Summary
Dna-analyser för miljön kräver rigorös design, testning, optimering och validering innan insamlingen av fältdata kan börja. Här presenterar vi ett protokoll för att ta användare genom varje steg för att utforma en artspecifik, sondbaserad qPCR-analys för detektion och kvantifiering av en målarts DNA från miljöprover.
Abstract
Nya, icke-invasiva metoder för att upptäcka och övervaka artförekomst håller på att utvecklas för att stödja fiskeri- och viltvårdsförvaltningen. Användningen av eDNA-prover (Environmental DNA) för att upptäcka makrobiota är en sådan grupp metoder som snabbt blir populära och implementeras i nationella förvaltningsprogram. Här fokuserar vi på utveckling av artspecifika riktade analyser för sondbaserade kvantitativa PCR-applikationer (qPCR). Att använda sondbaserad qPCR erbjuder större specificitet än vad som är möjligt enbart med primers. Dessutom kan förmågan att kvantifiera mängden DNA i ett prov vara användbar för vår förståelse av eDNA:s ekologi och tolkningen av eDNA-detektionsmönster inom området. Det krävs noggranna överväganden vid utveckling och testning av dessa analyser för att säkerställa känsligheten och specificiteten hos att upptäcka målarten från ett miljöprov. I detta protokoll kommer vi att beskriva de steg som behövs för att utforma och testa sondbaserade analyser för detektion av en målart; inklusive skapande av sekvensdatabaser, analysdesign, val och optimering av analys, testanalysprestanda och fältvalidering. Att följa dessa steg kommer att bidra till att uppnå en effektiv, känslig och specifik analys som kan användas med förtroende. Vi demonstrerar denna process med vår analys utformad för populationer av mucket (Actinonaias ligamentina), en sötvattenmusselart som finns i Clinch River, USA.
Introduction
Forskare och chefer blir alltmer intresserade av användningen av DNA-analyser för artdetektering. I tre decennier har kvantitativ pcr eller realtids PCR (qPCR/rtPCR) använts i många fält för sekvensspecifik detektion och kvantifiering av nukleinsyror1,2. Inom det relativt nya området eDNA-forskning har användningen av dessa analyser med en standardkurva för kvantifiering av kopior av mål-DNA per volym eller vikt av eDNA-provet nu blivit rutinpraxis. Mitokondriella DNA-sekvenser är i allmänhet riktade i eDNA-analyser eftersom mitokondriellt genom finns i tusentals kopior per cell, men analyser för nukleärt DNA eller RNA-sekvenser är också möjliga. Det är viktigt att förstå att publicerade analyser för eDNA-prover inte alltid är lika i prestanda. En analyss tillförlitlighet när det gäller att upptäcka endast DNA från en målart (dvs. specificitet) och detektion av låga mängder mål-DNA (dvs. känslighet) kan variera avsevärt på grund av skillnader i hur analysen utformades, valdes, optimerades och testades. Rapportering av kvantitativa mått på analysprestanda har tidigare till stor del förbisetts, men nyligen håller standarder för att förbättra transparensen i analysutvecklingenpå väg att växa fram 3,4,5,6,7,8.
Optimering och rapportering av analysprestandahjälpmedel vid studiedesign och tolkning av eDNA:s undersökningsresultat. Analyser som korsreagerar med DNA för icke-målarter kan leda till falska positiva upptäckter, medan analyser med dålig känslighet kan misslyckas med att upptäcka målartens DNA även när det finns i provet (falska negativ). En förståelse för analyskänslighet och selektivitet kommer att bidra till att informera de provtagningsinsatser som krävs för att upptäcka sällsynta arter. Eftersom det finns många naturliga variationskällor i eDNA måste studier begränsa kontrollerbara variationskällor så mycket som möjligt, inklusive fullständig optimering och karakterisering av eDNA-analysen3.
Förhållanden som direkt påverkar en analyss specificitet eller känslighet kommer att ändra analysens prestanda. Detta kan inträffa under olika laboratorieförhållanden (dvs. olika reagenser, användare, maskiner etc.). Detta protokoll bör därför ses över när en analys tillämpas under nya förhållanden. Även analyser som är väl karakteriserade i litteraturen bör testas och optimeras när de antas av ett nytt laboratorium eller när olika reagenser används (t.ex. mastermixlösning)5,9. Analysspecifikiteten kan ändras när den tillämpas på en annan geografisk region, eftersom analysen tillämpas på prover från en ny biotisk gemenskap som kan omfatta icke-målarter som analysen inte har testats mot, och genetisk variation i målarten kan förekomma. Återigen bör analysen ombedömds när den används på en ny plats. Fältförhållandena skiljer sig från laboratorieförhållandena eftersom PCR-hämmare på fältet är mer benägna att förekomma i prover. PCR-hämmare påverkar direkt förstärkningsreaktionen och påverkar därmed analysens prestanda. Därför krävs en intern positiv kontroll vid utveckling av en eDNA-analys.
Slutligen kan miljöförhållandena på fältet påverka målarternas DNA-molekyler och deras fångst genom DNA-nedbrytning, transport och retention. Dessutom varierar olika protokoll för DNA-insamling och extraktion i deras effektivitet och förmåga att behålla DNA. Det är dock viktigt att notera att dessa processer påverkar eDNA:s detekterbarhet men inte en molekylär analyss prestanda. Således är detekterbarhet av DNA från målarten i fältprover en funktion av både den tekniska prestandan hos qPCR-analysen samt fältförhållanden och insamlings-, lagrings- och extraktionsprotokoll. När du använder en väl karakteriserad och högpresterande analys kan användarna känna sig säkra på analysens kapacitet; göra det möjligt för forskare att nu fokusera på att förstå de externa analysfaktorerna (dvs. miljövariabler, skillnader i fångst- eller extraktionsprotokoll) som påverkar eDNA-detektion.
Här fokuserar vi specifikt på analysteknisk prestanda genom rigorös design och optimering. Vi demonstrerar protokollet med hjälp av en sondbaserad analys utvecklad för påvisande av en sötvattenmussla, mucket (Actinonaias ligamentina), från vatten som provtagits i Clinch River, USA. Nyligen presenterade Thalinger m.fl. (2020) riktlinjer för validering av riktade eDNA-analyser. Analysdesign enligt vårt protokoll kommer att ge en analys till Thalinger et al.s nivå 4 plus ett extra steg mot nivå 56. Vid denna tidpunkt kommer en analyss tekniska prestanda att optimeras och den kommer att vara klar för regelbunden användning i laboratorie- och fältapplikationer. Ytterligare användning av analysen i laboratorie-, mesokos- och fältexperiment kan sedan ta upp frågor om eDNA-detektion och faktorer som påverkar detekterbarheten, de sista stegen för validering på nivå5 6.
