता हो सकती है । फिर, परख फिर से मूल्यांकन किया जाना चाहिए जब एक नए स्थान में इस्तेमाल किया । क्षेत्र की स्थिति प्रयोगशाला की स्थिति से भिन्न होती है क्योंकि क्षेत्र में पीसीआर अवरोधक नमूनों में अधिक मौजूद होते हैं। पीसीआर अवरोधक सीधे प्रवर्धन प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार परख प्रदर्शन को प्रभावित करते हैं। इस कारण से, एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता है जब एक eDNA परख विकसित करने।
अंत में, क्षेत्र में पर्यावरण की स्थिति लक्षित प्रजातियों के डीएनए अणुओं और डीएनए क्षरण, परिवहन और प्रतिधारण के माध्यम से उनके कब्जे को प्रभावित कर सकती है । इसके अलावा, डीएनए संग्रह और निष्कर्षण के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल उनकी दक्षता और डीएनए को बनाए रखने की क्षमता में भिन्न होते हैं। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये प्रक्रियाएं ईडीएनए की पता लगाने की क्षमता को प्रभावित करती हैं लेकिन आणविक परख का प्रदर्शन नहीं। इस प्रकार, क्षेत्र के नमूनों में लक्षित प्रजातियों से डीएनए का पता लगाने की क्षमता क्यूपीसीआर परख के तकनीकी प्रदर्शन के साथ-साथ क्षेत्र की स्थिति और संग्रह, भंडारण और निष्कर्षण प्रोटोकॉल दोनों का एक कार्य है। एक अच्छी तरह से विशेषता और अत्यधिक प्रदर्शन परख का उपयोग करते समय, उपयोगकर्ता परख की क्षमताओं में आत्मविश्वास महसूस कर सकते हैं; शोधकर्ताओं को अब बाहरी परख कारकों (यानी, पर्यावरण चर, कब्जा या निष्कर्षण प्रोटोकॉल में अंतर) को समझने पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देने से ईडीएनए का पता लगाने को प्रभावित किया जा सकता है।
यहां हम कठोर डिजाइन और अनुकूलन के माध्यम से परख तकनीकी प्रदर्शन पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित करते हैं। हम एक मीठे पानी की मसल, म्यूकेट(Actinonaias स्नायु)का पता लगाने के लिए विकसित जांच आधारित परख का उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं, जो कड़ी नदी, संयुक्त राज्य अमेरिका में नमूने गए पानी से है। हाल ही में Thalinger एट अल (2020) लक्षित eDNA परख के सत्यापन के लिए दिशा निर्देश प्रस्तुत किया। हमारे प्रोटोकॉल के बाद परख डिजाइन Thalinger एट अल के स्तर 4 प्लस स्तर 5 6 की दिशा में एक अतिरिक्त कदम के लिए एक परखलाएगा। इस बिंदु पर एक परख के तकनीकी प्रदर्शन को अनुकूलित किया जाएगा और यह प्रयोगशाला और क्षेत्र अनुप्रयोगों में नियमित उपयोग के लिए तैयार हो जाएगा। प्रयोगशाला, मेसोकोस्म और क्षेत्र प्रयोगों में परख का और उपयोग तब ईडीएनए डिटेक्शन और पता लगाने की क्षमता को प्रभावित करने वाले कारकों के बारे में प्रश्नों का समाधान कर सकता है, स्तर 5 सत्यापन6के लिए अंतिम चरण।
Protocol
1. लक्ष्य और गैर-लक्षित प्रजातियों से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अनुक्रमों के अनुक्रम डेटाबेस का उत्पादन
- प्रश्न, लक्ष्यों और प्रणाली को परिभाषित किया जा रहा है । ईडीएनए डिटेक्शन के लिए लक्षित प्रजातियों की पहचान करें। जिस भौगोलिक प्रणाली में परख का उपयोग किया जाएगा, उसकी पहचान करें। एक ही टैक्सा (आमतौर पर आदेश या पारिवारिक स्तर) के भीतर लक्षित प्रजातियों, सिम्पेट्रिक (सह-होने वाली) प्रजातियों सहित ब्याज की प्रजातियों की एक सूची बनाएं, और बारीकी से संबंधित एलोपैथिक प्रजातियां, जो लक्ष्य(चित्रा 1)के समान भौगोलिक स्थान में नहीं हो सकती हैं।
नोट: यहां, ए स्नायुओं की प्रजातियों की कड़ी नदी आबादी को निशाना बनाया गया था । - चरण 1 से सूची में प्रजातियों के लिए कई जीन क्षेत्रों से दृश्यों को खोजें और डाउनलोड करें। एनसीबीआई (नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन), बोल्ड (बारकोड ऑफ लाइफ डाटाबेस), ईएमबीएल (यूरोपियन मॉलिक्यूलर बायोलॉजी लेबोरेटरी) और डीडीबीजे (डीएनए डाटा बैंक ऑफ जापान) जैसे सीक्वेंस डेटाबेस का इस्तेमाल किया जा सकता है । एनसीबीआई, ईएमबीएल और डीडीबीजे सभी शेयर सीक्वेंस की जानकारी।
- एनसीबीआई के न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस का उपयोग करके, लक्ष्य जीव (जैसे, ऐक्टिनोनियास स्नायु बंधन)और जीन क्षेत्र (उदाहरण के लिए, साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस I (सीओआई) या एनएचएच-डिहाइड्रोजनेज 1 (ND1) की खोज करें; उदाहरण खोज स्ट्रिंग: Actinonaias स्नायु बंधन और ND1)
- इसके बाद, उन सभी दृश्यों का चयन करें जो विनिर्देशों से मेल खाते हैं और भेजें का चयन करते हैं। पूरा रिकॉर्डचुनें, फाइल करें और डाउनलोड प्रारूप को या तो जेनबैंक या फास्टा के रूप में चुनें और फिर फ़ाइल बनाएं। ये सीक्वेंस अब कंप्यूटर में सेव हो जाते हैं।
- चरण 1 में परिभाषित सूची पर सभी प्रजातियों के लिए इन चरणों को दोहराएं। प्रत्येक जीन क्षेत्र के लिए दृश्यों को एक अलग फ़ाइल में रखें क्योंकि इनका अलग से विश्लेषण किया जाएगा।
- चरण 1 में पहचाने गए लक्ष्य प्रजातियों के लिए सभी प्रासंगिक दृश्यों (या दृश्यों का एक बड़ा, प्रतिनिधि अनुपात) डाउनलोड करें। यदि संभव हो तो भौगोलिक वेरिएंट शामिल करें।
- एक ही वर्गीकरण समूह की संबंधित और सिम्पेट्रिक गैर-लक्षित प्रजातियों के लिए खोज और डाउनलोड दृश्यों को दोहराएं जिन्हें चरण 1 में पहचाना गया था (उदाहरण के लिए, यदि लक्षित प्रजातियां परिवार संघिडी में अन्य सभी मीठे पानी की मसल प्रजातियों के लिए गोबर(ए स्नायु)डाउनलोड दृश्य हैं जो ब्याज की प्रणाली में होती हैं)।
- खोज दोहराएं और बारीकी से संबंधित लेकिन एलोपेट्रिक (भौगोलिक रूप से अलग) प्रजातियों के लिए डाउनलोड करें जो चरण 1.1 में सूचीबद्ध हैं।
नोट: सार्वजनिक डेटाबेस में सभी प्रजातियां (लक्ष्य और गैर-लक्ष्य) उपलब्ध नहीं होंगी। घर में ब्याज की प्रजातियों के वर्गीकरण और अनुक्रमण वर्गीकरण और अनुक्रमण द्वारा स्थानीय संदर्भ डेटाबेस बढ़ाएं। यदि एक ऐसी प्रजाति के साथ काम करना है जिसमें उच्च प्रजाति आनुवंशिक विविधता है या भौगोलिक रूप से बड़े क्षेत्र में काम कर रहा है जहां भौगोलिक वेरिएंट की उम्मीद की जा सकती है, तो सीमा पार से दृश्यों को इकट्ठा करें।
2. परख डिजाइन
