Summary
Denne artikel præsenterer en række på hinanden følgende metoder til udtryk og rensning af Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp denne protokol et hurtigt system til at rense protein kompleks på en dag. Overdækkede metoder er stedsstyret mutagenese, proteinudtryk i Escherichia coli, affinitetskromatografi, gelfiltreringskromatografi og krystallisering.
Abstract
Strukturelle undersøgelser med tryptophan synthase (TS) bienzym kompleks (α2β2 TS) fra Salmonella typhimurium er blevet udført for bedre at forstå sin katalytiske mekanisme, allosterisk adfærd, og detaljer om den enzymatiske transformation af substrat til produkt i PLP-afhængige enzymer. I dette værk tillod et nyt udtrykssystem til fremstilling af de isolerede α- og isolerede β-underenhed rensning af store mængder rene underenheder og α2β2StTS-kompleks fra de isolerede underenheder inden for 2 dage. Rensningen blev udført ved affinitetskromatografi efterfulgt af kavalergang af affinitetsmærket, ammoniumsulfatudfældning og størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC). For bedre at forstå den rolle, som nøglerester spiller ved enzymet β-site, blev site-direct mutagenesis udført i tidligere strukturelle undersøgelser. En anden protokol blev oprettet for at rense den vilde type og mutant α2β2StTS komplekser. En enkel, hurtig og effektiv protokol ved hjælp af ammoniumsulfatfraktionering og SEC tillod rensning af α2β2St TS-komplekspå en enkelt dag. Begge rensningsprotokoller, der er beskrevet i dette arbejde, har betydelige fordele sammenlignet med tidligere protokoller for at rense det samme kompleks ved hjælp af PEG 8000 og spermin til at krystalisere α2β2St TS-komplekslangs renseprotokollen. Krystallisering af vildtype og visse mutantformer forekommer under lidt forskellige forhold, der forringer rensningen af nogle mutanter ved hjælp af PEG 8000 og spermin. For at forberede krystaller egnet til røntgen krystallografiske undersøgelser blev der gjort en indsats for at optimere krystallisering, krystalkvalitet og kryoprotektion. De her præsenterede metoder bør generelt kunne anvendes til rensning af tryptofansynteseunderenheder og vilde typer og mutante α2β2St.TS-komplekser.
Introduction
Tryptofan synthase (TS) bienzym kompleks (α2β2)er et allosterisk enzym, katalysere de sidste to trin i biosyntesen af aminosyren L-Tryptophan i bakterier, planter og svampe1,2,3. Bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) forårsager en alvorlig mave-tarminfektion hos mennesker og andre dyr. Da mennesker og højere dyr ikke har TS (EF 4.2.1.20), hæmning af S. typhimurium α2β2 TS-kompleks (α2β2StTS) er blevet undersøgt som et potentielt lægemiddelmål til behandling af cryptosporidiose og tuberkulose4, genitale og okulære infektioner5og til potentiel herbicidudnyttelse i landbruget6. Den α-subunit katalyserer den aldolytiske kavalergang af indol-3-glycerol-fosfat (IGP) til glyceraldehyd-3-fosfat (GAP) og inddol, gennem dannelsen af en indolenine tautomer mellemliggende og efterfølgende kulstof-carbon bond kavalergang til at producere GAP og indole3,6. Det β-katalytiske sted indeholder et pyridoxalt 5′-fosfat (PLP) cofaktormolekyle bundet til β-Lys87 via en Schiff-base, der fungerer som en elektronvask i løbet af reaktionerne på enzymet β-subunit3,7. Den β-site katalyserer udskiftningen af L-Serine sidekæde hydroxyl med inddol for at give L-Tryptophan og et vandmolekyle i en PLP-afhængig reaktion. St. TS fungerer som en mangeårig model for undersøgelse af substratkanalisering og allosterisk kommunikation inden for multienzymkomplekser2,3. Tovejs allosterisk kommunikation mellem TS's α- og β-underenheder er nødvendig for at synkronisere de katalytiske trin og forhindre frigørelse af indoler under L-Tryptophan-syntese3. For at udvide denne indsats har vi forberedt flere mutanter (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr og β-Ser377Ala) ved enkeltpunktsmutation, der skal bruges til yderligere udforskning af forholdet mellem enzymstruktur, mekanisme og funktion på det katalytiske sted i StTS β-subunit.
Detaljeret forskning om katalysatormekanismen for α2β2StTS blev indledt af forskningsgruppen Edith W. Miles. Tidlige undersøgelser med indfødte Escherichia coli α2β2 TS kompleks har fokuseret på rensning og karakterisering af den isolerede α-subunit8,9, isolerede β-subunit10,11 og rekonstituering af α2β2 TS kompleks fra de isolerede underenheder12. Rensningen blev udført ved ammoniumsulfatudfældning, prøvedialyse, DEAE-Sephadex-kromatografi, dialyse og en anden kromatografisk runde på en DEAE-Sephadex kolonne12. I en anden protokol blev rensningen af det samme kompleks forbedret ved at indlæse det afklarede celle lysat på en DEAE-Sephadex kolonne efterfulgt af et kromatografisk trin på en Sepharose 4B kolonne, ammonium sulfatudfældning og dialyse13. Begge renselsesprotokoller varer i 4-5 dage. Escherichia coli α2β2 TS kompleks krystalliseret, men krystaller var ikke egnet til X-ray diffraktion på det tidspunkt.
I en ny undersøgelse, rekombinant og vilde type former for S. typhimurium α2β2 TS kompleks blev renset og krystalliseret14,15. Den rekombinant α2β2StTS kompleks var overekspresseret i E. coli stamme CB149 transporterer pEBA-10 udtryk vektor. Indledende krystallisering og X-ray diffraktion dataindsamling og analyse af α2β2StTS kompleks blev rapporteret14. Men, lange og tynde nål som α2β 2StTSkrystallernedsat strukturelle undersøgelser. I et forsøg på at indsamle bedre røntgen diffraktionsdata blev en anden rensningsprotokol beskrevet for at rense den vilde type og mutante former af α2β2St TS-kompleks15. Rensning blev udført med en indledende nedbør ved hjælp af spermin og PEG 8.000 i det afklarede celle lysat, og et stort voluminøst bundfald blev fjernet ved centrifugering. Den supernatantfraktion, der indeholder store mængder α2β2St.TS-kompleks, blev opbevaret i 16-48 timer ved 4 °C, indtil gule krystaller udfældede. Krystaller blev vasket og grundigt dialyzed mod forskellige buffere. Proteinkompleks blev recrystallized i buffer indeholdende ammonium sulfat og dialyzed15. Selvom proteinkrystallisering afhænger af protein- og præcipitantkoncentrationer i opløsning, er det vanskeligt at overvåge, forudsige og reproducere rensning for andre mutante former for α2β2StTS-kompleks i opløsning. Denne protokol har den fordel, at den ikke bruger kromatografiske metoder. Ulemperne er dog den lange rensningstid, der er nødvendig for at krystallisere, dialyse og rekrystallisere, hvilket typisk kræver 5-7 dage. For at opnå krystaller, der er egnede til indsamling af røntgendata, blev mere end 600 krystalliseringsbetingelser evalueret ved hjælp af en kombination og variation af proteinkoncentration, temperatur, præcipitanter (PEG 4.000, 6.000 og 8.000) og tilsætningsstoffer (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, kadaver, putrescine, spermine eller spermidin)15. Krystaller havde en bedre krystallinsk form og voksede hurtigere under forhold, der indeholder 12% PEG 8.000 og 2 mM spermin. Krystalliseringen var gunstigere ved 25 °C i stedet for ved 4, 30 eller 42 °C og voksede til maksimale dimensioner inden for 3 dage15. Flere α2β2StTS krystal strukturer blev rapporteret på det tidspunkt (1996-1999)16,17,18,19,20,21 og mange andre strukturer er blevet offentliggjort til dato.