Protocol
1. Generering av en sekvensdatabas över mitokondriella DNA-sekvenser från målarter och icke-målarter av intresse
- Definiera frågan, målen och systemet som ska åtgärdas. Identifiera målarten för eDNA-upptäckt. Identifiera det geografiska system där analysen ska användas. Gör en förteckning över arter av intresse, inklusive målarten, sympatriska arter (samuppstäckande) arter inom samma taxa (vanligtvis ordning eller familjenivå) och närbesläktade allopatriska arter, sådana som kanske inte befinner sig på samma geografiska plats som målet (figur 1).
OBS: Här var Clinch River populationerna av arten A. ligamentina riktade. - Sök och ladda ner sekvenser från flera genregioner efter arter på listan från steg 1. Sekvensdatabaser som NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) och DDBJ (DNA Data Bank of Japan) kan användas. NCBI, EMBL och DDBJ delar alla sekvensinformation.
- Med hjälp av NCBI:s nukleotiddatabas söker du efter målorganismen (t.ex. Actinonaias ligamentina)och genregionen (t.ex. cytokrom c oxidas I (COI) eller NADH-dehydrogenas 1 (ND1). Exempel på söksträng: Actinonaias ligamentina OCH ND1)
- Välj sedan alla sekvenser som matchar specifikationerna och välj Skicka till. Välj Slutförd post, Fil och nedladdningsformat som antingen GenBank eller FASTA och skapa sedan Fil. Dessa sekvenser sparas nu på datorn.
- Upprepa dessa steg för alla arter i listan som definieras i steg 1. Förvara sekvenser för varje genregion i en separat fil eftersom dessa kommer att analyseras separat.
- Ladda ner alla relevanta sekvenser (eller en stor, representativ andel sekvenser) för de målarter som identifieras i steg 1. Inkludera geografiska varianter om möjligt.
- Upprepa sök- och nedladdningssekvenserna för relaterade och sympatriska icke-målarter av samma taxonomiska grupp som identifierades i steg 1 (t.ex. om målarten är mucket (A. ligamentina) nedladdningssekvenser för alla andra sötvattenmusselarter i familjeunionen som förekommer i systemet av intresse).
- Upprepa sökningen och ladda ner för närbesläktade men allopatriska (geografiskt åtskilda) arter som förtecknas i steg 1.1.
OBS: Alla arter (mål och icke-mål) kommer inte att finnas tillgängliga i de offentliga databaserna. Öka den lokala referensdatabasen genom att förstärka och sekvensera taxonomiskt verifierade exemplar av arter av intresse internt. Om man arbetar med en art som har hög genetisk mångfald inom arten eller arbetar i ett geografiskt stort område där geografiska varianter kan förväntas, samla sekvenser från hela området.
2. Analysdesign
- Justera sekvenser från varje genregion separat med hjälp av justeringsprogram som finns i olika genetiska sekvensredigering och bioinformatiska program. Gör denna anpassning för var och en av de olika genregionerna.
- Till exempel importerar geneious prime-programvara (https://www.geneious.com) de nedladdade sekvensfilerna till programmet.
- Skapa separata mappar för varje genregion.
- Markera alla sekvenser i en mapp som innehåller sekvenser från ett genområde.
- Använd verktyget Flera justeringar för att skapa en nukleotidjustering av de markerade sekvenserna. Det kan finnas flera alternativ för typen av justering, med hjälp av Geneious eller MUSCLE inriktningar och standard parametrar fungerar bra.
- Välj lovande regioner för analysdesign genom visualisering av justerade sekvensdata. En region som har många sekvensdata tillgängliga för de arter som är av intresse, är mycket avvikande bland arter och visar att låg variation inom arter är en bra kandidat. Detta kommer att öka sannolikheten för att primers och sonder som är utformade kommer att kunna diskriminera målet från icke-målarter, samtidigt som man säkerställer att intraspecifika varianter kommer att förstärkas med analysen.
- Design av analysprimrar och sond.
- Använd qPCR-analysdesignprogramvara och följ instruktionerna. IDT: s PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) för att designa 5 uppsättningar qPCR-analyser användes här.
- Klistra in den sekvens som valts i steg 2.2 i rutan Sekvensinmatning. Om justeringen skapade blanksteg tar du bort dem från sekvensen.
- Välj qPCR 2 Primers + Probe i alternativet Välj din design.
- Ladda ner de rekommenderade analyserna.
- Kopiera sekvenserna från den främre primern för den första analysen och sök efter den här primersekvensen i justeringen som skapas i steg 2.1.4. Om du använder Geneious Prime använder du verktyget Kommentera och förutsäga för att lägga till primerområdet i justeringen. Gör detta för alla primer- och sondkombinationer (figur 2).
- Inspektera dessa regioner för anpassning för variation inom målarten såväl som inom de samde förekommande arterna.
- Om det finns intraspecifik genetisk variation, sök efter analyser där primers och sond inte faller inom dessa regioner.
- För att förhindra icke-målartsförstärkning, sök efter missmatchningar med icke-målarter. Välj analyser med flest felmatchningar för ytterligare validering. (2018) föreslår att du väljer uppsättningar med minst två av de tre regionerna (de två primersna eller en primer och en sond) som har minst två missmatchningar med alla icke-målarter. Tänk dock på att missmatchningar vid sonden bidrar mindre till specificitet10.
OBS: Skillnader inom 3 baspar i 3' änden av varje primer ökar specificiteten bättre än skillnader i 5' änden av primers10.
- Tänk på följande viktiga parametrar i analysdesign.
- Bestäm smältnings- och glödgningstemperaturerna för primers och sonden. Helst bör smälttemperaturen (Tm) av primers vara mellan 60-64 °C och inom 2 °C från varandra, och sondens Tm ska vara 6-8 grader högre än primernas Tm. Ställ in glödgningstemperaturen (Ta) för qPCR-reaktionen 5 °C under smälttemperaturen, cirka 55–60 °C11.
