في المختبر تقييم حماية عضلة القلب بعد انخفاض حرارة الجسم- الشروط المسبقة في نموذج الخلايا العضلية القلب البشري
Summary
لم يتم تقييم الآثار المتميزة لدرجات مختلفة من انخفاض حرارة الجسم على حماية عضلة القلب تقييما دقيقا. كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد مستويات موت الخلايا بعد علاجات مختلفة لانخفاض حرارة الجسم في نموذج قائم على خلايا القلب البشرية ، مما يضع الأساس لأبحاث جزيئية متعمقة في المستقبل.
Abstract
نقص التروية / ضعف عضلة القلب المشتقة من التروية هو سيناريو سريري شائع في المرضى بعد جراحة القلب. على وجه الخصوص ، فإن حساسية خلايا القلب للإصابة الإقفارية أعلى من حساسية مجموعات الخلايا الأخرى. في الوقت الحاضر ، يوفر انخفاض حرارة الجسم حماية كبيرة ضد الإهانة الإقفارية المتوقعة. ومع ذلك، لا تزال التحقيقات في التغيرات الجزيئية المعقدة الناجمة عن انخفاض حرارة الجسم محدودة. لذلك ، من الضروري تحديد حالة ثقافية مشابهة لظروف الجسم الحي التي يمكن أن تحدث ضررا مماثلا لتلك التي لوحظت في الحالة السريرية بطريقة قابلة للاستنساخ. لمحاكاة الحالات الشبيهة بالكيمياء في المختبر ، تم علاج الخلايا في هذه النماذج عن طريق الحرمان من الأكسجين / الجلوكوز (OGD). بالإضافة إلى ذلك، طبقنا بروتوكول درجة حرارة الوقت القياسي المستخدم أثناء جراحة القلب. وعلاوة على ذلك، نقترح نهجا لاستخدام طريقة بسيطة ولكنها شاملة للتحليل الكمي لإصابة عضلة القلب. تم تقييم مستويات موت الخلايا المبرمج والتعبير عن البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي واستخدام مجموعة ELISA. في هذا النموذج، اختبرنا فرضية بشأن آثار ظروف درجة الحرارة المختلفة على موت الخلايا المبرمج cardiomyocyte في المختبر. تعتمد موثوقية هذا النموذج على التحكم الصارم في درجة الحرارة، والإجراءات التجريبية التي يمكن التحكم فيها، والنتائج التجريبية المستقرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الآلية الجزيئية لبروتين القلب انخفاض حرارة الجسم، والتي قد يكون لها آثار هامة لتطوير العلاجات التكميلية لاستخدامها مع انخفاض حرارة الجسم.
Introduction
نقص التروية / ضعف عضلة القلب المشتقة من التروية هو سيناريو سريري شائع في المرضى بعد جراحة القلب1،2. خلال تدفق منخفض غير ساتيلي وفترات من الاعتقال الكلي الدورة الدموية, الضرر الذي ينطوي على جميع أنواع خلايا القلب لا يزال يحدث. على وجه الخصوص ، فإن حساسية خلايا القلب للإصابة الإقفارية أعلى من حساسية مجموعات الخلايا الأخرى. في الوقت الحاضر ، يوفر انخفاض حرارة الجسم العلاجي (TH) حماية كبيرة ضد الإهانة الإقفارية المتوقعة في المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب3،4. يعرف TH بأنه درجة حرارة الجسم الأساسية من 14-34 درجة مئوية ، على الرغم من عدم وجود توافق في الآراء بشأن تعريف التبريد أثناء جراحة القلب5و6و7. في عام 2013، اقترح فريق دولي من الخبراء نظام إبلاغ موحد لتصنيف نطاقات درجات الحرارة المختلفة للاعتقال الدورة الدموية الجهازية انخفاض حرارة الجسم8. واستنادا إلى دراسات تخطيط الدماغ الكهربائي والتمثيل الغذائي للدماغ، قسموا انخفاض حرارة الجسم إلى أربعة مستويات: انخفاض حرارة الجسم العميق (≤ 14 درجة مئوية)، وانخفاض حرارة الجسم العميق (14.1-20 درجة مئوية)، وانخفاض حرارة الجسم المعتدل (20.1-28 درجة مئوية)، وانخفاض حرارة الجسم المعتدل (28.1-34 درجة مئوية). وقد وفر توافق آراء الخبراء تصنيفا واضحا وموحدا، مما سمح للدراسات بأن تكون أكثر قابلية للمقارنة وأن توفر نتائج أكثر ملاءمة سريريا. وتستند هذه الحماية التي توفرها TH على قدرتها على الحد من النشاط الأيضي للخلايا، مما يحد من معدل استهلاكها من الفوسفات عالي الطاقة9،10. ومع ذلك ، فإن دور TH في حماية عضلة القلب مثير للجدل وقد يكون له آثار متعددة اعتمادا على درجة انخفاض حرارة الجسم.