- संरेखण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक जीन क्षेत्र से दृश्यों को अलग-अलग संरेखित करें जो विभिन्न आनुवंशिक अनुक्रम संपादन और जैव सूचना कार्यक्रमों में पाए जा सकते हैं। विभिन्न जीन क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए इस संरेखण करते हैं।
- उदाहरण के लिए, जेनेरियस प्राइम सॉफ्टवेयर (https://www.geneious.com) का उपयोग करके डाउनलोड की गई अनुक्रम फ़ाइलों को कार्यक्रम में आयात करें।
- प्रत्येक जीन क्षेत्र के लिए अलग फ़ोल्डर बनाएं।
- एक फ़ोल्डर के भीतर जिसमें एक जीन क्षेत्र से दृश्य होते हैं, सभी दृश्यों का चयन करें।
- चयनित दृश्यों का न्यूक्लियोटाइड संरेखण बनाने के लिए मल्टीपल अलाइनमेंट टूल का उपयोग करें। संरेखण के प्रकार के लिए कई विकल्प हो सकते हैं, वंशावली या मांसपेशी संरेखण का उपयोग करके और डिफ़ॉल्ट पैरामीटर अच्छी तरह से काम करते हैं।
- गठबंधन अनुक्रम डेटा के दृश्य के माध्यम से परख डिजाइन के लिए आशाजनक क्षेत्रों का चयन करें। एक क्षेत्र है कि अनुक्रम डेटा का एक बहुत ब्याज की प्रजातियों के लिए उपलब्ध है, प्रजातियों के बीच अत्यधिक अलग है, और कम के भीतर प्रजातियों भिन्नता से पता चलता है एक अच्छा उंमीदवार है । इससे इस बात की संभावना बढ़ जाएगी कि डिजाइन किए गए प्राइमर और प्रोब गैर-लक्षित प्रजातियों से लक्ष्य को भेदभाव करने में सक्षम होंगे, जबकि यह भी सुनिश्चित करेंगे कि अंतरविशिष्ट वेरिएंट परख के साथ बढ़ाया जाएगा ।
- परख प्राइमर और जांच का डिजाइन।
- क्यूपीसीआर परख डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और निर्देशों का पालन करें। आइडीसीआर के 5 सेट डिजाइन करने के लिए IDT के प्राइमरक्वेस्ट टूल (https://www.idtdna.com/) का उपयोग यहां किया गया था।
- अनुक्रम प्रवेश बॉक्स में चरण 2.2 में चयनित अनुक्रम पेस्ट करें। यदि संरेखण ने रिक्त स्थान बनाए हैं, तो अनुक्रम से उन लोगों को हटा दें।
- चुनें अपने डिजाइन विकल्प में QPCR 2 प्राइमर + प्रोब का चयन करें।
- अनुशंसित परख डाउनलोड करें।
- पहले परख के आगे प्राइमर से दृश्यों की प्रतिलिपि, और चरण 2.1.4 में बनाया संरेखण में इस प्राइमर अनुक्रम के लिए खोज। यदि वंशावली प्राइम का उपयोग कर रहे हैं, तो एनोटेट और भविष्यवाणी उपकरण का उपयोग करें ताकि प्राइमर क्षेत्र को संरेखण में जोड़ा जा सके। सभी प्राइमर और जांच संयोजनों(चित्रा 2) केलिए ऐसा करें।
- लक्ष्य प्रजातियों के भीतर और साथ ही सह-होने वाली प्रजातियों के भीतर भिन्नता के लिए संरेखण के इन क्षेत्रों का निरीक्षण करें।
- यदि अंतरविशिष्ट आनुवंशिक भिन्नता है, तो उन परखों की खोज करें जहां प्राइमर और जांच इन क्षेत्रों के भीतर नहीं आती है।
- गैर-लक्षित प्रजातियों के प्रवर्धन को रोकने के लिए, गैर-लक्षित प्रजातियों के साथ बेमेल की खोज करें। आगे सत्यापन के लिए सबसे बेमेल के साथ परख चुनें। Currier एट अल ( २०१८) तीन क्षेत्रों में से कम से दो के साथ सेट चुनने का सुझाव (दो प्राइमर, या एक प्राइमर और एक जांच) सभी गैर लक्ष्य प्रजातियों के साथ कम से दो बेमेल होने । हालांकि, ध्यान रखें कि जांच में बेमेल विशिष्टता10में कम योगदान करते हैं ।
नोट: प्रत्येक प्राइमर के 3 ' अंत के 3 आधार जोड़े के भीतर मतभेद विशिष्टता में वृद्धि प्राइमर10के 5 ' अंत में मतभेदों से बेहतर है ।
- परख डिजाइन में निम्नलिखित महत्वपूर्ण मापदंडों पर विचार करें।
- प्राइमर और जांच के पिघलने और एनेलिंग तापमान का निर्धारण करें। आदर्श रूप से प्राइमर का पिघलने का तापमान (टीएम) 60-64 डिग्री सेल्सियस के बीच और एक दूसरे के 2 डिग्री सेल्सियस के भीतर होना चाहिए, और जांच का टीएम प्राइमर के टीएम से 6-8 डिग्री अधिक होना चाहिए। क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के एनीलिंग तापमान (टीए) को पिघलने के तापमान से 5 डिग्री सेल्सियस नीचे, 55-60 डिग्री सेल्सियस11के आसपास सेट करें।
- जीसी सामग्री की जांच करें। 35 - 65% जीसी सामग्री के बीच चुनें, और 4 या अधिक लगातार जीएस वाले क्षेत्रों से बचें। प्राइमर (जीसी क्लैंप) के 3 ' अंत के 5 अंतिम ठिकानों में 1 या 2 जीएस या सीएस होने से विशिष्टता बढ़ सकती है क्योंकि इससे प्राइमर को एक मजबूत बॉन्ड12बनाने में मदद मिलेगी ।
- हेयरपिन और डिमर संरचनाओं के लिए खोजें। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड विश्लेषण कार्यक्रम (जैसे, ओलिगोएनलाइजर -आईडीटी13)का उपयोग करके अनुमानित हेयरपिन संरचनाओं और डिमर्स के लिए परीक्षण प्राइमर और जांच; ओलिगोकैलरेटर14)। ये संरचनाएं गैर-लक्षित प्रवर्धन और कम दक्षता का कारण बन सकती हैं। परख से बचें जो इन संरचनाओं के रूप में भविष्यवाणी कर रहे हैं।
- प्राइमर लंबाई निर्धारित करें। 20-25 ठिकानों के बीच लंबाई और जांच लंबाई में 18-25 ठिकानों के बीच प्राइमर के लिए लक्ष्य। लंबे समय तक प्राइमर और जांच में कम प्रवर्धन दक्षता हो सकती है।
- एम्प्लिकॉन लंबाई निर्धारित करें। यह लगभग 100 और 250 आधार जोड़े के बीच होना चाहिए। यह सीमा आम तौर पर उच्च पीसीआर दक्षता के लिए पर्याप्त है, लेकिन सेंगर अनुक्रमण4,15द्वारा सत्यापन में आसानी के लिए काफी लंबी है।
- डिजाइन जांच। सुनिश्चित करें कि जांच 5 ' अंत में एक जी आधार नहीं है, क्योंकि यह हरे और पीले रंग11से संकेत गीला कर सकता है । हमने आईडीटी 3IABkFQ और ज़ेन शमन और एफएएम या एचेक्स फ्लोरोफोरस के साथ डबल शमन जांच तैयार की है।
नोट: एमजीबी जांच निर्धारित करें: TaqMan एमजीबी (माइनर ग्रूम बाइंडर) जांच अक्सर eDNA अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, क्योंकि ये जांच बहुत कम हैं, वे 2 या 3 बेस जोड़ी बेमेल10के साथ भी गैर-लक्ष्यों को बांध सकते हैं। - जांच का निर्धारण करें टीएम जांच का पिघलने का तापमान प्राइमर की तुलना में 6-8 डिग्री सेल्सियस अधिक होना चाहिए । कम तापमान जांच की बाध्यकारी सफलता को कम करता है ।
- जांच की लंबाई और स्थान निर्धारित करें। जांच लंबाई में 20 और 25 बीपी के बीच होना चाहिए और आदर्श रूप से इसे ओवरलैपिंग के बिना एक ही कतरा पर प्राइमर बाध्यकारी साइट के करीब स्थित होना चाहिए ।
3. परख स्क्रीनिंग और अनुकूलन
- सिलिको परख विकास और परीक्षण में। प्राइमर-प्रोब सेट का आदेश देने से पहले, सिलिको में प्राइमर प्रवर्धन का परीक्षण करके विशिष्टता (संभावित गैर-लक्ष्य प्रवर्धन) का आकलनकरें।
