Summary
이 문서는 살모넬라 타이피무륨 트립토판 synthase의 발현 및 정화를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 이 프로토콜은 하루에 단백질 복합체를 정화하는 신속한 시스템이다. 커버되는 방법은 현장 지향 돌연변이 발생, 대장균의단백질 발현, 친화 성염색로그래피, 젤 여과 크로마토그래피 및 결정화입니다.
Abstract
살모넬라 타이피무륨의 트립토판 신체(TS) 바이엔자임 복합체(α2β2 TS)를 함유한 구조 연구는 촉매 메커니즘, 알로스터식 거동, 그리고 PLP 의존 효소에서 제품에 기판의 효소 변환에 대한 세부 사항을 더 잘 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 작품에서, 고립된 α 및 고립된 β 서브유닛을 생성하는 새로운 표현 시스템은 2일 이내에 고립된 서브유닛으로부터 고량의 순수 서브유닛과 α2 β2stTS 콤플렉스의 정화를 허용하였다. 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 그 다음으로 친화태그, 황산암모늄 강수량 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 분열이 뒤따랐다. 효소 β 부위의 주요 잔류물의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 현장 직접 돌연변이 발생은 이전 구조 연구에서 수행되었다. 또 다른 프로토콜은 야생 유형과 돌연변이 α2β2세인트TS 단지를 정화하기 위해 만들어졌습니다. 암모늄 황산염 분획 및 SEC를 사용하는 간단하고 빠르고 효율적인 프로토콜은 하루에2β2StTS 단지의 α 정화할 수 있었습니다. 이 작업에 기재된 두 정제 프로토콜은 이전 프로토콜과 비교하여 PEG 8000및 spermine을 사용하여 동일한 복합체를 정화하여 정화 프로토콜을 따라 α2β2stTS 단지를 결정화할 때 상당한 이점이 있다. 야생 유형 및 일부 돌연변이 형태의 결정화는 PEG 8000 및 spermine을 사용하여 일부 돌연변이체의 정제를 손상시키는 약간 다른 조건에서 발생합니다. 엑스레이 결정학 연구에 적합한 결정을 준비하기 위해 결정화, 결정 품질 및 냉동 보호를 최적화하기 위해 몇 가지 노력을기울였습니다. 여기에 제시 된 방법은 일반적으로 트립토판 synthase 서브 유닛과 야생 유형 및 돌연변이 α2β2세인트TS 단지의 정화에 적용해야합니다.
Introduction
트립토판 신타제(TS) 바이엔자임 복합체(α2 β 2)는알로스터 효소로, 박테리아, 식물, 곰팡이1,2,3에서아미노산 L-트립토판의 생합성에서 마지막 두 단계를 촉매한다. 박테리아 살모넬라 장내 세로바 티피무리움 (St)은인간과 다른 동물에서 심각한 위장 감염을 일으킨다. 인간과 더 높은 동물은 TS(EC 4.2.1.20)가 없기 때문에, S. typhimurium α2β2 TS 복합체 (α2β2StTS)의 억제는 크립토스포리디오스및 결핵4,생식기 및 안구 감염5,그리고잠재적인 그녀의 발동을 위한 잠재적 인 약물 대상으로 탐구되었습니다. α 서브유닛은 인돌-3-글리세롤-인산염(IGP)의 알돌리틱 분열을 글리세랄데히드-3-인산염(GAP)과 인돌로 촉매하여, 인돌닌 타우토머 중간체및 그 후 카본-카본 결합 분열의 형성을 통해 GAP및 인돌3,6을생성한다. β 촉매 부위에는 쉬프 베이스를 통해 β-Lys87에 결합된 피리독살 5′-인산염(PLP) 보조 분자가 포함되어 있으며, 이는 효소 β 서브유닛3,7에서반응하는 과정에서 전자 싱크로 기능한다. β 사이트는 L-트립토판과 PLP 의존 반응에서 물 분자를 제공하기 위해 인돌에 의해 L-세린 사이드 체인 하이드록실의 교체를 촉매한다. 세인트 (주) TS는 다효소 복합체2,3내의 기질 채널링 및 알로스터통신을 조사하는 오랜 모델역할을 한다. TS의 α 및 β 서브유닛 간의 양방향 알로스터 통신은 L-트립토판 합성3동안 촉매 단계를 동기화하고 인돌 방출을 방지할 필요가 있다. 이러한 노력을 확장하기 위해, 우리는 여러 돌연변이 (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr 및 β-Ser377Ala)를 단일 지점 돌연변이로 제조하여 효소 구조, 메커니즘 및 세인트TS β 서브 유닛의 촉매 부위에서의 관계의 추가 탐구에 사용할 수 있습니다.
α2β2StTS의 촉매 메커니즘에 대한 자세한 연구는 에디스 W. 마일즈의 연구 그룹에 의해 시작되었습니다. 네이티브 대장균 α2 β2 TS 복합체를 통한 초기 연구는 격리된 α 서브유닛8,9,격리된 β 서브유닛10,11 및 α2 β 2TS 단지의 재구성에 초점을 맞추고 있다12. 정제는 황산염 강수량 암모늄, 샘플 투석, DEAE-세바덱스 크로마토그래피, 투석 및 DEAE-Sephadex 컬럼12에대한 제2 크로마토그래피 라운드에 의해 수행되었다. 또 다른 프로토콜에서, 동일한 복합체의 정제는 DEAE-Sephadex 컬럼에 정제된 세포 용재를 적재하고 세파로즈 4B 컬럼, 황산암모늄 강수량 및투석(13)에크로마토그래피 단계를 거쳐 개선되었다. 두 정화 프로토콜모두 4-5일 동안 지속됩니다. 대장균 α2 β2 TS 복합체는 결정화되었지만 그 당시 의결은 X선 회절에 적합하지 않았다.
새로운 연구에서는, 재조합 및 야생형 형태의 S. typhimurium α2β2 TS 복합체는14,15로정결되었다. 재조합 α2β2stTS 복합체는 pEBA-10 발현 벡터를 운반하는 대장균 CB149로 과발현되었다. 초기 결정화 및 X선 회절 데이터 수집 및 분석α2β2StTS 복합체의 분석은14보고되었다. 그러나, α 같은 길고 얇은 바늘2β2세인트TS 크리스탈 구조 연구를 손상. 더 나은 X선 회절 데이터를 수집하기 위해, 또 다른 정화 프로토콜은 α2β2StTS 복합체15의야생 유형 및 돌연변이 형태를 정화하기 위해 설명되었다. 정화는 스퍼민과 PEG 8,000을 사용하여 초기 침전을 명확히 된 세포 용액으로 수행하였고 큰 부피가 큰 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. α 2 β2세인트TS복합체의 높은 양을 포함하는 상주 분획은 황색 결정이 침전될 때까지 4°C에서 16-48h로 저장하였다. 크리스탈은 다른 버퍼에 대해 세척하고 광범위하게 투석되었습니다. 단백질 복합체는 황산암모늄을 함유하는 완충액으로재결정되었고, 투석15. 단백질 결정화는 용액의 단백질 및 침전물 농도에 따라 달라지지만, 용액에서 다른 돌연변이 형태인 α2β2StTS 콤플렉스에 대한 정화를 모니터링, 예측 및 재현하기는 어렵다. 이 프로토콜은 크로마토그래피 방법을 사용하지 않는다는 장점이 있습니다. 그러나, 단점은 결정화, 투석 및 재결정화에 필요한 긴 정화 시간이며, 전형적으로 5-7일이 필요하다. X선 데이터 수집에 적합한 결정을 얻기 위해 600개 이상의 결정화 조건은 단백질 농도, 온도, 강수제(PEG 4,000, 6,000 및 8,000) 및 첨가제(CaCl2,MnCl2,ZnCl2,카다베린, 퍼드린, 퍼드린, 스프레딘, 스프레시네, 스프레딘, 스프레시네,15. 크리스탈은 더 나은 결정 형태를 가지고 있었고 12 % PEG 8,000 및 2 mM 스페민을 포함하는 조건에서 더 빠르게 성장했습니다. 결정화는 4, 30 또는 42°C보다 25°C에서 더 유리했으며3일 15일이내에 최대 치수로 성장하였다. 몇몇α2β 2StTS 결정 구조물은 그 당시 (1996-1999)16,17,18,19,20,21 및 그밖 많은 구조물이 현재까지 간행되었습니다 보고되었습니다.
