Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

Denna artikel presenterar en serie på varandra följande metoder för uttryck och rening av Salmonella typhimurium tryptofan syntas comp detta protokoll ett snabbt system för att rena proteinkomplexet på en dag. Täckta metoder är platsstyrd mutagenes, proteinuttryck i Escherichia coli,affinitetskromatografi, gelfiltreringskromatografi och kristallisering.

Abstract

Strukturella studier med tryptofansyntas (TS) bienzym komplexa (α2β2 TS) från Salmonella typhimurium har utförts för att bättre förstå dess katalytiska mekanism, allosteriskt beteende och detaljer om enzymatiska omvandlingen av substrat till produkt i PLP-beroende enzymer. I detta arbete tillät ett nytt uttryckssystem för att producera den isolerade α- och isolerade β-underenheten rening av höga mängder rena underenheter och α2β2StTS-komplex från de isolerade underenheterna inom 2 dagar. Rening utfördes av affinitet kromatografi följt av klyvning av affinitet taggen, ammonium sulfat nederbörd och storlek uteslutning kromatografi (SEC). För att bättre förstå rollen av viktiga rester vid enzymet β-site, utfördes site-direct mutagenesis i tidigare strukturella studier. Ett annat protokoll skapades för att rena den vilda typen och mutanta α2β2StTS-komplex. Ett enkelt, snabbt och effektivt protokoll med ammoniumsulfatfraktion och SEC tillät rening av α2β2StTS-komplex på en enda dag. Båda rening protokoll som beskrivs i detta arbete har betydande fördelar jämfört med tidigare protokoll att rena samma komplex med PEG 8000 och spermin för att kristallisera α2β2StTS komplex längs reningsprotokollet. Kristallisering av vild typ och vissa mutantformer sker under lite olika förhållanden, vilket försämrar reningen av vissa mutanter med PEG 8000 och spermin. För att förbereda kristaller som lämpar sig för röntgenkristallkroografiska studier gjordes flera ansträngningar för att optimera kristallisering, kristallkvalitet och kryoprotection. De metoder som presenteras här bör vara allmänt tillämpliga för rening av tryptofansyntasunderenheter och vilda typer och mutanta α2β2StTS-komplex.

Introduction

Tryptofansyntas (TS) bienzymkomplex (α2β2) är ett allosteriskt enzym som katalyserar de två sista stegen i biosyntesen av aminosyran L-tryptofan i bakterier, växter ochsvampar 1,2,3. Bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) orsakar en allvarlig gastrointestinal infektion hos människor och andra djur. Eftersom människor och högre djur inte har TS (EG 4.2.1.20), hämmas S. typhimurium α2β2 TS-komplex (α2β2StTS) har utforskats som ett potentiellt läkemedelsmål för behandling av cryptosporidiosis och tuberkulos4,genitala och okulär infektioner5, och för potentiell herbicidutnyttjande inom jordbruket6. α-underenheten katalyserar den aldolytiska klyvningen av indol-3-glycerol-fosfat (IGP) till glyceraldehyd-3-fosfat (GAP) och indol, genom bildandet av en indolenin tautomer mellanliggande och därefter kol-kol-kolbindning klyvning för att producera GAP och indol3,6. Den β katalytiska platsen innehåller en pyridoxal 5′-fosfat (PLP) kofaktormolekyl bunden till β-Lys87 via en Schiff-bas, som fungerar som en elektronsänka under reaktionerna vid enzymet β-underavdelning3,7. Den β katalyserar ersättningen av L-Serine sidokedjan hydroxyl med indol för att ge L-tryptofan och en vattenmolekyl i en PLP-beroende reaktion. St (st) TS fungerar som en långvarig modell för undersökning av substratkanalning och allosterisk kommunikation inom multienzymkomplex2,3. Dubbelriktad allosterisk kommunikation mellan α- och β-underenheterna av TS är nödvändig för att synkronisera katalytiska steg och förhindra indolfrisättning under L-Tryptofan syntes3. För att utöka denna ansträngning har vi förberett flera mutanter (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr och β-Ser377Ala) genom enpunktsmutation som ska användas i ytterligare utforskningar av förhållandet mellan enzymstruktur, mekanism och funktion på den katalytiska platsen för StTS β-underenheten.

Detaljerad forskning om katalystalmekanismen i α2β2StTS initierades av forskargruppen Edith W. Miles. Tidiga studier med infödda Escherichia coli α2β2 TS-komplex har fokuserat på rening och karakterisering av den isolerade α-underenheten8,9, isolerad β-underavdelning10,11 och rekonstitution av α2β2 TS-komplexet från de isolerade underenheterna12. Rening utfördes genom ammoniumsulfatutfällning, provdialys, DEAE-Sephadex kromatografi, dialys och en andra kromatografisk runda på en DEAE-Sephadex kolumn12. I ett annat protokoll förbättrades reningen av samma komplex genom att ladda det klarnade celllyatet på en DEAE-Sephadex-kolumn följt av ett kromatografiskt steg på en Sepharose 4B-kolumn, ammoniumsulfatutfällning och dialys13. Båda reningsprotokollen varar i 4-5 dagar. Escherichia coli α2β2 TS-komplex kristalliserade men kristaller var inte lämpliga för röntgendiffraktion vid den tiden.

I en ny studie renades rekombinanta och vilda typer av S. typhimurium α2β2 TS-komplex och kristalliserades14,15. Rekombinanta α2β2StTS-komplexet var överuttryckt i E. coli stam CB149 bär pEBA-10 uttryck vektor. Inledande kristallisering och röntgen diffraktion data insamling och analys av α2β2StTS-komplex rapporterades14. Långa och tunna nål som α2β2StTS kristaller nedsatta strukturella studier. I ett försök att samla in bättre röntgendiffraktionsdata beskrevs ett annat reningsprotokoll för att rena den vilda typen och mutantformerna av α2β2StTS-komplexet15. Rening utfördes med en första nederbörd med spermin och PEG 8,000 i den klarnade cell lysatet och en stor skrymmande fällning togs bort genom centrifugation. Den supernatanta fraktionen som innehåller höga mängder α2β2StTS-komplexet lagrades i 16-48 h vid 4 °C tills gula kristaller fälldes ut. Kristaller tvättades och i stor utsträckning dialyserades mot olika buffertar. Protein komplexa var rekristallized i buffert som innehåller ammonium sulfat och dialyzed15. Även om proteinkristallisering beror på protein- och utfällningskoncentrationer i lösningen, är det svårt att övervaka, förutsäga och reproducera rening för andra mutanta former av α2β2StTS-komplex i lösning. Detta protokoll har fördelen att det inte använder några kromatografiska metoder; Nackdelarna är dock den långa reningstiden som krävs för att kristallisera, dialysera och omkristallisera, vilket vanligtvis kräver 5-7 dagar. För att erhålla kristaller som lämpar sig för insamling av röntgendata utvärderades mer än 600 kristalliseringsförhållanden med hjälp av en kombination och variation av proteinkoncentration, temperatur, fällningsmedel (PEG 4 000, 6 000 och 8 000) och tillsatser (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadaverine, putrescine, spermin eller spermidin)15. Kristaller hade en bättre kristallin form och växte snabbare under förhållanden som innehöll 12% PEG 8,000 och 2 mM spermin. Kristallisering var mer gynnsam vid 25 °C snarare än vid 4, 30 eller 42 °C och växte till maximala dimensioner inom 3 dagar15. Flera α2β2StTS kristallstrukturer rapporterades vid den tiden (1996-1999)16,17,18,19,20,21 och många andra strukturer har publicerats hittills.

