Summary
لم يتم تقييم الآثار المتميزة لدرجات مختلفة من انخفاض حرارة الجسم على حماية عضلة القلب تقييما دقيقا. كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد مستويات موت الخلايا بعد علاجات مختلفة لانخفاض حرارة الجسم في نموذج قائم على خلايا القلب البشرية ، مما يضع الأساس لأبحاث جزيئية متعمقة في المستقبل.
Abstract
نقص التروية / ضعف عضلة القلب المشتقة من التروية هو سيناريو سريري شائع في المرضى بعد جراحة القلب. على وجه الخصوص ، فإن حساسية خلايا القلب للإصابة الإقفارية أعلى من حساسية مجموعات الخلايا الأخرى. في الوقت الحاضر ، يوفر انخفاض حرارة الجسم حماية كبيرة ضد الإهانة الإقفارية المتوقعة. ومع ذلك، لا تزال التحقيقات في التغيرات الجزيئية المعقدة الناجمة عن انخفاض حرارة الجسم محدودة. لذلك ، من الضروري تحديد حالة ثقافية مشابهة لظروف الجسم الحي التي يمكن أن تحدث ضررا مماثلا لتلك التي لوحظت في الحالة السريرية بطريقة قابلة للاستنساخ. لمحاكاة الحالات الشبيهة بالكيمياء في المختبر ، تم علاج الخلايا في هذه النماذج عن طريق الحرمان من الأكسجين / الجلوكوز (OGD). بالإضافة إلى ذلك، طبقنا بروتوكول درجة حرارة الوقت القياسي المستخدم أثناء جراحة القلب. وعلاوة على ذلك، نقترح نهجا لاستخدام طريقة بسيطة ولكنها شاملة للتحليل الكمي لإصابة عضلة القلب. تم تقييم مستويات موت الخلايا المبرمج والتعبير عن البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي واستخدام مجموعة ELISA. في هذا النموذج، اختبرنا فرضية بشأن آثار ظروف درجة الحرارة المختلفة على موت الخلايا المبرمج cardiomyocyte في المختبر. تعتمد موثوقية هذا النموذج على التحكم الصارم في درجة الحرارة، والإجراءات التجريبية التي يمكن التحكم فيها، والنتائج التجريبية المستقرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الآلية الجزيئية لبروتين القلب انخفاض حرارة الجسم، والتي قد يكون لها آثار هامة لتطوير العلاجات التكميلية لاستخدامها مع انخفاض حرارة الجسم.
Introduction
نقص التروية / ضعف عضلة القلب المشتقة من التروية هو سيناريو سريري شائع في المرضى بعد جراحة القلب1،2. خلال تدفق منخفض غير ساتيلي وفترات من الاعتقال الكلي الدورة الدموية, الضرر الذي ينطوي على جميع أنواع خلايا القلب لا يزال يحدث. على وجه الخصوص ، فإن حساسية خلايا القلب للإصابة الإقفارية أعلى من حساسية مجموعات الخلايا الأخرى. في الوقت الحاضر ، يوفر انخفاض حرارة الجسم العلاجي (TH) حماية كبيرة ضد الإهانة الإقفارية المتوقعة في المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب3،4. يعرف TH بأنه درجة حرارة الجسم الأساسية من 14-34 درجة مئوية ، على الرغم من عدم وجود توافق في الآراء بشأن تعريف التبريد أثناء جراحة القلب5و6و7. في عام 2013، اقترح فريق دولي من الخبراء نظام إبلاغ موحد لتصنيف نطاقات درجات الحرارة المختلفة للاعتقال الدورة الدموية الجهازية انخفاض حرارة الجسم8. واستنادا إلى دراسات تخطيط الدماغ الكهربائي والتمثيل الغذائي للدماغ، قسموا انخفاض حرارة الجسم إلى أربعة مستويات: انخفاض حرارة الجسم العميق (≤ 14 درجة مئوية)، وانخفاض حرارة الجسم العميق (14.1-20 درجة مئوية)، وانخفاض حرارة الجسم المعتدل (20.1-28 درجة مئوية)، وانخفاض حرارة الجسم المعتدل (28.1-34 درجة مئوية). وقد وفر توافق آراء الخبراء تصنيفا واضحا وموحدا، مما سمح للدراسات بأن تكون أكثر قابلية للمقارنة وأن توفر نتائج أكثر ملاءمة سريريا. وتستند هذه الحماية التي توفرها TH على قدرتها على الحد من النشاط الأيضي للخلايا، مما يحد من معدل استهلاكها من الفوسفات عالي الطاقة9،10. ومع ذلك ، فإن دور TH في حماية عضلة القلب مثير للجدل وقد يكون له آثار متعددة اعتمادا على درجة انخفاض حرارة الجسم.
