Summary
В этом отчете мы представляем протокол, который позволяет исследователю сгенерировать мышиную модель внутриглазного увеита. Эта модель, чаще называемая экспериментальным аутоиммунным увеитом (EAU), охватывает многие аспекты заболеваний человека. Здесь мы опишем, как индуцировать и контролировать прогрессирование заболевания, используя несколько показаний.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный увеит (EAU) управляется иммунными клетками, реагирующими на собственные антигены. Многие особенности этой неинфекционной, внутриглазной модели воспалительного заболевания повторяют клинический фенотип заднего увеита, поражающего людей. EAU был надежно использован для изучения эффективности новых воспалительных терапевтических средств, их способа действия и для дальнейшего исследования механизмов, лежащих в основе прогрессирования внутриглазных заболеваний. Здесь мы приводим подробный протокол по индукции EAU у мыши C57BL/6J – наиболее широко используемого модельного организма с восприимчивостью к этому заболеванию. Клиническая оценка тяжести и прогрессирования заболевания будет продемонстрирована с помощью фундоскопии, гистологического исследования и флуоресцеиновой ангиографии. Процедура индукции включает подкожную инъекцию эмульсии, содержащей пептид (IRBP1-20) из глазного белка интерфоторецептора ретиноидового связывающего белка (также известного как ретинолсвязывающий белок 3), complete Freund's Adjuvant (CFA) и дополненного убитой Mycobacterium tuberculosis. Инъекция этой вязкой эмульсии на заднюю часть шеи сопровождается однократной внутрибрюшинной инъекцией токсина Bordetella pertussis . При появлении симптомов (12-14 день) и под общим наркозом делаются фундоскопические снимки для оценки прогрессирования заболевания путем клинического обследования. Эти данные можно напрямую сравнить с данными в более поздние моменты времени и пик заболевания (день 20-22) с проанализированными различиями. В то же время этот протокол позволяет исследователю оценить потенциальные различия в проницаемости сосудов и повреждениях с помощью флуоресцеиновой ангиографии. EAU может быть индуцирован у других штаммов мышей - как дикого типа, так и генетически модифицированных - и в сочетании с новыми методами лечения, обеспечивающими гибкость для изучения эффективности лекарств и / или механизмов заболевания.
Introduction
Этот протокол продемонстрирует, как индуцировать экспериментальный аутоиммунный увеит (EAU) у мыши C57BL/6J путем однократной подкожной инъекции антигена сетчатки в эмульгированном адъюванте. Методы мониторинга и оценки прогрессирования заболевания будут детализированы с помощью фандоскопической визуализации и гистологического исследования с изложенными в них параметрами измерения. Кроме того, будет обсуждаться флуоресцеиновая ангиография, методика исследования структуры кровеносных сосудов сетчатки и проницаемости.
Эта модель EAU резюмирует центральные особенности неинфекционного заднего увеита у людей в отношении клиникопатологических характеристик и основных клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют заболеванием. EAU опосредована подмножествами Th1 и/или Th17 самореактивных CD4+T-лимфоцитов, как показано в экспериментах по переносу усыновления и у мышей, обедненных IFNγ1. Большая часть нашего понимания потенциальной роли этих клеток при увеите исходит из изучения EAU2, где клетки Th1 и Th17 обнаруживаются в тканях сетчатки3. Часто EAU используется в качестве доклинической модели для оценки полезности новых методов лечения в ослаблении заболевания. Терапевтические подходы, которые успешно модулировали болезнь EAU, показали некоторую эффективность в клинике и достигли статуса одобренного FDA. Примерами этого являются группы иммунорегуляторных препаратов, таких как Т-клеточная таргетная терапия: циклоспорин, FK-506 и рапамицин 4,5,6. В последнее время в этой модели также были изучены вмешательства, нацеленные на новые пути, для изучения как механизма, так и влияния на исход заболевания. К ним относятся нацеливание транскрипционной регуляции через считыватель хроматина Bromodomain Extra-Terminal (BET) белки и ингибиторы P-TEFb3. Более того, более традиционные подходы, такие как ингибитор VLA-4, недавно продемонстрировали подавление в EAU посредством модуляции эффекторных CD4 + Т-клеток7. Кроме того, было обнаружено, что нацеливание на клетки Th17 с помощью TMP778, обратного агониста RORγt, значительно подавляет EAU8. Кроме того, эта модель дает возможность изучить хроническое аутоиммунное воспаление в сетчатке и сопутствующие основные механизмы, такие как прайминг лимфоцитов.