Här är huvudsyftet att presentera alternativa protokoll för att rena tryptofansyntas och optimera proteinkristallisering. Det nuvarande arbetet visar betydande förbättringar för att rena den vilda typen isolerad α-underavdelning (αStTS), isolerad β-underenhet (βStTS), rekonstituerad α2β2StTS-komplex från isolerade underenheter och vilda typer och mutantformer av α2β2StTS-komplexet. Fördelarna jämfört med tidigare protokoll är betydande eftersom reningstiden minskade betydligt och kristallisering och kryoprotection optimerades. Mutanta former av α2β2StTS-komplex som konstruerats i detta arbete har kristalliserats nära samma tillstånd som används för den vilda typen form. Fin kristallisering optimering var dock nödvändigt att erhålla stora enskilda kristaller av tillräcklig kvalitet för struktur bestämning vid nära atomupplösning. Hittills finns det 134 tryptofansyntaskristallstrukturer deponerade i Protein Data Bank (PDB), som står 101, 31 respektive 2 kristallstrukturer för bakterier, arkéer och eukaryote. Snyggt, 73 strukturer tillhör S. enterica serovar typhimurium och 5 kristallstrukturer i α2β2StTS-komplexet har upplösningsgränser högre än 1,50 Angstroms. Föga förvånande förbereddes 4 av 5 i vår forskargrupp (PDB ID:5CGQ på 1.18 Å, 4HT3 kl 1.30 Å, 4HPJ kl 1.45 Å, 6DZ4 kl 1.45 Å upplösning). De raffinerade kristallstrukturerna i mutantformen α2β2StTS-komplexet förväntas ge nya insikter om mekanismen och rollerna som spelas av essentiella aminosyrarester som är involverade i L-tryptofansyntesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Snabbt protokoll för att rena α- β-underenheten och den rekombinationsbaserade α2β2StTS-komplexet