- Undersök GC-innehållet. Välj mellan 35 – 65 % GC-innehåll och undvik regioner med 4 eller fler på varandra följande G. Att ha 1 eller 2 Gs eller Cs i de 5 sista baserna i 3' änden av primern (GC-klämman) kan öka specificiteten eftersom det skulle hjälpa primern att göra en starkarebindning 12.
- Sök efter hårnål och dimer strukturer. Testa primers och sond för förutsagda hårnålsstrukturer och dimers med hjälp av ett oligonukleotidanalysprogram (t.ex. OligoAnalyzer -IDT13; OligoKalkylator14). Dessa strukturer kan orsaka icke-målförstärkning och lägre effektivitet. Undvik analyser som förutspås bilda dessa strukturer.
- Bestäm primerlängden. Sikta på primers mellan 18-25 baser i längd och sondlängd mellan 20-25 baser. Längre primers och sonder kan ha lägre förstärkningseffektivitet.
- Bestäm ampliconlängden. Det ska vara mellan cirka 100 och 250 baspar. Detta intervall är i allmänhet tillräckligt kort för hög PCR-effektivitet, men tillräckligt länge för enkel verifiering av Sanger-sekvensering4,15.
- Designa sonder. Se till att sonderna inte har en G-bas i 5' änden, eftersom det kan dämpa signalen från gröna och gula färgämnen11. Vi designade dubbla släckta sonder, med IDT 3IABkFQ och ZEN-quenchers och FAM- eller HEX-fluorforer.
OBS: Bestäm MGB-sonderna: TaqMan MGB-sonder (mindre spårbindning) används ofta för eDNA-studier. Men eftersom dessa sonder är mycket korta kan de binda till icke-mål även med ett 2 eller 3 bas par som inte matchar10. - Bestäm sonden Tm. Sondens smälttemperatur bör vara 6-8 °C högre än primerna. Lägre temperaturer minskar sondens bindningsframgång.
- Bestäm sondens längd och plats. Sonden ska vara mellan 20 och 25 bp lång och idealiskt placerad nära primerbindningsstället på samma sträng utan att överlappa den.
3. Analys screening och optimering
- I silico analys utveckling och testning. Innan du beställer primer-probe uppsättningar, bedöma specificitet (potentiell icke-målförstärkning) genom att testa primerförstärkning i silico.
- Testa primers genom NCBI: s Primer-Blast16 eller liknande program som kan identifiera potentiella icke-mål i NCBI nt / nr-databasen som kan förstärkas med analysen. Om du använder Primer-Blast pastaprimrar på använd min egen primerbox under Primer-parametrar. I alternativen Primer Pair Specificity Checking Parameters väljer du nr som databas och skriver ordningsordningen för den organism som är av intresse (t.ex. "Unionida" eller "Unionoida") i rutan Organism.
- Fortsätt att utvärdera primer-/avsöknings uppsättningar visuellt på justerade sekvens data.
- För att bedöma primers och sonder samtidigt i silico, skapa en textsträng av den främre primern, 12 N, sonden, 12 N och det omvända komplementet av den omvända primern. Om sondsekvensen är inom 12 baspar från en av primerna, använd antalet N som motsvarar antalet baspar mellan primern och sonden.
- Använd NCBI:s Nucleotide Blast-sökning (Blastn) för att söka mot nr-databasen17. Använd fliken Taxonomi för att leta efter icke-målarter med få missmatchningar; Dessa bör testas i laboratoriet under analysoptimering.
OBS: Vid silikotestning hjälper till att utesluta icke-specifika analyser, men potentiellt specifika analyser måste testas empiriskt (in vitro), eftersom inte alla arter har sekvenser i de genetiska databaserna och primer och sonder kan fortfarande binda till icke-mål även om det anses osannolikt av programvaran.
- Välj tre till fem primer/probe kombinationer att testa i laboratoriet.
- Beställ primers, sonder och en syntetisk DNA-standard samt ytterligare M13-tailed primers för ampliconsekvensering.
- Beställ syntetiska oligonukleotidprimrar och sonder från ett företag som tillverkar oligos. Sonder är märkta med ett fluorescerande färgämne och en quencher. Olika fluorforer bör väljas för analyser som måste multiplexeras. Kontrollera ditt qPCR-instrument för en lista över vilka fluorforer instrumentet kan upptäcka.
- Designa och beställ M13-tailed primers för verifiering av qPCR-detektering med Sanger-sekvens genom att lägga till M13 Forward (-20) -sekvensen, GTA AAA CGA CGG CCA GT, till 5' änden av den främre primern och M13 Reverse (-27) -sekvensen, CAG GAA ACA GCT ATG AC, till 5' änden av den omvända primern.
- Den syntetiska DNA-standarden innehåller målsekvensen (inklusive primerregionerna) vid en känd koncentration i kopior/μL. Kvantifiera okända prover baserat på en kurva som gjorts av kända koncentrationer av denna standard (dvs. standardkurvan). Förvärva den syntetiska standarden från samma företag som tillverkar primers och sond. Följ tillverkarens rekommendationer för återsuspension och lagring. Späd standarder i TE-buffert med en tRNA-bärare som använder plastartiklar med låg retention för att minska hydrolys och bindning till ytor.
OBS: Om standardkurvan inte fungerar bra (dålig PCR-effektivitet, se steg 3.4.2), försök att återhänga standarden i vatten eller Tris-HCl. - Suspendera primers och sonder i nukleasfritt vatten, Tris-HCl eller TE-buffert vid lämpliga koncentrationer för analysanvändning. Späd i allmänhet ut arbetslagren 20 gånger i huvudmixen för att uppnå den optimerade slutliga analyskoncentrationen. Förvara upphängda oligos vid konstant -20 °C när de inte används.
- In vitro (i laboratoriet) analysoptimering och testning. Avvisa analyser som har dålig effektivitet, korsreagerar med sambestämande arter eller har dålig känslighet18. Inkludera användning av en intern positiv kontroll (IPC) under analysutveckling samt vid körning av faktiska prover.
- Hitta först de optimala koncentrationsvärdena för temperatur och primer/sond för analysen. När dessa parametrar har optimerats för PCR-effektivitet (steg 3.4.2), korsreaktivitet (steg 3.4.3) och känslighet (steg 3.4.4), fortsätt att testa analysen med en multiplexerad IPC (steg 3.4.5).