- एनसीबीआई के प्राइमर-ब्लास्ट16 या इसी तरह के कार्यक्रमों के माध्यम से प्राइमर का परीक्षण करें जो एनसीबीआई एनटी/एनआर डेटाबेस में संभावित गैर-लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं जो परख के साथ बढ़ा सकते हैं। यदि प्राइमर-ब्लास्ट पेस्ट प्राइमर का उपयोग कर रहे हैं तो प्राइमर मापदंडों के तहत अपने स्वयं के प्राइमर बॉक्स का उपयोग करें। प्राइमर पेयर विशिष्टता जांच मापदंडों विकल्पों में, डेटाबेस के रूप में एनआर का चयन करें और जीव बॉक्स में ब्याज के जीव (जैसे, "Unionida" या "Unionoida") के आदेश टाइप करें।
- गठबंधन अनुक्रम डेटा पर नेत्रहीन प्राइमर/प्रोब सेट का आकलन करना जारी रखें ।
- सिलिको में एक ही समय में प्राइमर और जांच का आकलन करने के लिए, फॉरवर्ड प्राइमर, 12 एन, जांच, 12 एन, और रिवर्स प्राइमर के रिवर्स पूरक का एक पाठ स्ट्रिंग बनाएं। यदि जांच अनुक्रम प्राइमर में से एक के 12 आधार जोड़े के भीतर है, तो प्राइमर और जांच के बीच आधार जोड़े की संख्या के अनुरूप एन की संख्या का उपयोग करें।
- एनआर डेटाबेस17के खिलाफ खोज करने के लिए एनसीबीआई के न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट सर्च (ब्लास्टन) का उपयोग करें। कुछ बेमेल के साथ गैर-लक्षित प्रजातियों की तलाश करने के लिए टैक्सोनोमी टैब का उपयोग करें; परख अनुकूलन के दौरान प्रयोगशाला में इनका परीक्षण किया जाना चाहिए।
नोट: सिलिको परीक्षण में गैर-विशिष्ट परख से इंकार करने में मदद करता है, लेकिन संभावित विशिष्ट परख का अनुभवजन्य (इन विट्रो) परीक्षण किया जाना चाहिए, क्योंकि सभी प्रजातियों में आनुवंशिक डेटाबेस और प्राइमर में दृश्य नहीं होते हैं और जांच अभी भी सॉफ्टवेयर द्वारा अप्रत्याशित समझे जाने पर भी गैर-लक्ष्यों को बांध सकती है।
- प्रयोगशाला में परीक्षण करने के लिए तीन से पांच प्राइमर/जांच संयोजन चुनें।
- आदेश प्राइमर, जांच और एक सिंथेटिक डीएनए मानक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अतिरिक्त M13-एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के लिए पूंछ प्राइमर ।
- आदेश सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लिटाइड प्राइमर और एक कंपनी है कि ओलिगोस बनाता से जांच । जांच एक फ्लोरोसेंट डाई और एक quencher के साथ चिह्नित कर रहे हैं । परख के लिए विभिन्न फ्लोरोफोरस का चयन किया जाना चाहिए जिन्हें मल्टीप्लेक्स किए जाने की आवश्यकता है। एक सूची के लिए अपने क्यूपीसीआर उपकरण की जांच करें जिसमें से फ्लोरोफोरस उपकरण का पता लगा सकता है।
- डिजाइन और आदेश M13-पूंछ प्राइमर M13 आगे (-20) अनुक्रम, जीटीए AAA CGA CGG CCA जीटी, फॉरवर्ड प्राइमर के 5 ' अंत करने के लिए जोड़कर सेंगर अनुक्रम के साथ QPCR डिटेक्शन के सत्यापन के लिए, और M13 रिवर्स (-27) अनुक्रम, CAG GAA ACAT जीसी एटीजी एसी, रिवर्स प्राइमर के 5 ' अंत करने के लिए ।
- सिंथेटिक डीएनए मानक प्रतियां में एक ज्ञात एकाग्रता पर लक्ष्य अनुक्रम (प्राइमर क्षेत्रों सहित) शामिल है/ उसी कंपनी से सिंथेटिक मानक प्राप्त करें जो प्राइमर और जांच का निर्माण करती है। पुनर्पौण और भंडारण के लिए निर्माता सिफारिशों का पालन करें। हाइड्रोलिसिस को कम करने और सतहों के लिए बाध्यकारी करने के लिए कम प्रतिधारण प्लास्टिकवेयर का उपयोग करके एक tRNA वाहक के साथ टीई बफर में मानकों को पतला करें।
नोट: यदि मानक वक्र अच्छा प्रदर्शन नहीं करता है (खराब पीसीआर दक्षता, चरण 3.4.2 देखें), तो पानी या ट्राइस-एचसीएल में मानक को फिर से निलंबित करने का प्रयास करें। - परख के उपयोग के लिए सुविधाजनक सांद्रता पर नाभिक मुक्त पानी, Tris-HCl, या टी बफर में प्राइमर और जांच निलंबित करें। आम तौर पर, अनुकूलित अंतिम परख एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मास्टर मिश्रण में 20 गुना काम कर रहे शेयरों को पतला करें। उपयोग में नहीं होने पर लगातार -20 डिग्री सेल्सियस पर निलंबित ओलिगोस को स्टोर करें।
- इन विट्रो (प्रयोगशाला में) परख अनुकूलन और परीक्षण। अस्वीकार परख है कि गरीब दक्षता है, पार सह होने वाली प्रजातियों के साथ प्रतिक्रिया, या गरीब संवेदनशीलता है18. परख विकास के दौरान आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग के साथ-साथ वास्तविक नमूने चलाते समय भी शामिल करें।
- सबसे पहले, परख के लिए इष्टतम तापमान और प्राइमर/जांच एकाग्रता मूल्यों का पता लगाएं । एक बार इन मापदंडों को पीसीआर दक्षता (चरण 3.4.2), क्रॉस-रिएक्टिविटी (चरण 3.4.3) और संवेदनशीलता (चरण 3.4.4) के लिए अनुकूलित किया गया है, एक मल्टीप्लेक्स आईपीसी (चरण 3.4.5) के साथ परख का परीक्षण करने के लिए आगे बढ़ें।
- भविष्यवाणी की औसत प्राइमर टीएमएम से नीचे 5 डिग्री सेल्सियस नीचे केंद्रित पीसीआर तापमान ढाल का उपयोग करके प्राइमर और जांच के लिए इष्टतम एनीलिंग तापमान (टीए) का परीक्षण करें।
- इष्टतम प्राइमर और जांच सांद्रता का परीक्षण करें। आमतौर पर, 200 एनएम, 400 एनएम, और 800 एनएम प्राइमर सांद्रता और 75 एनएम, 125 एनएम और 200 एनएम जांच सांद्रता का परीक्षण किया जाता है।
- एक मानक वक्र बनाएं और दक्षता और रैखिक रेंज निर्धारित करें। लक्ष्य अनुक्रम युक्त सिंथेटिक डीएनए मानक के कम से ६ १० गुना कमजोर पड़ने का परीक्षण करें, लगभग१० ० प्रतियां/प्रतिक्रिया पर१० ५ प्रतियां/प्रतिक्रिया(चित्रा 3A)।
- वाई-एक्सिस पर प्रत्येक मानक के सीक्यू मूल्य (मात्राकरण पर चक्र के लिए सीमा) और एक्स-एक्सिस पर प्रतियों/प्रतिक्रिया में प्रारंभिक मानक एकाग्रता के लॉग बेस 10 को प्लॉट करने के लिए क्यूपीसीआर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । क्यूपीसीआर सॉफ्टवेयर को अपने आप एक रैखिक प्रतिगमन(चित्र 3बी)चलाना चाहिए।
- प्रतिगमन की ढलान से दक्षता की गणना करें, ई = -1 + 10(-1/ढलान)। उदाहरण के लिए, यदि ढलान -3.4 है, तो ई = -1 +10 (0.29) = 0.97 या 97%। आर 2 मानों की भी जांच करें जो इंगित करते हैं कि मानक वक्र पर कितनी अच्छी तरह फिट होता है। क्यूपीसीआर सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से इसकी गणना करनी चाहिए(चित्र 3बी)। 100% (±10%) और आर2 मूल्य ≥0.989, 15,19,20,21,22.