  1. DNA-subkloning i pETSUMO uttryck vektor
    1. Erhåll translationell koppling gen (trpA och trpB) kodning α- och β-underenheter av tryptofan syntas från bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium klonas i pEBA-10 uttryck vektor22. Använd pEBA-10 vektor som DNA-mall.
      OBS: Alternativt kan de listade primerna nedan användas för att förstärka båda generna från Salmonella enterica serovar typhimurium genom. Alla molekylärbiologiska steg följdes enligt beskrivningen i molekylär kloning: En laboratoriehandbok23.
    2. Använd polymeraskedjereaktion (PCR) för att individuellt förstärka polynukleotidsekvensen i α-underenheten(αSt TS) med primers αStTS-FW-Bam och α βStTS)StTS-Rev-Eco och fullängdssekvensen av β-underavdelning (βStTS) med primers βStTS-FW-Bam och βStTS-Rev-Hind. Använd en smälttemperatur på ca 55 °C och en polymerasförlängningstid på 2 min.
      1. Använd DNA-polymeras med hög återgivning (t.ex. Phusion) och tillverkarens protokoll för att förstärka DNA-sekvenserna. För en 50 μL PCR-reaktion tillsätt 34 μL nukleasfritt vatten, 10 μL 5x reaktionsbuffert, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM framåt primer, 1 μL 10 μM omvänd primer, 1 μL mall-DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Phusion DNA-polymeras.
      2. För PCR-programmet, använd en varm start (180 sekunder vid 98 °C) följt av 30 förstärkningscykler (30 sekunder vid 98 °C, 30 sekunder vid 55 °C och 120 sekunder vid 72 °C) och en slutlig förlängning (300 sekunder vid 72 °C).
        OBS: De kursiverade sekvenserna motsvarar restriktionsplatserna BamHI, EcoRI, BamHI respektive HindIII. Enzym klyvning effektivitet nära termini pcr fragment förbättrades genom att lägga till extra baser (gemener sekvenser).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Ladda PCR-produkten på 0,8% agarosgel i 1x TAE-buffert (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA) vid 6 V/cm, gelextrakt DNA-bandet av intresse och gel rena PCR-fragmentet med hjälp av en kiseldioxidpärlasats enligt tillverkarens instruktioner.
      1. Smält minst 200 ng av varje DNA-fragment med lämpliga restriktionsenzymer och villkor som rekommenderas av tillverkaren i 2 timmar vid 37 °C.
      2. För att ställa in en 50 μL begränsningsreaktion tillsätts 34 μL nukleasfritt vatten, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaktionsbuffert, 0,5 μL restriktionsenzym 1 och 0,5 μL begränsningsenzym 2.
      3. Ladda matsmältningsprodukten på 0,8% agarosgel på 1x TAE vid 6 V/cm, gelextrakt och gel rena det smälta fragmentet med hjälp av ett kommersiellt kit.
    4. Subclone individuellt varje fragment i E. coli uttrycket modifierade vektor pET SUMO, tidigare smält med lämpliga enzymer och gel renas.
      OBS: Denna vektor är en modifierad version av den kommersiella pET SUMO. Denna vektor har optimerats för begränsning enzym kloning. Multikloningsplatsen (MCS) av pET28b vektor(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI och XhoI) sattes in i pET SUMO kloning webbplats. Denna vektor innehåller en N-terminal 6x-Histidin tagg i ram med small Ubiquitin-liknande Modifier protein (SUMO) och flera kloning platser.
    5. Ligate 100 ng modifierad pET SUMO och 50 ng PCR fragment med T4 DNA ligase i 2 timmar vid 25 °C.
    6. Omvandla den konstruerade plasmiden till kompetenta celler av E. coli-stam DH10Bα celler. Plåtceller på LB agarplattor som innehåller 35 μg/mL kanamycin. Inkubera plattan inverterad över natten vid 37 °C.
    7. Välj en enda koloni från varje omvandling, förbered ultrarena plasmid-DNA och utför DNA-sekvensering för att verifiera att αStTS eller βStTS klonades i ram med N-terminal His6-SUMO-taggen.
      OBS: Förbered glycerollager av cellkultur (vänd cellupphängning i 16% slutlig koncentration av steril glycerol) och lagra dem långsiktigt vid -80 °C.
    8. Omvandla uttrycket plasmid SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS individuellt till kompetenta celler av E. coli uttryck stam Rosetta (DE3) pLysS med ett T7 promotorbaserat system. Plätera de rekombinanta cellerna på Luria Bertani (LB) agarplattor som innehåller 35 μg/mL kanamycin och kloramfenikol. Inkubera plattan inverterad över natten vid 37 °C.
    9. Efter framgångsrik kolonibildning, välj en enda koloni (utan några satellitkolonier) och sprid den i 5 ml LB-medium med båda antibiotika. Kulturceller över natten med skakningar vid 200 varv/min vid 37 °C.
      OBS: Förbered glycerollager av cellkultur, lagra långsiktigt vid -80 °C eller använd omedelbart för rekombinant proteinuttryck.
  2. Uttryck för sumo-αStTS och SUMO-βStTS-underenheter
    1. Inokulera färsk E. coli stam Rosetta (DE3) pLysS celler som hyser SUMO- αStTS eller SUMO-βStTS konstruerar eller skrapar några av de frysta glycerol beståndetien 50 mL kultur av LB som innehåller 35 μg/mL kanamycin och kloramfenikol. Odla celler över natten med skakningar vid 200 varv/min vid 37 °C.
    2. Nästa morgon inokulera 5 ml av nattcellskulturen i en frisk och steril 2x 1000 ml LB som innehåller 2% glycerol plus kanamycin och kloramfenikol (2,8 L Fernbachkolv). Odla cellkulturen med skakningar vid 200 varv/min vid 37 °C.
      OBS: Uttrycket av SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS i LB buljong ger 125-150 mg märkt protein per liter. Överväg att skala upp eller ned protokollet för att uppfylla specifika krav.
    3. Inducera rekombinant proteinuttryck när OD600 når 0,6-0,8 genom tillsats av isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) vid en slutlig koncentration på 0,4 mM följt av inkubation vid 30 °C över natten med skakningar vid 200 varv/min.
    4. Skörda cellerna genom att centrifugera vid 4 000 x g vid 4 °C i 20 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera cellpelletsen med kall lysbuffert 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, innehållande 500 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM 2-mercaptoethanol och 40 mM imidazole-Cl) till en slutlig volym på 60 ml.
      OBS: Celler kan förvaras långtidsmat vid -80 °C eller användas omedelbart för proteinrening. För att lagra celler, dela cellupphängningen i 2 x 50 ml engångscentrifugkoniska rör och håll cellpellets vid -80 °C tills proteinreningssteget.
  3. Rening av α- och β-underenheter av tryptofan syntas
    OBS: Alla förfaranden ska utföras vid 4 °C om inget annat anges. För att minska reningstiden, jämvikt Ni-NTA agarose nickel-laddade affinitet kolumner och storlek uteslutning kolumn i buffert före protein rening eller under rekombinant protein uttryck.
    1. Stör cellpellets genom ultraljudsbehandling med hjälp av en digital sonifier med 1/2" Horn sond (eller liknande utrustning). Utför 20 cykler vid 80% amplitud arbetscykel på isvattenbad med 10 s puls och 20 s vila eller tills fullständig cellstörning.
    2. Centrifugera celllysaten på 30 000 x g i 30 min. Aspirera supernatant, se till att pelleten inte lossar från röret. Filtrera supernatanten med en filterenhet på 0,45 μm på is och flöda den genom en 15 ml Ni-NTA agarose nickelladdad affinitetskolonn som är förjämförd i lysbuffert 1.
      OBS: Varje Ni-NTA agarose kolumn kommer att användas för att rena antingen SUMO-αStTS eller SUMO-βStTS rekombinant protein. Rening kan utföras i en 2x 5 ml Ni-NiTA-kolumn fäst vid ett snabbt protein flytande kromatografisystem. Rena ett protein i taget.
    3. Tvätta Ni-NTA agarose kolumn i 100 ml lysbuffert 1.
    4. Fortsätt med en 80 mL enstegs eluering med buffert E1 (25 mM Tris-Cl buffert, pH 7,8, innehållande 200 mM NaCl, 5% glycerol och 400 mM imidazole-Cl).
      OBS: SUMO-proteas tolererar upp till 300 mM imidazol och membranet av centrifugalfilterenheter tolererar upp till 100 mM imidazol. Vi rekommenderar att du utför en ammoniumsulfatutfällning för att ta bort stora mängder imidazol och minska reningstiden istället späd proteinprovet och slösa tid med proteinkoncentration.
    5. Utvärdera den ursprungliga volymen av den övernatanta fraktionen. Tillsätt långsamt små mängder ammoniumsulfat åt gången tills en mättnad på 60 % (39,48 g/ 100 ml) vid 25 °C uppnås. Rör försiktigt om lösningen i 30 minuter och undvik bubblor. Centrifugera vid 10 000 x g i 15 min.
    6. Aspirera och kassera den supernataantfraktionen försiktigt. Återanvänd pelletsfraktionen i 20 ml provbuffert (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl och 5% glycerol).
    7. För hans-SUMO-tagg klyvning med SUMO-protease, tillsätt det rekombinanta fragmentet av Ubl-specifika proteas 1 från Saccharomyces cerevisiae i ett 1:1000-förhållande och inkubera blandningen i 2 timmar vid 4 °C.
    8. Centrifugera rötningsprodukten vid 10 000 x g i 25 °C i 20 minuter för att avlägsna proteinaggregat innan provet lastar genom en kolonn för affinitetskromatografi.
    9. Ta bort spår av His6-SUMO tagg passerar 20 ml återanvända provet på en 15 mL Ni-NTA agarose kolumn, tidigare jämvikt i lysis buffert 1.
    10. Samla in genomst vidare genomstprovet som innehåller den icke-märkta αStTS eller βStTS.
    11. Tvätta Ni-NTA-kolumnen i 20 ml buffert 1 för att samla rester av icke-märkta αStTS eller βStTS.
    12. Koncentrera varje underenhet separat med en filterenhet på 15 ml 10 kDa centrifugal genom att snurra vid 3 000 x g vid 4 °C. Överför det koncentrerade proteinet till ett färskt 2,0 ml-rör och mikrocentrifug (10 000 x g, 10 min, 4 °C) för att avlägsna aggregat. Bestämproteinkoncentrationen 24, förbered 1 ml alikvoter vid 20-25 mg ml-1, etikett, blixtfrys i flytande kväve och lagra dem vid -80 °C.
      OBS: Förrenade proteinprover kan lagras långtids vid -80 °C eller användas omedelbart för proteinrening på en kromatografikolonn (SEC).
    13. Ta ett protein alikvot (20 mg) och mikrocentrifuge vid 10 000 x g i 10 minuter för att ta bort aggregat före SEC.
    14. Belastningsprov på en kromatografikolonn för storleksuteslutning (t.ex. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) fäst vid en snabb proteinvätskakromatografi med en flödeshastighet på 0,5 ml min-1, tidigare jämvikt i SEC-buffert (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxalfosfat).
      OBS: För att rena högre mängder isolerade αStTS eller βStTS underavdelning och minska antalet SEC-rundor, ladda ett 5 ml prov vid 20-25 mg mL-1 på en storlek exkludering kromatografi kolumn med en flödeshastighet på 1,5 mL min-1.
    15. Utvärdera kvaliteten på αStTS eller βStTS i toppfraktionen med en 12% eller en 15% natrium dodecyl sulfat-gel elektrofores (SDS-PAGE), respektive, fläckad med Coomassie lysande blå fläck25.
    16. Koncentrera proteinet med färska 15 ml 10 kDa cutoff centrifugalfilterenheter, bestämproteinkoncentrationen 24,förbered 0,5 ml alikvoter vid 20-25 mg ml-1, etikett, blixtfrysning i flytande kväve och lagra dem vid -80 °C.
  4. Rening av α2β2St TS-komplexet från α- β-underenheterna
    OBS: Balansera storleksuteslutningskromatografikolonnen (Sephadex S-200 HR eller Superdex 200 pg) i SEC-buffert (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxalfosfat).
    1. För att rena de vilda α2β2StTS-komplexet från underenheterna α- och β, tina koncentratprover av αStTS och βStTS-underenheter vid 4 °C.
    2. Kombinera alikvoter (1,2 αStTS: 1,0 βStTS molar ratio) och inkuberas vid 4 °C i 1 timme.
      OBS: Överskott av αStTS är nödvändigt för att säkerställa att större delen av βStTS kommer att införlivas i α2β2StTS-komplexet.
    3. Avlägsna proteinaggregat genom mikrocentrifugering (10 000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Läs in den förtydligade supernaten på kolumnen för storleksuteslutning.
    5. Utvärdera kvaliteten på αStTS eller βStTS i toppfraktionen med en 12% eller en 15% natrium dodecyl sulfat-gel elektrofores (SDS-PAGE), respektive, fläckad med Coomassie lysande blå fläck25.
    6. Bestämproteinkoncentrationen 24, förbered 250-1000 μL alikvoter vid 15-20 mg ml-1,blixtfrys i flytande kväve och lagra vid -80 °C.