Основными показаниями для доклинических исследований EAU являются клиническая оценка путем выполнения визуализации фундоскопии сетчатки и реже путем оценки целостности сетчатки с помощью оптической когерентной томографии (OCT). Гистопатологическая оценка сетчатки и иммунофенотипирование клеток сетчатки методом проточной цитометрии затем проводятся при прекращении. Фундоскопия - это простая в использовании живая система визуализации, которая позволяет быстро и воспроизводимо проводить клиническую оценку всей сетчатки. Для иммуногистохимических оценок методики основаны на подготовке срезов сетчатки, которые позволяют изучать архитектуру тканей на степень воспаления и структурного повреждения9. Критерии оценки и традиционные системы оценки для всех используемых методов будут изложены в рамках этого протокола. Степень повреждения, регистрируемого с помощью фандоскопической визуализации, часто тесно коррелирует с гистологическими изменениями. Этот двойной подход к мониторингу и оценке тяжести заболевания обеспечивает большую чувствительность и более надежные результаты измерения.
EAU является хорошо зарекомендовавшей себя, широко используемой моделью для доклинического тестирования и исследования иммуноопосредованных заболеваний глаз. Эта модель надежна и воспроизводима с >95% заболеваемости и генерирует всеобъемлющие данные, которые могут быть использованы для проверки или отказа от новых методов лечения внутриглазного воспалительного заболевания, которое представляет собой основную причину слепоты трудоспособного возраста во всем мире10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года и руководящими принципами Институционального органа по благополучию животных и этическому обзору (AWERB).
1. Корпус мышей C57BL/6J
- Домашние мыши в определенной среде, свободной от патогенов, на 12-часовом цикле свет-темнота и пища и вода доступны ad libitum.
- Провести все эксперименты на взрослой женщине C57BL/6J (предпочтительно выбираются женщины, так как существует частота женщин к мужчинам 1,4 к 1 у пациентов с увеитом). Рандомизируйте самок мышей C57BL/6J в возрасте от 6 до 8 недель по весу и возрасту. Размещайте мышей в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) в группах по 5-6 мышей на клетку.
2. Иммунизация мышей C57BL/6
- IRBP1-20 - Препарат эмульсии CFA
ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат эмульсии необходим для воспроизводимости и заболеваемости; таким образом, необходимо приложить все усилия для поддержания последовательности на протяжении всего процесса подготовки и экспериментов. При приготовлении эмульсии потери должны быть учтены в расчетах всех реагентов заранее. Эта потеря может составлять примерно 1,5x (или 50% дополнительно от подготовленного объема), исходя из количества мышей, запланированных для иммунизации. Ниже приведен следующий пример. Чтобы иммунизировать 10 мышей, подготовьте 15 мышей и используйте 400 мкг (пептид на 20 г мыши) x 15 мышей = 6 мг. Каждая мышь должна получить 200 мкл для иммунизации (всего 3 мл). Конечный объем содержит соотношение 1:1 пептидного раствора и CFA, следовательно, 1,5 мл пептидного раствора и 1,5 мл CFA.- Подготовьте все стерильные растворы в ламинарной проточной камере с использованием асептических методов.