- Testa optimal glödgningstemperatur (Ta) för primer och sonder med hjälp av en PCR-temperaturgradient centrerad 5 ° C under den förväntade genomsnittliga primern Tm.
- Testa optimala primer- och sondkoncentrationer. Vanligtvis testas 200 nM, 400 nM och 800 nM primerkoncentrationer och 75 nM, 125 nM och 200 nM sondkoncentrationer.
- Skapa en standardkurva och bestäm effektivitet och linjärt intervall. Testa minst sex tiofaldiga utspädningar av en syntetisk DNA-standard som innehåller målsekvensen, med cirka 100 kopior/reaktion på 105 kopior/reaktion (figur 3A).
- Använd qPCR-programvaran för att rita Cq-värdet (tröskelvärde för cykel vid kvantifiering) för varje standard på y-axeln och loggbasen 10 i den ursprungliga standardkoncentrationen i kopior/reaktion på x-axeln. QPCR-programvaran ska automatiskt köra en linjär regression (bild 3B).
- Beräkna effektiviteten från regressionens lutning, E = -1 + 10(-1/lutning). Om lutningen till exempel är -3,4, E= -1 + 10(0,29) = 0,97 eller 97%. Kontrollera också r2-värdena som anger hur väl standarden replikerar passar på kurvan. QPCR-programvaran bör också automatiskt beräkna detta (figur 3B). Sikta på effektivitetsvärden på 100% (±10%) och r2 värden på ≥0,989,15,19,20,21,22.
- Inspektera visuellt standardkurvan för partiskhet, det vill säga avvikelser från regressionen i jämn riktning eller för dålig standardkurvaprestanda mätt med effektivitet och r2-värden (figur 3C och 3D).
- Specificitet: Bedöma korsreaktivitet med icke-målarter för att minska risken för falska positiva identifieringar. Om eDNA-identifieringar kan leda till kostsamma hanteringsbeslut, verifiera positiva identifieringar genom ampliconsekvensering.
- Icke-mål: Kör analysen mot genomiska DNA-extraktioner av taxonomiskt verifierade exemplar av närbesläktade arter och av geografiskt samutst förekommande arter. med högsta prioritet att testa mot närbesläktade, samdena arter. Använd liknande totala DNA-koncentrationer för både mål- och icke-målprover. Den valda koncentrationen bör ge förstärkning från målarters prover nära mitten av standardkurvans linjära utfång. Förstärkning bör endast observeras med målarten.
- Om icke-målförstärkning observeras, rengör och sekvensera produkten för att verifiera dess identitet. Det är inte ovanligt att observera kontaminering från målarten i vävnadsprover av icke-målarter, vilket innebär att alla förstärkningar i detta skede bör kontrolleras genom sekvensering. Reamplify rengjorda ampliconer från specificitetstester med M13 tailed primers och sekvens med M13 primers.
- I laboratoriet efter PCR överför du qPCR-produkterna som ska sekvenseras till färska rör. Ta bort kvarvarande primers och reaktionskomponenter med ett rengöringskit (t.ex. MinElute PCR Rening Kit).
- Gör 1:100 utspädningar av elutionerna och förstärk 1 μL av varje i 30 cykler i en 50 μL PCR-reaktion med M13-tailed primers och en högåtergivningspolymeras (t.ex. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase).
- Kör 10 μL av varje reaktion på en 1% agarose gel för att kontrollera om det finns ett enda band av förväntad storlek. Om inget band observeras, öka antalet cykler eller mängden prov. Om flera band observeras, gel rena bandet av förväntad storlek.
- Ta bort kvarvarande primers och reaktionskomponenter med ett saneringskit enligt ovan och mät DNA-koncentrationerna av elutionerna.
- Ställ in sekvenseringsreaktioner med M13-primerna enligt anvisningarna från sekvenseringsanläggningen.
OBS: Öppna aldrig förstärkta prover i qPCR-laboratoriet. Förbered prover för sekvensering i ett laboratorium som är dedikerat till prover efter PCR.
- Känslighet: Känslighet påverkar risken för falska negativ eller underlåtenhet att upptäcka målartens DNA när den förekommer. Utvärdera detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) för varje analys. Slutligen, inkludera en intern positiv kontroll (IPC) för att bedöma PCR-hämning av prover. Multiplex och testa denna IPC-analys med den utformade analysen för att säkerställa att de två analyserna inte stör varandra.
- LOD: Gör sex 4-faldiga seriella utspädningar av den syntetiska DNA-standarden, med 8-24 replikat per standardutspädning (Figur 4). Beräkna den lägsta initiala koncentrationen med 95% detektion. LOD- och LOQ-tomter kan genereras med lod/LOQ-kalkylatorR-skript 5.
OBS: Data under LOD bör inte censureras. På grund av PCR: s specificitet finns det ingen lägre gräns för sanna positiva identifieringar. LOD är den högsta koncentrationen under vilken falska negativ kan förväntas uppstå. - LOQ: Från samma utspädningsserie, beräkna den lägsta initiala DNA-standardkoncentrationen kvantifierbar med en variationskoefficient (CV) under 35%.
OBS: LOD och LOQ ska rapporteras i kopior/reaktion. Vid användning av en validerad analys och fältprover som förstärk under LOQ bör resultaten rapporteras som % detektioner snarare än eDNA-koncentrationer, eftersom den exakta koncentrationen inte kan mätas medförtroende 5.
- LOD: Gör sex 4-faldiga seriella utspädningar av den syntetiska DNA-standarden, med 8-24 replikat per standardutspädning (Figur 4). Beräkna den lägsta initiala koncentrationen med 95% detektion. LOD- och LOQ-tomter kan genereras med lod/LOQ-kalkylatorR-skript 5.
- Använd en intern positiv kontroll (IPC) för att testa för PCR-hämning. Hämning kan leda till minskad känslighet och falska negativ. Testa IPC-analysens förmåga att multiplexeras med målanalysen.
- En IPC-analys kan multiplexeras med målanalysen med hjälp av en sond med ett annat reporterfärgämne än målanalysen. Denna IPC-analys består av en kort syntetisk DNA-sekvens från en art som inte är relaterad till mål taxa, införlivad i qPCR master mix vid en låg koncentration av cirka 102 kopior/reaktion, tillsammans med primer och sonder som upptäcker den. Denna lägre koncentration är nödvändig för att undvika konkurrens med målsekvensen för polymeras och nukleotider23.