- नेत्रहीन पूर्वाग्रह के लिए मानक वक्र का निरीक्षण, यानी, एक सुसंगत दिशा में प्रतिगमन से विचलन या दक्षता और आर 2 मूल्यों(चित्रा 3सी और 3 डी)द्वारा मापाके रूप में गरीब मानक वक्र प्रदर्शन के लिए ।
- विशिष्टता: झूठी सकारात्मक की संभावना को कम करने के लिए गैर-लक्षित प्रजातियों के साथ क्रॉस-रिएक्टिविटी का आकलन करें। जहां ईडीएनए डिटेक्शन के परिणामस्वरूप प्रबंधन निर्णय महंगे हो सकते हैं, एम्प्लिकॉन अनुक्रमण द्वारा सकारात्मक पहचानों को सत्यापित करें।
- गैर-लक्ष्य: संबंधित प्रजातियों और भौगोलिक रूप से सह-होने वाली प्रजातियों के वर्गीकरण रूप से सत्यापित नमूनों के जीनोमिक डीएनए अर्क के खिलाफ परख चलाएं; उच्चतम प्राथमिकता के साथ बारीकी से संबंधित, सह होने वाली प्रजातियों के खिलाफ परीक्षण करने के लिए किया जा रहा है । लक्ष्य और गैर-लक्षित नमूनों दोनों के लिए समान कुल डीएनए सांद्रता का उपयोग करें। चुनी गई एकाग्रता को मानक वक्र की रैखिक सीमा के बीच के पास लक्षित प्रजातियों के नमूनों से प्रवर्धन करना चाहिए। केवल लक्षित प्रजातियों के साथ प्रवर्धन देखा जाना चाहिए।
- यदि गैर-लक्षित प्रवर्धन मनाया जाता है, तो उत्पाद को अपनी पहचान सत्यापित करने के लिए साफ और अनुक्रम करें। गैर-लक्षित प्रजातियों के ऊतकों के नमूनों में लक्षित प्रजातियों से संदूषण का निरीक्षण करना असामान्य नहीं है, इस प्रकार इस स्तर पर सभी प्रवर्धन अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किए जाने चाहिए। M13 पूंछ प्राइमर और M13 प्राइमर के साथ अनुक्रम का उपयोग कर विशिष्टता परीक्षणों से साफ एम्प्लिकॉन को फिर से सरल करें।
- पीसीआर के बाद प्रयोगशाला में क्यूपीसीआर उत्पादों को ताजा ट्यूबों में अनुक्रमित करने के लिए स्थानांतरित करें। एक क्लीन-अप किट (उदाहरण के लिए, मिनेल्यूट पीसीआर शुद्धिकरण किट) के साथ अवशिष्ट प्राइमर और प्रतिक्रिया घटकों को हटा दें।
- Elutions के 1:100 कमजोर पड़ने और M13 पूंछ प्राइमर और एक उच्च निष्ठा बहुलकों (जैसे, फुसियन उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक) के साथ एक 50 μL पीसीआर प्रतिक्रिया में 30 चक्र के लिए प्रत्येक के 1 μL बढ़ाना बनाओ।
- अपेक्षित आकार के एक बैंड की जांच करने के लिए 1% एगर उठे जेल पर प्रत्येक प्रतिक्रिया के 10 माइक्रोन चलाएं। यदि कोई बैंड नहीं देखा जाता है, तो चक्रों की संख्या या नमूने की मात्रा बढ़ाएं। यदि कई बैंड देखे जाते हैं, तो जेल अपेक्षित आकार के बैंड को शुद्ध करें।
- ऊपर के रूप में एक साफ किट के साथ अवशिष्ट प्राइमर और प्रतिक्रिया घटकों को हटा दें और elutions के डीएनए सांद्रता को मापने ।
- अनुक्रमण सुविधा के निर्देशों के अनुसार M13 प्राइमर के साथ अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं की स्थापना की।
नोट: क्यूपीसीआर प्रयोगशाला में कभी भी प्रवर्धित नमूने न खोलें। पीसीआर के बाद के नमूनों को समर्पित प्रयोगशाला में अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करें।
- संवेदनशीलता: संवेदनशीलता झूठी नकारात्मक, या लक्ष्य प्रजातियों डीएनए का पता लगाने के लिए विफलताओं की संभावना को प्रभावित करता है जब यह मौजूद है । प्रत्येक परख के लिए पता लगाने की सीमा (LOD) और मात्राकरण (LOQ) की सीमा का आकलन करें। अंत में, नमूनों के पीसीआर अवरोध का आकलन करने के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) शामिल करें। मल्टीप्लेक्स और डिजाइन परख के साथ इस आईपीसी परख का परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि दो परख एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप नहीं करते ।
- LOD: सिंथेटिक डीएनए मानक के छह 4 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ, 8-24 के साथ मानक कमजोर पड़ने प्रति प्रतिकृति(चित्रा 4)। 95% का पता लगाने के साथ सबसे कम प्रारंभिक एकाग्रता की गणना करें। LOD और LOQ भूखंडों एक LOD/LOQ कैलकुलेटर आर स्क्रिप्ट5के साथ उत्पन्न किया जा सकता है ।
नोट: LOD के नीचे डेटा सेंसर नहीं किया जाना चाहिए । पीसीआर की विशिष्टता के कारण, सच्चे सकारात्मक के लिए कोई कम सीमा नहीं है। LOD उच्चतम एकाग्रता है जिसके नीचे झूठी नकारात्मक होने की उम्मीद की जा सकती है। - LOQ: एक ही कमजोर पड़ने श्रृंखला से, 35% से नीचे भिन्नता (सीवी) के गुणांक के साथ सबसे कम प्रारंभिक डीएनए मानक एकाग्रता मात्रात्मक गणना करें।
नोट: LOD और LOQ प्रतियां/प्रतिक्रिया में सूचित किया जाना चाहिए । एक मान्य परख का उपयोग करते समय और क्षेत्र के नमूने LOQ के नीचे बढ़ाते हैं, परिणामों को ईडीएनए सांद्रता के बजाय% डिटेक्शन के रूप में सूचित किया जाना चाहिए, क्योंकि सटीक एकाग्रता को आत्मविश्वास5के साथ नहीं मापा जा सकता है।
- LOD: सिंथेटिक डीएनए मानक के छह 4 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ, 8-24 के साथ मानक कमजोर पड़ने प्रति प्रतिकृति(चित्रा 4)। 95% का पता लगाने के साथ सबसे कम प्रारंभिक एकाग्रता की गणना करें। LOD और LOQ भूखंडों एक LOD/LOQ कैलकुलेटर आर स्क्रिप्ट5के साथ उत्पन्न किया जा सकता है ।
- पीसीआर अवरोध के लिए परीक्षण करने के लिए आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) का उपयोग करें। अवरोध संवेदनशीलता और झूठी नकारात्मक में कमी का कारण बन सकता है। आईपीसी की परख की क्षमता को लक्ष्य परख के साथ मल्टीप्लेक्स किया जाए।
- एक आईपीसी परख लक्ष्य परख से एक अलग रिपोर्टर डाई के साथ एक जांच का उपयोग कर लक्ष्य परख के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है । इस आईपीसी परख लक्ष्य taxa से असंबंधित प्रजातियों से एक छोटे सिंथेटिक डीएनए अनुक्रम के होते हैं, लगभग १०२ प्रतियां की एक कम एकाग्रता पर qPCR मास्टर मिश्रण में शामिल/प्रतिक्रिया, प्राइमर और जांच है कि यह पता लगाने के साथ । पॉलीमरेज और न्यूक्लियोटाइड्स23के लिए लक्ष्य अनुक्रम के साथ प्रतिस्पर्धा से बचने के लिए यह कम एकाग्रता आवश्यक है ।
- नमूना के आईपीसी टेम्पलेट के सीक्यू मूल्य की तुलना नो टेम्पलेट कंट्रोल में आईपीसी टेम्पलेट से करें। इस नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) में सिर्फ डीएनए इनपुट ही आईपीसी के टेम्पलेट का है। इस प्रतिक्रिया में आईपीसी टेम्पलेट को अपेक्षा के अनुसार बढ़ाना चाहिए। यदि किसी नमूने में आईपीसी टेम्पलेट एनटीसी में आईपीसी टेम्पलेट से अलग 2 या उससे अधिक चक्रों पर परिलक्षित होता है, तो ईडीएनए नमूना बाधित होता है। नमूने जो अवरोध दिखाते हैं, उन्हें 1:10 पतला किया जा सकता है और फिर से परीक्षण किया जा सकता है। यदि कोई नमूना बाधित रहता है, तो उस नमूने को विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए।
- सबसे पहले, परख के लिए इष्टतम तापमान और प्राइमर/जांच एकाग्रता मूल्यों का पता लगाएं । एक बार इन मापदंडों को पीसीआर दक्षता (चरण 3.4.2), क्रॉस-रिएक्टिविटी (चरण 3.4.3) और संवेदनशीलता (चरण 3.4.4) के लिए अनुकूलित किया गया है, एक मल्टीप्लेक्स आईपीसी (चरण 3.4.5) के साथ परख का परीक्षण करने के लिए आगे बढ़ें।