- Взвесьте желаемое количество (400 мкг на 20 г мыши) человеческого IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) лиофилизированного пептида. Растворяют пептид в 100% ДМСО. Хранить в запасе в лиофилизированном виде при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения полного растворения порошка каждая чешуйка должна сначала вступить в контакт с ДМСО и не проявлять никаких признаков остаточного твердого вещества. Добавьте PBS небольшими порциями, чтобы достичь окончательного объема. Не смешивайте с вихрем, вместо этого используйте мягкое перемешивание пипеткой. Конечная концентрация ДМСО не должна превышать 1% от общего объема пептидного препарата. Приготовление эмульсии в пластиковой трубке объемом 20 мл с коническим дном должно обеспечить лучший доступ ДМСО к лиофилизированному порошку. - Добавьте раствор пептида DMSO-PBS при 1:1 v/v к CFA, который уже был дополнен 1,5 мг/мл убитой Mycobacterium tuberculosis, чтобы получить конечную концентрацию 2,5 мг/мл. Добавляйте по каплям, мягко и часто пипетируя, образуя вязкую и равномерно распределенную эмульсию.
- Аэрировать пептидный раствор и CFA с помощью пипетки 1000 мкл (установленной на 700 мкл для предотвращения дальнейшей потери) и пипетки для получения кремообразной густой консистенции. Этот метод включает в себя использование пипетки для многократной аспирации вверх и вниз до достижения желаемой толщины. Для достижения оптимальных результатов убедитесь, что раствор антигена и адъювант тщательно смешаны перед инъекцией.
- Внутрибрюшинная инъекция коклюшного токсина
- Суспендировать 1,5 мкг коклюшного токсина Bordetella в 100 мкл среды RPMI 1640, дополненной 1% мышиной сывороткой11.
- Выполните внутривенную инъекцию стерильным шприцем и иглой 23G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание нарушений в месте инъекции, токсин коклюша необходимо вводить перед введением антигена. - Временно переведите каждую мышь в отдельную клетку, чтобы получить одну инъекцию 100 мкл i.p. токсина Bordetella pertussis .
- Подкожное введение эмульсии IRBP
- Далее вводят эмульсию IRBP подкожно. Этот процесс требует, чтобы два обработчика животных были надлежащим образом одеты с защитой в соответствии с правилами охраны здоровья и безопасности.
- Попросите одного обученного человека слегка удерживать мышь на верхней части клетки в позе, похожей на неряшливость, животом вниз, в то время как другой обученный человек зажимает кожу, чтобы сформировать палаточную структуру на задней части шеи, где игла может быть вставлена, чтобы прорезать между пальцем и большим пальцем.
ВНИМАНИЕ: Существует опасность травмы от укола иглой. - Как только игла будет позиционирована, введите 200 мкл эмульсии IRBP. При удалении иглы поверните головку иглы, чтобы закрыть кожу перед вытаскиванием, и приложите давление после этого к месту инъекции, чтобы предотвратить рефлюкс эмульсии.
ВНИМАНИЕ: Эмульсия не должна контактировать с кожей или мехом мыши, так как это может вызвать раздражение, а в более тяжелых случаях - развитие поражения. Если это происходит, область должна быть немедленно протерта и тщательно с использованием 70% этанола, а затем высушена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если дренирующие лимфатические узлы необходимы для обследования в конце исследования, место инъекции будет другим. В этом случае вводят 100 мкл в обе стороны бока подкожно. Это создаст более сильную реакцию на дренирующие паховые лимфатические узлы, которые могут быть иссечены во время сбора урожая. Однако, если предполагаемый результат заключается исключительно в развитии EAU, предпочтительнее одна инъекция 200 мкл в задней части шеи, чтобы избежать дискомфорта от нескольких мест инъекции.
3. Клиническая оценка - Исследование глазного дна мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Клиническое заболевание должно быть оценено с помощью исследования глазного дна, с помощью живой визуализации яркого поля с использованием фундоскопа и программного обеспечения Discover, используемого для визуализации.
- В начале заболевания (12-14 день) седативные мыши под общим наркозом использовали комбинацию кетамина (50 мг/мл) и домитора (медетомидин; 1 мг/мл). Разбавить 1-й частью Домитора; 1,5 части кетамина и 2,5 части стерильной инъекционной воды, затем вводят 100 мкл на 30 г внутрибрюшинно. Используйте 1 мл стерильных шприцев и игл 23G для вышеуказанной комбинации анестезии.