Her er hovedformålet at præsentere alternative protokoller til rensning af tryptofansynthansyntese og optimere proteinkrystallisering. Nærværende arbejde viser betydelige forbedringer for at rense den vilde type isoleret α-subunit (αStTS), isoleret β-subunit (βStTS), rekonstitueret α2β2StTS kompleks fra isolerede underenheder, og vilde type og mutant former af α2β2StTS kompleks. Fordelene i forhold til tidligere protokoller er betydelige, da rensningstiden blev reduceret betydeligt, og krystallisering og kryoprotektion blev optimeret. Mutant former for α2β2StTS kompleks manipuleret i dette arbejde har krystalliseret nær samme tilstand, der anvendes til den vilde type form. Men fin krystallisering optimering var nødvendig for at opnå store enkelt krystaller af tilstrækkelig kvalitet til struktur bestemmelse ved nær atomare opløsning. Til dato er der 134 tryptophan synthase krystal strukturer deponeret i Protein Data Bank (PDB), regnskab 101, 31 og 2 krystal strukturer, henholdsvis for bakterier, archaea og eukaryote. Pænt, 73 strukturer tilhører S. enterica serovar typhimurium og 5 krystal strukturer af α2β2StTS kompleks har opløsning grænser højere end 1,50 Angstroms. Ikke overraskende blev 4 ud af 5 udarbejdet i vores forskningsgruppe (PDB IDs: 5CGQ ved 1,18 Å, 4HT3 ved 1,30 Å, 4HPJ ved 1,45 Å, 6DZ4 ved 1,45 Å opløsning). De raffinerede krystalstrukturer af mutant form af α2β2StTS kompleks forventes at give ny indsigt i den mekanisme og roller, som essentielle aminosyre rester involveret i L-Tryptophan syntese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hurtig protokol til rensning af α- og β-underenhed og rekombineret α2β2StTS-kompleks
- DNA-subklonering i pETSUMO-udtryksvektor
- Anskaffelse af det translationelt koblingsgen (trpA og trpB), der kodper α- og β- underenheder af tryptophansyntase fra bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium klonet i pEBA-10-udtryksvektoren22. Brug pEBA-10 vektor som DNA-skabelon.
BEMÆRK: Alternativt kan de anførte primere nedenfor bruges til at forstærke begge gener fra Salmonella enterica serovar typhimurium genom. Alle molekylærbiologiske trin blev fulgt som beskrevet i Molekylær kloning: En laboratoriemanual23. - Brug polymerase kædereaktion (PCR) til at forstærke polynukleotidsekvensen i fuld længde af α-underenheden (αStTS) med primere αStTS-FW-Bam og αTS-Rev-Ecoog fuld længde sekvens af β-underenhed(βStTS) med primere βStTS-FW-Bam og βStTS-Rev-Hind. Brug en smeltetemperatur på ca. 55 °C og en polymeraseforlængelsestid på 2 min.
- Brug high-fidelity DNA polymerase (f.eks. Phusion) og producentens protokol til at forstærke DNA-sekvenserne. For en 50 μL PCR-reaktion tilsættes 34 μL nukleasefrit vand 10 μL 5x reaktionsbuffer, 1 μL på 10 mM dNTP' er, 1 μL på 10 μM fremad primer, 1 μL 10 μM omvendt primer, 1 μL af skabelon-DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Pionhus DNA polymerase.
- Til PCR-programmet skal du bruge en varm start (180 sekunder ved 98 °C) efterfulgt af 30 forstærkningscyklusser (30 sekunder ved 98 °C, 30 sekunder ved 55 °C og 120 sekunder ved 72 °C) og en endelig forlængelse (300 sekunder ved 72 °C).
BEMÆRK: De kursiverede sekvenser svarer til henholdsvis BamHI-, EcoRI-, Bam HI-og Hind III-begrænsningsstederne. Enzymspaltningseffektivitet tæt på terminien af PCR-fragmenter blev forbedret ved at tilføje ekstra baser (små sekvenser).
αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3'
αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3'
βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3'
βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3'
- Pcr-produktet indlæses på 0,8 % agarosegel i 1x TAE-buffer (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre og 1 mM EDTA) ved 6 V/cm, gelekstrakter DNA-båndet af interesse, og gel renser PCR-fragmentet ved hjælp af et silicaperlesæt efter fabrikantens anvisninger.
- Mindst 200 ng af hvert DNA-fragment fordøjes med passende restriktionsenzymer og -tilstande, som fabrikanten anbefaler i 2 timer ved 37 °C.
- For at opstille en fordøjelsesreaktion på 50 μL begrænsning tilsættes 34 μL nukleasefrit vand, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaktionsbuffer, 0,5 μL restriktionsenzym 1 og 0,5 μL restriktionsenzym 2.
- Indlæs fordøjelsesproduktet på 0,8% agarosegel på 1x TAE ved 6 V/cm, gelekstrakt og gel rense det fordøjede fragment ved hjælp af et kommercielt kit.
- Subklon individuelt hvert fragment i E. coli udtrykket modificeret vektor pET SUMO, tidligere fordøjet med passende enzymer og gel renset.
BEMÆRK: Denne vektor er en modificeret version af den kommercielle pET SUMO. Denne vektor er optimeret til begrænsning af enzymkloning. Multikloningsstedet (MCS) for pET28b-vektoren (BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI og XhoI) blev indsat på pET SUMO-kloningsstedet. Denne vektor indeholder en N-terminal 6x-Histidine tag i ramme med den lille Ubiquitin-lignende Modifier protein (SUMO) og flere kloning steder. - Ligate 100 ng modificeret pET SUMO og 50 ng PCR-fragment med T4 DNA-ligase i 2 timer ved 25 °C.
- Omdan den konstruerede plasmid til kompetente celler af E. coli stamme DH10Bα celler. Pladeceller på LB agarplader med indhold af 35 μg/mL kanamycin. Pladen inkuberes omvendte natten over ved 37 °C.
- Vælg en enkelt koloni fra hver transformation, forbered ultra-ren plasmid DNA, og udfør DNA sekventering for at kontrollere, at αStTS eller βStTS blev klonet i ramme med N-terminal His6-SUMO tag.
BEMÆRK: Forbered glycerolbestandene af cellekultur (drej celleaffjedringen i 16% endelig koncentration af steril glycerol), og opbevar dem på lang sigt ved -80 °C. - Omdan udtrykket plasmid SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS individuelt til kompetente celler af E. coli udtryk stamme Rosetta (DE3) pLysS med en T7 promotor-baseret system. Rekombinantcellerne på Luria Bertani (LB) agarplader med indhold af 35 μg/mL kanamycin og chloramphenicolpladen. Pladen inkuberes omvendte natten over ved 37 °C.
- Efter vellykket kolonidannelse skal du vælge en enkelt koloni (uden satellitkolonier) og sprede den i 5 mL LB-medium med begge antibiotika. Kulturceller natten over med rysten ved 200 omdrejninger ved 37 °C.
BEMÆRK: Forbered glycerollagre af cellekultur, opbevar på lang sigt ved -80 °C eller brug straks til rekombinant proteinudtryk.