2. Rening av den vilda typen eller mutantformen av α2β2StTS-komplexet

  1. Platsstyrd mutagenes för att förbereda mutant βStTS
    1. Använd konstruktion pEBA-10 uttryck vektor22 som DNA mall under två steg av polymeras kedjan reaktion för att införa specifika punkt-mutationer i β-kedjanTS polynukleotid sekvensen.
      OBS: Detta protokoll kan användas för att införa en enda punkt mutation i antingen α-eller β-underavdelning från Salmonella typhimurium tryptofan syntas. För ytterligare, nya oligonukleotid primers som innehåller önskvärda mutationen måste vara lämpligt utformade. I detta arbete listas mutationer βQ114A, βK167T, βS377A.
    2. Utför PCR-reaktioner med par nukleotidprimrar TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev och TS-FW-NcoI/S377A-Rev för att generera fragmenten A1, B1 respektive C1.
      OBS: Oligonukleotid TS-NcoI-FW respektive TS-SacI-Rev glödgarna uppströms respektive nedströms sekvensen αβ StTS polynukleotid klonas i pEBA-10 vektorn.
      1. Använd DNA-polymeras med hög återgivning (t.ex. Phusion) och tillverkarens protokoll för att förstärka DNA-sekvenserna. För en 50 μL PCR-reaktion, tillsätt 34 μL nukleasfritt vatten, 10 μL 5x reaktionsbuffert, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM framåt primer, 1 μL 10 μM omvänd primer, 1 μL mall-DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA-polymeras.
      2. För PCR-programmet, använd en varm start (180 sekunder vid 98 °C) följt av 30 förstärkningscykler (30 sekunder vid 98 °C, 30 sekunder vid 55 °C och 120 sekunder vid 72 °C) och en slutlig förlängning (300 sekunder vid 72 °C).
        OBS: Alla molekylärbiologiska steg följdes enligt beskrivningen i molekylär kloning: En laboratoriehandbok23. Medan en gemener motsvarar en begränsnings plats, motsvarar en fet och kursiv sekvens en mutation.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Utför PCR-reaktioner med par nukleotidprimrar TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF och TS-Rev-SacI/S377A-FF för att generera fragmenten A2, B2 respektive C2.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc tgcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Använd polymeraskedjereaktion för att individuellt förstärka de partiella fragmenten. Använd en smälttemperatur på 55 °C och en polymerasförlängningstid på 2 min.
    5. För att utföra den andra omgången PCR-reaktioner, ladda PCR-produkten ovan på 0,8% agarosgel på 1x TAE vid 6 V/ cm och gelextrakt och gel rena fragmenten av intresse.
      1. Blanda fragmenten A1/A2, B1/B2 och C1/C2 separat i ekvämningsmängder, värmeprotesen blandningen i 10 min vid 96 °C och glödg vid 25 °C. Utöka de rekombinanta strängarna med en polymeras med hög återgivning och deoxyribonukleotider enligt tillverkarens protokoll.
    6. För att generera ett högt kopieringsnummer av det mutanta DNA-fragmentet i full längd, lägg till oligoprimrar TS-FW-NcoI och TS-Rev-SacI för att utföra en andra PCR.
    7. Ladda PCR-produkten på 0,8% agarose i 1x TAE-buffert vid 6 V/cm, gelextrakt DNA-bandet av intresse, gel renar PCR-fragmentet och fortsätt med lämplig begränsningssammanfattning i 2 timmar vid 37 °C enligt lämplig buffert och förhållanden som rekommenderas av tillverkaren.
      1. Smält minst 200 ng av varje DNA-fragment med lämpliga restriktionsenzymer och villkor som rekommenderas av tillverkaren i 2 timmar vid 37 °C. För att ställa in en 50 μL begränsningsreaktion tillsätts 34 μL nukleasfritt vatten, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaktionsbuffert, 0,5 μL restriktionsenzym 1 och 0,5 μL begränsningsenzym 2. Ladda matsmältningsprodukten på 0,8% agarose i 1x TAE-buffert vid 6 V/cm och rena det smälta PCR-fragmentet.
    8. Smält 200 ng pEBA-10 konstruktion med begränsning enzymer NcoI och SacI följer tillverkarens rekommendation. Ladda matsmältningsprodukten på 0,8% agarosgel i 1x TAE-buffert vid 6 V/cm, punktskatt bandet korrespondent till vektorn och gel rena den smälta vektorn.
    9. Ligate 100 ng vektor med 50 ng PCR fragment, tidigare smält och renad, med T4 DNA ligase i 2 timmar vid 25 °C. Omvandla den konstruerade plasmiden till kompetenta celler E. coli stam DH10B celler. Plåtceller på LB-agarplattor som innehåller 50 μg/mL ampicillin. Inkubera plattan inverterad över natten vid 37 °C.
    10. Välj en enda koloni (utan satellitkolonier) från varje cellomvandling och sprid den i 5 ml LB-medium som innehåller ampicillin. Odla celler över natten med skakningar vid 200 varv/min vid 37 °C. Förbered 10 μg ultrarent plasmid-DNA från varje konstruerad konstruktion. Förbered glycerollager av cellkultur (vänd cellupphängning i 16% slutlig koncentration av steril glycerol) och lagra långsiktigt vid -80 °C.
    11. Utför DNA-sekvenssekvens för att bekräfta den fulllängdssekvens som kodar α- β underenheterna tryptofansyntas. Bekräfta varje enskild mutation och kassera alla plasmid konstruktion som innehåller oönskade slumpmässiga mutation. De oligonukleotidprimrar som används i denna studie listas nedan.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      OBS: Oligonukleotidprimrar TS-1F, TS-1R, TS-2F och TS-3F glödgning på polynukleotidsekvensen i β-underenheten (GenBanks anslutningskod: CP051286.1). Primers TS-4F och TS-5F glödgning på polynukleotidsekvensen i α-underenheten (GenBanks anslutningskod: CP053865.1).
    12. Använd 200 ng av varje plasmidkonstruktion (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T och pEBA-10-βS377A) för att omvandla kompetenta celler av E. coli-uttrycksstammen CB149, utan trpoperon 26. Efter framgångsrik kolonibildning, välj en enda koloni och odla cellerna i 5 ml LB-medium som innehåller 50 μg/mL ampicillin. Kultur i bakterieinkubatorn vid 37 °C över natten. Förbered glycerollager av cellkultur, lagra långsiktigt vid -80 °C eller använd omedelbart för rekombinant proteinuttryck.