- После этого следите за мышью, чтобы убедиться, что все рефлексы потеряны и что она не реагирует на раздражители.
- Сразу после получения инъекции i.p. и пока мышь все еще удерживается в неряшливости, нанесите 1% тропикамида и 2,5% фенилэфрина местно на каждый глаз для расширения зрачка. Стремитесь полностью покрыть роговицу обоими расширяющими растворами. Может пройти несколько минут, прежде чем зрачок полностью расширится.
- После этого щедро нанесите на глазную мазь viscotears и поддерживайте на протяжении всего процесса визуализации, чтобы сохранить глаз полностью смазанным и увлажненным.
- Тем временем откройте программное обеспечение (например, Discover) и установите фундоскоп (например, Micron) для захвата изображений под ярким полем. Выделите каждой отдельной мыши папку и пометьте изображения R или L в соответствии с каждым сфотографированным глазом.
- Установите мышь на специально построенную сцену для визуализации в реальном времени и позиционируйте микроскоп для полного доступа к сетчатке.
- Чтобы получить точное представление о заболевании, сделайте снимки всей области сетчатки, охватывающей все уголки периферии помимо диска зрительного нерва. Для этого отрегулируйте окуляр по всей длине. Крайне важно, чтобы глаз всегда оставался полностью смазанным на протяжении всего процесса визуализации; убедитесь в этом, доливая глазную мазь с постоянной скоростью.
- Обратитесь к разделу 4 (ниже) на данном этапе для выполнения флуоресцеиновой ангиографии.
- После того, как все изображения будут завершены, разбавьте анестетик обратного противоседания (5 мг / мл антиседана) в инъекционной воде и введите в дозе 0,1 мг / кг т.. Верните мышь в клетку и поместите на предварительно нагретый коврик с доступом к пропитанной влажной пищей до выздоровления. Полное восстановление характеризуется движением всего тела и ходьбой по клетке с устойчивой походкой, обычно занимающей несколько часов.
- В назначенной экспериментальной конечной точке (например, день 21-23) повторите шаги 4.1-4.5 и снова сфотографируйте всю область сетчатки, покрывая диск зрительного нерва и все уголки периферии, чтобы получить точное представление о заболевании.
4. Флуоресцеиновая ангиография
- Чтобы измерить утечку сосудов у этих животных, находясь под анестезией, дайте каждой мыши инъекцию 2% флуоресцеина подкожно в задней части шеи и в таком положении, чтобы сетчатка была централизована в середине живого изображения.
- Установите в фундоскоп фильтр возбуждения синего света при 465-490 нм. Свет, улавливаемый возбужденным флуоресцеином, составляет 520-530 нм.
- Через 1,5 мин после инъекции флуоресцеина сфотографируйте каждую сетчатку и повторите снова через 7 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время имеет решающее значение для этих событий, если невозможно захватить оба, то просто изобразить один глаз.
5. Оценка клинических заболеваний
- Основывают клиническую оценку на тяжести следующих критериев: воспаление диска зрительного нерва, манжеты сосудов сетчатки, инфильтрация тканей сетчатки и структурные повреждения.
- Присудите каждому из этих параметров оценку по шкале от 0 до 5, и общая сумма является репрезентативной для клинического заболевания для всего глаза, с максимальным баллом 20, доступным на глаз. Таблица 1 может быть использована в качестве руководства для критериев оценки.
6. Гистология и гистологическая оценка
- После усыпления мышей по вывиху шейки матки энуклеа исследуйте глаза, раздвинув веки друг от друга для легкого доступа ко всему глазу.
- Затем поместите изогнутые щипцы позади земного шара с намерением захватить орбитальную соединительную ткань и зрительный нерв. Позаботьтесь о том, чтобы не сжимать земной шар.