- सीटू परख विकास और परीक्षण में
- प्रयोगशाला में: यदि प्रयोगशाला में जीव के साथ-साथ सिम्पेट्रिक प्रजातियों तक पहुंच उपलब्ध है; इन प्रजातियों के साथ बाड़ों से पानी के नमूने लें, नमूनों की प्रक्रिया करें और इन ईडन्ना नमूनों के खिलाफ परख का परीक्षण करें। M13 पूंछ वाले प्राइमर का उपयोग करके इच्छित लक्ष्य के प्रवर्धन को सत्यापित करने के लिए ऊपर के रूप में अनुक्रम उत्पाद।
- क्षेत्र में:
- उन साइटों की पहचान करें जहां लक्षित जीव होने के लिए जाना जाता है और होने के लिए ज्ञात नहीं है। प्रत्येक साइट पर बहुतायत के कुछ उपाय करना बेहतर है जहां लक्षित प्रजातियां होती हैं।
- तय करें कि नमूना मात्रा और नमूना संग्रह विधियों (जैसे, निस्पंदन, अपकेंद्रित्र, आदि) का उपयोग किया जाएगा।
- प्रत्येक साइट पर एक क्षेत्र खाली या नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें, यह साफ पानी है जिसे क्षेत्र स्थल पर लाया गया है और फिर24नमूने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही क्षेत्र उपकरण और प्रोटोकॉल के साथ एकत्र और तैयार किया गया है। फील्ड ब्लैंक का उद्देश्य साइट पर लाए गए नमूना उपकरण और फील्ड गियर के प्रदूषण का पता लगाना है। खेत पानी के नमूनों को संसाधित करने से पहले खेत को खाली लें।
- साइट प्रति कई पानी के नमूने लें, अधिमानतः प्रति साइट 3 नमूने लें।
- प्रयोगशाला में वापस, प्रक्रिया और नमूने निकालने।
- चित्रा 5A के समान स्थापित प्लेट का उपयोग करके परख चलाएं और घटना और बहुतायत में ज्ञात साइट मतभेदों के साथ ईडीएनए एकाग्रता और पता लगाने की आवृत्ति की तुलना करें। 24 , 25अनुक्रमण द्वारा सभी डिटेक्शन की पुष्टि करें ।
नोट: उपरोक्त थिंगर एट अल (2020) स्केल 6 (परख के तकनीकी प्रदर्शन का अनुकूलन) के स्तर4 के माध्यम से एक परख मान्य करेगा और स्तर 5 परख सत्यापन का समर्थन करने वाले डेटा को इकट्ठा करना शुरू करेगा। स्तर 5 संभावना मॉडलिंग और eDNA पारिस्थितिकी अध्ययन के लिए परख के उपयोग को शामिल किया गया। हमें लगता है कि यह बुनियादी परख विकास के दायरे से परे है, लेकिन हम प्रयोगशाला और क्षेत्र की जांच की परख डिजाइन और डेटा व्याख्या में सुधार करने के लिए परख के इन अनुप्रयोगों को प्रोत्साहित करते हैं ।
Representative Results
एक प्रजाति-विशिष्ट क्यूपीसीआर परख को mucket(ए स्नायु बंधन)के लिए डिजाइन करने में, कड़ी नदी में सभी Unionidae प्रजातियों के उपलब्ध दृश्यों को डाउनलोड किया गया था। एक ही नदी में पाए जाने के बावजूद लैल्सिलिस सिलिकोटिया जैसी बारीकी से संबंधित प्रजातियों को भी संदर्भ डेटाबेस में शामिल किया गया था। जनरलबैंक में ब्याज की नदी प्रणाली में सभी प्रजातियां नहीं पाई गईं, इसलिए अतिरिक्त प्रजातियों को घर में अनुक्रमित किया गया था। दृश्यों को कई परख डिजाइन करने के लिए जेनेर सॉफ्टवेयर और प्राइमर क्वेस्ट (आईडीटी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गठबंधन किया गया था। विजुअल असेसमेंट(चित्रा 2)के लिए अलाइनमेंट में प्राइमर और जांच के पांच सेट जोड़े गए थे । इसके बाद उन्हें प्राइमर-ब्लास्ट का इस्तेमाल करते हुए सिलिको में परीक्षण किया गया, जिसके बाद उन्हें विट्रो में आगे परीक्षण करने का आदेश दिया गया। प्रयोगशाला में, सभी परख विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए 27 उपलब्ध प्रजातियों के डीएनए अर्क का उपयोग कर परीक्षण किया गया । एक परख (A.lig.1) सफलतापूर्वक केवल लक्ष्य प्रजातियों(तालिका 1; तालिका 2)। इस परख परख दक्षता, LOD और LOQ के आगे परीक्षण के लिए आगे बढ़े । इसकी एम्प्लिकॉन लंबाई 121 बेस जोड़े हैं। तालिका 3 ए स्नायु सिंथेटिक डीएनए मानक के लिए इस्तेमाल अनुक्रम से पता चलता है । चित्रा 3A और चित्रा 3B अच्छी दक्षता और आर2 मूल्यों के साथ एक सफल परख के परिणाम दिखाते हैं। चित्रा 3C और चित्रा 3 डी एक परख दिखाते हैं जिसका मानक वक्र में खराब दक्षता है; इस परख को छोड़ दिया गया। चयनित परख (A.lig.1) के लिए LOD और LOQ दोनों को ५.०० प्रतियां/Klymus एटअल5 में वर्णित असतत विधि का उपयोग कर प्रतिक्रिया पाया गया । जिस आईपीसी को परख(टेबल 3-6)से मल्टीप्लेक्स किया गया था, उससे ए स्नायुना परख के स्टैंडर्ड कर्व पर कोई असर नहीं हुआ । हम जिस आईपीसी का उपयोग करते हैं वह माउस हेम्ट ट्रांसक्रिप्ट का एक टुकड़ा है। इस परख एक और आवेदन के लिए IDT द्वारा predesigned था, लेकिन हम अपनी प्रयोगशाला के eDNA अनुप्रयोगों के लिए एक आईपीसी के रूप में इसके उपयोग को संशोधित किया ।
एक सफल क्यूपीसीआर रन को प्रदर्शन के प्रत्येक उपाय (यानी, मानक वक्र प्रवर्धन, जीनोमिक डीएनए सकारात्मक नियंत्रण, कोई टेम्पलेट नियंत्रण और आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण) के लिए कुछ मानदंडों को पूरा करना चाहिए। लक्ष्य परख मानकों में घातीय प्रवर्धन घटता होना चाहिए । इन घटता एक अंत बिंदु पठार तक पहुंचने अगर पर्याप्त चक्र चलाने की अनुमति दी चाहिए । यह फ्लोरोसेंट जांच की प्रतिक्रिया के दौरान पूरी तरह से भस्म होने का संकेत है, और फ्लोरेसेंस का स्तर अधिकतम सीमा तक पहुंच रहा है। बाद में बढ़ाना मानकों ४० चक्र में एक पठार तक नहीं पहुंच सकता है । सकारात्मक नियंत्रण (जीनोमिक डीएनए और आईपीसी) एक ही पैटर्न होना चाहिए। Unknowns बढ़ा सकता है या नहीं हो सकता है, लेकिन अज्ञात में प्रवर्धन भी एक घातीय पैटर्न और एक अंत बिंदु पठार(चित्रा 5)होना चाहिए ।
एक गुणवत्ता क्यूपीसीआर में, मानक कमजोर पड़ने एकाग्रता में प्रत्येक 10 गुना अंतर के लिए लगभग हर 3.3 चक्रों के समान रूप से दूरी सीक्यू पर बढ़ाता है। एक मानक कमजोर पड़ने की प्रत्येक प्रतिकृति कसकर समूहित तरीके से फैलती है जिसमें लगभग एक ही सीक्यू (आर 2 मूल्यों द्वारा प्रतिनिधित्व कियाजाता है)। सभी मानक कमजोर पड़ने प्रवर्धन(चित्रा 3A)प्रदर्शित करना चाहिए । एक गरीब क्यूपीसीआर में, मानक गैर-घातीय आकार, कमजोर पड़ने के बीच सीक्यू मूल्यों में असमान भिन्नता, अंत बिंदु पठार पर नहीं आते हैं, या कुछ कमजोर पड़ने बिल्कुल नहीं बढ़ा सकते हैं(चित्रा 3डी)।
एक मानक वक्र के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर दक्षता, आर2,ढलान, और वाई-अवरोधन हैं। दक्षता 100% के पास आदर्श मूल्यों के साथ 90%-110% के बीच गिरनी चाहिए और आर2 मान 0.98 से ऊपर होना चाहिए जिसमें आदर्श परिणाम 1.015,22आ रहे हैं। ढलान मूल्य -3.2 और - 3.5 के बीच होना चाहिए, जिसके पास आदर्श परिणाम -3.322हैं। वाई-अवरोधन मान 34-41 के सीक्यू के बीच गिरने चाहिए, जिसमें आदर्श परिणाम 37.0 के सीक्यू होने चाहिए। वाई-इंटरसेप्ट लक्ष्य अनुक्रम की 1 प्रति के साथ एक प्रतिक्रिया का अनुमानित सीक्यू है, सबसे छोटी इकाई जिसे एक क्यूपीसीआर में मापा जा सकता है। वाई-इंटरसेप्ट से सीक्यू के अधिक से अधिक अज्ञात लोगों के बाधित होने की संभावना है। अवरोध या अक्षम प्राइमर सेट के मामले में लक्ष्य का पता लगाने के लिए पीसीआर के 40 से अधिक चक्र चलाना आवश्यक हो सकता है, हालांकि इन परिस्थितियों में मात्राकरण संभव नहीं है और लक्ष्य अनुक्रम के बिना अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण, लेकिन अज्ञात के समान कुल डीएनए युक्त, गैर-विशिष्ट स्रोतों से प्रवर्धन से इंकार करने के लिए चलाया जाना चाहिए।