ومن المعروف جيدا I/ R عضلة القلب أن يرافقه زيادة apoptisisالخلية 11. وقد لاحظت التقارير الأخيرة أن وفاة خلايا القلب المبرمجة يزيد خلال جراحة القلب المفتوح، ويمكن أن تتزامن مع نخر، وبالتالي زيادة عدد خلايا عضلة القلبالميتة 12. لذلك ، فإن الحد من موت الخلايا القلبية المبرمج هو نهج علاجي مفيد في الممارسة السريرية. في الماوس الأذيني HL-1 نموذج cardiomyocyte, وقد تبين انخفاض حرارة الجسم العلاجية للحد من الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج وعامل الخلايا المبرمج المحفزة (AIF) خلال إعادة التروية13. ومع ذلك ، فإن تأثير درجة الحرارة في تنظيم موت الخلايا المبرمج مثير للجدل ويبدو أنه يعتمد على درجة انخفاض حرارة الجسم. لاحظ كوبر وزملاؤه أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم في المجازة القلبية الرئوية العادية ، تم زيادة معدل موت الخلايا المبرمج للأنسجة عضلة القلب من الخنازير مع اعتقال الدورة الدموية العميق لانخفاض حرارة الجسم14. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت نتائج بعض الدراسات إلى أن انخفاض حرارة الجسم العميق قد ينشط مسار موت الخلايا المبرمج ، في حين يبدو أن انخفاض حرارة الجسم الأقل عدوانية يمنع المسار12و15و16. قد يكون سبب هذه النتيجة بسبب الآثار المحيرة المرتبطة بالإصابة الإقفارية وعدم فهم الآليات التي تؤثر بها درجة الحرارة على أنسجة عضلة القلب. ولذلك، ينبغي تحديد حدود درجة الحرارة التي يتم فيها تعزيز موت الخلايا المبرمج أو تخفيفه بدقة.
للحصول على فهم أفضل للآليات المرتبطة بفعالية انخفاض حرارة الجسم وتوفير أساس عقلاني لتنفيذه في البشر ، من الضروري تحديد حالة ثقافية مماثلة لظروف الجسم الحي التي يمكن أن تنتج ضررا مماثلا لتلك التي لوحظت للحالة السريرية بطريقة قابلة للتكاثر. خطوة أساسية نحو تحقيق هذا الهدف هو تهيئة الظروف المثلى للحث على موت الخلايا القلبية المبرمج. وبناء على ذلك، استكشفنا في هذه الدراسة التفاصيل المنهجية فيما يتعلق بتجارب الحرمان من الأكسجين والجلوكوز مع الخلايا المستزرعة، وهو نموذج سهل في المختبر للكشف عن نقص التروية. وعلاوة على ذلك، قمنا بتقييم تأثير أوقات نقص الأكسيد والكيمياء المختلفة على موت الخلايا المبرمج القلبية، وتحققنا من فرضيتنا فيما يتعلق بتأثير ظروف درجة الحرارة المختلفة على موت الخلايا المبرمج في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وترد المعلومات المتعلقة بالكواشف والأدوات التجارية في جدول المواد.
تم اشتقاق خط خلايا القلب البشري AC16 من انصهار الخلايا الأولية من أنسجة القلب البطينية للبالغين مع الخلايا الليفية البشرية SV40 المحولة17، والتي تم شراؤها من BLUEFBIO (شنغهاي ، الصين). يطور خط الخلية العديد من السمات الكيميائية الحيوية والمورفولوجية المميزة لخلايا القلب. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم خط الخلية على نطاق واسع لتقييم تلف عضلة القلب ووظيفة عضلة القلب في المختبر18،19.