- Anskaffelse af det translationelt koblingsgen (trpA og trpB), der kodper α- og β- underenheder af tryptophansyntase fra bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium klonet i pEBA-10-udtryksvektoren22. Brug pEBA-10 vektor som DNA-skabelon.
- Udtryk for underenhederne SUMO-αStTS og SUMO-βStTS
- Pode friske E. coli stamme Rosetta (DE3) pLysS celler huser SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS konstruerer eller skrabe nogle af de frosne glycerol lager i en 50 ml kultur LB indeholder 35 μg/mL kanamycin og chloramphenicol. Celler vokses natten over med rysten ved 200 omdrejninger ved 37 °C.
- Næste morgen podes 5 ml af natten cellekultur i en frisk og steril 2x 1000 ml LB indeholder 2% glycerol plus kanamycin og chloramphenicol (2,8 L Fernbach kolbe). Vokse cellekultur med rysten ved 200 omdrejninger ved 37 °C.
BEMÆRK: Udtrykket af SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS i LB bouillon giver 125-150 mg mærket protein pr. Liter. Overvej at skalere protokollen op eller ned for at opfylde specifikke krav. - Rekombinant proteinudtryk, når OD600 når 0,6-0,8 ved tilsætning af isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) ved en endelig koncentration på 0,4 mM efterfulgt af inkubation ved 30 °C natten over ved omrystning ved 200 omdrejninger ved 200 omdrejninger i minuttet.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 4.000 x g ved 4 °C i 20 min. Supernatanten fjernes, og cellepillerne suspenderes igen med kold lysisbuffer 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, der indeholder 500 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM 2-mercaptoethanol og 40 mM imidazol-Cl) til et sidste volumen på 60 mL.
BEMÆRK: Celler kan opbevares på lang sigt ved -80 °C eller anvendes straks til proteinrensning. For at opbevare cellerne opdeles celleaffjedringen i 2 x 50 mL engangscentrifugeformiske rør, og cellepillerne holdes ved -80 °C, indtil proteinrensningstrinnet er opfyldt.
- Rensning af α- og β-underenheder af tryptophan synthase
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres ved 4 °C, medmindre andet er angivet. For at reducere rensningstiden skal Ni-NTA agarose nikkelladede affinitetskolonner og størrelsesudelukkelseskolonne i buffer før proteinrensning eller under rekombinant proteinudtryk.- Afbryd cellepille ved sonikering ved hjælp af en digital soniker med 1/2" Hornsonde (eller et lignende udstyr). Udfør 20 cyklusser ved 80% amplitude-arbejdscyklus på isvandbad med 10 s puls og 20 s hvile eller indtil fuldstændig celleforstyrrelse.
- Centrifuge cellen lysat på 30.000 x g i 30 min. Aspirat supernatant, der sikrer, at pellet ikke løsner sig fra røret. Supernatanten filtreres med en 0,45 μm filterenhed på is, og den strømmes gennem en 15 mL Ni-NTA agarose nikkelladet affinitetskolonne, der er præekvilibreret i lysis buffer 1.
BEMÆRK: Hver Ni-NTA agarose kolonne vil blive brugt til at rense enten SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS rekombinant protein. Rensning kan udføres i en 2x 5 mL Ni-NiTA kolonne fastgjort til et hurtigt protein flydende kromatografi system. Rens et protein ad gangen. - Vask Ni-NTA agarose kolonne i 100 mL lysis buffer 1.
- Fortsæt med en 80 mL ettrins-udligning med buffer E1 (25 mM Tris-Cl buffer, pH 7,8, der indeholder 200 mM NaCl, 5% glycerol og 400 mM imidazol-Cl).
BEMÆRK: SUMO-protease tåler op til 300 mM imidazol, og membranen af centrifugalfilteranordninger tåler op til 100 mM imidazol. Vi anbefaler, at du udfører en ammoniumsulfatudfældning for at fjerne store mængder imidazol og reducere rensningstiden i stedet fortynde proteinprøven og spilde tid med proteinkoncentration. - Vurder det oprindelige volumen af den supernatantfraktion. Der tilsættes langsomt små mængder ammoniumsulfat ad gangen, indtil en mætning på 60 % (39,48 g/ 100 mL) ved 25 °C er nået. Rør forsigtigt opløsningen i 30 minutter og undgå bobler. Centrifuge ved 10.000 x g i 15 min.
- Aspirér og kassér den supernatantfraktion omhyggeligt. Pelletfraktionen blev genbrugt i 20 mL prøvebuffer (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl og 5% glycerol).
- For Hans-SUMO-tag kavalergang med SUMO-protease, tilsæt rekombinant fragment af Ubl-specifikke protease 1 fra Saccharomyces cerevisiae i en 1:1000 ratio og inkubere blandingen i 2 timer ved 4 °C.
- Fordøjelsesproduktet centrifugeres ved 10.000 x g i 25 °C i 20 minutter for at fjerne proteinaggregater, inden prøven indlæses gennem en affinitetskromatografikolonne.
- Fjern spor af His6-SUMO-tag, der passerer den 20 mL genbrugte prøve på en 15 mL Ni-NTA agarose-kolonne, der tidligere var ekvilibreret i lysis buffer 1.
- Gennemsamle den pass-through-prøve, der indeholder den ikke-mærkede αSt.TS eller βSt.TS.
- Ni-NTA-kolonnen vaskes i 20 mL buffer 1 for at indsamle rester af ikke-mærkede αSt.TS eller βSt.TS.
- Koncentrer hver underenhed separat med en 15 mL 10 kDa cutoff centrifugalfilterenhed ved spinding ved 3.000 x g ved 4 °C. Det koncentrerede protein overføres til et friskt 2,0 mL rør og mikrocentrifuge (10.000 x g, 10 min,4 °C) for at fjerne granulater. Proteinkoncentrationen bestemmes24, der fremstilles 1 mL aliquots ved 20-25 mg mL-1, etiket, flash-freeze i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
BEMÆRK: Prærensede proteinprøver kan opbevares på lang sigt ved -80 °C eller anvendes straks til proteinrensning på en kolonne med størrelsesudematografi (SEK). - Tag et protein aliquot (20 mg) og mikrocentrifuge ved 10.000 x g i 10 minutter for at fjerne aggregater tidligere SEC.
- Indlæs prøven på en kolonne med størrelsesudelukkelseskromatografi (f.eks. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) fastgjort til en hurtig proteinvæskekromatografi med en strømningshastighed på 0,5 mL min-1, tidligere ekvilibreret i SEC buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxal fosfat).
BEMÆRK: For at rense større mængder isolerede αSt.TS eller βSt.TS-underenhed og reducere antallet af SEC-runder skal der indlæses en prøve på 5 mL ved 20-25 mg mL-1 på en kolonne med størrelsesudematografi med en strømningshastighed på 1,5 mL min-1. - Vurder kvaliteten af αStTS eller βStTS i peak fraktion ved hjælp af en 12% eller en 15% natrium dodecyl sulfat-gel elektrophoresis (SDS-PAGE), henholdsvis farves med Coomassie strålende blå plet25.
- Koncentrat protein med friske 15 mL 10 kDa cutoff centrifugalfilterenheder, determine proteinkoncentration24, forbered 0,5 mL aliquots ved 20-25 mg mL-1, etiket, flash-fryse i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
- Rensning af α2β2StTS-komplekset fra α- og β-underenheder
BEMÆRK: Udjævn kolonnen med størrelsesudelukkelseskromatografi (Sephadex S-200 HR eller Superdex 200 pg) i SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxalphosphat).- For at rense α2β2St.TS-kompleks af α og β underenheder, optøes koncentratprøver af αSt.TS og βSt.TS-underenheder ved 4 °C.