- Для фиксации поместите глаз в 4% глутаровый альдегид минимум на 15 минут, чтобы свести к минимуму отслоение сетчатки, а затем переведите на 10% формальдегид в течение не менее 24 ч. 1-2 мл фиксатора даст достаточный объем, чтобы покрыть два глаза.
- Выполняют встраивание в парафин, сечение на микротоме и окрашивание по стандартным протоколам. Толщина сечения 3-4 мкм рекомендуется для любого типа окрашивания.
- Выполните гистологическое исследование глаз с использованием стандартных протоколов окрашивания гематоксилином и эозином (H&E).
- Назначают баллы по шкале 0-4, согласно критериям оценки EAU, основанным на степени инфильтрации иммунных клеток в пределах сетчатки и сосудистой оболочки, нарушении слоев сетчатки, степени образования гранулемы и степени отслоения сетчатки, что указывает на повреждение сетчатки, как описано ранее (Agarwal 2013) и обобщено в таблице 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе мы описываем пошаговый метод индуцирования модели экспериментального аутоиммунного увеита (EAU) путем иммунизации мышей увейтогенным пептидом сетчатки, полученным из IRBP. Оценка заболеваний с использованием широко используемых и легкодоступных подходов охватывается, хотя они не являются исключительными и могут быть добавлены или частично заменены другими методами визуализации. Первые признаки EAU у мышей C57BL/6J могут быть обнаружены через две недели после иммунизации, а пик заболевания достигнут в течение трех недель, как показано на рисунке 1. Фуноскопические изменения классифицируются во время прогрессирования заболевания как воспалительные изменения, которые включают воспаление ткани сетчатки, сосудов и диска зрительного нерва и структурные повреждения сетчатки (рисунок 2) в дополнение к гистологическим изменениям, основанным на инфильтрации иммунных клеток и структурном повреждении. Эти клинические и гистопатологические изменения могут быть обнаружены в течение 85 дней после иммунизации, а градуированные и оцененные для оценки предлагают изучать прогрессирование заболевания. Чтобы избежать непреднамеренной предвзятости в качественном визуальном оценивании, изображения должны оцениваться более чем одним экспертом, а оценщики должны быть слепы к группам лечения.
Здесь мы покажем, как клинические и гистологические системы оценки (таблица 1 и таблица 2) помогают ученым количественно оценить тяжесть ЕА, подтвердить эффективность лечения и исследовать механизм действия препарата. Сосудистая утечка также является патологической особенностью модели и при увеите человека. Мы показываем примеры сосудистой утечки флуоресцеина (рисунок 3) в качестве другого метода оценки заболевания в этой модели.
Рисунок 1. Схематическая хронология прогрессирования клинико-гистологического заболевания при ИРБП1-20 индуцированной ЭА. Временная шкала, отмечающая начало инфильтрации и прогрессирование IRBP1-20 , индуцированной EAU к пику заболевания. От иммунизации первые признаки клинического заболевания, выявленные с помощью фундоскопической визуализации и гистопатологического анализа, приходятся между 12-14 днями. Затем болезнь будет продолжать прогрессировать, в соответствии с этими параметрами, пока пик не будет достигнут около 21-23 дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Репрезентативные фундоскопические изображения, коррелирующие с гистологическими срезами на разных стадиях ИРБП1-20 индуцированного EAU-заболевания у мышей C57BL/6J. Клинические фундоскопические и