- Jämför Cq-värdet för exemplets IPC-mall med IPC-mallen i kontrollen ingen mall. I detta ingen mallkontroll (NTC) är den enda DNA-ingången IPC-mallen. IPC-mallen i denna reaktion bör förstärkas som förväntat. Om IPC-mallen i ett prov förstärker vid 2 eller fler cykler som skiljer sig från IPC-mallens i NTC, hämmas eDNA-provet. Prover som visar hämning kan spädas 1:10 och testas på ett igen. Om ett prov förblir hämmat bör provet tas bort från analysen.
- Hitta först de optimala koncentrationsvärdena för temperatur och primer/sond för analysen. När dessa parametrar har optimerats för PCR-effektivitet (steg 3.4.2), korsreaktivitet (steg 3.4.3) och känslighet (steg 3.4.4), fortsätt att testa analysen med en multiplexerad IPC (steg 3.4.5).
- Utveckling och testning av situ-analyser
- I laboratoriet: Om tillgång till skadegöraren i laboratoriet samt sympatric arter finns tillgänglig; ta vattenprover från djurutrymmen med dessa arter, bearbeta proverna och testa analysen mot dessa eDNA-prover. Sekvensprodukter enligt ovan för att verifiera förstärkning av det avsedda målet med hjälp av M13 tailed primers.
- I fältet:
- Identifiera platser där målorganismen är känd för att förekomma och som inte är känd för att förekomma. Det är att föredra att ha ett visst mått av överflöd på varje plats där målarten förekommer.
- Bestäm vilka provvolymer och provtagningsmetoder (t.ex. filtrering, centrifugering osv.) som ska användas.
- Inkludera en fältlös eller negativ kontroll på varje plats, detta är rent vatten som har förts till fältplatsen och sedan samlats in och förberetts med samma fältutrustning och protokoll som används för eDNA-provtagning24. Syftet med fältlösen är att upptäcka kontaminering av provtagningsutrustningen och fältredskapen som förs till platsen. Ta fältet tomt innan du bearbetar fältvattenprover.
- Ta flera vattenprover per plats, helst 3 prover per plats.
- Tillbaka i laboratoriet, bearbeta och extrahera prover.
- Kör analysen med en platta som liknar figur 5A och jämför eDNA-koncentrations- och detektionsfrekvensen med kända skillnader i förekomst och överflöd på platsen. Bekräfta alla identifieringar genom attsekvensera 24,25.
OBS: Ovanstående skulle validera en analys genom nivå 4 i Thalinger et al.s (2020) skala6 (optimering av analysens tekniska prestanda) och börja samla in data som stöder nivå 5-analysvalidering. Nivå 5 innehåller sannolikhetsmodellering och användning av analysen för eDNA-ekologistudier. Vi anser att detta ligger utanför tillämpningsområdet för grundläggande analysutveckling, men vi uppmuntrar dessa tillämpningar av laboratorie- och fälttestade analyser för att förbättra analysdesign och datatolkning.
Representative Results
Vid utformningen av en artspecifik qPCR-analys för mucket (A. ligamentina), laddades tillgängliga sekvenser av alla Unionidae-arter i Clinch-floden ner. Närbesläktade arter som Lampsilis siliquoidea ingick också i referensdatabasen även om de inte finns i samma flod. Inte alla arter i flodsystemet av intresse hittades i GenBank, så ytterligare arter sekvenserades i hus. Sekvenser justerades med hjälp av Geneious programvara och Primer Quest (IDT) programvara användes för att utforma flera analyser. Fem uppsättningar primers och sond lades till i justeringen för visuell bedömning (figur 2). De testades sedan i silico med Primer-Blast, varefter de beställdes för ytterligare testning in vitro. I laboratoriet testades alla analyser med HJÄLP AV DNA-extraktioner av 27 tillgängliga arter för att verifiera specificitet. En analys (A.lig.1) förstärkte endast målarterna(tabell 1). Tabell 2). Denna analys gick framåt för ytterligare tester av analyseffektivitet, LOD och LOQ. Den har en ampliconlängd på 121 baspar. Tabell 3 visar den sekvens som används för A. ligamentina syntetisk DNA-standard. Figur 3A och figur 3B visar resultaten av en framgångsrik analys med god effektivitet och r2-värden. Figur 3C och figur 3D visar en analys vars standardkurva har dålig effektivitet. denna analys kasserades. LOD och LOQ för den valda analysen (A.lig.1) befanns båda vara 5,00 kopior/reaktion med hjälp av den diskreta metoden som beskrivs i Klymus et al5. Den IPC som multiplexerades med analysen (tabellerna 3-6) påverkade inte A. ligamentina assays standardkurva. Den IPC vi använder är ett fragment av musen HemT-transkription. Denna analys var fördesignad av IDT för ett annat program, men vi ändrade dess användning som en IPC för vårt labbs eDNA-applikationer.
En lyckad qPCR-körning bör uppfylla vissa kriterier för varje prestandamått (dvs. standardböjförstärkning, genomisk DNA-positiv kontroll, ingen mallkontroll och intern positiv kontroll). Målanalysstandarderna bör ha exponentiella förstärkningskurvor. Dessa kurvor bör nå en ändpunktsplatå om de tillåts köra tillräckligt med cykler. Detta tyder på att fluorescerande sonden konsumeras helt under reaktionen och fluorescensnivåerna når en maximal gräns. Senare förstärkningsstandarder kanske inte når en platå i 40 cykler. De positiva kontrollerna (genomiskt DNA och IPC) bör ha samma mönster. Okända ämnen kan förstärkas eller inte, men förstärkning i okända ämnen bör också ha ett exponentiellt mönster och en ändpunktsplatå (figur 5).
I en qPCR av hög kvalitet förstärker standardutspädningarna vid jämnt fördelat Cq på ungefär var 3,3:e cykel för varje 10-faldig koncentrationsskillnad. Varje replikat av en standardutspädning förstärker på ett tätt grupperat sätt med nästan samma Cq (representeras av r2-värdena). Alla standardutspädningar bör uppvisa förstärkning(figur 3A). I en dålig qPCR kan standarder uppvisa icke-exponentiell form, ojämn variation i Cq-värden mellan utspädningar, inte komma till en ändpunktsplatå, eller vissa utspädningar kanske inte förstärker alls (figur 3D).