1. ثقافة الخلية
ملاحظة: تتكون وسيلة الثقافة القاعدية من وسيط النسر المعدل من Dulbecco الخالي من المصل (DMEM) ، و 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1٪ مكمل نمو الخلايا العضلية القلبية ، و 1٪ محلول البنسلين / العقدية. تخزين المتوسطة في 4 °C و prewarm إلى 37 °C قبل الاستخدام.
- إزالة خلايا القلب البشرية المبردة (HCM) من النيتروجين السائل وتذوب لهم في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
- يهز بلطف قارورة (<1 دقيقة) في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تبقى قطعة صغيرة فقط من الجليد في القارورة.
- نقل القارورة إلى غطاء تدفق صفح معقم. مسح الجزء الخارجي من القارورة مع كرة القطن انخفض في الكحول 70٪.
- نقل 4 مل من النمو الكامل prewarmed انخفاض متوسطة في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا المذابة.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 × غرام لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant و resuspend بيليه في 5 مل من المتوسطة كاملة.
- الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحت جو مع الهواء 95٪ و 5٪ CO2.
ملاحظة: قبل حصاد الخلايا للتجارب ، يسمح للخلايا بالنمو حتى تصل إلى التقاء 60-70٪ تقريبا.
2. إنشاء نموذج الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD)
ملاحظة: قبل ساعتين من فترة الدراسة، استبدل وسيط النمو بمتوسط خال من المصل، وتم إعادة تنبيب الخلايا في حاضنة رطبة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية تحت جو مع 5٪ CO2.
- يستنشق المتوسط من لوحة 6-جيدا ويغسل الخلايا بلطف ثلاث مرات مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
- أضف 2 مل من DMEM الطازج الخالي من السكر لكل بئر.
- زراعة الخلايا في درجة حرارة ثابتة في حاضنة ثلاثة غاز تحت جو مع خليط من 95٪ N2،5٪ CO2،و 0.1٪ O2 في 37 درجة مئوية لمدة 1، 2، 4، 8، 12، أو 16 ساعة.
- بعد علاج نقص الأكسيجة، يستنشق الوسط من لوحة 6-جيدا ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ثلاث مرات.
- إضافة 2 مل من DMEM كاملة لكل بئر.
- الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحت جو مع الهواء 95٪ و 5٪ CO2.
3. بروتوكول درجة حرارة الوقت
ملاحظة: يتم استخدام بروتوكول درجة حرارة الوقت القياسية أثناء جراحة القلب، كما هو موضح سابقا من قبل الآخرين20،21. معالجة HCMs وفقا للبروتوكول التالي(الشكل 1):تشير النقطة الزمنية 1 (T1) إلى نهاية الحث، وتشير النقطة الزمنية 2 (T2) إلى نهاية الصيانة وتشير النقطة الزمنية 3 (T3) إلى نهاية إعادة الحرب. تحليل خلايا التحكم التي يتم الحفاظ عليها في ظل ظروف مستمرة للحرارة (37 درجة مئوية). يتم إنشاء ظروف درجة الحرارة باستخدام حاضنة ثلاثية الغاز ، مما يسمح بتنظيم دقيق لدرجة الحرارة.
- قبل ساعتين من التجارب، يستنشق الوسط الثقافي من طبق من 6 آبار وإضافة 2 مل من DMEM الطازج الخالي من المصل لكل بئر.
- إعادة احتضان الخلايا في حاضنة رطبة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت جو مع 5٪ CO2.
- بعد 2 ساعة، يستنشق الوسط من لوحة 6-جيدا ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ثلاث مرات.
- أضف 2 مل من DMEM الطازج الخالي من المصل لكل بئر.
- رينكوبات الخلايا في حاضنة الغاز الثلاثي.
ملاحظة: استبدل الوسط لإزالة الخلايا غير المرفقة والحطام. - على الفور تغيير درجة الحرارة عن طريق وضع أطباق الثقافة حاضنة الغاز الثلاثي.