अज्ञात नमूनों में आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) प्रवर्धन की तुलना नकारात्मक टेम्पलेट नियंत्रण आईपीसी के परिणामों से की जानी चाहिए, क्योंकि अभिकर्षकों के लिए कोई प्रतिस्पर्धा नहीं है और कोई अवरोधक मौजूद नहीं है । एक आईपीसी के साथ Unknowns 2 चक्र या एनटीसी के औसत सीक्यू मूल्य से अधिक है, या कि बढ़ाना नहीं है के एक Cq होने के साथ बाधित माना जाना चाहिए । यदि नमूनों में कोई अवरोधक मौजूद नहीं हैं, तो सभी आईपीसी प्रवर्धन एनटीसी(चित्रा 6)के समान सीक्यू मूल्यों के साथ साजिश में एक तंग समूह होना चाहिए।
अंत में, परख की सीटू परीक्षण में हुई। कड़ी नदी से बीस पानी के नमूने और तीन क्षेत्र खाली नमूना 25-26 सितंबर, २०१९ के बीच एक कौड़ी बिस्तर से ५०० मीटर के भीतर फ़िल्टर किया गया ए स्नायु बंधनके लिए जाना जाता है । पानी के लगभग चार 1 एल नमूने नमूना स्थान प्रति फ़िल्टर किए गए थे। स्थान साइटों धारा में कौड़ी बिस्तर के तल पर शामिल है, किनारे के पास कौड़ी बिस्तर के नीचे, धारा में बिस्तर के १०० मीटर नीचे की ओर, धारा में बिस्तर के ५०० मीटर डाउनस्ट्रीम और किनारे के पास बिस्तर के ५०० मीटर डाउनस्ट्रीम(चित्रा 7)। प्रयोगशाला में वापस, प्रत्येक फिल्टर आधे में काट दिया गया था और डीएनए एक फिल्टर के केवल आधे से निकाला गया था । प्रत्येक नमूने के लिए शेष फिल्टर आधा एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया गया था। इसके बाद आईपीसी के साथ ए.एलआईजी.1 परख का उपयोग करके नमूने चलाए गए । 23 नमूनों में से पांच में हिचक पाई गई। इन नमूनों को 1:10 पतला किया गया था और कमजोर पड़ने को फिर से चलाया गया था । 20 क्षेत्र नमूनों में से उन्नीस डिजाइन परख का उपयोग कर परिलक्षित । इन 19 नमूनों में से पांच परख के LOD और 5 प्रतियां/प्रतिक्रिया के LOQ से ऊपर थे; मतलब नमूनों के अधिकांश एक eDNA पता लगाने था, लेकिन एक स्तर पर जहां झूठी नकारात्मक परिणाम होने की संभावना है और यह कि परख आत्मविश्वास से उन 14 नमूनों के लिए कॉपी संख्या की मात्रा नहीं हो सकता है । फिर भी, चार जैविक साइट का 75 से 100% प्रत्येक नमूना स्थान पर परिलक्षित होता है। तीन क्षेत्र रिक्त स्थान के दो नकारात्मक थे, जबकि एक क्षेत्र खाली प्रवर्धन दिखाया था, क्षेत्र में स्वच्छ तकनीक के महत्व पर जोर ।
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अनुक्रम डेटाबेस निर्माण के लिए कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: संभावित प्राइमर के साथ कड़ी नदी कौड़ी प्रजातियों के लिए अनुक्रम संरेखण और Actinonaias स्नायु बंधन ND1 परख के लिए जांच । गहरे हरे रंग में फॉरवर्ड प्राइमर, हल्के हरे रंग में लाल और रिवर्स प्राइमर में जांच करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: मानक वक्र और रैखिक प्रतिगमन उदाहरण। एकस्वीकार्य मानक वक्र का उदाहरण जो तीन के प्रवर्धन से प्राप्त होता है, वह प्रत्येक छह मानक कमजोर पड़ने की प्रतिकृति है। बाईं ओर मानक की उच्चतम एकाग्रता के साथ एक 10 गुना मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला, कम सांद्रता के साथ सही करने के लिए चलती है । सभी निशानों को पार करने वाली क्षैतिज रेखा क्वांटिटेशन (सीक्यू) पर चक्र के लिए सीमा है। जहां प्रत्येक ट्रेस इस सीमा को पार करता है, जहां सीक्यू निर्धारित किया जाता है। बी.लीनियर प्रतिगमन चित्रा 3 ए के मानक प्रतिकृति से बना है। मानक कमजोर पड़ने की प्रतिकृति हलकों में प्लॉट की जाती है और अज्ञात (नमूने) एक्स के साथ प्लॉट किए जाते हैं। दक्षता 98.9%, आर2 1.0 आ रहा है, और -3.349 की ढलान है। C. तीन के प्रवर्धन से प्राप्त एक खराब मानक वक्र का उदाहरण छह मानक कमजोर पड़ने में से प्रत्येक को दोहराता है। D.मानक के लिए मानक वक्र बनाने वाला एक रैखिक प्रतिगमन उदाहरण 3C में परिलक्षित होता है। खराब दक्षता और आर2 मूल्यों पर ध्यान दें। यह भी ध्यान दें कि 6 मानकों में से केवल 4 परिलक्षित होते हैं। यदि दोहराने के बाद रन, मानक वक्र में सुधार नहीं होता है, समस्या एक गरीब प्राइमर के साथ हो सकता है/जांच सेट है कि लक्ष्य डीएनए बढ़ाना नहीं है के रूप में उंमीद है कि किस मामले में, इस परख पर विचार नहीं किया जाना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: LOD और LOQ मानक qPCR के लिए प्लेट सेटअप के उदाहरण चलाता है । वक्र में उपयोग किए जाने वाले मानक नीले रंग में होते हैं, मानक एकाग्रता अंधेरे से हल्के नीले रंग तक कम हो जाती है। हरे रंग में डीएनए सकारात्मक नियंत्रण और पीले रंग में कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) नहीं। प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के लिए 24 प्रतिकृति दिखाने वाले ग्रे में प्रायोगिक मानक सांद्रता। कमजोर पड़ने श्रृंखला को दो प्लेटों (ए, बी) में चढ़ाया गया था, प्रत्येक को एक मानक वक्र, सकारात्मक नियंत्रण और एनटीसी के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: प्लेट सेटअप और प्रवर्धन एक qPCR चलाने से निशान । A.प्लेट सेटअप, नीले, गहरे रंग में दिखाए गए मानक मानक की एकाग्रता को उच्चतम दर्शाते हैं। हरे रंग में डीएनए सकारात्मक नियंत्रण, पीले (एनटीसी) में कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं, ग्रे में नमूना लक्ष्य। B.एक qPCR रन से प्रवर्धन निशान । नीले रंग में दिखाए गए मानक, हरे रंग में डीएनए सकारात्मक नियंत्रण, पीले रंग में कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं, और लाल रंग में अज्ञात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6: आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) के लिए प्रवर्धन निशान। मजेंटा में सभी अज्ञात नमूनों के लिए आईपीसी के निशान और त्रिकोण के साथ नारंगी रंग में दिखाए गए नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) से आईपीसी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: वर्जीनिया/टेनेसी सीमा के साथ कड़ी नदी में एक कौड़ी बिस्तर के eDNA संग्रह साइटों दिखा नक्शा । बिस्तर के नीचे, बिस्तर के १०० मीटर डाउनस्ट्रीम और बिस्तर के ५०० मीटर डाउनस्ट्रीम में वॉलन्स मोड़ पर नमूने एकत्र किए गए । साइटों को या तो स्ट्रीम (स्ट्रीम में) या तटरेखा (किनारे) से लगभग 1 - 2 मीटर के बीच में एकत्र किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| घटक | नाम | अनुक्रम 5'-3 ' | फ्लोरोसेंट लेबल | |