- Kombiner aliquots (1,2 αStTS: 1,0 βStTS kindtandforhold) og inkuberes ved 4 °C i 1 time.
BEMÆRK: Overskydende αStTS er nødvendigt for at sikre, at det meste af βStTS vil blive indarbejdet i α2β2StTS kompleks. - Proteinaggregater fjernes ved mikrocentrifugering (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
- Indlæs den tydeliggjorte supernatant på kolonnen med størrelsesudelukkelse.
- Vurder kvaliteten af αStTS eller βStTS i peak fraktion ved hjælp af en 12% eller en 15% natrium dodecyl sulfat-gel elektrophoresis (SDS-PAGE), henholdsvis farves med Coomassie strålende blå plet25.
- Proteinkoncentrationen bestemmes24, der fremstilles 250-1000 μL aliquots ved 15-20 mg mL-1,flash-freeze i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
2. Rensning af α2β2St.TS-kompleks af vild eller mutant art
- Site-instrueret mutagenesis at forberede mutant βStTS
- Brug konstruktions-pEBA-10-udtryksvektor22 som DNA-skabelon under to trin af polymerasekædereaktion for at introducere specifikke punktmutationer i β-kædeTS polynukleotidsekvensen.
BEMÆRK: Denne protokol kan bruges til at introducere en enkelt punktmutation i enten α- eller β-underenhed fra Salmonella typhimurium tryptophan synthase. For yderligere skal nye oligonukleotid primere, der indeholder den ønskelige mutation, være passende designet. I dette arbejde er mutationer βQ114A, βK167T, βS377A opført. - Udfør PCR-reaktioner ved hjælp af par nukleotidprimere TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev og TS-FW-NcoI/S377A-Rev for at generere fragmenter henholdsvis A1, B1 og C1.
BEMÆRK: Oligonukleotid TS-NcoI-FW og TS-SacI-Rev, henholdsvis annealer opstrøms og nedstrøms for αβ StTS polynukleotidsekvensen klonet i pEBA-10 vektoren.- Brug high-fidelity DNA polymerase (f.eks. Phusion) og producentens protokol til at forstærke DNA-sekvenserne. For en 50 μL PCR-reaktion tilsættes 34 μL nukleasefrit vand 10 μL 5x reaktionsbuffer, 1 μL på 10 mM dNTP' er, 1 μL på 10 μM fremad primer, 1 μL 10 μM omvendt primer, 1 μL skabelon-DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA-polymerase.
- Til PCR-programmet skal du bruge en varm start (180 sekunder ved 98 °C) efterfulgt af 30 forstærkningscyklusser (30 sekunder ved 98 °C, 30 sekunder ved 55 °C og 120 sekunder ved 72 °C) og en endelig forlængelse (300 sekunder ved 72 °C).
BEMÆRK: Alle molekylærbiologiske trin blev fulgt som beskrevet i Molekylær kloning: En laboratoriemanual23. Mens en sekvens med små bogstaver svarer til et begrænsningssted, svarer en fed og kursiv sekvens til en mutation.
TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
- Udfør PCR-reaktioner ved hjælp af par nukleotidprimere TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF og TS-Rev-SacI/S377A-FF for at generere fragmenter henholdsvis A2, B2 og C2.
TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc GCGGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3' - Brug polymerase kædereaktion til individuelt at forstærke de delvise fragmenter. Brug en smeltetemperatur på 55 °C og en polymeraseforlængelsestid på 2 min.
- For at udføre anden runde af PCR-reaktioner skal du indlæse PCR-produktet ovenfor på 0,8% agarosegel på 1x TAE ved 6 V/cm og gelekstrakt og gel rense de fragmenter af interesse.
- Fragmenterne A1/A2, B1/B2 og C1/C2 blandes separat i lige store mængder, opvarmes blandingen i 10 minutter ved 96 °C og anneal ved 25 °C. Udvid de rekombinante tråde med en high-fidelity polymerase og deoxyribonucleotider i henhold til producentens protokol.
- For at generere et højt kopinummer af det mutante DNA-fragment i fuld længde, skal du tilføje oligo primere TS-FW-NcoI og TS-Rev-SacI for at udføre en anden PCR.
- PCR-produktet belastes på 0,8 % agarose i 1x TAE-buffer ved 6 V/cm, gelekstrakter DNA-båndet af interesse, gel renser PCR-fragmentet og fortsætter med passende begrænsningsfordøjelse i 2 timer ved 37 °C efter den relevante buffer og de betingelser, som producenten anbefaler.
- Mindst 200 ng af hvert DNA-fragment fordøjes med passende restriktionsenzymer og -tilstande, som fabrikanten anbefaler i 2 timer ved 37 °C. For at opstille en fordøjelsesreaktion på 50 μL begrænsning tilsættes 34 μL nukleasefrit vand, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaktionsbuffer, 0,5 μL restriktionsenzym 1 og 0,5 μL restriktionsenzym 2. Indlæs fordøjelsesproduktet på 0,8% agarose i 1x TAE buffer ved 6 V/cm og rens det fordøjede PCR-fragment.
- Digest 200 ng pEBA-10 konstruere med restriktion enzymer NcoI og SacI efter fabrikantens anbefaling. Indlæs fordøjelsesproduktet på 0,8% agarosegel i 1x TAE buffer ved 6 V/cm, punktafgift bandkorrespondenten til vektoren, og gel rense den fordøjede vektor.
- Ligate 100 ng vektor med 50 ng PCR-fragment, tidligere fordøjet og renset, med T4 DNA-ligase i 2 timer ved 25 °C. Omdan den konstruerede plasmid til kompetente celler E. coli stamme DH10B celler. Pladeceller på LB agarplader med et indhold af 50 μg/mL ampicillin. Pladen inkuberes omvendte natten over ved 37 °C.
- Vælg en enkelt koloni (uden satellitkolonier) fra hver celletransformation, og spred den i 5 mL LB-medium, der indeholder ampicillin. Celler vokses natten over med rysten ved 200 omdrejninger ved 37 °C. Forbered 10 μg ultra-ren plasmid DNA fra hver manipuleret konstruktion. Glycerolbestandene af cellekulturen (vend celleaffjedringen i 16% den endelige koncentration af steril glycerol) og opbevar langtidshold ved -80 °C.
- Udfør DNA-sekventering for at bekræfte sekvensen i fuld længde, der koder α- og β-underenheder af tryptofansyntese. Bekræft hver enkelt mutation og kassér enhver plasmidkonstruktion, der indeholder uønsket tilfældig mutation. De oligonukleotidprimer, der anvendes i denne undersøgelse, er anført nedenfor.
TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTG-3'
BEMÆRK: Oligonukleotid primere TS-1F, TS-1R, TS-2F, og TS-3F anneal på polynukleotid sekvens af β-subunit (GenBank tiltrædelse kode: CP051286.1). Primere TS-4F og TS-5F anneal på polynukleotidsekvensen af α-underenheden (GenBanks tiltrædelseskode: CP053865.1). - Brug 200 ng af hver plasmidkonstruktion (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T og pEBA-10-βS377A) til at omdanne kompetente celler af E. coli-ekspressionsstamme CB149, der mangler trp operon26. Efter vellykket kolonidannelse skal du vælge en enkelt koloni og dyrke cellerne i 5 mL LB-medium indeholdende 50 μg/mL ampicillin. Dyrkning i bakterieinkubatoren ved 37 °C natten over. Glycerollagre af cellekultur tilberedes, opbevares på lang sigt ved -80 °C, eller der anvendes straks til rekombinant proteinudtryk.