De viktiga parametrarna för en standardkurva är effektivitet, r2,lutning och y-intercept. Effektiviteten bör falla mellan 90%-110% med idealvärden nära 100% och r2 värden bör vara över 0,98 med idealiska resultat närmar sig 1,015,22. Lutningsvärdena bör ligga mellan -3,2 och -3,5 med idealiska resultat nära -3,322. Y-intercept-värdena bör falla mellan en Cq på 34-41 med idealiska resultat med en Cq på 37,0. Y-intercept är den förväntade Cq för en reaktion med 1 kopia av målsekvensen, den minsta enheten som kan mätas i en enda qPCR. Okända med Cq är större än y-intercept är sannolikt hämmade. Att köra mer än 40 cykler av PCR kan vara nödvändigt för att upptäcka målet vid hämning eller en ineffektiv primeruppsättning, men kvantifiering är inte möjlig under dessa omständigheter och ytterligare negativa kontroller utan målsekvensen, men som innehåller totalt DNA som liknar det okända, bör köras för att utesluta förstärkning från icke-specifika källor.
IPC-förstärkning (Internal Positive Control) i okända prover bör jämföras med resultaten av den negativa mallkontroll-IPC, eftersom det inte finns någon konkurrens om reagenser och inga hämmare förekommer. Okända personer med en IPC med en Cq på 2 cykler eller större än NTC:s genomsnittliga Cq-värde, eller som inte förstärker bör anses hämmade. Om det inte finns några hämmare i proverna bör all IPC-förstärkning ha en tät gruppering i området med Cq-värden nära samma som NTC (figur 6).
Slutligen inträffade in situ-testning av analysen. Tjugo vattenprover från Clinch River och tre fält blankprov filtrerades mellan 25-26 september 2019 inom 500 meter från en musselbädd känd för att ha A. ligamentina. Cirka fyra 1 L-prover av vatten filtrerades per provtagningsplats. Platser som ingår längst ner i musselbädden i ström, botten av musselbädden nära stranden, 100 m nedströms sängen i ström, 500 m nedströms sängen i ström och 500 m nedströms sängen nära stranden(figur 7). Tillbaka i laboratoriet halverades varje filter och DNA extraherades från endast hälften av ett filter. Den återstående filterhalvan för varje prov lagrades i en -80 °C frys. Proverna kördes sedan med A.lig.1-analysen multiplexerad med IPC. Av de 23 proverna konstaterades fem vara hämmade. Dessa prover späddes ut 1:10 och utspädningar gjordes om. Nitton av de 20 fältprover som förstärks med hjälp av den konstruerade analysen. Av dessa 19 prover låg fem över analysens LOD och LOQ på 5 kopior/reaktion; de flesta av proverna hade en eDNA-detektion men på en nivå där falska negativa resultat sannolikt kommer att inträffa och att analysen inte med säkerhet kunde kvantifiera kopieringsnumret för dessa 14 prover. Ändå replikeras 75 till 100% av de fyra biologiska området på varje provtagningsplats. Två av de tre fältämnena var negativa, medan ett fält tomt visade förstärkning, betonar vikten av ren teknik i fältet.
Figur 1: Arbetsflöde för mitokondriell DNA-sekvensdatabaskonstruktion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Sekvensjusteringar för clinchflodmusselarter med prospektiva primers och sonder för Actinonaias ligamentina ND1-analysen. Framåt primers i mörkgrönt, sond i rött och omvänd primer i ljusgrönt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Standardkurva och linjära regressionsexempel. A. Exempel på en acceptabel standardkurva som härleds från förstärkningen av tre replikat var och en av sex standardutspädningar. En 10-faldig standard utspädningsserie med den högsta koncentrationen av standarden till vänster, med minskande koncentrationer som rör sig åt höger. Den horisontella linjen som korsar alla spår är tröskeln för cykel vid kvantifiering (Cq). Om varje spår korsar detta tröskelvärde är det där Cq bestäms. B.Linjär regression gjord av standard replikat av figur 3A. Replikat av standardutspädningarna ritas i cirklar och det okända (proverna) ritas med x. Effektiviteten är 98,9%, r2 närmar sig 1,0 och lutning på -3,349. C. Exempel på en dålig standardkurva som härrör från förstärkning av tre replikat var och en av sex standardutspädningar. D. En linjär regression som bildar standardkurvan för standardreplikerna förstärks i exempel 3C. Observera dålig effektivitet och r2-värden. Observera också att endast 4 av de 6 standarderna förstärktes. Om standardkurvan inte förbättras efter upprepade körningar kan problemet vara med en dålig primer/probe-uppsättning som inte förstärker mål-DNA som förväntat, i vilket fall denna analys inte bör övervägas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Exempel på plåtinställningar för LOD- och LOQ-standard qPCR-körningar. Standarder som används i kurvan är i blått, standardkoncentrationen minskar från mörk till ljusblå. DNA-positiv kontroll i grönt och ingen mallkontroll (NTC) i gult. Experimentella standardkoncentrationer i grått som visar 24 replikat för varje standardutspädning. Utspädningsserien pläterades över två plattor (A, B), var och en med en standardkurva, positiv kontroll och NTC. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Plattinställning och förstärkning spårar från en qPCR-körning. A. Plåtinställning, standarder som visas i blå, mörkare färg som indikerar den högsta koncentrationen av standarden. DNA-positiv kontroll i grönt, inga mallkontroller i gult (NTC), provmål i grått. B. Förstärkning spårar från en qPCR-körning. Standarder som visas i blått, DNA-positiv kontroll i grönt, inga mallkontroller i gult och okända i rött. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Förstärkningsspår för intern positiv kontroll (IPC). IPC spårar för alla okända exempel i magenta och IPC från ntc-kontroller (no template controls) som visas i orange med trianglar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Karta som visar eDNA-samlingsplatserna för en musselbädd i Clinch River längs gränsen mellan Virginia och Tennessee. Prover samlades in vid Wallens Bend längst ner i sängen, 100 m nedströms sängen och 500 m nedströms sängen. Platser samlades antingen mitt i strömmen (i ström) eller ungefär 1 - 2 meter från strandlinjen (stranden). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| komponent | Namn | Sekvens 5' – 3' | Fluorescerande etikett | |
| Framåt Primer | A.lig.1-f | CCCTCATCACGTACCTCTTAATC | ||
| Omvänd primer | A.lig.1-r | GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA (OLIKA) | ||
| sond | A.lig.1 sond | TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT | Fam. | |
Tabell 1: Den konstruerade Actinonaias ligamentina qPCR-analysen (A.lig.1) inklusive sekvenser för framåt- och omvända primers och sonden.