| फॉरवर्ड प्राइमर | A.lig.1-f | सीसीसीसीकैटेकैकैकैकटीसीटीसी | ||
| रिवर्स प्राइमर | A.lig.1-r | GGAATGCCCATACATAATTCAACTTTA | ||
| सलाई | A.lig.1 जांच | TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT | एफएएम | |
तालिका 1: डिजाइन किया गया Actinonaias स्नायु बंधन qPCR परख (A.lig.1) आगे और रिवर्स प्राइमर और जांच के लिए दृश्यों सहित ।
| प्रजातियां | प्रवर्धित | कड़ी नदी में |
| 1. ऐक्टिनोनियस स्नायु बंधन | हाँ | हाँ |
| 2. ऐक्टिनोनियास पेट्टोरोसा | नहीं | हाँ |
| 3. एम्बेमा प्लिकाटा | नहीं | हाँ |
| 4. कॉर्बिबुला स्प्प। | नहीं | हाँ |
| 5. कम्कलैंडिया मोनोडोन्टा | नहीं | हाँ |
| 6. साइक्लोनियास ट्यूबरकुलेटा | नहीं | हाँ |
| 7. सायप्रोजेनिया स्टेगेरिया | नहीं | हाँ |
| 8. एलिप्टियो दिलाटाटा | नहीं | हाँ |
| 9. एपिओब्लास्मा ब्रेविडेन्स | नहीं | हाँ |
| 10. एपिओब्लास्मा कैप्सेफॉर्मिस | नहीं | हाँ |
| 11. एपिओब्लास्मा फ्लोरेंटिना ऑरिओला | नहीं | हाँ |
| 12. एपिओब्लास्मा ट्राइक्वेरा | नहीं | हाँ |
| 13. फ्यूस्कोनिया कोर | नहीं | हाँ |
| 14. फुस्कोनिया सबरोटुंडा | नहीं | हाँ |
| 15. लैल्सिलिस ओवाटा | नहीं | हाँ |
| 16. लैल्सिलिस सिलिकोइडिया | नहीं | नहीं |
| 17. लस्मिगोना कोस्टाटा | नहीं | हाँ |
| 18. लेमिऑक्स रिमॉसस | नहीं | हाँ |
| 19. लेक्सिंगटनिया डोलेबेलाइड्स | नहीं | हाँ |
| 20. मेडिसियस कॉनराडिकस | नहीं | हाँ |
| 21. प्लेथोबासस साइफियस | नहीं | हाँ |
| 22. प्लूरोबेमा प्लेनम | नहीं | हाँ |
| 23. Ptychobranchus fasciolaris | नहीं | हाँ |
| 24. पीटीइकोब्रांचस सबटेंटस | नहीं | हाँ |
| 25. क्वाड्रुला पुस्टुलोसा | नहीं | हाँ |
| 26. स्ट्रोफिटस अनदुलटस | नहीं | हाँ |
| 27. विल्लोसा आईरिस | नहीं | हाँ |
तालिका 2: A.lig.1 परख के इन विट्रो विशिष्टता परीक्षण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रजातियों की एक सूची। लक्ष्य के परख परिलक्षित जीनोमिक डीएनए(Actinonaias स्नायु)और गैर लक्ष्य प्रजातियों में से किसी को बढ़ाना नहीं था ।
| घटक | अनुक्रम 5'-3' | ||||
| ऐक्टिनोनियस लिगेमेंटिना मानक | सीसीसीसीकैटेकासीजीटीएसी सीटीटीसीएटैक्टेटागगग्टटीसीटीसीजीटीसीटीसीटीटीसीटीसीटीटीजीएजीटीए | ||||
| AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAAAGCCCAAATAAAGTTAATTATGCATCATTC | |||||
| CCCAACCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAAGAATGTAACACACCTCCTT | |||||
| CAAACTACCTACCCCATCATCATACCCACACCACTATTATATTTTAGCACTTAGACTTTTTTTACTTTTTTTACTTTTTTTTTTACTTTTTTTTTTT | |||||
| GACAATTATTTCCATCATCCTTANTATCATCCCAATTTTTTTTTTTTTTCTCTCTCTCTCT | |||||
| TGTGTATCTCTCCCCCCTAGCTGTTAACACACTTATAACAGGCTGCCCCTCAAACTCA | |||||
| AATGCCCTTTAGTAGCTATCGAGCATAGCCCAAACCATTTCTTATTAGTAGTTACAA | |||||
| टीएसी | |||||
| आईपीसी टेम्पलेट (हेम-टी) | सीटीएकैटाक्टैकेकासीटीसीटीजीटीटीसीजीटीसीएटीसीएटीसीटीटीकैगएसीजीटीटी | ||||
| जीटीएटीजीसीएजीटीसीजीटीसीएजीटीसीएसी | |||||
तालिका 3: ऐक्टिनोनियस स्नायु बंधन का अनुक्रम (5'-3') और इस परख के लिए उपयोग किया जाने वाला आईपीसी टेम्पलेट (हेम-टी)। फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के लिए सीक्वेंस बोल्ड और इटालिक्स में हैं, और जांच को रेखांकित किया गया है ।
| घटक | नाम | अनुक्रम 5'-3 ' | फ्लोरोसेंट लेबल | |
| फॉरवर्ड प्राइमर | हेमट-एफ | TCTGAGTGTCCCTC | ||
| रिवर्स प्राइमर | हेमट-आर | GCAGTCCTTGAGAAGAAGAGC | ||
| सलाई | हेमट-पी | TGACAGTCTCTCTCTTGTGAACATTCG | Cy5 | |
तालिका 4: आगे और रिवर्स प्राइमर और जांच के लिए दृश्यों सहित आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) परख ।
| प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) | घटक |
| 10 | पर्यावरण मास्टर मिक्स |
| 1 | 20uM ए lig.1 F/R मिश्रण |
| 1 | 2.5यूएम ए एलआईजी.1 जांच |
| 1 | 5यूएम आईपीसी प्राइमर मिक्स (hemT-F/R) |
| 0.75 | 2.5यूएम आईपीसी जांच (हेमटी-पी) |
| 1.5 | 1 X 103 आईपीसी टेम्पलेट की एकाग्रता |
| 2.75 | एच20 |
| 2 | नमूना |
| 20 | कुल वॉल्यूम |
तालिका 5: आईपीसी की परख के साथ A.lig.1 परख के लिए इस्तेमाल किया पीसीआर मिश्रण ।
| कहीं जाना | तापमान (डिग्री सेल्सियस) | समय | |
| 1 | प्रारंभिक नामकरण | 95 | 10 मिनट |
| 2 | डेन्चर | 95 | 15 सेकंड |
| 3 | एनीलिंग | 60 | 1 मिनट |
| 4 | स्टेप 2 पर जाएं, 39X दोहराएं |
तालिका 6: A.lig.1 परख के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति।
Discussion
किसी भी अध्ययन के साथ के रूप में, सवाल को परिभाषित करने के लिए संबोधित किया जा पहला कदम है और eDNA परख के डिजाइन अध्ययन के दायरे पर निर्भर करता है26. उदाहरण के लिए, यदि अनुसंधान या सर्वेक्षण का लक्ष्य एक या कुछ प्रजातियों का पता लगाना है, तो एक लक्षित जांच-आधारित परख सबसे अच्छा है। यदि, हालांकि, लक्ष्य प्रजातियों के एक बड़े सुइट या संयोजन का आकलन करना है, तो उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण मेटाबारकोडिंग परख बेहतर अनुकूल हैं। एक बार यह निर्धारित हो जाने के बाद किन दृष्टिकोण को लेना है, तो परख डिजाइन, परीक्षण और अनुकूलन सहित एक प्रायोगिक अध्ययन की सिफारिश की जाती है24. परख डिजाइन प्रजातियों की एक सूची के साथ शुरू होता है के रूप में वर्णित अंक 1. यह सूची यह समझने का आधार होगी कि एक परख विशिष्टता और भौगोलिक सीमा के संदर्भ में कितनी अच्छी तरह प्रदर्शन करती है।6,10. यह एक विशिष्ट भौगोलिक क्षेत्र के लिए परख डिजाइन करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, डिजाइनर को बेहतर है कि क्षेत्र में अंय प्रजातियों के खिलाफ पार प्रतिक्रियाशीलता के लिए एक परख का परीक्षण करने के लिए सक्षम है, और सीमाओं के बारे में पता है यह अंय क्षेत्रों के लिए एक परख का विस्तार करने पर है, जहां एक लक्ष्य प्रजातियों हो सकता है24. एक बार सूची पूरी हो जाने के बाद, दृश्यों को सार्वजनिक आनुवंशिक डेटाबेस से डाउनलोड किया जा सकता है। चूंकि ये डेटाबेस अधूरे हैं27, परख डिजाइन में उपयोग किए जाने वाले दृश्यों के स्थानीय संदर्भ डेटाबेस को पूरा करने के लिए घर में संभव के रूप में सूची में कई प्रजातियों के रूप में अनुक्रम करना चाहिए। बारीकी से संबंधित प्रजातियों को प्राथमिकता दें, क्योंकि ये सबसे अधिक संभावना गैर-लक्ष्य हैं जो बढ़ाना होगा। लक्ष्य प्रजातियों के रूप में एक ही जीनस या परिवार के भीतर सभी प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित शुरू करने के लिए एक अच्छी जगह है । बारीकी से संबंधित प्रजातियों के साथ तुलना लक्ष्य प्रजातियों के लिए अद्वितीय अनुक्रम क्षेत्रों की पहचान करने में मदद मिलेगी । यह यह सूचित करने में मदद कर सकता है कि परख अन्य प्रणालियों या स्थानों में कैसे प्रदर्शन कर सकती है। माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र