BEMÆRK: En enkelt enkelt punktmutation i enten α- eller β-underenhed fra Salmonella typhimurium tryptophan synthase kan forringe enzymfunktionen eller lavere syntese af L-Tryptophan i E. coli stamme CB149. Overvej at bruge enten E. coli stamme BL21(DE)pLys-S eller Rosetta (DE3)pLys-S, hvis der ikke er påvist udtryk eller lavere mængder rekombinant α2β2StTS-kompleks i en SDS-PAGE gel.
- Brug konstruktions-pEBA-10-udtryksvektor22 som DNA-skabelon under to trin af polymerasekædereaktion for at introducere specifikke punktmutationer i β-kædeTS polynukleotidsekvensen.
- Udtryk for vildtype og mutantform af α2β2St.TS-kompleks i E. coli
- Grow E. coli-ekspressionstamme, der huser den ønskelige konstruktion i et friskt og sterilt 50 mL LB-medium, der indeholder 50 μg/mL ampicillin. Celler vokses natten over med rysten ved 200 omdrejninger ved 37 °C.
- Der tilsættes 5 mL af nattens cellekultur i en frisk og steril 2x 1000 mL LB, der indeholder 2% glycerol plus ampicillin (2,8 L Fernbach kolbe). Vokse cellekultur med rysten ved 200 omdrejninger ved 37 °C.
- Rekombinant proteinudtryk, når OD600 når 0,6-0,8 ved tilsætning af IPTG ved en endelig koncentration på 0,4 mM efterfulgt af inkubation ved 30 °C natten over med rysten ved 200 omdrejninger ved 200 omdrejninger i minuttet.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 4.000 x g i 4 °C i 20 min. Supernatanten fjernes, og cellepillerne suspenderes igen med kold lysisbuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, der indeholder 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA og 1 mM PMSF) til et endeligt volumen på 50 mL buffer.
BEMÆRK: Celler kan opbevares på lang sigt ved -80 °C eller anvendes straks til proteinrensning. For at opbevare cellerne opdeles celleaffjedringen i 2 x 50 mL engangscentrifugeformiske rør, og cellepillerne holdes ved -80 °C, indtil proteinrensningstrinnet er opfyldt. Udtrykket af mutant og vild type form af α2β2StTS kompleks i LB bouillon giver 125-150 mg protein per liter. Overvej at skalere protokollen op eller ned for at opfylde specifikke krav.
- Rensning af vildtlevende eller mutantform af α2β2St.TS-kompleks
BEMÆRK: Følgende protokol er beregnet til at rense den ikke-mærkede rekombinant vilde type eller mutantform af rekombinanten α2β2StTS kompleks inden for 1 dag, afhængigt af færdighedssæt og indsats. For at reducere rensningstiden skal kolonnen med udelukkelse af ækvilibreret størrelse i buffer forudgående proteinrensning/-udtryk reduceres. Rensning af vilde eller mutanter α2β2StTS-komplekset udføres ved en totrinsrensning bestående af ammoniumsulfatfraktionering og en størrelsesudelukkelseskromatografi. Denne protokol giver 60-100 mg rent kompleks fra 1 L LB medium.- Afbryd cellepille ved sonikering ved hjælp af en digital soniker med 1/2" Hornsonde (eller et lignende udstyr). Udfør 20 cyklusser ved 80% amplitude-arbejdscyklus på isvandbad med 10 s puls og 20 s hvile eller indtil fuldstændig celleforstyrrelse.
- Cellens lysat centrifuges ved 30.000 x g i 30 min ved 25 °C. Aspirat supernatant, der sikrer, at pellet ikke løsner sig fra røret. Den tydeliggjorte supernatantfraktion filtreres med et filter på 0,45 μm ved stuetemperatur.
- Vurder det oprindelige volumen af den afklarede supernatantfraktion. Tilsæt langsomt små mængder ammoniumsulfat ad gangen, indtil en 20% mætning er nået (11,51 g / 100 mL). Ammoniumsulfatfraktionering udføres ved 25 °C. Rør forsigtigt opløsningen i 10 minutter og undgå bobler.
- Centrifuge ved 30.000 x g i 10 min ved 25 °C. Den 20% supernatantfraktion overføres til en ren kolbe. Resuspend forsigtigt 20% pelletfraktion i 20 mL prøvebuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, indeholdende 100 mM NaCl, 1 mM EDTA og 2 mM dithiothreitol) og forbered en prøve til at køre SDS-PAGE gel. Kassér 20% pellet fraktion.
- Vurder det oprindelige volumen af den 20% supernatant fraktion. Tilsæt ammoniumsulfat til 30% mætning er nået (5,94 g / 100 ml), røropløsning, undgå bobler og centrifuge som før. Overfør den 30% supernatantfraktion til en ren kolbe. Resuspend forsigtigt 30% pellet fraktion i 20 mL prøve buffer 2 og forberede en prøve til at køre SDS-PAGE gel. Kassér 30% pellet fraktion.
- Vurder det oprindelige volumen af den 30% supernatant fraktion. Tilsæt ammoniumsulfat ved en 40% mætning er nået (6,14 g / 100 ml), røropløsning, undgå bobler og centrifuge som før. Den 40% supernatantfraktion overføres til en ren kolbe. Resuspend forsigtigt 40% pellet fraktion i 10 mL prøve buffer 2 og forberede en prøve til at køre SDS-PAGE gel. Kassér den 40% supernatant fraktion.
BEMÆRK: Vurdere kvaliteten af αβStTS kompleks ved hjælp af prøver af 30% og 40% supernatant og pellet fraktioner i en 12% SDS-PAGE gel25. Hvis du kontrollerer, at et andet mutant αβStTS-kompleks er i den 40% supernatantfraktion, skal du fortsætte med en 60% mætning af ammoniumsulfat (13,0 g / 100 mL). Forrensede protein aliquots af de forrensede α2β2 StTS kompleks kan opbevares på lang sigt ved -80 °C eller anvendes straks til proteinrensning på en størrelse udelukkelse kromatografi kolonne (SEC). - Mikrocentrifuge proteinprøven ved 10.000 x g, 20 min. 4 °C og lad den supernatantfraktion på en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-kolonne, der er fastgjort til en hurtig proteinvæskekromatografi med en strømningshastighed på 0,5 mL min-1, tidligere ekvilibreret i SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxalphosphat).
BEMÆRK: For at rense store mængder kompleks, indlæse en 5 mL prøve ved 20-25 mg mL-1 på en HiLoad 26/600 Superdex 200 pg kolonne med en strømningshastighed på 1,5 mL min-1. - Vurder prøver indsamlet langs ammonium sulfat fraktionering og peak fraktioner fra SEC kolonne på en 12% SDS-PAGE gel farves med Coomassie strålende blå plet25.
- Koncentrer den vilde type eller mutant α2β2StTS kompleks med en 15 mL 100 kDa cutoff centrifugalfilter enhed ved spinding ved 3.000 x g ved 4 °C. Det koncentrerede protein overføres til et friskt 2,0 mL rør og mikrocentrifuge (10.000 x g, 10 min,4 °C) for at fjerne granulater.
- Proteinkoncentrationen bestemmes24, der fremstilles 0,5 mL aliquots ved 20-25 mg mL-1, etiket, flash-freeze i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
3. Optimeret krystallisering til vildtype og mutantform af α2β2StTS-kompleks
BEMÆRK: Den oprindelige krystalliseringstilstand for α2β2St.TS-kompleks blev tidligere rapporteret under forhold, der indeholder 12% PEG 8.000 og 2 mM spermin22.