соответствующие изображения тканей C57BL/6J от того же животного, иммунизированного пептидом IRBP 1-20. (A и B) фуноскопические изображения и гистологические срезы глаза, полученные от здоровых и введенных CFA мышей. Сетчатка не имеет признаков воспаления, и соответствующие гистологические участки показывают сохраненные слои сетчатки. (C) Фуноскопическое изображение глаза, полученное от мыши C57BL/6J через 14 дней после иммунизации, демонстрирует классические признаки EAU, представляющие собой тяжелый отек диска зрительного нерва на ранней стадии заболевания, соответствующая гистология показывает инфильтрацию иммунных клеток в стекловидное пространство. (D) Фуноскопические изображения глаз, полученные от мыши C57BL/6J через 21 день после иммунизации, показывают признаки наручников сосудов и инфильтрации иммунных популяций. Гистологические данные демонстрируют серьезные структурные изменения в результате складчатости сетчатки (желтые стрелки). V = сосуд, O = оптический диск, R = сетчатка, L = хрусталик, Vit = стекловидное тело, iO = воспаленный диск зрительного нерва, iV = воспаленный сосуд, iR = воспаленная сетчатка, i = инфильтрирующие клетки в стекловидном теле, RFs = складки сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Репрезентативные изображения флуоресцентной ангиографии, сделанные с использованием системы визуализации Micron III при пике заболевания. Мышам C57BL/6J вводили подкожно 2% флуоресцеина и изображения, сделанные в различные моменты времени после циркуляции индикатора. (A) CFA принимается только контрольной мышью через 1,5 и 7 минут после введения флуоресцеина. (B) Репрезентативные изображения иммунизированных мышей IRBP1-20 , полученные через 1,5 и 7 минут соответственно после приема флуоресцеина. Белая стрелка указывает на утечку сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Счёт | Оптический диск | Сосуды сетчатки | Инфильтрат ткани сетчатки | Структурные повреждения | ||||
| 1 | Минимальное воспаление | 1-4 мягких наручника | 1-4 небольших поражения или 1 линейное поражение | Поражения сетчатки или атрофия сетчатки с участием от 1/4 до 3/4 области сетчатки | ||||
| 2 | Легкое воспаление | >4 мягких наручника или 1-3 умеренных наручника | 5-10 небольших поражений или 2-3 линейных поражения | Пан-атрофия сетчатки с множественными небольшими поражениями (рубцами) или линейными поражениями <3 (рубцы) | ||||
| 3 | Умеренное воспаление | >3 умеренные манжеты | >10 небольших поражений или линейных поражений >3 | Пан-атрофия сетчатки с линейными поражениями >3 или сливающимися поражениями (рубцами) | ||||
| 4 | Сильное воспаление | >1 Сильные наручники | Линейный сливающийся очаг поражения | Отслоение сетчатки со складыванием | ||||
| 5 | * Не видно (белый или крайняя отслойка) | * Не видно (белый или крайняя отслойка) | * Не видно (белый или крайняя отслойка) | * Не видно (белый или крайняя отслойка) | ||||
Таблица 1. Обычная клиническая балльная шкала для оценки тяжести клинического заболевания EAU. Таблица, показывающая критерии, используемые для оценки степени тяжести заболевания у мышей, иммунизированных IRBP1-20. Оценки были распределены в соответствии с отличительными признаками, изложенными выше, которые были видны на изображениях глазного дна, каждому глазу был присвоен общий балл из двадцати. * Из-за затемнения инфильтрата и отслоения сетчатки внутри задней камеры не может быть оценено. Таблица адаптирована с разрешения Xu H., et al., 20088.