ومن المعروف جيدا I/ R عضلة القلب أن يرافقه زيادة apoptisisالخلية 11. وقد لاحظت التقارير الأخيرة أن وفاة خلايا القلب المبرمجة يزيد خلال جراحة القلب المفتوح، ويمكن أن تتزامن مع نخر، وبالتالي زيادة عدد خلايا عضلة القلبالميتة 12. لذلك ، فإن الحد من موت الخلايا القلبية المبرمج هو نهج علاجي مفيد في الممارسة السريرية. في الماوس الأذيني HL-1 نموذج cardiomyocyte, وقد تبين انخفاض حرارة الجسم العلاجية للحد من الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج وعامل الخلايا المبرمج المحفزة (AIF) خلال إعادة التروية13. ومع ذلك ، فإن تأثير درجة الحرارة في تنظيم موت الخلايا المبرمج مثير للجدل ويبدو أنه يعتمد على درجة انخفاض حرارة الجسم. لاحظ كوبر وزملاؤه أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم في المجازة القلبية الرئوية العادية ، تم زيادة معدل موت الخلايا المبرمج للأنسجة عضلة القلب من الخنازير مع اعتقال الدورة الدموية العميق لانخفاض حرارة الجسم14. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت نتائج بعض الدراسات إلى أن انخفاض حرارة الجسم العميق قد ينشط مسار موت الخلايا المبرمج ، في حين يبدو أن انخفاض حرارة الجسم الأقل عدوانية يمنع المسار12و15و16. قد يكون سبب هذه النتيجة بسبب الآثار المحيرة المرتبطة بالإصابة الإقفارية وعدم فهم الآليات التي تؤثر بها درجة الحرارة على أنسجة عضلة القلب. ولذلك، ينبغي تحديد حدود درجة الحرارة التي يتم فيها تعزيز موت الخلايا المبرمج أو تخفيفه بدقة.
للحصول على فهم أفضل للآليات المرتبطة بفعالية انخفاض حرارة الجسم وتوفير أساس عقلاني لتنفيذه في البشر ، من الضروري تحديد حالة ثقافية مماثلة لظروف الجسم الحي التي يمكن أن تنتج ضررا مماثلا لتلك التي لوحظت للحالة السريرية بطريقة قابلة للتكاثر. خطوة أساسية نحو تحقيق هذا الهدف هو تهيئة الظروف المثلى للحث على موت الخلايا القلبية المبرمج. وبناء على ذلك، استكشفنا في هذه الدراسة التفاصيل المنهجية فيما يتعلق بتجارب الحرمان من الأكسجين والجلوكوز مع الخلايا المستزرعة، وهو نموذج سهل في المختبر للكشف عن نقص التروية. وعلاوة على ذلك، قمنا بتقييم تأثير أوقات نقص الأكسيد والكيمياء المختلفة على موت الخلايا المبرمج القلبية، وتحققنا من فرضيتنا فيما يتعلق بتأثير ظروف درجة الحرارة المختلفة على موت الخلايا المبرمج في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
غالبا ما تمنع تعقيدات الحيوانات السليمة ، بما في ذلك التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا ، إجراء دراسات مفصلة لمكونات محددة من إصابة I / R. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج خلية في المختبر يمكن أن يعكس بدقة التغيرات الجزيئية بعد نقص التروية في الجسم الحي. وقد تم الإبلاغ سابقا البحوث على نماذج …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970265، 81900281،81700288)، المؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (2019M651904)؛ والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