- Forbered stamløsninger forud for krystalliseringsanalyserne for at opnå en bedre krystalliseringsgen reproducerbarhed. For at udføre strukturelle undersøgelser med TS krystallisere protein med Na+ eller Cs+ ion på metalkoordinationsstedet for bienzymkomplekset.
- Der fremstilles en 5 ml lageropløsning på 200 mM spermin i vand, og der opbevares 500 μL aliquots ved -20 °C.
- Der fremstilles en opløsning på 50 ml på 30 % (w/v) PEG 8000 i vand, og der opbevares 25 ml aliquots i en engangscentrifuge-konisk kolbe på 50 mL ved 25 °C.
- Der fremstilles en 25 ml lageropløsning på 1 M CSCl i vand, og ved 25 °C opbevares.
- Der fremstilles en opløsning på 1 M NaCl i vand på 25 mL, og ved 25 °C opbevares.
- Der fremstilles en 3x 50 ml lageropløsning på 1 M bicin og titreres med CSOH eller NaOH for at opnå bufferopløsninger ved pH 7.6, 7.8 og 8.0. Der skal være 25 mL aliquots ved 4 °C.
- Der optøs en prøve på α2β2St.TS-kompleks (20-25 mg mL-1)på et isbad.
- Mikrocentrifugeprøve ved 10.000 x g i 10 min ved 25 °C for at fjerne proteinaggregater.
- Overfør den ryddede supernatantfraktion til et rent mikrocentrifugerør.
- Anslået proteinkoncentration24 og fortyndet protein aliquots (150-200 μL) ved 15 mg mL-1 med 50 mM bicine-CsOH eller -NaOH, pH 7,8 indeholdende 50 mM CSCl eller NaCl. Proteinprøven opbevares ved 25 °C.
- Forbered 500 μL reservoiropløsningerne til 3x 24-godt siddende dråbeplader i sterile 1,5 mL mærkede mikrocentrifugerør. Reservoiropløsningen indeholder 50 mM bicine-CsOH eller -NaOH, 50 mM CsCl eller NaCl og PEG 8000. Koncentrationen af PEG 8000 (6-11%) på pladesøjlerne og koncentrationen af spermin (2-8 mM) varieres på pladerækkerne. Skift buffer pH -lager (pH 7,6, 7,8 og 8,0) for hvert sæt.
- Kaper rørene og hvirvlen kraftigt mindst 10 sek. Centrifugerør ved 10.000 x g i 10 minutter ved 25 °C for at fjerne bobler. Dispenser 500 μL bufferopløsning i hvert mærket reservoir.
- Brug en P-10 mikropipette og dispenser 5 μL proteinopløsning ved 15 mg ml-1 pr. siddende dråbebrønd. Undgå bobler. Der tilsættes 5 μL af hver korrespondentbeholderopløsning til proteindråben. Undgå bobler under blanding og ikke pipette op og ned for at homogenisere blandingen.
- Tape pladen med et gennemsigtigt tape, og opbevar pladen ved 25 °C. Krystaller vises om 2-5 dage og vokser til deres fulde dimensioner inden for to uger.
4. Indsamling af røntgendiffraktionsdata og α2β2St.TS kompleks strukturløsning
BEMÆRK: Før dataindsamling af røntgendiffraktioner skal kryobeskyttende opløsning forberedes til hver krystal på forhånd. Brug den specifikke reservoiropløsning til at fremstille 3 aliquots, der indeholder stigende koncentrationer af dimethylsulfoxid i opløsning (10, 20 og 30% v/v) og specifikke ligand (r). Dimethylsulfoxid viste sig at være et bedre kryobeskyttende middel end glycerol, ethylenglycol og PEG 200-300.
- Høst en stor enkelt krystal ved hjælp af en cryoloop under det stereoskopiske mikroskop.
- Pipetter 2 μL af hver kryoprotectantopløsning, der indeholder nedbørsopløsningen, plus højere koncentrationer af dimethylsulfoxid og ligand (r) på et nyt dækslør.
- Sekventielt, blød crystal i hver dråbe og lad krystal ekvilibraten i 30 s i kryobeskyttende opløsning.
- Kryobeskyttet krystal, der er lynkølet ved hjælp af en gasformig nitrogenstrøm ved -173 °C (100 K), eller nedsænkes i flydende nitrogen til langtidsopbevaring i pucken.
BEMÆRK: Fyld en skum dewar med flydende nitrogen, forkøle en krystal puck, gemme krystaller i kryogene opbevaring Dewar, og skib krystaller til synkrotronen ved hjælp af en tør afskiber. - Fortsæt med indsamling af røntgendiffraktionsdata ved -173 °C. Optag røntgendiffraktionsdata ved hjælp af en eksponeringstid på 0,5-4,0 s og 0,5° svingninger. Roter krystal 180-360°.
- Behandl røntgendiffraktionsbillederne med iMosflm27 for at generere refleksionsfil i den relevante rumgruppe. Generelt tilhører α2β 2St.TS-krystaller rumgruppen C 121 (C2).
- Skaler flere observationer af refleksioner sammen med Scala28, implementeret i CCP4-pakke29.
- Løs strukturen af højopløsnings-α2β2StTS-kompleks ved molekylær udskiftning ved hjælp af MolRep30 og en passende søgemodel. Undersøg modellen og elektrontæthedskortet i Coot31 efter en vellykket strukturløsning.
BEMÆRK: Der er mange TS krystaller strukturer deponeret i Protein Data Bank med forskellige ligand (r). For et bedre molekylært udskiftningstrin og nedsat tid, der passer til den nyere krystalstruktur, skal du bruge den bedste søgemodel, der indeholder ligand (r) af interesse. Fortsæt med krystalstrukturforfinelse i CCP429,30 eller Phenix31. - Foretag manuelle justeringer af modellen ved hjælp af Coot32efterfulgt af automatisk raffinement med Refmac29,33 eller phenix.refine31,34. Byg og forfin den endelige model ved at køre iterative runder af model bygning i Coot32 og automatiseret raffinement.
- Fortsæt med koordinat- og strukturfaktorer, der aflejrer på Protein Data Banks websted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rensning af α-og β- underenheder af tryptophan synthase
Den α- underenhed (αStTS) og β-underenheden (βSt.TS) af Salmonella typhimurium tryptophan synthase blev subkloneret i den modificerede pET SUMO-vektor. Figur 1A viser repræsentative SDS-PAGE-resultater af to stærke bånd svarende til Fusionsproteinet His6-SUMO-αStTS (lane αON) og His6-SUMO-βStTS (lane βON). Den rensningsprotokol, der er beskrevet i dette arbejde, gjorde det muligt at rense begge underenheder individuelt inden for 2 dage. Den første dag blev brugt til at rense hvert protein ved Ni-NTA affinitet kromatografi, ammonium sulfat nedbør efterfulgt af His-SUMO-tag kavalergang, fjernelse af His-SUMO-tag spor, og protein koncentration. Figur 1B og 1C viser repræsentative SDS-PAGE-resultater af henholdsvis α-underenheden og β-underenhedsrensningen. På den anden dag blev koncentratet α-underenhed, β-underenhed og α2β2St.TS-komplekset fra α- og β-underenheder indlæst på en størrelsesudelukkekromatografikolonne. Figur 1D viser en typisk elutionsprofil for αStTS, βStTS og α2β2St TS-komplekser på en S-200 HR-størrelsesudelukkelseskolonne. Figur 1E viser et repræsentativt SDS-PAGE-resultat af de indsamlede myldretidsfraktioner. De reneste topfraktioner blev samlet, koncentreret, og α2β2St TS-kompleksblev brugt til proteinkrystalliseringsundersøgelser.