| Степень | Критерии |
| 0 | Без изменений |
| 0.5 (трасса) | Легкая воспалительная клеточная инфильтрация. Отсутствие повреждений тканей |
| 1 | Просачивание; складки сетчатки и очаговые отслоения сетчатки; несколько мелких гранулем в сосудистой оболочке и сетчатке, периваскулит |
| 2 | Умеренная инфильтрация; складки сетчатки, отслоения и очаговое повреждение фоторецепторных клеток; мелкие и средние гранулемы, периваскулит и васкулит |
| 3 | Средняя и тяжелая инфильтрация; обширное сворачивание сетчатки с отслоениями, умеренным повреждением фоторецепторных клеток; гранулематозные поражения среднего размера; субретинальная неоваскуляризация |
Таблица 2. Гистологически оценивая EAU
Таблица, показывающая критерии, используемые для оценки тяжести ЕАУ на основе гистопатологических особенностей заболевания. Оценки были распределены в соответствии с отличительными признаками, изложенными выше на окрашивании H&E, каждому глазу был присвоен общий балл из четырех. Таблица адаптирована с разрешения Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальные модели на животных являются необходимыми инструментами для изучения патогенеза заболеваний и доклинического тестирования новых терапевтических парадигм. В текущем протоколе мы обсудили методологию индуцирования, мониторинга и оценки EAU, экспериментальной модели внутриглазного воспалительного увеита. Эта модель EAU имеет более 95% заболеваемости, когда все процедуры выполняются в соответствии с протоколом, изложенным в настоящем документе, и приводит к развитию хронической, монофазной EAU. Для достижения этого уровня заболеваемости мы подчеркиваем важность подготовки антигена и инъекции эмульсии, оба из которых подробно описаны выше. Основными признаками EAU у животных являются воспаление сетчатки и / или хориоидальная оболочка, васкулит сетчатки, разрушение фоторецепторов и потеря зрения, все из которых представляют собой многие существенные клинико-патологические особенности заднего увеита человека12. Большая часть понимания основных клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в увеите, получена из индуцированной модели EAU, как описано в настоящем описании. EAU может быть индуцирован у мышей13 и крыс11 путем активной иммунизации антигенами сетчатки, которые распознаются лимфоцитами. Эти антигены сетчатки принимают различные формы; IRBP (для мышей) или растворимый антиген сетчатки (S-Ag) для крыс. Индуцирование EAU на фоне C57BL/6J порождает более хроническую форму заболевания, при этом пик патологии наблюдается через три недели после иммунизации. Для сравнения, применение антигена сетчатки к фону B10RIII14 вызывает острую монофазную и клинически тяжелую форму EAU, где пиковая патология обычно проявляется в течение двух недель после индукции, а болезнь стихает к 3-й неделе.
Различные эпитопы IRBP были протестированы на мышах C57BL / 6J, и пептид IRBP1-20 оказался воспроизводимой моделью с высоким уровнем заболеваемости и тяжести. Недавно сообщалось, что новый увейтогенный эпитоп IRBP, аминокислотные остатки от 651 до 670 человеческих IRBP индуцируют EAU с более высокой клинической заболеваемостью и тяжелым проявлением заболевания11 и могут быть использованы в предпочтении, если это соответствует научным целям. Поскольку известно, что влияние кишечной комменсальной микробиоты и активация аутореактивных рецепторов Т-клеток (TCR) влияют на начало заболевания при применении различных антигенов15, мы рекомендуем новичкам в этой области использовать пептиды hIRBP1-20 или hIRBP651-670 в дозе, титрованной между 300-500 мкг, чтобы достичь надежной модели. Действительно, изменчивость этой модели была задокументирована в других местах с отчетами, подчеркивающими важность различий между жилищными системами и микробиомом, которые могут повлиять на тяжесть заболевания и заболеваемость15. Таким образом, может потребоваться больше или меньше пептидного антигена и коклюшного токсина.
Существует ряд других моделей, по которым может быть выполнен описанный нами анализ. К ним относятся спонтанный увеит, который прогрессирует у трансгенных (R161H) т-клеточных рецепторов IRBP (TCR), у которых глазное воспаление развивается к 5-6 неделям в возрасте16 лет. EAU также может быть адцептивно индуцирован путем передачи увейтогенных эффекторных CD4 + T-клеток. Активированные, IRBP-специфические CD4+T-клетки, полученные от праймированных мышей, могут быть использованы в качестве источника эффекторных клеток 3,11. Эта модель представляет собой эффекторную фазу заболевания, избегая при этом сложностей использования CFA в индуцируемой модели.