परख के विकास के लिए सामान्य विकल्प हैं, क्योंकि प्रजातियों की एक व्यापक विविधता से अधिक अनुक्रम जानकारी माइटोकॉन्ड्रियल जीन पर उपलब्ध है जो जीवन परियोजनाओं के बारकोड में उपयोग की गई है, और क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए परमाणु डीएनए की तुलना में प्रतियों/कोशिका में बहुत अधिक एकाग्रता पर मौजूद है24,28,29. कई जीन क्षेत्रों को आगे परख विकास के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए क्योंकि अनुक्रम कवरेज आनुवंशिक भंडार डेटाबेस में टैक्सा के बीच भिन्न होता है । संदर्भ दृश्यों के इस स्थानीय डेटाबेस के बाद बनाया गया है, गठबंधन अनुक्रम डेटा और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के मैनुअल दृश्य का एक संयोजन प्राइमर डिजाइन करने के लिए प्रयोग किया जाता है/ किसी को यह निर्धारित करने के लिए सॉफ्टवेयर पर सख्ती से भरोसा नहीं करना चाहिए कि कौन सा परीक्षण करना है। यह संरेखण पर नेत्रहीन सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जहां प्राइमर और जांच लक्ष्यों और गैर लक्ष्यों पर बैठते है कि वे कैसे एक पीसीआर में कार्य कर सकते है की एक बेहतर समझ पाने के लिए । अंत में परख स्क्रीनिंग और अनुकूलन तीन स्तरों में शामिल है (सिलिको में, इन विट्रो और सीटू में)6,7,24,25. सिलिको डिजाइन और परीक्षण में सफलता का एक अच्छा मौका के साथ परख की एक छोटी सूची का उत्पादन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन अनुभवजन्य (इन विट्रो) परीक्षण सबसे अच्छा वास्तविक प्रदर्शन के साथ परख का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । इन विट्रो अनुकूलन और परख के परीक्षण में प्रतिक्रिया दक्षता को मापने और परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता को परिभाषित करना शामिल है। पता लगाने और मात्राकरण की सीमा दो मापदंडों अक्सर परख विकास में अनदेखी की है लेकिन डेटा व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं । एक परख के लिए मानक घटता के कई प्रतिकृति चलाने से, LOD और LOQ आसानी से मापा जा सकता है1,5,30. कुछ अध्ययनों में परख के LOD या LOQ के संबंध में परिणामों पर चर्चा की गई है, लेकिन सेनगुप्ता एट अल (2019) अपने परिणामों की स्पष्ट समझ के लिए अपने डेटा व्याख्या और ग्राफिक्स में अपने परख के LOD और LOQ को शामिल करते हैं31. आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण डिजाइन परख में भी मल्टीप्लेक्स किया जाना चाहिए । नमूनों में पीसीआर अवरोध के लिए परीक्षण के बिना, झूठी नकारात्मक हो सकता है24,32. हम पीसीआर अवरोध परीक्षण के लिए सबसे आसान तरीका के रूप में लक्ष्य परख के साथ एक मल्टीप्लेक्स आईपीसी परख के उपयोग का प्रस्ताव23. अंत में, क्षेत्र और प्रयोगशाला एकत्र नमूनों से परख के सीटू परीक्षण में लक्ष्य प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है पर्यावरण के नमूनों में होता है24.
प्रजातियों के उपयोग के लिए सीमाएं मौजूद हैं-विशिष्ट, जांच-आधारित क्यूपीसीआर एडीएनए नमूनों के साथ परखता है। उदाहरण के लिए, परीक्षण के लिए कई परख का डिजाइन अनुक्रम उपलब्धता द्वारा सीमित हो सकता है, और परख प्रदर्शन के पहलुओं पर समझौता आवश्यक हो सकता है। इन विकल्पों को अध्ययन के लक्ष्यों द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए औरपरिणाम 26के साथ सूचित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य एक दुर्लभ प्रजातियों का पता लगाने है और कुछ सकारात्मक की उंमीद कर रहे हैं, अपूर्ण विशिष्टता के साथ एक परख (यानी, गैर लक्ष्य प्रजातियों के प्रवर्धन) का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर सभी डिटेक्शन अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया जाएगा । यदि लक्ष्य एक प्रजाति की भौगोलिक सीमा की निगरानी कर रहा है और eDNA एकाग्रता डेटा की जरूरत नहीं है, अपूर्ण दक्षता के साथ एक परख का इस्तेमाल किया जा सकता है और डेटा केवल प्रतिशत का पता लगाने के रूप में रिपोर्ट । इसके अलावा, जब तक प्रयोगशाला में सभी संभावित व्यंजनों का परीक्षण नहीं किया जाता है, जो शायद ही कभी संभव है, कोई भी परख की सच्ची विशिष्टता को पूर्ण निश्चितता के साथ नहीं जान सकता है। उदाहरण के लिए, परख को कड़ी नदी में कई मीठे पानी की मसल प्रजातियों के खिलाफ डिजाइन और परीक्षण किया गया था। एक अलग नदी प्रणाली में इस परख का उपयोग करने के लिए, हम इसे नए स्थान में प्रजातियों के एक सुइट के खिलाफ परीक्षण की आवश्यकता होगी । परख के विकास के दौरान परीक्षण नहीं की जाने वाली प्रजातियों या जनसंख्या के भीतर आनुवंशिक भिन्नता भी विशिष्टता को प्रभावित कर सकती है। अंत में, भले ही एक परख को उच्च तकनीकी प्रदर्शन के लिए सत्यापित किया गया हो; कार्यक्षेत्र में काम करते समय स्थितियां बदलती हैं। पानी के प्रवाह, पीएच और पशु व्यवहार जैसी गैर-परख संबंधित स्थितियों से विभिन्न ईडीएनए संग्रह और निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं। परख का उपयोग करना जो अनुकूलित और अच्छी तरह से वर्णित हैं, ईडीएनए डिटेक्शन पर ऐसे मापदंडों के प्रभाव की समझ को सुविधाजनक बनाने में मदद करेंगे।
ईडीएनए का क्षेत्र तरीकों और तकनीकों के मानकीकरण को बढ़ाने के लिए अन्वेषणात्मक विश्लेषण के चरण से परे परिपक्व हो रहा है। इन घटनाओं से ईडीएनए तकनीकों, क्षमताओं और सीमाओं के बारे में हमारी समझ में सुधार होगा। हम ऊपर जो अनुकूलन प्रक्रिया रेखांकित करते हैं, वह परख की संवेदनशीलता, विशिष्टता और प्रजनन क्षमता में सुधार करता है। इस शोधन और eDNA तरीकों के मानकीकरण का अंतिम लक्ष्य शोधकर्ताओं की क्षमताओं में सुधार करने के लिए eDNA डेटा के आधार पर अनुमान बनाने के साथ ही अंत उपयोगकर्ता और परिणामों में हिस्सेदारी धारक विश्वास में वृद्धि है ।
Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं । फंडिंग प्रायोजकों की अध्ययन के डिजाइन में कोई भूमिका नहीं थी; डेटा के संग्रह, विश्लेषण या व्याख्या में; पांडुलिपि के लेखन में; या परिणाम प्रकाशित करने के निर्णय में।
Acknowledgments
हम अल्वी वदूद और ट्रूडी फ्रॉस्ट को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने प्राइमर विकास और परीक्षण में मदद की। इस अध्ययन में रिपोर्ट की परख डिजाइन के लिए धन रक्षा सामरिक पर्यावरण अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (RC19-1156) विभाग द्वारा प्रदान किया गया था । व्यापार, उत्पाद, या फर्म नाम का कोई भी उपयोग केवल वर्णनात्मक उद्देश्यों के लिए है और अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन का मतलब नहीं है। इस अध्ययन के दौरान उत्पन्न डेटा https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 यूएसजीएस डेटा रिलीज के रूप में उपलब्ध हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
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