Rensning af vildtype og mutant α2β2StTS-kompleks
En anden hurtig og effektiv protokol til rensning af den vilde type og mutant form af α2β2S. typhimurium tryptophan synthase kompleks er beskrevet i dette arbejde. Figur 2 viser en gengivelse af pEBA-10-konstruktionen, der indeholder kodningen af wild type translationally kobling genet (trpA og trpB) for α- og β-subunits22. Pcr-mutagenesis-protokollen i to trin til generering af mutantformer af α2β2St.TS-kompleks er afbildet i figur 3.
Kodningsregionerne i mutant α2β2St.TS-kompleks i pEBA10 blev bekræftet ved DNA-sekventering og brugt til at omdanne E. coli-stamme CB149-celler26. Den vilde type og mutant form af α2β2StTS kompleks var overekspresseret og rekombinant proteiner blev renset med succes inden for 1-2 dage. Ammoniumsulfatfraktionering ved stuetemperatur fjernede let de fleste forurenende proteiner fra det heterologe ekspressionssystem (Figur 4A, bane 20P, 30P og 40S). Figur 4Bviser en repræsentativ elueringsprofil med en relativ elueringsposition på α2β2StTS-kompleks (143,06 kDa) på en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-kolonne med udelukkelse af kromatografi . Renheden af de udelukkede myldrefraktioner blev SDS-PAGE analyseret før samling(Figur 4C).
Optimering af vilde typer og mutant α2β2tryptophan synthase kompleks krystallisering
Aliquots af vild type og mutant α2β2StTScomplex ved 15 mg ml-1 blev brugt til at oprette 24-godt siddende drop plader. Dråber bestående af 5 μL proteinopløsning og den tilsvarende volumen reservoiropløsning blev typisk ekvilibreret mod 500 μL reservoiropløsning (figur 5). Spermin er forpligtet til at krystallisere den vilde type og mutant α2β2StTS kompleks22. Mens den endelige koncentration af spermin til krystallisering af den vilde type er 2 mM, viste koncentrationen af spermin til krystallisering af mutantkomplekset i dette arbejde at være lidt højere (4-8 mM).
Store enkeltkrystaller blev opnået gennem en fin krystalliseringsoptimering, varierende PEG 8000 (6-11%) og bicine buffer pH. Krystaller med forskellige morfologier dukkede op i 2-5 dage og krystaller voksede til fuld størrelse inden for to uger (Figur 6). Før dataindsamlingen af røntgendiffraktionsdata blev krystaller gennemblødt i kryobeskyttende opløsning (reservoirbuffer indeholdende op til 30% dimethylsulfoxid). Den optimerede proces resulterede i kvalitetskrystaller, der var egnede til røntgendiffraktionsmålinger ved næsten atomopløsning.
Analyse af røntgendiffraktionsdata
En krystalstruktur af den vilde type α2β2St TS-kompleksblev udarbejdet med metoder beskrevet i denne artikel, og røntgendiffraktionsdata blev indsamlet ved nær atomopløsning. Krystallen blev gennemblødt i kryobeskyttende opløsning indeholdende F9-hæmmer (2- ({[4- (Trifluoromethoxy)Phenyl]Sulfonyl}Amino)Ethyl DihydrogenPhosphat) og L-Tryptophan.
Der blev indsamlet et komplet røntgendiffraktionsdatasæt på SIBYLS-synkrotronstrålelinjen 12.3.1 ved Advanced Light Source (Berkeley-CA) ved at dreje krystallen 360° i intervaller på 0,5°. X-ray diffraktion intensiteter blev behandlet, og dataindsamling statistikker er sammenfattet i tabel 1. Symmetrianalysen viser, at krystallen tilhørte den monokliniske rumgruppe C2. Enhedscelleparametrene er a = 182,55, b = 59,30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. Den beregnede værdi af Matthews-koefficienten (Vm = 2,57 Å3 Da-1) antyder tilstedeværelsen af et TS heterodimermolekyle (αβ StTS) i krystallens asymmetriske enhed med et opløsningsmiddelindhold på 52,08%35,36. Alle røntgendata blev indsamlet ved lave temperaturer (100 K) for at forbedre diffraktionskvaliteten og mindske strålingsforfald. Den α2β2StTS krystalstruktur i kompleks blev løst ved molekylær udskiftning metode ved hjælp af den vilde type αβ StTS model i kompleks med hæmmeren F9 på α-site og cæsium ion på metal koordinering site (PDB ID kode: 4HT3). Den endelige koordinatfil og strukturfaktorerne blev deponeret i FBF med tiltrædelseskode 5CGQ (Figur 7A). Krystalstrukturen af den vilde type α2β2St.TS-kompleks med inhibitor F9 ved enzymet α-(Figur 7B), cæsiumion på metalkoordinationsstedet (Figur 7C), cofaktor pyridoxal 5 Fosfat, der er kovalent bundet til βLys87 (figur 7D), og produktet L-tryptophan ved enzymet β-(Figur 7E)blev løst ved 1,18 Angstrom-opløsning. Model 5CGQ er den højeste opløsning α2β2StTS krystal struktur deponeret i FBF til dato.