      OBS: En enda enpunktsmutation i antingen α- eller β-underavdelning från Salmonella typhimurium tryptofan syntas kan försämra enzymfunktionen eller lägre syntes av L-tryptofan i E. coli stam CB149. Överväg att använda antingen E. coli stam BL21(DE)pLys-S eller Rosetta (DE3)pLys-S om inga uttryck eller lägre mängder rekombinant α2β2StTS-komplex detekteras i en SDS-PAGE gel.
  2. Uttryck av vild typ och mutant form av α2β2StTS-komplex i E. coli
    1. Odla E. coli uttryck stam som hyser den önskvärda konstruktionen i en frisk och steril 50 ml LB medium som innehåller 50 μg/mL ampicillin. Odla celler över natten med skakningar vid 200 varv/min vid 37 °C.
    2. Tillsätt 5 ml av cellkulturen över natten i en frisk och steril 2x 1000 ml LB som innehåller 2% glycerol plus ampicillin (2,8 L Fernbachkolv). Odla cellkulturen med skakningar vid 200 varv/min vid 37 °C.
    3. Inducera rekombinant proteinuttryck när OD600 når 0, 6-0, 8 genom tillsats av IPTG vid en slutlig koncentration på 0, 4 mM följt av inkubation vid 30 °C över natten med skakningar vid 200 varv/min.
    4. Skörda cellerna genom att centrifugera vid 4 000 x g i 4 °C i 20 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera cellpelletsen med kall lysbuffert 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, innehållande 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA och 1 mM PMSF) till en slutlig volym på 50 mL buffert.
      OBS: Celler kan förvaras långtidsmat vid -80 °C eller användas omedelbart för proteinrening. För att lagra celler, dela cellupphängningen i 2 x 50 ml engångscentrifugkoniska rör och håll cellpellets vid -80 °C tills proteinreningssteget. Uttrycket av mutant och vild typ form av α2β2StTS komplex i LB buljong ger 125-150 mg protein per liter. Överväg att skala upp eller ned protokollet för att uppfylla specifika krav.
  3. Rening av vild typ eller mutantform av α2β2StTS-komplex
    OBS: Följande protokoll är avsett att rena den icke-märkta rekombinanta vilda typen eller mutantformen av rekombinanta α2β2StTS-komplex inom 1 dag, beroende på färdighet och ansträngningar. För att minska reningstiden, jämvikt storlek uteslutning kolumn i buffert tidigare protein rening/uttryck. Rening av vilda typer eller α2β2StTS-komplexet utförs genom en tvåstegsrening som omfattar ammoniumsulfatfraktion och en storleksuteslutning kromatografi. Detta protokoll ger 60-100 mg rent komplex från 1 L LB medium.
    1. Stör cellpellets genom ultraljudsbehandling med hjälp av en digital sonifier med 1/2" Horn sond (eller liknande utrustning). Utför 20 cykler vid 80% amplitud arbetscykel på isvattenbad med 10 s puls och 20 s vila eller tills fullständig cellstörning.
    2. Centrifug celllysat vid 30 000 x g i 30 min vid 25 °C. Aspirera supernatant, se till att pelleten inte lossar från röret. Filtrera den klarlagda supernatantfraktionen med ett filter på 0,45 μm vid rumstemperatur.
    3. Utvärdera den ursprungliga volymen av den klarnade supernatantfraktionen. Tillsätt långsamt små mängder ammoniumsulfat åt gången tills en mättnad på 20 % uppnås (11,51 g / 100 ml). Utför ammoniumsulfatfraktion vid 25 °C. Rör försiktigt om lösningen i 10 minuter och undvik bubblor.
    4. Centrifugera vid 30 000 x g i 10 min vid 25 °C. Överför den 20% supernata medelfraktionen till en ren kolv. Återanvänd försiktigt 20% pelletsfraktion i 20 ml provbuffert 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, innehållande 100 mM NaCl, 1 mM EDTA och 2 mM dithiothreitol) och förbered ett prov för att köra SDS-PAGE gel. Kassera 20% pelletsfraktion.
    5. Utvärdera den ursprungliga volymen av den 20% supernataantfraktionen. Tillsätt ammoniumsulfat till 30% mättnad uppnås (5,94 g / 100 ml), rör om lösning, undvik bubblor och centrifugera som tidigare. Överför den 30% supernataantfraktionen till en ren kolv. Återanvänd försiktigt 30% pelletsfraktion i 20 ml provbuffert 2 och förbered ett prov för att köra SDS-PAGE gel. Kassera 30% pelletsfraktion.
    6. Utvärdera den ursprungliga volymen av den 30% supernataantfraktionen. Tillsätt ammoniumsulfat vid en 40% mättnad uppnås (6,14 g / 100 ml), rör om lösning, undvik bubblor och centrifugera som tidigare. Överför den 40% supernataantfraktionen till en ren kolv. Återanvänd försiktigt 40% pelletsfraktion i 10 ml provbuffert 2 och förbered ett prov för att köra SDS-PAGE gel. Kassera den 40% supernataantfraktionen.
      OBS: Bedöm kvaliteten på αβStTS-komplexet med hjälp av prover av 30% och 40% supernatant och pelletsfraktioner i en 12% SDS-PAGE gel25. Om du kontrollerar att något annat mutantt αβStTS-komplex finns i den 40% övernaturliga fraktionen, fortsätt med en 60% mättnad av ammoniumsulfat (13,0 g / 100 ml). Förrenade protein alikvoter av den förrenade α2β2 StTS-komplexet kan lagras långsiktigt vid -80 °C eller användas omedelbart för proteinrening på en storleksuteslutning kromatografikolonn (SEC).
    7. Mikrocentrifug proteinprovet vid 10 000 x g,20 min, 4 °C och ladda den supernata medelfraktionen på en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-kolumn fäst vid en snabb protein flytande kromatografi med en flödeshastighet på 0,5 mL min-1, tidigare jämvikt i SEC-buffert (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxalt fosfat).
      OBS: För att rena stora mängder komplex, ladda ett 5 ml prov vid 20-25 mg mL-1 på en HiLoad 26/600 Superdex 200 pg-kolumn med en flödeshastighet på 1,5 mL min-1.
    8. Utvärdera prover som samlats in längs ammoniumsulfatfraktionen och toppfraktionerna från SEC-kolumnen på en 12% SDS-PAGE gel färgad med Coomassie lysande blå fläck25.
    9. Koncentrera den vilda typen eller mutanten α2β2StTS-komplexet med en 15 ml 100 kDa cutoff centrifugalfilterenhet genom att snurra vid 3 000 x g vid 4 °C. Överför det koncentrerade proteinet till ett färskt 2,0 ml-rör och mikrocentrifug (10 000 x g, 10 min, 4 °C) för att avlägsna aggregat.
    10. Bestämproteinkoncentrationen 24, förbered 0,5 ml alikvoter vid 20-25 mg ml-1, etikett, blixtfrysning i flytande kväve och lagra dem vid -80 °C.