В дополнение к этому, есть много преимуществ в использовании глазных воспалительных моделей в качестве соответствующих инструментов для исследования других воспалительных заболеваний, в частности, с патологией подмножества эффекторов Th1 и Th17. Основными преимуществами использования этой модели являются неинвазивные и поддающиеся количественной оценке методы мониторинга развития и прогрессирования заболевания, которыми являются фундоскопия и ангиография. Эти неинвазивные системы визуализации обеспечивают легкий доступ к нейронным тканям, которые в противном случае были бы скрыты за защитными анатомическими барьерами. Дополнительные методы мониторинга прогрессирования заболевания включают применение ОКТ-визуализации, которая более чувствительна, чем фуноскопическая визуализация, при обнаружении клеточных инфильтратов, особенно на ранней стадии начала ЭАУ. Методика позволяет проводить многослойную визуализацию сетчатки в поперечном и горизонтальном сечении продольно и неинвазивно. In vivo ОКТ-визуализация добавляет информацию о толщине сетчатки, которая не может быть получена с помощью фуноскопических и гистологических исследований17. Все чаще доступность еще более сложных неинвазивных методов визуализации, таких как адаптивная оптика, сканирующая лазерная офтальмоскопия и мультимодальные инструменты визуализации, будет способствовать дальнейшему расширению наших возможностей по исследованию этого заболевания у мелких грызунов. Кроме того, способность препарировать и изолировать резидентные и инфильтрирующие клеточные популяции для более глубокого анализа иммунофенотипов с использованием таких методов, как проточная цитометия, предоставляет большие возможности для предоставления проницательной информации.
Существует несколько установленных систем подсчета баллов, основанных на клинических критериях, полученных с помощью фундоскопии 8,9,18. Хотя они немного отличаются между офтальмологическими исследовательскими центрами, все они надежны, коррелируют с гистопатологическими особенностями и способны точно отражать тяжесть заболевания. В настоящем исследовании мы ссылаемся на систему подсчета баллов, разработанную Xu et al.8. Эта система предлагает более подробный подход к оценке с большим количеством клинических параметров измерения. Он содержит максимальный балл 20, что вводит более широкое окно для оценки, чем альтернативные системы, ограниченные максимум 5. Это более важно для дальнейшего изучения в рамках терапевтических подходов. Минимизация ошибок оператора, однако, имеет решающее значение при использовании такого уточненного и подробного набора параметров и может потребовать тщательного обучения оператора и независимой проверки интерпретации.
Здесь мы представляем протокол для индуцирования EAU у самок мышей C57BL /6, поскольку наблюдается повышенная заболеваемость женщин: мужчин 1,4: 1 с увеитом в клинических условиях. Тем не менее, следует учитывать пол мышей, используемых для индуцирования аутоиммунного заболевания, поскольку это может повлиять на цитокиновую среду11, а также выявить важные различия в том, как они реагируют на терапевтическое вмешательство. Другим соображением является возраст мышей при индукции заболевания. Например, мы изучили возрастную зависимость восприимчивости у мышей B10RIII и пришли к выводу, что мыши старше 8 недель жизни имеют более низкую частоту EAU (неопубликованное исследование из нашей группы).
В заключение, животные модели внутриглазных заболеваний предоставили бесценный инструмент для изучения заднего увеита человека и способствовали разработке новых методов лечения, таких как CsA. Тем не менее, ни одна животная модель сама по себе не воспроизводит весь спектр увеита человека, поскольку каждая из них обладает уникальными характеристиками, которые делают ее пригодной для изучения конкретных аспектов заболевания. Эта модель EAU индуцируется аутоиммунитетом путем применения пептида IRBP, дополненного адъювантами, которые вызывают врожденные иммунные реакции. Однако неизвестно, являются ли все формы заднего увеита у людей аутоиммунными и является ли антигенная мимикрия провоцирующим фактором. Кроме того, неясно, существует ли связь с инфекцией в провоцировании увеита человека. Тем не менее, модель, описанная в настоящем документе, является полезной и воспроизводимой генерической моделью, которая может быть использована для сбора полезной информации относительно этиологии, патогенеза и терапии этого угрожающего зрению заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявить с этой работой.
Acknowledgments
JG была награждена финансированием UCL Impact Studentship и Rosetrees Trust для поддержки CB. VC получил грант на совместную исследовательскую деятельность от Akari Therapeutics Inc. Мы хотели бы поблагодарить Институт офтальмологии UCL, подразделение биологической службы, особенно г-жу Элисон О'Хара и ее команду за их техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