- بعد 1 ساعة من التبريد، سارع إلى تنشق الوسط من لوحة 6-well وإضافة 2 مل من DMEM الطازج الخالي من السكر لكل بئر.
- زراعة الخلايا في حاضنة الغاز الثلاثي تحت جو يتألف من 95٪ N2،5٪ CO2،و 0.1٪ O2 في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة لإنشاء نقص الأكاسجة.
- تعيين درجة الحرارة كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: يبدأ البروتوكول ب 10 ساعة من المعالجة ذات درجة الحرارة المنخفضة، تليها مرحلة إعادة warming لمدة 2 ساعة تصل إلى 37 درجة مئوية، و 24 ساعة من نورموذرميا (37 درجة مئوية). في كل نقطة زمنية، تتم إزالة ثلاثة أطباق بيتري للتحليل. - بعد المعالجة منخفضة الحرارة، يستنشق الوسط من لوحة 6-جيدا ويغسل مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) ثلاث مرات.
- إضافة 2 مل من DMEM كاملة لكل بئر.
- الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحت جو مع الهواء 95٪ و 5٪ CO2.
4. CCK-8 فحص الجدوى
- قم بتدفئة محلول حمض التريبسين-الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) بنسبة 0.25٪ وPBS إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- اسبير المتوسطة، وشطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ومن ثم إضافة 0.5 مل من 0.25٪ تريبسين على طول جدار البئر. حضانة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل تقريبا جميع HCMs (حوالي 1 دقيقة).
- إضافة 1 مل من DMEM المتوسطة كاملة إلى الآبار لتحييد تريبسين.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والكريه HCMs عن طريق الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 3 دقائق. يستنشق العملاق دون إزعاج بيليه.
- الاستغناء عن 100 μL aliquots من تعليق الخلية (5000 خلية / جيدا) في لوحة 96 جيدا. Preincubate لوحة لمدة 24 ساعة في حاضنة رطبة (في 37 درجة مئوية)
- استخدام الخلايا المستزرعة في لوحات 96 جيدا لتوليد مجموعات العلاج المختلفة.
- احتضان اللوحة لفترة زمنية مناسبة (16 ساعة) في حاضنة.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر من الطبق.
- احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في الحاضنة.
- قياس الامتصاص في 450 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
تنبيه: يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات إلى الآبار، لأنها تتداخل مع قياسات القراءة OD.
5. تدفق قياس الخلايا لتحليل موت الخلايا المبرمج
- تنفيذ خطوات المحاولة والطرد المركزي باتباع الخطوات 4.2-4.4.
ملاحظة: يتم حصاد الخلايا مع تريبسين دون EDTA. لتقييم موت الخلايا المبرمج، يتم جمع الخلايا العائمة والملتصقة على حد سواء. - الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 1000 × غرام. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. باستخدام ماصة، نقل 100 ميكرولتر من تريبان الأزرق المعالج تعليق الخلية إلى مقياس الدم. باستخدام عداد حصيلة اليد، عد الخلايا الحية، غير الملطخة في مجموعة واحدة من 16 مربعا ومن ثم استخدام برنامج تلفزيوني لتوليد تعليق الخلية في 1×107 خلايا / مل.
- الحصول على 200 ميكرولتر من تعليق الخلية (5 × 105 -1 × 106 خلايا).
- الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 × ز وإعادة إنفاق بيليه في الملحق V-FITC حل ملزم.
- إضافة 5 ميكرولتر من الملحق V-FITC لصبغ الخلايا.
- إضافة 10 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم في تعليق الخلية.
- اخلطي الخلايا برفق واحتضنيها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: يتم إعادة إنفاق الخلايا 2-3 مرات أثناء الحضانة لتحسين التلطيخ. - بدء تدفق الخلايا وتأكد من أن البرنامج يعمل بشكل مناسب.
- فتح نافذتين رسم نقطة في برنامج قياس التدفق الخلوي.
- حدد الضوء المبعثر الأمامي (FSC) على محور X والضوء المتناثر الجانبي (SSC) على محور Y لاستبعاد حطام الخلايا و/أو الكتل من حيث حجمها وحبيبتها على التوالي.