3. Optimerad kristallisering för vild typ och mutantform av α2β2StTS-komplex

OBS: Det ursprungliga kristalliseringsförhållandet för α2β2StTS-komplexet rapporterades tidigare under förhållanden som innehåller 12% PEG 8 000 och 2 mM spermin22.

  1. Förbered lagerlösningar före kristalliseringsanalyserna för att uppnå en bättre kristalliserings reproducerbarhet. För att utföra strukturella studier med TS, kristallisera protein med Na+ eller Cs+ jon på metallkoordineringsplatsen för bienzymkomplexet.
    1. Förbered 5 ml stamlösning på 200 mM spermin i vatten och håll 500 μL alikvoter vid -20 °C.
    2. Förbered 50 ml stamlösning på 30 % (w/v) PEG 8000 i vatten och förvara 25 ml alikvoter i en 50 ml engångskolv med centrifuger vid 25 °C.
    3. Förbered en 25 ml stamlösning på 1 M CsCl i vatten och håll vid 25 °C.
    4. Förbered 25 ml stamlösning på 1 M NaCl i vatten och förvara den vid 25 °C.
    5. Förbered 3x 50 ml stamlösning på 1 M bicine och titrera med CsOH eller NaOH för att erhålla buffrade lösningar vid pH 7.6, 7.8 och 8.0. Håll 25 ml alikvoter vid 4 °C.
  2. Tina upp ett prov α2β2StTS-komplex (20-25 mg mL-1)på ett isbad.
  3. Mikrocentrifugprov vid 10 000 x g i 10 min vid 25 °C för att avlägsna proteinaggregat.
  4. Överför den rensade supernatantfraktionen till ett rent mikrocentrifugrör.
  5. Uppskattad proteinkoncentration24 och utspädda protein alikvoter (150-200 μL) vid 15 mg mL-1 med 50 mM bicine-CsOH eller -NaOH, pH 7,8 innehållande 50 mM CsCl eller NaCl. Förvara proteinprovet vid 25 °C.
  6. Förbered 500 μL-reservoarlösningarna för 3x 24-brunns sittdroppplattor i sterila 1,5 ml märkta mikrocentrifugrör. Reservoarlösningen innehåller 50 mM bicine-CsOH eller -NaOH, 50 mM CsCl eller NaCl och PEG 8000. Variera koncentrationen av PEG 8000 (6-11%) på plattpelarna och koncentrationen av spermin (2-8 mM) på plattraderna. Byt buffert pH (pH 7.6, 7.8 och 8.0) för varje uppsättning.
  7. Kapa rören och virveln kraftigt minst 10 sek. Centrifugrör vid 10 000 x g i 10 min vid 25 °C för att avlägsna bubblor. Dispensera 500 μL buffrad lösning i varje märkt behållare.
  8. Använd en P-10 mikropipett och dispensera 5 μL proteinlösning vid 15 mg ml-1 per sittning släpp väl. Undvik bubblor. Tillsätt 5 μL av varje korrespondentreservoarlösning till proteindroppe. Undvik bubblor under blandning och rör inte upp och ner för att homogenisera blandningen.
  9. Tejpa plattan med en genomskinlig tejp och förvara plattan vid 25 °C. Kristaller förekommer om 2-5 dagar och växer till sina fulla dimensioner inom två veckor.

4. Insamling av röntgendiffraktionsdata och α2β2StTS-komplex strukturlösning

OBS: Före insamling av röntgendiffraktionsdata bereder du kryoprotektantlösning för varje kristall i förväg. Använd den specifika reservoarlösningen för att förbereda 3 alikvoter som innehåller ökande koncentrationer av dimethylsulfoxid i lösning (10, 20 och 30% v/v) och specifika ligand (er). Dimetylsulfoxid konstaterades vara ett bättre kryoprotektalt än glycerol, etylenglykol och PEG 200-300.

  1. Skörda en stor enda kristall med en cryoloop under det stereoskopiska mikroskopet.
  2. Pipett 2 μL av varje kryoprotektantlösning som innehåller utfällningslösningen plus högre koncentrationer av dimethylsulfoxid och ligand (er) på en ny täckrutschbana.
  3. Sekventiellt, blötlägg crystal i varje droppe och låt kristallen jämvikta i 30 s i kryoprotektantlösningen.
  4. Blixtkylning av den kryoprotekterade kristallen med en gasformig kväveström vid -173 °C (100 K) eller nedsänkt i flytande kväve för långtidslagring i puckar.
    OBS: Fyll ett skum Dewar med flytande kväve, förkyl en kristallpuck, förvara kristaller i den kryogena lagringen Dewar och skicka kristaller till synkrotronen med en torr avsändare.
  5. Fortsätt med röntgendiffraktionsdatainsamling vid -173 °C. Registrera röntgendiffraktionsdata med en exponeringstid på 0,5–4,0 s och 0,5°-svängningar. Rotera kristall 180-360°.
  6. Bearbeta röntgendiffraktionsbilderna med iMosflm27 för att generera reflektionsfil i lämplig rymdgrupp. I allmänhet α2β2StTS-kristaller till rymdgruppen C 121 (C2).
  7. Skala ihop flera observationer av reflektioner med Scala28, implementerad i CCP4-paketet29.
  8. Lös strukturen hos högupplösta 2 α2β2StTS-komplexet med molekylär ersättning med MolRep30 och en lämplig sökmodell. Inspektera modellen och elektrontäthetskartan i Coot31 efter en lyckad strukturlösning.
    OBS: Det finns många TS kristaller strukturer deponeras i Protein Data Bank med olika ligand (s). För ett bättre molekylärt ersättningssteg och minskad tidspassning av den nyare kristallstrukturen, använd den bästa sökmodellen som innehåller ligand (er) av intresse. Fortsätt med kristallstrukturförfining i CCP429,30 eller Phenix31.
  9. Gör manuella justeringar av modellen med Coot32, följt av automatisk förfining med Refmac29,33 eller phenix.refine31,34. Bygg och förfina den slutliga modellen genom att köra iterativa rundor av modellbyggnad i Coot32 och automatiserad förfining.
  10. Fortsätt med koordinat- och strukturfaktordeposition på Protein Data Banks webbplats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rening av α- β-underenheter av tryptofansyntasen
Den α-underenheten(αStTS) och β-underenheten (βStTS) i Salmonella typhimurium tryptofan syntas var subcloned i den modifierade pET SUMO vektorn. Figur 1A visar representativa SDS-PAGE-resultat av två starka band som motsvarar fusionsproteinet His6-SUMO-αStTS (lane αON) och His6-SUMO-βStTS (lane βON). Reningsprotokollet som beskrivs i detta arbete tillät rening av båda underenheterna individuellt inom 2 dagar. Den första dagen användes för att rena varje protein genom Ni-NTA affinitet kromatografi, ammonium sulfat nederbörd följt av His-SUMO-tag klyvning, avlägsnande av His-SUMO-tag spår och protein koncentration. Figur 1B och 1C visar representativa SDS-PAGE-resultat α underenheten respektive β underenhetsrening. På den andra dagen laddades koncentratet α-underenhet, β-underavdelning och α2β2StTS-komplexet från underenheterna α- och β-underenheter på en kromatografikolonn med storleksuteslutning. Figur 1D visar en typisk elueringsprofil för αStTS, βStTS och α2β2StTS-komplex på en S-200 HR-storleksuteslutningskolumn. Figur 1E visar ett representativt SDS-PAGE-resultat av de insamlade toppfraktionerna. De renaste toppfraktionerna poolades, koncentrerades och α2β2StTS-komplexet användes för proteinkristalliseringsstudier.