| art | förstärkt | I clinchfloden |
| 1. Actinonaias ligamentina | Ja | Ja |
| 2. Actinonaias pectorosa | Nej | Ja |
| 3. Amblema plicata (olika betydelser) | Nej | Ja |
| 4. Corbicula spp. | Nej | Ja |
| 5. Cumberlandia monodonta | Nej | Ja |
| 6. Kytonias tuberculata | Nej | Ja |
| 7. Cyprogenia stegaria | Nej | Ja |
| 8. Elliptio dilatata (på)Elliptio dilatata | Nej | Ja |
| 9. Epioblasma brevidens | Nej | Ja |
| 10. Epioblasma capsaeformis | Nej | Ja |
| 11. Epioblasma florentina aureola | Nej | Ja |
| 12. Epioblasma triquetra | Nej | Ja |
| 13. Fusconaia cor | Nej | Ja |
| 14. Fusconaia subrotunda | Nej | Ja |
| 15. Lampsilis ovata | Nej | Ja |
| 16. Lampsilis silikat | Nej | Nej |
| 17. Lasmigona costata | Nej | Ja |
| 18. Lemiox rimosus | Nej | Ja |
| 19. Lexingtonia dolabelloides | Nej | Ja |
| 20. Medionidus conradicus | Nej | Ja |
| 21. Plethobasus cyfys | Nej | Ja |
| 22. Pleurobema plenum | Nej | Ja |
| 23. Ptychobranchus fasciolaris | Nej | Ja |
| 24. Ptychobranchus subtentus | Nej | Ja |
| 25. Quadrula pustulosa | Nej | Ja |
| 26. Strophitus undulatus | Nej | Ja |
| 27. Villosa iris | Nej | Ja |
Tabell 2: En förteckning över arter som används för in vitro-specificitetstestning av A.lig.1-analysen. Analysen förstärkte arvsmassans DNA från målet (Actinonaias ligamentina) och förstärkte inte någon av de icke-målarter.
| komponent | Sekvens 5'-3' | ||||
| Actinonaias ligementina standard | CCCTCATCACGTAC (ccctcatcacgtac) CTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA | ||||
| AAGCCCTCGGGT (AAGCCCTCGGGT) ACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC | |||||
| CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAGCTCTTCGTAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT | |||||
| CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT | |||||
| GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT | |||||
| TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA | |||||
| AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA | |||||
| TAAC (taac) | |||||
| IPC-mall (Hem-T) | CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTCCCTCGAATCTCAGACGCT | ||||
| GTATGACAGTCTCCTTTCGTGAACATTCGGCTGCTATGTTCTCAAGGACTGCAC | |||||
Tabell 3: Sekvens (5'-3') av Actinonaias ligamentina standard och IPC-mallen (Hem-T) som används för denna analys. Sekvensen för de framåt- och omvända primerna är i fetstil och kursiv stil, och sondens är understruken.
| komponent | Namn | Sekvens 5' – 3' | Fluorescerande etikett | |
| Framåt Primer | HemT-F | TCTGAGTGTCCCTCGAATCT | ||
| Omvänd primer | HemT-R | GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC | ||
| sond | HemT-P | TGACAGTCTCCTTTCGTGAACATTCG | Cy5 (cy5) | |
Tabell 4: IPC-analysen (Internal Positive Control) inklusive sekvenser för framåt- och omvända primers och sonden.
| Volym per prov (μL) | komponent |
| 10 | Miljö master mix |
| 1 | 20uM A. lig.1 F/R blandning |
| 1 | 2.5uM A. lig.1 sond |
| 1 | 5uM IPC primer mix (HemT-F/ R) |
| 0.75 | 2.5uM IPC-sond (HemT-P) |
| 1.5 | 1 X 103 koncentration av IPC-mallen |
| 2.75 | H20 |
| 2 | prov |
| 20 | Total volym |
Tabell 5: PCR-blandningen som används för A.lig.1-analysen multiplexerade med IPC-analysen.
| steg | Temperatur (°C ) | Tid | |
| 1 | Inledande denatur | 95 | 10 min |
| 2 | denaturera | 95 | 15 sek |
| 3 | Glödgning | 60 | 1 min |
| 4 | Gå till steg 2, upprepa 39X |
Tabell 6: Reaktionsförhållanden för A.lig.1-analysen.