- حدد قناة الكشف PE (590 مم) و FITC (530 مم) ، والتي تستخدم لقياس كثافة الفلورسينس للخلايا.
- ضع أنبوب العينة الفارغ (HCMs الذي لم يتم صبغه) على مقياس تدفق الخلايا.
- انقر فوق سجل لجمع الجسيمات من التعليق في أنبوب عينة فارغة ومن ثم بوابة السكان الخلية لمزيد من التحليل في مؤامرة نقطة الأولى.
- ضع العينات ذات اللون الواحد على ذراع دعم الأنبوب. انقر فوق تسجيل لجمع الجسيمات من التعليق ثم بوابة السكان الخلية لمزيد من التحليل في مؤامرة نقطة الأولى.
- جمع HCMs في أنابيب العينة الأخرى وتحسين القياس عن طريق ضبط الفولتية من القنوات الفلورية.
ملاحظة: يتم استخدام عينات غير ملطخة وملطخة واحدة كعناصر تحكم التعويض أثناء التجربة. - عرض إحصاءات كل أنبوب عينة وحساب معدل موت الخلايا المبرمج لكل عينة.
6. تقييم إزالة الاستقطاب الميتوكوندريا
- إجراء المحاولة والطرد المركزي باتباع الخطوات 4.2-4.4.
- إعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من المتوسطة كاملة، ومن ثم ضبط كثافة الخلية تعديلها إلى 1 × 105 - 6 × 106 خلايا
- إضافة 0.5 مل من حل العمل JC-1 إلى كل أنبوب.
- احتضان الخلايا في حاضنة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: خلال فترة الحضانة، إضافة 1 مل من 5× JC-1 تلطيخ العازلة إلى 4 مل من الماء المقطر لإعداد العازلة تلطيخ JC-1. - بعد الحضانة، طرد الخلايا في 600 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
- تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من JC-1 تلطيخ العازلة.
- كرر الخطوات من 6.5 إلى 6.6 ثلاث مرات.
- Resuspend HCMs في 1 مل من الجليد الباردة تلطيخ العازلة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل واستخدام الخلايا للتحليل في غضون 30 دقيقة.
- حدد قناة الكشف PE (590 نانومتر) و FITC (530 نانومتر) لقياس كثافة الفلورية لصبغة JC-1 في الخلايا.
ملاحظة: إعداد مقياس تدفق الخلايا باتباع الخطوات 5.10-5.17.
7. المقايسة التفاعلية لأنواع الأكسجين
- إجراء المحاولة والطرد المركزي باتباع الخطوات 4.2-4.4.
- وصمة عار الخلايا في وسط الثقافة مع 10 μM DCFDA وضبط كثافة الخلية إلى 1 × 106 - 1 × 107 خلايا
- حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- ماصة بلطف الخلايا صعودا / أسفل كل 3-5 دقيقة.
- بعد الحضانة، اغسل الخلايا ثلاث مرات بمتوسط زراعة الخلايا الخالي من المصل.
- تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي باتباع الخطوات 5.10-5.17.
ملاحظة: DCF متحمس في 488 نانومتر وكثافة الانبعاثات تقاس في 530 نانومتر.
8. قياس كاسباس 3 / كاسباس 8 النشاط
- إجراء trypsinization باتباع الخطوات 4.2-4.4.
- جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 600 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت lysate لكل 2 × 106 خلايا.
- ليس الخلايا لمدة 15 دقيقة على الجليد.
- بعد احتضان لمدة 15 دقيقة في حمام جليدي، والطرد المركزي العينة في 1.6 × 104 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجليد الباردة للاستخدام.
ملاحظة: يجب أن يكون تركيز البروتين في العينة على الأقل 1-3 ملغم/ مل. - إزالة Ac-DEVD-pNA (2 mM) ووضعه على حمام جليدي للاستخدام.
- أضف بدقة 40 ميكرولتر من محلول العازلة إلى اللوحة المسماة بالإنزيمات، وأضف 80 ميكرولتر من العينة، وأخيرا أضف 10 ميكرولتر من Ac-DEVD-pNA (2 mM).
- احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
- قياس قيمة A405 على قارئ لوحة صغيرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: يتم حساب الامتصاص الناتج عن pNA التي تم إنشاؤها بواسطة caspase-3/caspase-8 عن طريق طرح قيمة A405 عنصر تحكم فارغ من تلك العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم تحديد تأثير التعرض ل OGD على صلاحية HCMs بواسطة المقايسة CCK-8. بالمقارنة مع تلك التي لوحظت في مجموعة التحكم، انخفضت قابلية بقاء الخلية بشكل كبير بطريقة تعتمد على الوقت(الشكل 2A). وأظهرت معدلات موت الخلايا المبرمج من HCMs في أوقات مختلفة بعد إعادة التروية اتجاها محددا، حيث من 0 إلى 16 ساعة، زادت معدلات موت الخلايا المبرمج تدريجيا ووصلت إلى الحد الأقصى لمعدل في 16 ساعة نقطة زمنية(الشكل 2B). كما OGD لمدة 12 ساعة انخفاض نشاط الخلية بنسبة ~ 50٪، تم استخدام 12 ساعة OGD للحث على تلف الخلايا في التجارب اللاحقة.
درسنا في وقت لاحق تأثير درجة الحرارة على عملية موت الخلايا المبرمج. بالمقارنة مع تلك التي لوحظت في مجموعة OGD ، كانت النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة أعلى في المجموعات الثلاث التي عولجت بانخفاض حرارة الجسم(الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك ، كان للخلايا في مجموعة انخفاض حرارة الجسم العميق أعلى قابلية للحياة (>92٪) ، أعلى بمقدار 2.1 مرة من تلك التي لوحظت في مجموعة OGD. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت نتائج قياس التدفق الخلوي أن انخفاض حرارة الجسم منع موت الخلايا المبرمج من HCMs في ظل ظروف OGD(الشكل 3A & 3C). لأن خلل الميتوكوندريا يرتبط مع موت الخلايا المبرمج، حصلنا على بيانات إضافية لتقييم اضطرابات الميتوكوندريا. تم تحديد مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام مقايسة DCFH-DA. بالمقارنة مع تلك التي لوحظت في مجموعة OGD، انخفض علاج انخفاض حرارة الجسم مستويات ROS داخل الخلايا في HCMs(الشكل 4A). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا مع تلطيخ JC-1. بعد علاج OGD ، تم تقليل الفلورسينس الأحمر من JC-1 بشكل كبير ، وزادت الفلورية الخضراء بشكل كبير. في المقابل، منع علاج انخفاض حرارة الجسم بشكل كبير التأثير الناجم عن OGD وزاد من النسبة الحمراء إلى الخضراء بهامش كبير(الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، لوحظ أيضا انخفاض caspase 3/caspase-8 في الخلايا التي عولجت مع العلاجات انخفاض حرارة الجسم (الشكل 4C،4D)
الشكل 1: مخطط تدفق الإجراء التجريبي. تم التعامل مع HCMs وفقا للبروتوكول التالي: تشير النقطة الزمنية 1 (T1) إلى نهاية الحث (التبريد لمدة 2 ساعة)؛ تشير النقطة الزمنية 2 (T2) إلى نهاية الصيانة (انخفاض حرارة الجسم لمدة 10h عند درجة الحرارة المطلوبة)؛ والنقطة الزمنية 3 (T3) تشير إلى نهاية إعادة الإعادة (إعادة الارتشاء لمدة ساعتين حتى 37 درجة مئوية). تم الحفاظ على درجة الحرارة عند درجة الحرارة المطلوبة: 34 درجة مئوية لانخفاض حرارة الجسم المعتدل ، و 31 درجة مئوية لانخفاض حرارة معتدل ، و 17 درجة مئوية لانخفاض حرارة الجسم الشديد. تم تحليل خلايا التحكم التي يتم الحفاظ عليها في ظل ظروف مستمرة للحرارة (37 درجة مئوية). تم إنشاء ظروف درجة الحرارة باستخدام حاضنة ثلاثية الغاز ، مما يسمح بتنظيم دقيق لدرجة الحرارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم صلاحية الخلايا وموت الخلايا المبرمج بواسطة المقايسات CCK-8 و Annexin V/PI. (أ) تم قياس صلاحية الخلية باستخدام اختبار صلاحية الخلية. (ب) تم تحليل موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي. *p < 0.05,***p < 0.001 مقابل المجموعة العادية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم صلاحية الخلية وموت الخلايا المبرمج بعد علاجات انخفاض حرارة الجسم. (أ)تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي. (ب)التحليل الكمي للخلايا المبرمج. (ج)تم قياس صلاحية الخلية باستخدام اختبار صلاحية الخلية. **p < 0.01,***p < 0.001 مقابل المجموعة العادية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل وظيفة الميتوكوندريا والنشاط caspase-3 caspase-8. مستويات ROS داخل الخلايا. B القياس الكمي لإمكانات غشاء الميتوكوندريا. (C&D) وقدر نشاط كاسباس-8/كاسباس-3 باستخدام عدة ELISA. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 مقابل مجموعة OGD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
غالبا ما تمنع تعقيدات الحيوانات السليمة ، بما في ذلك التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا ، إجراء دراسات مفصلة لمكونات محددة من إصابة I / R. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج خلية في المختبر يمكن أن يعكس بدقة التغيرات الجزيئية بعد نقص التروية في الجسم الحي. وقد تم الإبلاغ سابقا البحوث على نماذج OGD13،22، والعديد من الأساليب المتطورة تم تأسيس23،24. تتضمن عملية إعداد نماذج OGD خطوتين رئيسيتين: الحرمان من الأكسجين والحرمان من الجلوكوز. في هذه الدراسة ، تم إجراء الحرمان من الجلوكوز عن طريق زراعة الخلايا في وسط خال من الجلوكوز ، وتحقق الحرمان من الأكسجين عن طريق الاستبدال بالنيتروجين ، وهو حاليا طريقة راسخة لإعداد نماذج OGD25،26. ومع ذلك ، اعتمادا على نوع الخلية ، يجب النظر في عاملين ، بما في ذلك:1) كثافة بذر الخلايا و 2) مدة التعرض ل OGD. كلما زاد عدد الخلايا المرفقة ، زادت مقاومة إجهاد OGD ، بحيث تكون مدة البذر قبل OGD حاسمة. تم بذر HCMs (2 ×10 5 خلايا / آبار) في لوحة من 6 آبار لمدة 30-34 ساعة قبل OGD ، وفي ذلك الوقت كانت الخلايا التقاء بنسبة 65٪ تقريبا. ارتفاع كثافة الخلية سوف يقلل من تأثير OGD على الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تقليل احتمال فقدان الخلايا أثناء خطوات الغسيل. تأثير مدة التعرض لOGD هو عامل مهم آخر في تقييم فعالية نموذج OGD. على سبيل المثال ، لدراسة الآثار الوقائية للأدوية ، من المناسب اختيار المدة التي تسبب موت الخلايا بنسبة 40-50٪ دون علاج. إذا كان موت الخلية متطرفا جدا ، على سبيل المثال ، 80 ٪ ، فسيكون من الصعب تحديد التأثير الوقائي للكواشف التي يتم تحليلها. بالنسبة ل HCMs ، أدى التعرض ل OGD لمدة 12 ساعة إلى وفاة 42٪ من الخلايا. لذلك ، في التجارب اللاحقة ، تم استخدام علاج OGD لمدة 12 ساعة للحث على تلف الخلايا.
بسبب الاختلاف في الحركية انخفاض حرارة الجسم بين في الجسم الحي والبيئات في المختبر، والنهج الأمثل وآليات التعريفي انخفاض حرارة الجسم لنموذج cardiomyocyte لا يزال غير واضح. في العقود القليلة الماضية، تم تطوير العديد من النماذج في المختبر لدراسة خلايا القلب في درجات حرارة منخفضة. على سبيل المثال، أنشأت جانا كريش وآخرون نموذج خلايا انخفاض حرارة الجسم المعتدل لدراسة تأثير درجة الحرارة على موت الخلايا المبرمج عضلة القلب بعد نقص التروية-reperfusion13. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد ركزت على الآثار الفسيولوجية من التبريد, وهناك أيضا عدد كبير من الآثار الجانبية الضارة التي تحدث خلالإعادة 27. وقد أظهرت نتائج الدراسات السابقة أن إعادةwarming يمكن أن تحفز ضعف الانتصاب في خلايا القلب المعزولة27,28. لذلك ، فإن درجة الحرارة وسرعة إعادة الحرب ضرورية بشكل خاص. للتحكم الصارم في تأثير درجة الحرارة ، طبقنا بروتوكول درجة الحرارة الزمنية القياسي المستخدم أثناء جراحة القلب ، كما ذكر سابقا20،21. في هذا النموذج، يتم التحكم في درجة الحرارة بدقة ضمن نطاق درجة الحرارة المطلوبة، بما في ذلك ثلاث مراحل: 1) فترة التبريد (1 ساعة)؛ 1) فترة التبريد (1 ساعة)؛ (2) درجة الحرارة (1 ساعة)؛ 1) فترة التبريد (1 ساعة)؛ (2) درجة الحرارة (1 ساعة)؛ (1) درجة الحرارة (1 ساعة)؛ (1) درجة الحرارة ( 2) فترة الحفاظ على درجة الحرارة (10 ساعة)؛ و 3) فترة إعادة warming درجة الحرارة (2 ساعة). وبالإضافة إلى ذلك، فإن درجات الحرارة المستخدمة في هذه الدراسة هي نموذجية من معتدل (34 درجة مئوية)، معتدلة (31 درجة مئوية)، وشديدة (17 درجة مئوية) درجات حرارة منخفضة، مماثلة لتلك المستخدمة في المنشورات السابقة29،30،31. وأخيرا، اختبرنا أيضا فرضيتنا فيما يتعلق بآثار ظروف درجة الحرارة المختلفة على موت الخلايا المبرمج القلبية في المختبر. كما هو متوقع، أظهرت النتائج أن درجة الحرارة خفضت بشكل كبير مستويات ROS، استعادة MMP، وانخفاض caspase-8 / caspase-3 النشاط.
ونحن ندرك أن هذه الدراسة أجريت باستخدام كل من خط الخلية غير المتعاقدة ونموذج المختبر، الذي لم يتأثر بأي سوائل الجسم. على الرغم من هذه القيود، فإن التحسن الكبير في موت الخلايا المبرمج الناتج عن علاج انخفاض حرارة الجسم يؤكد على أهمية إجراء مزيد من التحقيق، بما في ذلك في دراسات الجسم الحي. ولذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الآلية الجزيئية لبروتين القلب انخفاض حرارة الجسم، والتي قد يكون لها آثار هامة لتطوير العلاجات التكميلية لاستخدامها مع انخفاض حرارة الجسم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970265، 81900281،81700288)، المؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (2019M651904)؛ والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
References
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure. EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).
- Otto, K. A. Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery. VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).
- Wang, X., et al. Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery. CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).
- Leshnower, B. G., et al. Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).
- Vallabhajosyula, P., et al. Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).
- Keeling, W. B., et al. Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).
- Yan, T. D., et al. Consensus on hypothermia in aortic arch surgery. Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).
- Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism. DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model. CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).
- Zhu, W. S., et al. Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury. Sci Rep. 6, 24498 (2016).
- Castedo, E., et al. Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement. Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).
- Krech, J., et al. Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes. Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).
- Cooper, W. A., et al. Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis. ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).
- Kajimoto, M., et al. Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).
- Liu, Y., et al. Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model. Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).
- Davidson, M. M., et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).
- Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes. EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).
- Pan, J. A., et al. miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).
- Schmitt, K. R., et al. S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth. NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).
- Tong, G., et al. Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway. Neuroscience. 358, 201-210 (2017).
- Yu, Z. P., et al. Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes. Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).
- Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia. European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).
- Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis. Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).
- Zhang, Y., et al. HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury. BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).
- An, W., et al. Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction. BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).
- Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).
- Yarbrough, W. M., et al. Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure. Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).
- Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).
- Bobi, J., et al. Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management. Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).
- Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).