Rening av den vilda typen och mutanten α2β2StTS-komplexet
Ett annat snabbt och effektivt protokoll för att rena den vilda typen och mutantformen av α2β2S. typhimurium tryptofan syntas komplex beskrivs i detta arbete. Figur 2 visar en återgivning av pEBA-10-konstruktionen som innehåller den vilda typen translationell kopplingsgen (trpA och trpB) kodning för α- och β-underenheter22. Pcr-mutagenesprotokollet i två steg för att generera mutantformer av α2β2StTS-komplexet avbildas i figur 3.

Kodningsregionerna i mutanta α2β2StTS-komplexet i pEBA10 bekräftades genom DNA-sekvensering och användes för att omvandla E. coli-stam CB149-celler26. Den vilda typen och mutanta formen av α2β2StTS komplexa var överuttryckta och rekombinanta proteiner renades framgångsrikt inom 1-2 dagar. Ammoniumsulfatfraktion vid rumstemperatur avlägsnade lätt de flesta främmande proteiner från det heterologa uttryckssystemet (Figur 4A, körfält 20P, 30P och 40S). En representativ elueringsprofil med relativ elueringsposition på α2β2StTS (143,06 kDa) komplex på ett HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-storlek uteslutning kromatografi kolumn visas i figur 4B. Renheten hos de uteslutna toppfraktionerna analyserades SDS-PAGE innan poolning (figur 4C).

Optimering av vild typ och mutant α2β2tryptofan syntas komplex kristallisering
Alikvoter av vild typ och mutant α2β2StTScomplex vid 15 mg ml-1 användes för att ställa in 24-brunns sittande droppplattor. Droppar bestående av 5 μL proteinlösning och motsvarande volym reservoarlösning jämviktades vanligtvis mot 500 μL reservoarlösning (figur 5). Spermin krävs för att kristallisera den vilda typen och mutanta α2β2StTS-komplex22. Medan den slutliga koncentrationen av spermin för att kristallisera den vilda typen är 2 mM, visade koncentrationen av spermin för att kristallisera mutantkomplexet i detta arbete vara något högre (4-8 mM).

Stora enskilda kristaller erhölls genom en fin kristallisering optimering, varierande PEG 8000 (6-11%) och bicine buffert pH. Kristaller med olika morfologier uppträdde på 2-5 dagar och kristaller växte till full storlek inom två veckor (Figur 6). Före röntgendiffraktionsdatainsamling blötlades kristaller i kryoprotektantlösning (reservoarbuffert som innehåller upp till 30% dimetylsulfoxid). Den optimerade processen resulterade i kvalitetskristaller som lämpar sig för röntgendiffraktionsmätningar med nära atomupplösning.

Analys av röntgendiffraktionsdata
En kristallstruktur av den vilda typen α2β2StTS-komplexet utarbetades med metoder som beskrivs i denna artikel och röntgendiffraktionsdata samlades in vid nära atomupplösning. Kristallen blötlades i kryoprotektiv lösning som innehåller F9-hämmare (2- ({[4- (Trifluoromethoxy)Fenyl]Sulfonyl}Amino)Etyl Dihydrogenfosfat) och L-tryptofan.

En komplett röntgendiffraktionsdatauppsättning samlades in på SIBYLS synkrotronstrålelinje 12.3.1 vid Advanced Light Source (Berkeley-CA) genom att rotera kristallen 360° i steg om 0,5°. Röntgendiffraktionsintensiteter bearbetades och datainsamlingsstatistiken sammanfattas i tabell 1. Symmetrianalysen visar att kristallen tillhörde den monokliniska rymdgruppen C2. Parametrarna för enhetsceller är a = 182,55, b = 59,30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. Det beräknade värdet av Matthews-koefficienten (Vm = 2,57 Å3 Da-1) tyder på närvaron av en TS heterodimermolekyl (αβ StTS) i kristallens asymmetriska enhet med en lösningsmedelshalt på 52,08%35,36. Alla röntgendata samlades in vid låga temperaturer (100 K) för att förbättra diffraktionskvaliteten och minska strålningsförfallet. α2β2StTS kristallstruktur i komplex löstes genom molekylär ersättningsmetod med den vilda typen αβ StTS-modellen i komplex med hämmaren F9 vid α-platsen och cesiumjonen vid metallkoordineringsplatsen (PDB ID-kod: 4HT3). Den slutliga samordningsakten och strukturfaktorerna deponerades i det preliminära budgetförslaget med anslutningskod 5CGQ (figur 7A). Kristallstrukturen hos den vilda typen α2β2StTS-komplexet med hämmare F9 vid enzymet α-site (Figur 7B),cesiumjon på metallkoordineringsplatsen (Figur 7C), kofaktorn pyridoxal 5 '-fosfat covalently bunden till βLys87 (Figur 7D), och produkten L-tryptofan vid enzymet β-site (Figur 7E) löstes vid 1.18 Angstrom upplösning. Model 5CGQ är den högsta upplösningen α2β2StTS kristallstruktur deponerad i PDB hittills.