Discussion
Som med alla studier är definitionen av den fråga som ska tas upp det första steget och utformningen av eDNA-analysen beror på studiens omfattning26. Om målet med forskningen eller undersökningen till exempel är att upptäcka en eller några arter är en riktad sondbaserad analys bäst. Om målet dock är att bedöma en större svit eller sammansättning av arter, är metabarkodningsanalyser med hög genomströmning bättre lämpade. När det har fastställts vilken metod som ska ske rekommenderas en pilotstudie med analysdesign, testning och optimering24. Analysdesignen börjar med en lista över arter som beskrivs i Figur 1. Denna förteckning kommer att ligga till grund för att förstå hur väl en analys fungerar när det gäller specificitet och det geografiska intervall som den kan tillämpas på6,10. Det uppmuntras att utforma analysen för ett visst geografiskt område, vilket gör det möjligt för konstruktören att bättre testa en analys för korsaktivitet mot andra arter i det området, och att vara medveten om de begränsningar detta har för att utvidga en analys till andra områden där en målart kan förekomma.24. När listan är klar kan sekvenser laddas ner från offentliga genetiska databaser. Eftersom dessa databaser är ofullständiga27, bör man sekvensera så många arter på listan som möjligt i huset för att fylla i den lokala referensdatabasen över sekvenser som kommer att användas i analysdesign. Prioritera närbesläktade arter, eftersom dessa är de mest sannolika icke-målen som kommer att förstärkas. Att fokusera på alla arter inom samma släkte eller familj som målarten är ett bra ställe att börja. Jämförelser med närbesläktade arter hjälper till att identifiera sekvensregioner som är unika för målarten. Detta kan hjälpa till att informera om hur analysen kan fungera i andra system eller platser. Mitokondriella regioner är det vanliga valet för analysutveckling, eftersom mer sekvensinformation från ett bredare antal arter finns tillgänglig vid mitokondriella gener som har använts i streckkodning av livsprojekt, och eftersom mitokondriellt DNA finns i mycket större koncentration i kopior / cell än nukleärt DNA24,28,29. Flera genregioner bör bedömas för vidare analysutveckling eftersom sekvenstäckningen varierar mellan taxa i databasen för genetiska arkiv. När den här lokala databasen med referenssekvenser har skapats används en kombination av manuell visualisering av justerade sekvensdata och datorprogram för att utforma primer/probe-analyserna. Man bör inte förlita sig strikt på programvara för att avgöra vilka analyser som ska testas. Det är viktigt att verifiera visuellt på inriktningar där primers och sonder sitter på målen och icke-mål för att få en bättre förståelse för hur de kan agera i en PCR. Slutligen omfattar analysscreening och optimering tre nivåer (i silico, in vitro och in situ)6,7,24,25. I silico design och testning är viktigt för att producera en kort lista över analyser med en god chans att lyckas, men empirisk (in vitro) testning är avgörande för att välja analysen med bästa faktiska prestanda. In vitro-optimering och testning av analyser inkluderar att mäta reaktionseffektiviteten och definiera analysens känslighet och specificitet. Gränser för detektion och kvantifiering är två parametrar som ofta förbises i analysutvecklingen men som är viktiga för datatolkning. Genom att köra flera replikat av standardkurvorna för en analys kan LOD och LOQ enkelt mätas1,5,30. Få studier diskuterar resultat med avseende på analysens LOD eller LOQ, men Sengupta et al. (2019) införlivar sin analyss LOD och LOQ i sin datatolkning och grafik för en tydligare förståelse av deras resultat31. Interna positiva kontroller bör också multiplexeras till den utformade analysen. Utan testning för PCR-hämning i proverna kan falska negativ uppstå24,32. Vi föreslår användning av en multiplexerad IPC-analys med målanalysen som den enklaste metoden för PCR-hämningstestning23. Slutligen är det nödvändigt att på plats testa analysen från fält- och laboratoriesamlade prover för att säkerställa att målförstärkning sker i miljöprover24.
Det finns begränsningar för användning av artspecifika, sondbaserade qPCR-analyser med eDNA-prover. Till exempel kan utformningen av flera analyser för testning begränsas av sekvenstillgänglighet, och kompromisser kan vara nödvändiga när det gäller aspekter av analysprestanda. Dessa val måste vägledas av studiens mål och ska rapporteras med resultaten26. Om målet till exempel är att upptäcka en sällsynt art och få positiva resultat förväntas, kan en analys med ofullständig specificitet (dvs. förstärkning av icke-målarter) användas om alla upptäckter kommer att verifieras genom sekvensering. Om målet är att övervaka det geografiska området för en art och eDNA-koncentrationsdata inte behövs, kan en analys med ofullständig effektivitet användas och data rapporteras endast som procentdetektering. Om inte alla potentiella konspecificer testas i laboratoriet, vilket sällan är möjligt, kan man inte med absolut säkerhet veta den verkliga specificiteten hos en analys. Till exempel designades och testades analysen mot flera sötvattenmusselarter i Clinch River. För att använda denna analys i ett annat flodsystem skulle vi behöva testa den mot en svit av arter på den nya platsen. Genetisk variation inom arten eller populationen som inte testas under analysutvecklingen kan också påverka specificiteten. Slutligen, även om en analys har kontrollerats ha hög teknisk prestanda, villkor ändras när du arbetar inom området. Icke-analysrelaterade tillstånd som vattenflöde, pH och djurbeteende kan ändra eDNA-detekterbarhet, liksom användning av olika eDNA-insamlings- och extraktionsprotokoll. Att använda analyser som är optimerade och väl beskrivna hjälper till att underlätta förståelsen av hur sådana parametrar påverkar eDNA-detektion.
EDNA:s område mognar bortom det förberedande analysstadiet till att öka standardiseringen av metoder och tekniker. Denna utveckling kommer att förbättra vår förståelse för eDNA-tekniker, förmågor och begränsningar. Optimeringsprocessen som vi beskriver ovan förbättrar en analyss känslighet, specificitet och reproducerbarhet. Det slutliga målet med denna förfining och standardisering av eDNA-metoder är att förbättra forskarnas förmåga att dra slutsatser baserade på eDNA-data samt öka slutanvändar- och intressentförtroendet för resultaten.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; Vid insamling, analys eller tolkning av uppgifter. i manuskriptets skrift; eller i beslutet att offentliggöra resultaten.
Acknowledgments
Vi tackar Alvi Wadud och Trudi Frost som hjälpte till med primerutveckling och testning. Finansiering för den analysdesign som rapporterades i denna studie tillhandahölls av Institutionen för försvarsstrategi strategisk miljöforskning och utvecklingsprogram (RC19-1156). All användning av handels-, produkt- eller firmanamn är endast för beskrivande ändamål och innebär inte godkännande från den amerikanska regeringen. Data som genereras under denna studie är tillgängliga som en USGS-datarea https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
References
- Kubista, M., et al.
- Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology. 10, 5 (1992).
- Mauvisseau, Q., et al. Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches. Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).
- Hernandez, C., et al. 60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada. Environmental DNA. , (2020).
- Klymus, K. E., et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environmental DNA. , (2019).
- Thalinger, B., et al. A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. bioRxiv. , (2020).
- Helbing, C. C., Hobbs, J. Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring. CSA Group. , (2019).
- Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management. Trends in Ecology & Evolution. , (2020).
- Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).
- Prediger, E. How to design primers and probes for PCR and qPCR. IDT. , Available from: http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes (2020).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).
- Owczarzy, R., et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).
- Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).
- Taylor, S. C., et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 5279. , ed Bio-Rad (2020).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 6894. , Bio-Rad (2020).
- Eurogentec. Eurogentec. Vol. 0708-V2. , ed Eurogentec (2020).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
- Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
- Guan, X., et al. Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America. Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).
- Mosher, B. A., et al. Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners. Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).
- Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences. Cladistics. 28, 6 (2012).
- Rees, H. C., et al. REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).
- Evans, N. T., Lamberti, G. A. Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool. Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Sengupta, M. E., et al. Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).
- Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).