Figur 1: Rensning af α- og β-underenheder og α2β2St.TS-kompleks. (A) Rekombinant proteinudtryk. 12% SDS-PAGE gel af den dag-nat udtryk profil SUMO-αStTS (αON) og SUMO-βStTS (βON) efter IPTG induktion ved 30 °C (α/β0 forudgående IPTG induktion). (B, C) Ni-NTA-affinitetskromatografi efterfulgt af ammoniumsulfatudfældning (60% mætning), (S) afklaret råekstrakt (FT1) Ni-NTA-kolonne passerer gennem prøve (W) kolonnevaskprøve (E) eluatprøve (60S) og (60P) supernatant- og bundfaldsfraktioner efter højhastigheds centrifation henholdsvis (D) SUMO-protease fordøjelse produkt (FT2) Ni-NTA kolonne passerer gennem prøve, der indeholder tag-mindre αStTS eller βStTS underenhed. (D) fordelingsprofil for αSt.TS-underenhed (28,67 kDa), βSt.TS-underenhed (42,86 kDa) og α2β2StTS-kompleks (143,06 kDa) med en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-størrelsesudelukkelseskromatografikolonne. Hver kørsel blev udført separat. (E) SDS-PAGE geler af de ekskluderede tostopfraktioner fra hver enkelt kromatografi. Mens 15% SDS-PAGE geler var parate til at analysere α2β2StTS kompleks og αStTS underenhed, en 12% SDS-PAGE gel var parat til at analysere βStTS underenhed. Lane MW, molekylvægtmarkører i kDa. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentation af konstruktionen pEBA-10. (A) Repræsentation af det wild type translationelt koblingsgen (trpA og trpB), der koder α- og β- underenheder af tryptofansyntesen fra bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) Vektoren indeholder en ampicillin resistens (amp) gen, en replikation oprindelse (ori), en lacIq gen til bedre nedlukning en lac promotor i mangel af IPTG inducer, og LacI-undertrykte promotor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samlet repræsentation af pcr-mutagenesis-protokollen i to trin. Den pEBA-10 vektor blev brugt som en DNA-skabelon. Den første runde af PCR blev udarbejdet med primere TS-FW-NcoI og MUT-REV (en omvendt primer, der indeholder en mutation) for at generere det første fragment og primere TS-Rev-SacI og MUT-FW (en fremad primer, der indeholder en mutation) for at generere det andet fragment). Fragmenter blev gelpureret og jævnt kombineret, varme denatureret og udglødet. De rekombinante tråde blev udvidet med polymerase og deoxyribonucleotider. Den anden runde af PCR blev udarbejdet med primere TS-FW-NcoI og TS-Rev-SacI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Rensning af vilde typer og mutantform af α2β2St.TS-kompleks. (A) 12 % SDS-PAGE-gel af prøver indsamlet langs ammoniumsulfatudfældning ved hjælp af 20, 30, 40 og 50 % ammoniumsulfatmætning ved stuetemperatur: (CE) råekstrakt (S) og (P) supernatant- og bundfaldsfraktioner efter højhastigheds centrifugering. (B) Elution profil af α2β2StTS (143,06 kDa) kompleks med en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR størrelse udelukkelse kromatografi kolonne. (C) 12% SDS-PAGE gel billede af de udelukkede togfraktioner. Lane MW, molekylvægtmarkører i kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Krystalliseringsoptimering for vildtype og mutantform af α2β2StTS-kompleks. Krystaller blev dyrket i 50 mM Bicine-CsOH buffer indeholdende 50 mM CsCl2. Koncentrationen af polyethylen glycol 8000 (6-11%) og spermin (2-8 mM) blev varieret for at opnå enkelte store krystaller former til at udføre strukturelle undersøgelser af X-ray protein krystallografi. (A)Bicine-CsOH, pH 7.6. (B)Bicine-CsOH, pH 7.8. (C)Bicine-CsOH, pH 8.0. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fotomikrograf af krystaller af vild og mutant form af α2β2StTS-kompleks. Krystaller adskiller sig i morfologi, men de tilhører rumgruppen C2. Krystallerne voksede til deres fulde dimensioner i de endelige forhold efter to uger. Krystaller på ca. 0,20 x 0,15 x 0,10 mm i størrelse. (A-D) PLP holokrystaller i kompleks med cæsiumion på metalkoordinationsstedet for formularen af vild type (kolonne A), mutantform α2β2 βQ114A (kolonne B), α2β2 βK167T (kolonne C) og α2β2 βS377A (kolonne D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Samlet visualisering af krystalstruktur og validering af elektrontæthedskort opnået efter krystalstrukturforfinelse. (A) krystalstruktur af den vilde type α2β2St.TS-kompleks med inhibitor F9 ved enzymet α-site (gul farvet), cæsiumion på metalkoordinationsstedet (blåfarvet), cofaktor pyridoxal 5'-fosfat covalent bundet til βLys87 (grøn farvet), og produktet L-tryptophan på enzymet β-site (cyan farvet) ved 1,18 Angstrom opløsning. Mens α-underenheden er farvet i lyseblå, er β-underenheden farvet i laks. (B-E) Elektrontæthedskort kontureret ved 1,0 r.m,s. niveau omkring (B) inhibitor F9 (C) cæsiumion (D) pyridoxal-5′-fosfat, og (E) L-Tryptophan. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Indsamling og behandling af data | |
| Røntgenkilde / Strålelinje | ALS-bjælkelinje 12.3.1 |
| Bølgelængde (Å) | 10,000 |
| Beslutning (Å) | 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18) |
| Samlet antal refleksioner | 2151280 (252941) |
| Samlet antal entydige refleksioner | 231646 (32187) |
| Områdegruppe til indeksering, skalering og fletning | C 1 2 1 af 19. |
| Celledimensioner | |
| a, b, c (Å) | 182.55, 59.30, 67.37 |
| α, β, γ (°) | 90.00, 94.82, 90.00 |
| Mosaik | 0.61 |
| Matthews bind VM (Å3 Da-1) | 2.57 |
| Rmeas (%) | 8.6 (93.0) |
| 14.7 (3.0) | |
| CC1/2 (%) | 0.999 (0.778) |
| Fuldstændighed (%) | 98.6 (94.2) |
| Mangfoldighed | 9.3 (7.9) |
| Statistik for finjustering | |
| Rwork/Rfree (%) | 14.04 / 16.05 |
| RMSD-bindingslængde (Å) | 0.0120 |
| RMSD-bindingsvinkel (°) | 14,059 |
| Ramachandran foretrak | 515 (96.44%) |
| Ramachandran tilladt | 16 (3.00%) |
| Ramachandran ikke tilladt | 3 (0.56%) |
Tabel 1: Indsamling og behandling af data. Værdier i parentes er for den ydre skal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har med succes konstrueret mutantform α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T og α2β2 βS377A StTS-komplekser til strukturfunktionskorrelationsundersøgelser. I første omgang har vi forsøgt at rense mutanterne ved hjælp af en tidligere rensningsprotokol22, som kræver α2β2St TSkompleks krystallisering med PEG 8000 og spermin under rensning. Selvom krystalliseringshastigheden afhænger af mutantformen og koncentrationen af komplekset i opløsning, er det vanskeligt at forudsige, hvornår krystaller forekommer i et stort opløsningsvolumen. Krystallisering kan opnås enten efter lange perioder (48-96 h) eller være nødvendig tilsætning af ekstra mængder PEG 8000 efter krystalliseringsstart15.
Desværre blev mutantformer af α2β2StTS-kompleks præsenteret i dette arbejde ikke med succes renset ved hjælp af denne protokol, da de ikke krystalliserede under de indledende trin i protokollen, der forringer krystallografiske undersøgelser. Derfor har vi skabt en enkel og effektiv rensningsprotokol bestående af ammoniumsulfatfraktionering og størrelsesudelukkelseskromatografi, som giver høje udbytter af vild type og mutant form af α2β2StTS-kompleks. Denne protokol er hurtigere (1-2 dage) og reproducerbar sammenlignet med den forrige protokol (5-7 dage)15,22, da der ikke er nogen krystalliseringskrav og protokolfejlfinding langs rensning. Derudover har vi skabt nye udtrykskonstruktioner og protokol til rensning af store mængder af α-underenheden, β-underenheden og rekonstitueret α2β2StTS-komplekset fra isolaterne.
Fremtidig anvendelse omfatter rekombination af vilde type og mutante underenheder til at udføre funktionelle og strukturelle undersøgelser. Mutant α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T og α2β2 βS377A kompleks krystalliseret under forhold, der indeholder højere koncentrationer af spermin (4-8 mM) sammenlignet med den vilde typeform (2 mM). Derfor er det værd at bruge tid på at forbedre kvaliteten af proteinkrystaller ved at variere koncentrationen af precipitants og buffer pH. Enkelt store krystal former tilfældigt voksede i bicine buffered løsning (pH 7,6-8,0) indeholder 6-11% PEG 8.000. De metoder, der er beskrevet i dette arbejde, vil blive brugt til at forberede krystalstrukturer af den vilde type og mutante former af α2β2-komplekset med forskellige ligands inden for α- og β-aktive steder, efterligne forskellige mellemprodukter og overgangstilstande, der er involveret i konverteringen af indol og serine til tryptofan. Krystalstrukturerne i disse mutanter forventes at give ny indsigt i den mekanisme og roller, som nøglerester i L-Tryptophan syntese spiller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre og erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health (GM097569).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
References
- Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
- Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
- Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
- Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
- Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
- Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
- Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
- Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
- Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
- Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
- Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
- Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
- Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
- Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
- Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
- Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
- Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
- Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
- Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
- Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
- Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
- Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
- Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
- Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
- Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).