여기서 주요 목적은 트립토판 신체화를 정화하고 단백질 결정화를 최적화하기 위한 대체 프로토콜을 제시하는 것입니다. 본 작품은 야생형 절연 α 서브유닛(αStTS), 격리된 β 서브유닛(βStTS), α2 β2st TS 복합체, α2 β2StTS 복합체의 야생형 및 돌연변이 형태 를 정화하는 상당한 개선을보여준다. 정제 시간이 현저히 단축되고 결정화 및 극저온 보호가 최적화되었기 때문에 과거의 프로토콜에 비해 이점이 상당합니다. 이 작품에서 설계된 α2β2세인트TS 복합체의 돌연변이 형태는 야생 형 형태에 사용되는 동일한 조건 근처에서 결정화되었습니다. 그러나, 미세 결정화 최적화는 거의 원자 분해능에서 구조 판정을 위한 충분한 품질의 큰 단결정획득이 필요하였다. 현재까지, 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 증착된 134개의 트립토판 신체 결정 구조물이 있으며, 각각 101, 31 및 2개의 결정 구조를 각각 박테리아, 고고학 및 진핵생물에 대해 회계합니다. 멋지게, 73 구조는 S. 엔테리카 세로바 티피무륨에 속하고 5 α 의 5 결정 구조2β2세인트TS 단지는 1.50 Angstroms보다 높은 해상도 한계를 가지고있다. 당연히, 4 아웃 5 우리의 연구 그룹에서 준비 되었다 (PDB IDs:5CGQ 에서 1.18 Å, 4HT3 에서 1.30 Å, 4HPJ 에서 1.45 Å, 6DZ4 에서 1.45 Å 해상도). α2β2StTS 복합체의 돌연변이 형태의 정제 된 결정 구조는 L-트립토판 합성에 관련된 필수 아미노산 잔류물이 연주 되는 메커니즘과 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 예상됩니다.
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Protocol
1. α 및 β 서브 유닛을 정화하는 빠른 프로토콜과 재결합 된 α2β2StTS 단지
- PETSUMO 발현 벡터로 DNA 감속
- α인코딩하는 번역적 결합 유전자(trpA 및 trpB)를 획득하여- pEBA-10 발현벡터(22)에서복제된 박테리아 살모넬라 엔테리카 세로바 티피무리움으로부터 트립토판 신체의 β-서브유닛을 획득한다. pEBA-10 벡터를 DNA 템플릿으로 사용합니다.
참고: 대안적으로, 아래 나열된 프라이머는 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피무륨 게놈으로부터 두 유전자를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 모든 분자 생물학 단계는 분자 복제에 설명된 대로 수행되었습니다: 실험실 매뉴얼23. - 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 α-서브유닛(αStTS)의 전체길이 폴리뉴클레오티드 서열을 개별적으로 증폭시키고, α 세인트TS-FW-Bam과 α세인트TS-Rev-Eco와 β-서브유닛(βStTS)의 전체 길이 시퀀스와 β세인트TS-FW-Bam 및StΒ.S-Β. 약 55°C의 용융 온도와 폴리머라제 연장 시간을 2분의 사용한다.
- 고충실도 DNA 폴리머라제(예를 들어, 푸시온)와 제조업체의 프로토콜을 사용하여 DNA 서열을 증폭시한다. 50 μL PCR 반응의 경우 뉴클레아제 없는 물 34μL, 5x 반응 버퍼10 μL, 1μL 1μL 1μM dNTP, 1μM 전방 프라이머 1μL, 1μM 역 프라이머 1μL, 1μL 의 1μL(200 ng), DM 의 1.5 μL, DNAL 의 1.5 μL을 추가합니다.
- PCR 프로그램의 경우 핫 스타트(98°C에서 180초)를 한 다음 30증폭 사이클(98°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 120초) 및 최종 연장(72°C에서 300초)을 사용한다.
참고: 기울임꼴 시퀀스는 각각 BamHI, EcoRI, BamHI 및 HindIII 제한 사이트에 해당합니다. 추가 염기(소문자 서열)를 추가하여 PCR 단편의 종착에 가까운 효소 절단 효율이 향상되었다.
α세인트TS-FW-밤: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAA-3′
α세인트TS-레브 에코: 5′-ccgGAATTCTTATGCGGGGGC-3′
β세인트TS-FW-밤: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
β세인트TS-레브 힌드: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCTCCTC-3′
- 6V/cm에서 1x TAE 버퍼(40m Tris, 20m 아세트산 및 1mM EDTA)로 0.8% 아가로즈 젤에 적재PCR 제품을 적재하고, 젤은 DNA 대역을 관심 있는 젤 추출물, 젤은 제조사의 지시에 따라 실리카 비드 키트를 사용하여 PCR 단편을 정화한다.
- 37°C에서 2시간 동안 제조업체가 권장하는 적절한 제한 효소 및 조건으로 각 DNA 단편의 적어도 200 ng를 소화합니다.
- 50 μL 제한 소화 반응을 설정하려면 뉴클레아제없는 물의 34 μL, DNA 10 μL (200 ng), 10x 반응 완충제의 5 μL, 제한 효소 1의 0.5 μL 및 0.5 μL을 추가합니다 2.
- 소화 제품을 1x TAE에 0.8% 아가로즈 젤을 6V/cm, 젤 추출물, 젤로 하여 상업용 키트를 사용하여 소화된 조각을 정화합니다.
- 각각의 단편을 대장균 발현 수정 벡터 pET SUMO로 개별적으로 서브클론, 이전에적절한 효소및 겔 정제로 소화하였다.
참고: 이 벡터는 상용 pET SUMO의 수정된 버전입니다. 이 벡터는 제한 효소 복제에 최적화되었습니다. pET28b벡터(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI 및 XhoI)의 멀티 클로닝 사이트(MCS)가 pET SUMO 복제 부위에 삽입되었다. 이 벡터에는 작은 유비퀴틴과 같은 수피기 단백질(SUMO) 및 다중 복제 부위가 있는 프레임에 N 단자 6x-Histidine 태그가 포함되어 있습니다. - 25°C에서 2시간 동안 T4 DNA 리개세를 가진 수정된 pET SUMO 및 PCR 단편의 50 ng의 Ligate 100 ng.
- 대장균 균주 DH10B α 세포의 유능한 세포로 생성 된 플라스미드를변환합니다. 35 μg/mL 카나마이신을 포함하는 LB 천 판의 플레이트 셀. 37 °C에서 하룻밤 반전 플레이트를 배양.
- 각 변환에서 단일 콜로니를 선택하고, 초순수 플라스미드 DNA를 준비하고, dna 시퀀싱을 수행하여 α세인트TS 또는 βStTS가 N 단말 His6-SUMO 태그로 프레임에 복제되었는지 확인합니다.
참고: 세포 배양의 글리세롤 주식을 준비 (멸균 글리세롤의 16 % 최종 농도에서 세포 현탁액을 돌려) -80 °C에서 장기 저장. - 발현 플라스미드 SUMO-αStTS 또는 SUMO-βStTS를 T7 프로모터 기반 시스템으로 대장균 발현 균주 로제타(DE3) pLysS의 유능한 세포로 개별적으로 변환합니다. 35 μg/mL 카나마이신 및 클로람페니콜을 포함하는 루리아 베르타니 (LB) 한천 판에 재조합 세포를 플레이트. 37 °C에서 하룻밤 반전 플레이트를 배양.
- 성공적인 식민지 형성 후, 하나의 단일 식민지를 선택 (어떤 위성 식민지없이) 두 항생제와 LB 배지의 5 mL에 분산. 37 °C에서 200 rpm에서 흔들림과 함께 하룻밤 배양 세포.
참고: 세포 배양의 글리세롤 주식을 준비하거나- -80°C에 장기간 보관하거나 재조합 단백질 발현에 즉시 사용하십시오.
- α인코딩하는 번역적 결합 유전자(trpA 및 trpB)를 획득하여- pEBA-10 발현벡터(22)에서복제된 박테리아 살모넬라 엔테리카 세로바 티피무리움으로부터 트립토판 신체의 β-서브유닛을 획득한다. pEBA-10 벡터를 DNA 템플릿으로 사용합니다.
- SUMO-α세인트TS 및 SUMO-β세인트TS 서브유닛의 표현
- 신선한 대장균 균주 로제타(DE3) pLysS 세포는 SUMO-α세인트TS 또는 SUMO-βStTS를 구성하거나 35 μg/mL 카나마이신 및 클로람페니콜을 포함하는 LB의 50mL 배양으로 냉동 글리세롤 재고의 일부를 긁어냅니다. 37 °C에서 200 rpm에서 흔들어 하룻밤 세포를 성장시다.
- 다음날 아침, 2% 글리세롤과 카나마이신 및 클로람페니콜(2.8 L Fernbach 플라스크)을 함유한 LB의 신선하고 멸균 된 2x 1000 mL에서 야간 세포 배양의 5mL을 접종한다. 37°C에서 200 rpm에서 흔들림으로 세포 배양을 성장시다.
참고: LB 국물에있는SUMO-αStTS 또는 SUMO-βStTS의 발현은 리터당 태그가 붙은 단백질의 125-150 mg을 산출합니다. 특정 요구를 충족하기 위해 프로토콜을 위 또는 아래로 확장하는 것이 좋습니다. - OD600이 0.6-0.8에 도달하면 0.4mMM의 최종 농도에서 이소프로필 β-D-1 티오갈라크토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하고, 200rpm에서 하룻밤 사이에 30°C에서 인큐베이션을 유도한다.
- 4°C에서 4,000 x g에서 원심분리하여 20분 동안 세포를 수확하십시오. 상체를 제거하고 감기 용해 버퍼 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 % 글리세롤, 10 mM MM 2-mercaptoethanol 및 40 mM imidazole-Cl)로 셀 펠릿을 다시 일시 중단하여 60 mL의 최종 볼륨으로 합니다.
참고: 세포는 -80°C에서 장기간 저장하거나 단백질 정화를 위해 즉시 사용할 수 있습니다. 세포를 저장하려면 세포 현탁액을 2 x 50mL 일회용 원심분리기 원심분리관으로 분할하고 단백질 정화 단계까지 세포 펠릿을 -80°C로 유지한다.
- 정화의 정화 α- 트립토판 신체의 β 서브 유닛
참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 절차는 4°C에서 수행되어야 합니다. 정제 시간을 줄이기 위해, 단백질 정제 전 또는 재조합 단백질 발현 중 완충제에서 Ni-NTA 아가로즈 니켈 충전 친화성 컬럼및 크기 배제 컬럼을 평형화한다.- 1/2" 호른 프로브(또는 유사한 장비)가 있는 디지털 소니어를 사용하여 초음파 처리로 세포 펠릿을 방해합니다. 10s 펄스와 20s 의 휴식을 사용하거나 완전한 세포 붕괴까지 얼음 수조에 80 % 진폭 의무 사이클에서 20 사이클을 수행합니다.
- 30 분 동안 30,000 x g에서 세포 용액을 원심 분리합니다. 흡인 슈퍼내역, 펠릿이 튜브에서 빠져나가지 않도록 합니다. 얼음 에 0.45 μm 필터 단위로 상체를 필터링하고 15 mL Ni-NTA 아가로스 니켈 충전 친화 컬럼을 통해 흐르며 용해 버퍼 1에서 미리 평가됩니다.
참고: 각 Ni-NTA 아가로즈 컬럼은 SUMO-α세인트TS 또는 SUMO-βStTS 재조합 단백질을 정화하는 데 사용됩니다. 정화는 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 2x 5mL Ni-NiTA 컬럼에서 수행될 수 있다. 한 번에 하나의 단백질을 정화합니다. - 세척 Ni-NTA 아가로즈 컬럼을 100 mL의 용해 버퍼 1.
- 완충E1(25mM Tris-Cl 버퍼, pH 7.8, 200mM NaCl, 5% 글리세롤, 400mm imidazole-Cl)을 함유한 80mL 1단계 용출을 진행한다.
참고: SUMO-protease는 최대 300mm imidazole를 용인하고 원심 필터 장치의 멤브레인은 최대 100mm imidazole를 견딜 수 있습니다. 다량의 이미다졸을 제거하고 정제 시간을 줄이는 황산암모늄 강수량을 수행하는 것이 좋습니다 대신 단백질 샘플을 희석하고 단백질 농도로 시간을 낭비합니다. - 상체 분획의 초기 볼륨을 평가합니다. 25°C에서 60% 포화(39.48g/100mL)까지 소량의 황산암모늄을 한 번에 천천히 첨가한다. 용액을 30분 간 부드럽게 저어서 거품을 피하십시오. 10,000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기.
- 주체 분획을 주의 깊게 폐기하십시오. 20mL의 샘플 버퍼(20mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl 및 5% 글리세롤)에서 펠릿 분획을 재연한다.
- SUMO-protease를 가진 그의 수모 태그 분열의 경우, 1:1000 비율로 사카로미세스 세레비시아e로부터 Ubl 특이적 프로테아제 1의 재조합 단편을 추가하고 4°C에서 2시간 동안 혼합물을 배양한다.
- 25°C에서 10,000 x g의 소화 산물을 원심분리하여 친화도 크로마토그래피 컬럼을 통해 시료를 적재하기 전에 단백질 응집체를 20분 동안 제거한다.
- 이전에 리시스 버퍼 1에서 평형된 15mL Ni-NTA 아가로즈 컬럼에서 20mL 재일시 중단 된 샘플을 통과하는 His6-SUMO 태그의 흔적을 제거합니다.
- 태그가 없는 α세인트TS 또는세인트TS β 포함하는 통과 샘플을 수집합니다.
- Ni-NTA 컬럼을 버퍼 1의 20mL로 세척하여 태그가 없는 αStTS 또는stTS β 남은 부분을 수집합니다.
- 각 하위 유닛을 4°C에서 3,000 x g에서 회전하여 15mL 10 kDa 컷오프 원심 필터 장치로 별도로 농축합니다. 농축 단백질을 신선한 2.0mL 튜브 및 미세 원심 분리기(10,000 x g, 10분, 4°C)로 전달하여 골재를 제거합니다. 단백질농도(24)를결정하고, 20-25 mgmL-1에서1mL 알리코트, 라벨, 액체 질소의 플래시 프리즈를 준비하고 -80°C에 저장한다.
참고: 사전 정제 된 단백질 샘플은 -80 °C에서 장기간 저장하거나 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 (SEC)에 단백질 정화를 위해 즉시 사용할 수 있습니다. - 단백질 알리쿼트(20 mg)와 마이크로센심분리기를 10,000 x g에서 10분 간 복용하여 이전 SEC의 골재를 제거하십시오.
- 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 샘플을 로드합니다(예: HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) 0.5 mL min-1의유량으로 빠른 단백질 액체 크로마토그래피에 부착된, 이전에 SEC 버퍼(10mM Tris-Cl, pH 7.8, 100mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1 mM Pyridal phooxphates)에서 평형화되었다.
참고: 더 높은 양의 격리된 αStTS 또는 βStTS 서브유닛을 정화하고 SEC 라운드 수를 줄이려면, 1.5mLmin-1의유량으로 크기 배제 크로마토그래피 컬에 20-25 mgmL-1에서 5mL 샘플을 적재한다. - α세인트TS 또는 βStTS의 품질을 평가하여 12% 또는 15% 나트륨 도데실 황산염-젤 전기포아증(SDS-PAGE)을 사용하여 쿠마시 브릴리언트 블루스테인(25)으로염색하였다.
- 신선한 15mL 10 kDa 컷오프 원심 필터 단위로 단백질 농축 단백질을 농축하고, 단백질 농도24를결정하고, 20-25 mg mL-1,라벨, 액체 질소의 플래시 동결에서 0.5 mL 알리코를 준비하고 -80 °C에 저장하십시오.
- α2β2세인트TS 단지의 α 및 β 서브 유닛의 정화
참고: SEC 버퍼(10m Tris-Cl, pH 7.8, 100mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1m 피리독살 인산염)의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(Sephadex S-200 HR 또는 Superdex 200 pg)의 크기를 상형화합니다.- α α 및 β 서브유닛으로부터 2 β2세인트TS 콤플렉스를 정화하기 위해 α세인트 TS 및 βStTS 서브유닛의 농축 샘플을 4°C에서 정화한다.
- 알리쿼트(1.2 αStTS:1.0β St TS 어어 비)를 결합하고 4°C에서 1h로 배양한다.
참고: 대부분의 β 세인트 TS가 α2β2StTS 컴플렉스에 통합되도록 αStTS를 초과해야 합니다. - 미세 원심 분리 (10,000 x g, 10 분, 4 °C)에 의해 단백질 응집체를 제거합니다.
- 명확한 상체를 크기 제외 열에 로드합니다.
- α세인트TS 또는 βStTS의 품질을 평가하여 12% 또는 15% 나트륨 도데실 황산염-젤 전기포아증(SDS-PAGE)을 사용하여 쿠마시 브릴리언트 블루스테인(25)으로염색하였다.
- 단백질농도(24)결정, 15-20 mgmL-1에서250-1000 μL 알리쿼트, 액체 질소의 플래시 동결, -80°C에 저장한다.
2. α2β2세인트TS 단지의 야생 형 또는 돌연변이 형태의 정화
- 돌연변이 β세인트TS를 준비하는 현장 지향 돌연변이 발생
- β-체인 TS 폴리뉴클레오티드 서열에서 특정 점 돌연변이를 도입하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응의 2단계 동안 DNA 템플릿으로서 pEBA-10 발현벡터(22)를 사용한다.
참고: 이 프로토콜은 살모넬라 타이피무륨 트립토판 신체로부터 α 또는 β 서브유닛에서 단일 점 돌연변이를 도입하는 데 사용할 수 있습니다. 추가, 바람직한 돌연변이를 포함하는 새로운 올리고뉴클레오티드 프라이머는 적절히 설계되어야 한다. 이 작품에서는 K167T, βS377A를 β β. - 뉴클레오티드 프라이머 TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev, TS-FW-NcoI/S377A-Rev 쌍을 사용하여 PCR 반응을 수행하여 각각 A1, B1 및 C1의 단편을 생성합니다.
참고: 올리고뉴클레오티드 TS-NcoI-FW 및 TS-SacI-Rev는 각각 pEBA-10 벡터에서 복제된 αβ StTS 폴리뉴클레오티드 서열의 상류 및 하류에서 음막을 방출한다.- 고충실도 DNA 폴리머라제(예를 들어, 푸시온)와 제조업체의 프로토콜을 사용하여 DNA 서열을 증폭시한다. 50 μL PCR 반응의 경우, 뉴클레아제 없는 물 34μL, 5x 반응 버퍼10 μL, 1μL 의 1μL, 10 μM 전방 프라이머 1μL, 1μM 역 프라이머 1μL, 템플릿 DNA 1μL(200 ng), 1.5 μL 의 DM, DNAL 의 1.5 μL을 추가합니다.
- PCR 프로그램의 경우 핫 스타트(98°C에서 180초)를 사용하고 30°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 120초), 최종 연장(72°C에서 300초)을 사용한다.
참고: 모든 분자 생물학 단계는 분자 복제에 설명된 대로 수행되었습니다: 실험실 매뉴얼23. 소문자 서열은 제한 부위에 해당하지만 굵게 나기울릭 서열은 돌연변이에 해당합니다.
TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
Q114A-Rev: 5'C AGA GGC GAC GCC GCC GTG CGC ACC GGC GGCc GGT TTC-3'
K167T-레브: 5'CTC GTT ACA GGC GGC TGT 태그 CGT AGC GGA GCC-3'
S377A-레브: 5'C TTT ATC TCC GCC GCC AGC 개그 ATT GAC CAC CAG-3'
- 뉴클레오티드 프라이머 TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF, TS-Rev-SacI/S377A-FF 쌍을 사용하여 PCR 반응을 수행하여 각각 A2, B2 및 C2의 단편을 생성합니다.
TS-레브-사치 (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT GCT G-3'
K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC 개그-3'
S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3' - 부분 조각을 개별적으로 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응을 사용합니다. 55°C의 용융 온도와 2분의 폴리머라제 연장 시간을 사용합니다.
- PCR 반응의 두 번째 라운드를 수행하려면, 위의 PCR 제품을 6 V/cm에서 1x TAE에 0.8% 아가로즈 젤에 적재하고 젤 추출물과 겔은 관심있는 조각을 정화한다.
- 파편 A1/A2, B1/B2 및 C1/C2를 과응량으로 따로 혼합하고, 혼합물을 96°C에서 10분 동안 가열하고, 25°C에서 음막이 가열한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 고충실도 폴리머라제 및 데옥시리보뉴클레오티드로 재조합 가닥을 확장한다.
- 전체 길이 돌연변이 DNA 단편의 높은 카피 수를 생성하려면 올리고 프라이머 TS-FW-NcoI 및 TS-Rev-SacI를 추가하여 두 번째 PCR을 수행합니다.
- 6V/cm에서 1x TAE 완충제에서 0.8% 아가로즈에 PCR 제품을 적재하고, 젤은 관심 있는 DNA 대역을 추출하고, 젤은 PCR 단편을 정화하고, 제조자가 권장하는 적절한 완충제 및 조건에 따라 37°C에서 2시간 동안 적절한 제한 소화를 진행한다.
- 37°C에서 2시간 동안 제조업체가 권장하는 적절한 제한 효소 및 조건으로 각 DNA 단편의 적어도 200 ng를 소화합니다. 50 μL 제한 소화 반응을 설정하려면 뉴클레아제없는 물의 34 μL, DNA 10 μL (200 ng), 10x 반응 완충제의 5 μL, 제한 효소 1의 0.5 μL 및 0.5 μL을 추가합니다 2. 6V/cm에서 1x TAE 버퍼로 0.8% 아가로즈에 적재된 소화 제품은 소화된 PCR 조각을 정화합니다.
- 제약 효소 NcoI와 SacI와 pEBA-10 구조의 200 ng를 제조 업체의 권고에 따라 다이제스트. 소화 제품을 6V/cm에서 1x TAE 버퍼에 0.8% 아가로즈 젤에 적재하고, 밴드 특파원을 벡터에 소비하고, 겔은 소화된 벡터를 정화한다.
- 이전에 소화및 정제된 PCR 단편의 50 ng를 가진 벡터의 Ligate 100 ng는 25°C에서 2시간 동안 T4 DNA 리개아제로 정제되었다. 생성된 플라스미드를 유능한 세포 E. 대장균 균주 DH10B 세포로 변환합니다. 50 μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 천 판의 플레이트셀. 37 °C에서 하룻밤 반전 플레이트를 배양.
- 각 세포 변환에서 단일 식민지 (위성 식민지없이)를 선택하고 ampicillin을 포함하는 LB 배지의 5 mL에 분산. 37 °C에서 200 rpm에서 흔들어 하룻밤 세포를 성장시다. 각 엔지니어링 된 구조에서 초순수 플라스미드 DNA 10 μg를 준비합니다. 세포 배양의 글리세롤 주식을 준비 (멸균 글리세롤의 16 % 최종 농도에서 세포 현탁액을 돌려) -80 ° C에서 장기 저장.
- 트립토판 신체의 α 및 β 서브 유닛을 인코딩하는 전신 서열을 확인하기 위해 DNA 시퀀싱을 수행한다. 각 개별 단일 돌연변이를 확인하고 바람직하지 않은 무작위 돌연변이를 포함하는 모든 플라스미드 구조를 폐기하십시오. 이 연구에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 아래에 나열되어 있습니다.
TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
TS-3F: 5'-가트가트GCAAACAGC-3'
TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
참고: 올리고뉴클레오티드 프라이머 TS-1F, TS-1R, TS-2F 및 TS-3F 는 β 서브유닛의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 (GenBank 가입 코드: CP051286.1). 프라이머 TS-4F 및 TS-5F 는 α 서브유닛의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 (GenBank 가입 코드: CP053865.1). - 각 플라스미드 구조(pEBA-10-β Q114A, pEBA-10-βK167T 및 pEBA-10-β S377A)의 200ng를 사용하여 대장균 발현 균주 CB149의 유능한 세포를 변형시키고, trp operon26이부족하다. 성공적인 식민지 형성 후, 하나의 단일 식민지를 선택하고 50 μg / mL 암피실린을 포함하는 LB 배지의 5 mL에서 세포를 성장. 세균 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 37 °C의 배양. 세포 배양의 글리세롤 주식을 준비하거나- -80°C에서 장기간 보관하거나 재조합 단백질 발현에 즉시 사용하십시오.
참고: 살모넬라 타이피무륨 트립토판 신타제로부터 α 또는 β 서브유닛에서 단일 단일 포인트 돌연변이는 대장균 CB149에서 효소 기능 또는 L-트립토판의 합성을 손상시킬 수 있다. 대장균 균주 BL21(DE)pLys-S 또는 로제타(DE3)를 사용하지 않는 경우 재조합 α 2 β2stTS 복합체가 SDS-PAGE 젤에서 검출되지 않는 경우 는 고려하십시오.
- β-체인 TS 폴리뉴클레오티드 서열에서 특정 점 돌연변이를 도입하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응의 2단계 동안 DNA 템플릿으로서 pEBA-10 발현벡터(22)를 사용한다.
- 대장균의 야생형 및 돌연변이 형태 α2 β2stTS 복합체의 표현
- 50 μg/mL 암피실린을 함유한 LB 배지의 신선하고 멸균 50mL에서 바람직한 구조를 품고 있는 대장균 발현 균주를 성장시다. 37 °C에서 200 rpm에서 흔들어 하룻밤 세포를 성장시다.
- 2% 글리세롤과 암피실린(2.8L Fernbach 플라스크)을 함유한 LB의 신선하고 멸균 된 2x 1000 mL에 하룻밤 세포 배양 5mL을 추가합니다. 37°C에서 200 rpm에서 흔들림으로 세포 배양을 성장시다.
- OD600이 0.4mMM의 최종 농도에서 IPTG를 첨가하여 0.6-0.8에 도달하면 재조합 단백질 발현을 유도하고 200 rpm에서 하룻밤 사이에 30°C에서 인큐베이션을 유도한다.
- 4°C에서 4,000 x g에서 원심분리하여 20분 동안 세포를 수확하십시오. 상체를 제거하고 차가운 용해 버퍼 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 5 mM 디티오토리톨, 1 mMM EDTA 및 1 mM MM PMSF)를 50mL 버퍼의 최종 부피로 다시 중단하십시오.
참고: 세포는 -80°C에서 장기간 저장하거나 단백질 정화를 위해 즉시 사용할 수 있습니다. 세포를 저장하려면 세포 현탁액을 2 x 50mL 일회용 원심분리기 원심분리관으로 분할하고 단백질 정화 단계까지 세포 펠릿을 -80°C로 유지한다. LB 국물에 α2β 2StTS 복합체의 돌연변이 및 야생 형 형태의 발현은 리터당 125-150 mg의 단백질을 산출합니다. 특정 요구를 충족하기 위해 프로토콜을 위 또는 아래로 확장하는 것이 좋습니다.
- 야생형 또는 돌연변이형태의 α2 β2stTS 콤플렉스의 정화
참고: 다음 프로토콜은 재조합 의 비 태그재조합 야생형 또는 돌연변이 형태를 정화하기 위한 α2β2StTS는 스킬 세트와 노력에 따라 1일 이내에 복잡합니다. 정제 시간을 줄이기 위해, 버퍼 이전 단백질 정제/발현에서 크기 배제 컬럼을 평형화한다. 야생 형 또는 돌연변이 α 정화2β2StTS 복합체는 황산암모늄 분획 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 2단계 정화에 의해 수행된다. 이 프로토콜은 LB 배지 1L에서 60-100 mg의 순수 복합체를 산출합니다.- 1/2" 호른 프로브(또는 유사한 장비)가 있는 디지털 소니어를 사용하여 초음파 처리로 세포 펠릿을 방해합니다. 10s 펄스와 20s 의 휴식을 사용하거나 완전한 세포 붕괴까지 얼음 수조에 80 % 진폭 의무 사이클에서 20 사이클을 수행합니다.
- 원심분리기 세포는 25°C에서 30분 동안 30,000 x g에서 셀 용액을 분리합니다. 흡인 슈퍼내역, 펠릿이 튜브에서 빠져나가지 않도록 합니다. 실온에서 0.45 μm 필터로 명확한 상체 분획을 필터링합니다.
- 명확히 된 상골 분획의 초기 볼륨을 평가합니다. 20%의 포화도가 도달할 때까지 한 번에 소량의 황산암모늄을 천천히 추가합니다(11.51 g/100 mL). 25°C에서 황산암모늄 분획을 수행하십시오. 부드럽게 10 분 용액을 저어 거품을 피하십시오.
- 25°C에서 10분 동안 30,000 x g의 원심분리기. 20% 초상분획을 깨끗한 플라스크로 옮킨다. 시료 버퍼 2(50m Tris-Cl, pH 7.80)의 20mL에서 20% 펠릿 분획을 부드럽게 재중단하고 100mM NaCl, 1mM EDTA 및 2mM 디티오토리톨을 함유하고 있으며, SDS-PAGE 젤을 실행하도록 샘플을 준비한다. 20% 펠릿 분획을 버리십시오.
- 20% 상수 분획의 초기 볼륨을 평가합니다. 황산암모늄을 30% 포화도에 넣고(5.94g/100mL),저어주세요, 거품을 피하고, 원심분리기를 이전과 같이 피한다. 30% 초상분획을 깨끗한 플라스크로 옮킨다. 시료 버퍼 2의 20mL에서 30% 펠릿 분획을 부드럽게 재중단하고 샘플을 준비하여 SDS-PAGE 젤을 실행합니다. 30% 펠릿 분획을 폐기합니다.
- 30% 상수 분획의 초기 볼륨을 평가합니다. 40% 포화도에 황산암모늄을 첨가하여 (6.14g/100mL)에 도달하고, 용액을 저어주며, 거품을 피하고, 원심분리기를 이전과 같이 피한다. 40% 초상분획을 깨끗한 플라스크로 옮킨다. 10mL의 샘플 버퍼 2에서 40% 펠릿 분획을 부드럽게 재중단하고 샘플을 준비하여 SDS-PAGE 젤을 실행합니다. 40% 상부 분획을 삭제합니다.
참고: 12% SDS-PAGE gel25에서 30% 및 40% 상퍼 및 펠릿 분획의 샘플을 사용하여 αβStTS 복합체의 품질을 평가합니다. 다른 돌연변이 αβStTS 복합체가 40% 상수 분획에 있는지 확인하면, 황산암모늄(13.0g/100mL)의 60% 포화를 진행한다. 사전 정제된 α2β2 StTS 복합체의 사전 정제 단백질 알리쿼트는 -80°C에서 장기간 저장하거나 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC)에 단백질 정제를 위해 즉시 사용될 수 있다. - 10,000 x g,20분에서 단백질 샘플을 미세원심분리, 4°C 및 고속 단백질 액체 크로마토그래피에 부착된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 컬럼에 상체 분획을 0.5mLmin-1의유량으로 적재하고, 이전에 SEC 버퍼(10m Tris-Cl, pH 7.8, 100mM NaCl, 5% 글리그롤)로 평형화 0.1 mM 피리독살 인산염).
참고: 다량의 복합체를 정화하려면 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 컬럼에 20-25 mgmL-1에서 5mL 샘플을 1.5mLmin-1의유량으로 적재한다. - 쿠마시 브릴리언트 블루스테인(25)으로염색된 12% SDS-PAGE 젤에서 AMmonium 황산염 분획 및 SEC 열에서 피크 분획을 따라 수집된 샘플을 평가한다.
- 야생형 또는 돌연변이 α2 β2stTS콤플렉스를 15mL 100 kDa 컷오프 원심 필터 유닛으로 4°C에서 3,000xg에서 회전한다. 농축 단백질을 신선한 2.0mL 튜브 및 미세 원심 분리기(10,000 x g, 10분, 4°C)로 전달하여 골재를 제거합니다.
- 단백질농도(24)를결정하고, 20-25 mgmL-1에서0.5mL 알리쿼트, 라벨, 액체 질소의 플래시 동결을 준비하고 -80°C에 저장한다.
3. α2β2StTS 콤플렉스의 야생 유형 및 돌연변이 형태에 최적화된 결정화
참고: α2β2StTS 단지에 대한 초기 결정화 조건은 이전에 12% PEG 8,000 및 2mM 스퍼민22를포함하는 조건에서 보고되었다.
- 결정화 분석 전에 스톡 솔루션을 준비하여 더 나은 결정화 재현성을 달성합니다. TS로 구조 연구를 수행하려면 bienzyme 복합체의 금속 협착 부위에서 Na+ 또는 Cs+ 이온으로 단백질을 결정화하십시오.
- 물에 200mM의 5mL 스톡 용액을 준비하고 -20 °C에서 500 μL 알리쿼트를 유지합니다.
- 물에 30 % (w / v) PEG 8000의 50 mL 재고 용액을 준비하고 25 ° C에서 50 mL 일회용 원심 분리기 원심 분리기 원추형 플라스크에 25 mL 알리쿼트를 유지합니다.
- 물에 1 M CsCl의 25 mL 스톡 용액을 준비하고 25 ° C에서 유지하십시오.
- 물에 1 M NaCl의 25 mL 재고 용액을 준비하고 25 ° C에서 유지하십시오.
- PH 7.6, 7.8 및 8.0에서 완충 솔루션을 얻기 위해 CsOH 또는 NaOH와 함께 3x 50 mL 스톡 솔루션을 CsOH 또는 NaOH와 함께 준비합니다. 25mL 알리코를 4°C로 유지하십시오.
- 얼음 욕조에 α2β2세인트TS 복합체 (20-25 mg mL-1)의샘플을 해동하십시오.
- 마이크로원심분리기 샘플은 단백질 응집체를 제거하기 위해 25°C에서 10분 동안 10,000 x g에서 10분 동안 샘플링합니다.
- 클리어된 상체 분획을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기습니다.
- 추정 단백질농도(24) 및 희석 단백질 알리쿼트(150-200 μL)에서 15 mgmL-1에 50mM 비신-CsOH 또는 -NaOH, pH 7.8은 50mM MM CsCl 또는 NaCl을 함유하고 있다. 단백질 샘플을 25°C로 유지하십시오.
- 멸균 1.5mL 라벨 마이크로센심분리기 튜브에 3x 24 웰 앉아 드롭 플레이트에 대한 500 μL 저수지 솔루션을 준비합니다. 저수지 용액에는 50mM 비신-CsOH 또는 -NaOH, 50mM CsCl 또는 NaCl 및 PEG 8000이 포함되어 있습니다. 플레이트 열에 PEG 8000(6-11%)의 농도와 플레이트 행의 스페민(2-8mMM)의 농도가 다양합니다. 각 집합에 대해 버퍼 pH(pH 7.6, 7.8 및 8.0)를 변경합니다.
- 튜브와 소용돌이를 10초 이상 힘차게 캡합니다. 25°C에서 10분 동안 10,000 x g의 원심분리기 튜브를 사용하여 거품을제거합니다. 각 레이블이 매겨진 저장소에 500 μL 버퍼링 솔루션을 분배합니다.
- P-10 마이크로피펫을 사용하고 각 앉아있는 드롭당 15 mg mL-1에서 5 μL의 단백질 용액을 분배하십시오. 거품을 피하십시오. 각 리그레크 용액의 5μL을 단백질 강하에 추가합니다. 혼합 하는 동안 거품을 방지 하 고 혼합물을 균질화 하기 위해 위아래로 파이펫 하지 마십시오.
- 투명 접착제 테이프로 플레이트를 테이프로 25°C로 플레이트를 보관합니다. 크리스탈은 2-5 일 동안 나타나고 2 주 이내에 전체 차원으로 증가합니다.
4. X 선 회절 데이터 수집 및 α2β2StTS 복잡한 구조 솔루션
참고: X선 회절 데이터 수집에 앞서 각 결정에 대해 냉동 보호용 솔루션을 미리 준비합니다. 특정 저수지 용액을 사용하여용액(10, 20 및 30% v/v) 및 특정 리간드(s)에서 d imethyl sulfoxide의 농도증가를 포함하는 3개의 알리코트(aliquots)를 준비한다. 디메틸 설프리산화물은 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 PEG 200-300보다 더 나은 냉동 보호제로 밝혀졌다.
- 입체 현미경 의 밑에 극저온루프를 사용하여 큰 단결정 수확하십시오.
- 침전액을 함유한 각 냉동보호제 용액의 파이펫 2 μL과 새로운 커버 슬라이드에디이메틸 설산화물 및 리간드(들)의 농도가 더 높다.
- 순차적으로, 각 방울에 crystal을 담그고 동결 보호용 액액에 30 s의 크리스탈을 평형하게 하십시오.
- -173°C(100K)에서 기체 질소 스트림을 사용하여 냉동 고리 결정을 플래시 냉각하거나 퍽에 장기간 보관하기 위해 액체 질소에 침지합니다.
참고: 액체 질소로 폼 드와르를 채우고, 크리스탈 퍽을 미리 식히고, 극저온 저장 Dewar에 결정을 저장하고, 건조 한 화주를 사용하여 싱크로트론에 결정을 발송합니다. - -173°C에서 X선 회절 데이터 수집을진행합니다. 0.5-4.0의 노출 시간과 0.5° 진동을 사용하여 X선 회절 데이터를 기록합니다. 크리스탈 180-360°를 회전합니다.
- iMosflm27로 X선 회절 이미지를 처리하여 적절한 공간 그룹에서 반사 파일을 생성합니다. 일반적으로, α2β2세인트TS 결정은 우주 그룹 C 121 (C2)에 속한다.
- CCP4패키지(29)에서구현된스칼라(28)와반사의 여러 관측을 함께 확장한다.
- MolRep(30)를 이용한 분자 교체및 적절한 검색 모델을 사용하여 고해상도 α2β2세인트TS 복합체의 구조를 해결한다. 성공적인 구조 용액 후 Coot31의 모델 및 전자 밀도 맵을 검사합니다.
참고: 단백질 데이터 뱅크에 다른 리간드(들)를 증착하는 많은 TS 결정 구조가 있습니다. 더 나은 분자 교체 단계와 새로운 결정 구조에 맞게 시간 감소, 관심리간 (들)을 포함하는 최고의 검색 모델을 사용합니다. CCP429,30 또는페닉스(31)에서결정 구조 정제를 진행한다. - Coot32를사용하여 모델에 대한 수동 조정을 한 다음 Refmac29,33 또는 phenix.refine31,34로자동으로 개선됩니다. Coot32에서 반복적인 모델 빌드 라운드를 실행하고 자동화된 개선으로 최종 모델을 구축하고 개선합니다.
- 단백질 데이터 뱅크 웹 사이트에서 좌표 및 구조 요인 증착을 진행합니다.
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Representative Results
α정화- 및 트립토판 신체의 β서브 유닛
살모넬라 타이피무륨 트립토판 신체의 α-서브유닛(αSt TS)과 β-서브유닛(βStTS)은 수정된 pET SUMO 벡터에서 분리하였다. 도 1A는 His6-SUMO-αStTS(레인 αON) 및 His6-SUMO-βStTS(레인 βON) 융합 단백질에 대응하는 두 개의 강력한 밴드의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 이 작업에 기재된 정화 프로토콜은 2일 이내에 두 하위 단위의 정제를 개별적으로 허용하였다. 첫날은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 강수량, 그 순모 태그 분열, 그의 수모 태그 흔적 제거, 단백질 농도에 의해 각 단백질을 정화하는 데 사용되었습니다. 도 1B 및 1C는 각각 α 서브유닛 및 β 서브유닛 정제의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 둘째 날, α 및 β 서브유닛으로부터 의 농축 α 서브유닛, β 서브유닛 및 α2β2stTS 복합체가 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 적재되었다. 도 1D는 S-200 HR 크기 배제 열에 αStTS, βStTS 및 α 2 β 2StTS 복합체의 일반적인 용출 프로파일을 나타낸다. 도 1E는 수집된 피크 분수의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 가장 순수한 피크 분획은 풀리고, 농축되었고, α2β2StTS 복합체는 단백질 결정화 연구에 사용되었습니다.
야생형 및 돌연변이α2 β2stTS 복합체의 정화
α 2 β2S. typhimurium 트립토판신타제 복합체의 야생 형 및 돌연변이 형태를 정화하는 또 다른 신속하고 효율적인 프로토콜이 이 작품에 설명되어 있습니다. 도 2는 α대한 야생형 번역 결합 유전자(trpA 및 trpB) 인코딩을 포함하는 pEBA-10 분재의 표현을 나타내며-서브유닛(22)을 β. α2 β 2stTS 복합체의 돌연변이 형태를 생성하는 2단계 PCR 돌연변이 발생 프로토콜은 도 3에묘사된다.
돌연변이α2 β2stTS 복합체의 코딩 영역은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었고 대장균 균주 CB149세포(26)를변형시키는 데 사용되었다. α2 β2세인트TS복합체의 야생형 및 돌연변이 형태는 과발현되었고 재조합 단백질은 1-2일 이내에 성공적으로 정제되었다. 심모늄 황산염 분획은 이종 발현 시스템에서 대부분의 오염 물질 단백질을 쉽게 제거하였다(도4A,차선 20P, 30P 및 40S). HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 α2β2stTS(143.06 kDa) 복합체의 상대용출 위치를 가진 대표적인 용출 프로파일이 도 4B에도시되어 있다. 제외된 피크 분획의 순도는 풀링 전에 분석된 SDS-PAGE(도4C)였다.
야생형 및 돌연변이 α2 β2트립토판신체 복합결정화 최적화
야생 타입과 돌연변이 α2β2세인트TS콤플렉스의 알리쿼트는 15 mg ml-1에서 24 웰 앉아 드롭 플레이트를 설정하는 데 사용되었다. 전형적으로, 5μL 단백질 용액과 저수지 용액의 동등한 부피로 구성된 물방울은 저수지 용액의 500 μL에 대하여 평형하였다(도5). 스퍼민은 야생 유형과 돌연변이 α 2 β2세인트TS 복합체2를구체화하는 데 필요합니다. 야생형을 결정화하기 위한 스페민의 최종 농도는 2mM이지만, 이 작품에서 돌연변이 복합체를 결정화하기 위한 스페민의 농도는 약간 더 높은 것으로 나타났다(4-8mMM).
큰 단결정은 미세결정 최적화, 다양한 PEG 8000(6-11%) 및 비신 버퍼 pH를 통해 얻어졌다. 다른 형태와 크리스탈은 2-5 일에 나타났고 결정은 2 주 이내에 전체 크기로 증가(그림 6). X선 회절 데이터 수집 전에 결정은 냉동 보호용 액액(30% 디메틸 설프리산화물을 함유한 저수지 버퍼)에 담근 것으로 나타났습니다. 최적화된 공정으로 인해 거의 원자 해상도에서 X선 회절 측정에 적합한 품질 결정이 발생했습니다.
X선 회절 데이터 분석
2 β2stTS 복합체 α의 결정구조는 본 문서에 기재된 방법으로 제조되었고 X선 회절 데이터는 거의 원자분해능에서 수집되었다. 결정은 F9 억제제 (2- {[4- (트리플루오로메톡시)Phenyl]Sulfonyl}아미노)와 L-트립토판을 포함하는 냉동 보호 용액에 담근했다.
0.5°의 증분에서 크리스탈 360°를 회전시켜 고급 광원(버클리-CA)에서 SIBYLS 싱크로트론 빔라인 12.3.1에서 완전한 X선 회절 데이터 세트를 수집하였다. X선 회절 강도가 처리되었으며 데이터 수집 통계는 표 1에요약됩니다. 대칭 분석은 결정이 단일 클리닉 공간 그룹 C2에 속한다는 것을 나타냅니다. 단위 셀 매개 변수는 = 182.55, b = 59.30, c = 67.37Å, α = 90.00, β = 94.82, γ = 90.00 °이다. 매튜스 계수(Vm = 2.57 Å3 Da-1)의계산된 값은 52.08%35,36의용매 함량을 가진 결정의 비대칭 단위에서 1개의 TS 이성구체 분자(αβ StTS)의 존재를 시사한다. 모든 X선 데이터는 회절 품질을 개선하고 방사선 붕괴를 감소시키기 위해 저온(100 K)에서 수집되었습니다. α2 β2세인트TS결정구조는 금속조정부위(PDB ID 코드: 4HT3)에서 α 부위 및 세슘 이온에서 억제제 F9를 가진 복합체에서 야생형 αβ StTS 모델을 이용한 분자대체방법에 의해 해결되었다. 최종 좌표 파일 및 구조 계수는 가입 코드 5CGQ(도7A)로PDB에 증착되었다. βα 효소 α 부위(도 7B),금속 조정 부위(도7C)에서억제제 F9가 있는 2개의세인트TS 콤플렉스의 결정 구조는, 공동점 피리독살 5'-인산염이 βLys87(도 7D)에 공봉되고, 제품 L-트립토판은 효소 β 분해능(도 78)에서 18.2.18(도7D)로결합하였다. 모델 5CGQ는 현재까지 PDB에 증착된2 β2세인트TS 크리스탈 구조의 α 가장 높은 해상도입니다.
그림 1: α 및 β 서브유닛의 정화와 α2β2StTS 복합체. (A) 재조합 단백질 발현. 30°C(α/β0 이전 IPTG 유도)에서 IPTG 유도 후 SUMO-αStTS(αON) 및 SUMO-βStTS(βON)의 야간 발현 프로파일의 12% SDS-PAGE 겔. (B, C) Ni-NTA 친화성 크로마토그래피는 암모늄 황산염 침전(60% 포화), (S) 정제 된 원유 추출물 (FT1) Ni-NTA 컬럼이 샘플 (W) 열 세척 샘플 (E) 용출 시료 (60S) 및 (60P) 초피 시료 (60S) 및 (60P) 초대형 및 침전 후 분획을 통과합니다. 각각 (D) SUMO-protease 소화 제품 (FT2) Ni-NTA 컬럼은 태그가없는 α세인트TS 또는 β세인트TS 하위 단위를 포함하는 샘플을 통과합니다. (D)α세인트TS 서브유닛(28.67 kDa), β세인트TS 서브유닛(42.86 kDa), α2 β2세인트TS 복합체(143.06 kDa)의 용출 프로파일은 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 크기 배제 크롬토그래피 컬럼을 장착했다. 각 실행은 별도로 수행되었습니다. (E) 각 개별 크로마토그래피로부터 제외된 피크 분획의 SDS-PAGE 겔. 15% SDS-PAGE 젤은 α2 β2StTS 복합체와 αStTS 서브유닛을 분석할 준비가 되어 있었지만, 12% SDS-PAGE 젤은 βStTS 서브유닛을 분석할 준비가 되어 있었습니다. 레인 MW, kDa의 분자량 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생성 pEBA-10의 표현. (A) α인코딩하는 야생형 번역형 결합유전자(trpA 및 trpB)의 표현- 그리고 박테리아 살모넬라 엔테리카 세로바 티히무리움(양, 아메드 외 1996)으로부터 트립토판 신체의 서브유닛을 β. (B)벡터는 암피실린 내성(amp) 유전자, 복제 기원(ori), IPTG 유도제부재의 락 프로모터를 더 잘 종료하기 위한 lacIq 유전자, 및 LacI 억제 프로모터를 포함합니다.
그림 3: 2단계 PCR 돌연변이 발생 프로토콜의 전반적인 표현. pEBA-10 벡터는 DNA 템플릿으로 사용되었다. 제1PCR은 제1 단편 및 프라이머 TS-Rev-SacI 및 MUT-FW(돌연변이를 포함하는 전방 프라이머)를 생성하기 위해 프라이머 TS-FW-NcoI 및 MUT-REV(돌연변이를 포함하는 역프라이머)로 제조되었다. 파편은 젤정제와 동등하게 결합되고, 열변성, 그리고 안전했다. 재조합 가닥은 폴리머라제와 데옥시리보뉴클레오티드로 확장되었다. PCR의 두 번째 라운드는 프라이머 TS-FW-NcoI와 TS-레브 -SacI와 함께 준비되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 야생형의 정화와 돌연변이 형태 α2β2StTS 복합체. (A)실온에서 20, 30, 40 및 50% 암모늄 황산염 포화를 사용하여 암모늄 황산염 침전을 따라 수집된 샘플의 12% SDS-PAGE 젤: (CE) 원유 추출물(S) 및 (P) 초고속 원심분리 후 상류분수. (B)힐루션 프로파일α2β2세인트TS (143.06 kDa) 복합체는 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 가진 복합체. (C)12% SDS-PAGE 겔 사진은 제외된 피크 분획의. 레인 MW, kDa의 분자량 마커 (정밀 플러스 단백질 미염색 표준, 바이오 라드). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 야생 형및 돌연변이 형태α2β2StTS 복합체에 대한 결정화 최적화. 크리스탈은 50mM 의 비신-CsOH 버퍼로 50m MM CsCl2를함유하여 재배되었다. 폴리에틸렌 글리콜 8000(6-11%) 및 스페민(2-8mMMM)의 농도는 X선 단백질 결정학에 의한 구조적 연구를 수행하기 위해 단일 대형 결정 형태를 얻기 위해 다양하였다. (A)비신-CsOH, pH 7.6. (B)비신-CsOH, pH 7.8. (C)비신-CsOH, pH 8.0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 야생 유형의 결정및 돌연변이 형태의 α2β2세인트TS 복합체의 사진 현미경 사진. 결정은 형태학이 다르지만 우주 그룹 C2에 속합니다. 결정은 2 주 후 최종 조건에서 전체 크기로 성장했다. 약 0.20 x 0.15 x 0.10 mm 크기의 크리스탈. (A-D) PLP 홀로 결정 야생형 형태(column A), 돌연변이 형태 α2 β2βQ114A(컬럼 B),α2 β2βK167T(컬럼 C), α2 β 2βS377A(컬럼 D)의 금속 협주현장에서 이온을 결합한 복합체이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 결정 구조의 전반적인 시각화 및 결정 구조 정제 후 얻은 전자 밀도 맵의 검증. (A)효소 α 부위(노란색 색), 금속 조정 부위의 세슘 이온(파란색), 공동수인 피리독살 5'-인산염 이월성액을 효소 β 부위(18)에서 함유된 억제제 F9가 함유된 야생형 α2 β2세인트TS단지의 결정구조. α 하위 유닛은 밝은 파란색으로 지정되지만 β 하위 유닛은 연어로 채색됩니다. (B-E) 전자 밀도 맵은 1.0 r.m.s. 레벨 주위(B)억제제 F9(C)세슘 이온(D)피리독살-5′-인산염,(E)L-트립토판에서 윤곽을 형성하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 데이터 수집 및 처리 | |
| 엑스레이 소스/빔 라인 | ALS 빔라인 12.3.1 |
| 파장 (Å) | 10,000 |
| 해상도 (Å) | 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18) |
| 총 반사 수 | 2151280 (252941) |
| 총 수 고유 반사 | 231646 (32187) |
| 인덱싱, 배율 조정 및 병합을 위한 공간 그룹 | C 1 2 1 |
| 셀 치수 | |
| a, b, c (Å) | 182.55, 59.30, 67.37 |
| α, β, γ (°) | 90.00, 94.82, 90.00 |
| 모사이시티 | 0.61 |
| 매튜스 볼륨 VM (Å3 Da-1) | 2.57 |
| 루마스 (%) | 8.6 (93.0) |
| 14.7 (3.0) | |
| CC1/2 (%) | 0.999 (0.778) |
| 완전성(%) | 98.6 (94.2) |
| 다양성 | 9.3 (7.9) |
| 개선 통계 | |
| Rwork/Rfree (%) | 14.04 / 16.05 |
| RMSD 채권 길이(Å) | 0.0120 |
| RMSD 본드 각도(°) | 14,059 |
| 라마찬드란이 선호 | 515 (96.44%) |
| 라마찬드란 허용 | 16 (3.00%) |
| 라마찬드란 허용되지 않음 | 3 (0.56%) |
표 1: 데이터 수집 및 처리. 괄호의 값은 외부 셸에 대한 것입니다.
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Discussion
우리는 성공적으로 구조 기능 상관 관계 연구를위한2β2 βQ114A, α2β2 βK167T,α2 β2 βS377A 세인트TS 복합체를 α 돌연변이 형태를 성공적으로 설계했다. 처음에, 우리는 이전 정화 프로토콜을 사용하여 돌연변이를 정화하기 위해 노력했다22,이는 정제 하는 동안 PEG 8000 및 spermine와 α2β2세인트TS 복합 결정화를 필요로. 결정화 속도는 돌연변이 형태와 용액의 복합체 농도에 따라 다르지만, 결정이 큰 용액 부피에서 나타나는 시기를 예측하기 어렵다. 결정화는 장시간(48-96h) 후에 달성되거나 결정화 개시 후 PEG 8000의 추가 금액을 추가하는 데 필요한 중 하나를 달성할 수있다.15.
불행히도, 이 작품에 제시된 α2β2세인트TS 복합체의 돌연변이 형태는 프로토콜의 초기 단계에서 결정화하지 못했기 때문에 이 프로토콜을 사용하여 성공적으로 정제되지 않아 결정학적 연구를 손상시켰다. 따라서, 우리는 암모늄 황산염 분획 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 간단하고 효율적인 정화 프로토콜을 만들었습니다, 이는 α2β2StTS 단지의 야생 유형과 돌연변이 형태의 높은 수율을 제공합니다. 이 프로토콜은 단순화를 따라 결정화 요구 사항 및 프로토콜 문제 해결이 없기 때문에 이전 프로토콜(5-7일)15,22와비교할 때 더 빠르며 재현할 수 있다. 또한, 당사는 α 서브유닛, β 서브유닛 및 재구성 α2β2세인트TS 콤플렉스를 격리하기 위해 새로운 식 구문 및 프로토콜을 만들었습니다.
향후 응용 분야에는 기능 및 구조 연구를 수행하기 위해 야생 유형 및 돌연변이 하위 단위의 재조합이 포함됩니다. 돌연변이 α2 β2 βQ114A, α2β2 βK167T, α2β2 βS377A 복합체는 야생형 형태(2mMM)와 비교하여 높은 농도의 스페민(4-8mMM)을 포함하는 조건에서 결정화된다. 따라서 침전제 및 완충제 pH의 농도를 변화시킴으로써 단백질 결정의 품질을 향상시키는 데 시간을 할애하는 것이 좋습니다. 단일 대형 결정 형태는 6-11% PEG 8,000을 함유한 비신 버퍼링 솔루션(pH 7.6-8.0)에서 무작위로 성장하였다. 이 작품에 기재된 방법은 α2 β2 복합체의 야생형 및 돌연변이 형태의 결정구조를 α 및 β 활성 부위 내에서 서로 다른 리간드로 제조하여, 인돌과 세린의 변환에 관여하는 상이한 중간체 및 전이 상태를 모방하여 트립토판으로 전환한다. 이러한 돌연변이의 결정 구조는 L-트립토판 합성의 주요 잔류물이 연주하는 메커니즘과 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개하고 경쟁 금융 이익을 선언 할 아무것도 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 국립 보건원 (GM097569)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
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