Figure 1
Figur 1: Rening av α- β och α2β2StTS-komplexet. A) Rekombinant proteinuttryck. 12% SDS-PAGE gel av över natten uttryck profilen för SUMO-αStTS (αON) och SUMO-βStTS (βON) efter IPTG induktion vid 30 °C (α/β0 tidigare IPTG induktion). B, C) Ni-NTA affinitetskromatografi följt av ammoniumsulfatutfällning (60% mättnad), (S) klargjort råextrakt (FT1) Ni-NTA-kolumn passerar genom prov (W) kolumntvättprov (E) eluatprov (60S) och (60P) övernaturliga och fällbara fraktioner efter höghastighets centrifugation, (D) SUMO-proteasfrostprodukt (FT2) Ni-NTA-kolumn passerar genom provet som innehåller tagglös αStTS eller βStTS-underenhet. (D) elueringsprofil för αStTS-underenhet (28,67 kDa), βStTS-underenhet (42,86 kDa) och α2β2StTS-komplex (143,06 kDa) med en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-storlek exkluderingskromatografikolonn. Varje körning utfördes separat. (E)SDS-PAGE geler av de uteslutna toppfraktionerna från varje enskild kromatografi. Medan 15% SDS-PAGE geler var beredda att analysera α2β2StTS-komplex och αStTS-underenhet, var en 12% SDS-PAGE gel beredd att analysera βStTS-underenheten. Lane MW, molekylviktsmarkörer i kDa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Representation av konstruktionen pEBA-10. a)Representation av den vilda typen translationell kopplingsgen (trpA och trpB) som kodar för α- och β-underenheterna av tryptofansyntasen från bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) Vektorn innehåller en ampicillinresistens (amp) gen, ett replikeringsursprung (ori), enlacI q-gen för att bättre stänga av en lacpromotor i avsaknad av IPTG-inducerare, och LacI-förträngd promotor .Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Övergripande representation av protokollet om tvåstegs PCR-mutagenes. PEBA-10 vektorn användes som en DNA mall. Den första omgången PCR utarbetades med primers TS-FW-NcoI och MUT-REV (en omvänd primer som innehåller en mutation) för att generera det första fragmentet och primers TS-Rev-SacI och MUT-FW (en framåt primer som innehåller en mutation) för att generera det andra fragmentet). Fragmenten var gel renad och equimolarly kombinerad, värme denatured och glödgade. Rekombinanta strängar förlängdes med polymeras och deoxyribonukleotider. Den andra omgången PCR förbereddes med primers TS-FW-NcoI och TS-Rev-SacI. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Rening av vild typ och mutantform av α2β2StTS-komplex. (A) 12% SDS-PAGE gel av prover som samlats in längs ammoniumsulfatutfällningen med 20, 30, 40 och 50% ammoniumsulfatmättnad vid rumstemperatur: (CE) råextrakt (S) och (P) övernaturliga och fällbara fraktioner efter höghastighetscentrifugation. (B) Elueringsprofil på α2β2StTS (143,06 kDa) komplex med en HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR storlek uteslutning kromatografi kolumn. (C) 12% SDS-PAGE gelbild av de uteslutna toppfraktionerna. Lane MW, molekylärviktsmarkörer i kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Kristalliseringsoptimering för vild typ och mutantform av α2β2StTS-komplex. Kristaller odlades i 50 mM Bicine-CsOH-buffert som innehöll 50 mM CsCl2. Koncentrationen av polyetylenglykol 8000 (6-11%) och spermin (2-8 mM) varierades för att erhålla enskilda stora kristallformer för att utföra strukturella studier av röntgenproteinkristallografi. A)Bicine-CsOH, pH 7.6. B)Bicine-CSOH, pH 7.8. C)Bicine-CSOH, pH 8.0. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Fotomikrografi av kristaller av vild typ och mutantform av α2β2StTS-komplex. Kristaller skiljer sig åt i morfologi, men de tillhör rymdgruppen C2. Kristallerna växte till sina fulla dimensioner under de sista förhållandena efter två veckor. Kristaller av ungefär 0,20 x 0,15 x 0,10 mm i storlek. Jag är inte så bra på att säga det här. PLP-holokristaller i komplext med cesiumjon vid metallkoordineringsstället av vildtypsform (kolumn A), mutantform α2β2 βQ114A (kolumn B), α2β2 βK167T (kolumn C) och α2β2 βS377A (kolumn D). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Övergripande visualisering av kristallstruktur och validering av elektrontäthetskartor som erhållits efter förfining av kristallstrukturen. a)Kristallstruktur av vild typ α2β2StTS-komplex med hämmare F9 vid enzymet α-site (gulfärgad), cesiumjon på metallkoordineringsplatsen (blåfärgad), kofaktorn pyridoxal 5'-fosfat covalent bunden till βLys87 (grönfärgad) och produkten L-tryptofan vid enzymet β-site (cyanfärgad) vid 1,18 Angstrom upplösning. Medan α-underenheten är färgad i ljusblått, är β-underenheten färgad i lax. (B-E) Elektrondensitetskartor konturerade på 1.m 0 r.m.s. nivå runt(B)hämmare F9 (C) cesiumjon (D) pyridoxal-5′-fosfat och (E) L-tryptofan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Insamling och behandling av uppgifter
Röntgenkälla / Strållinje ALS-strållinje 12.3.1
Våglängd (Å) 10,000
Beslut (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
Totalt antal reflektioner 2151280 (252941)
Totalt antal unika reflektioner 231646 (32187)
Utrymmesgrupp för indexering, skalning och sammanslagning C 1 2 1
Celldimensioner
a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
Mosaikitet 0.61
Matthews volym VM (Å3 Da-1) 2.57
Rmeas (%) 8.6 (93.0)
14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
Fullständighet (%) 98.6 (94.2)
Multiplicitet 9.3 (7.9)
Statistiken över förfining
Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
RMSD-bindningslängd (Å) 0.0120
RMSD-bindningsvinkel (°) 14,059
Ramachandran favoriserade 515 (96.44%)
Ramachandran tillåtet 16 (3.00%)
Ramachandran otillåten 3 (0.56%)

Tabell 1: Insamling och behandling av uppgifter. Värden inom parentes är för det yttre skalet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har framgångsrikt konstruerat mutantform α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T och α2β2 βS377A StTS-komplex för strukturfunktionskorrelationsstudier. Inledningsvis har vi försökt rena mutanterna med hjälp av ett tidigare reningsprotokoll22, som kräver α2β2StTS-komplex kristallisering med PEG 8000 och spermin under rening. Även om kristalliseringshastigheten beror på mutantformen och på koncentrationen av komplexet i lösning, är det svårt att förutsäga när kristaller förekommer i en stor lösningsvolym. Kristallisering kan uppnås antingen efter långa perioder (48-96 h) eller vara nödvändigt tillsats av extra mängder PEG 8000 efter kristalliseringsinitiering15.

Tyvärr, mutanta former av α2β2StTS komplex presenteras i detta arbete inte framgångsrikt renas med detta protokoll eftersom de misslyckades med att kristallisera under de första stegen i protokollet, försämra kristallografiska studier. Därför har vi skapat ett enkelt och effektivt reningsprotokoll bestående av ammoniumsulfatfraktion och storleksuteslutning kromatografi, vilket ger höga utbyten av vild typ och mutant form av α2β2StTS-komplex. Detta protokoll är snabbare (1-2 dagar) och reproducerbart jämfört med föregående protokoll (5-7 dagar)15,22, eftersom det inte finns några kristalliseringskrav och protokollfeltagning längs rening. Dessutom har vi skapat nya uttryckskonstruktioner och protokoll för att rena stora mängder av α-underenheten, β-underenheten och den rekonstituerade α2β2StTS-komplexet från isolaterna.

Framtida tillämpning omfattar rekombination av vilda typer och mutanta underenheter för att utföra funktionella och strukturella studier. Mutant α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T och α2β2 βS377A-komplex kristalliserat under förhållanden som innehåller högre koncentrationer av spermin (4-8 mM) jämfört med den vilda typen form (2 mM). Därför är det värt att spendera tid på att förbättra kvaliteten på proteinkristaller genom att variera koncentrationen av fällningsmedel och buffert pH. Enstaka stora kristallformer växte slumpmässigt i bicine buffrad lösning (pH 7,6-8,0) innehållande 6-11% PEG 8,000. De metoder som beskrivs i detta arbete kommer att användas för att förbereda kristallstrukturer av den vilda typen och mutantformerna av α2β2-komplexet med olika ligands inom de α- och β-aktiva platserna, härma olika intermediärer och övergångsstater som är involverade i omvandlingen av indol och serin till tryptofan. Kristallstrukturerna hos dessa mutanter förväntas ge nya insikter om mekanismen och rollerna som nyckelrester spelar i L-tryptofansyntesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja och deklarera inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av US National Institute of Health (GM097569).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Tags

Biokemi Utgåva 163 Tryptofansyntas rekombinant protein mutantprotein proteinuttryck proteinrening ammoniumsulfatutfällning storleksuteslutning kromatografi proteinkristallisering
PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hilario, E., Fan, L., Mueller, L.… More

Hilario, E., Fan, L., Mueller, L. J., Dunn, M. F. PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase. J. Vis. Exp. (163), e61839, doi:10.3791/61839 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter